DE60003417T2

DE60003417T2 - Pharmazeutische zusammensetzung enthaltend durch pim aktivierten nkt zellen, und ihr verwendung in der therapie

Info

Publication number: DE60003417T2
Application number: DE60003417T
Authority: DE
Inventors: Irina Apostolov; Gabriel Gachelin; Philippe Kourilsky; Yousuke Takahama
Original assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1999-04-19
Filing date: 2000-04-19
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2020-04-20
Also published as: HK1044795A1; DK1171578T3; US20060263376A1; PT1171578E; US7052909B1; WO2000063348A2; FR2792205B1; EP1171578B1; WO2000063348A3; CA2368029A1; EP1171578A2; FR2792205A1; ATE243252T1; HK1044795B; EP1346725A1; JP2003502284A; ES2206221T3; DE60003417D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von mindestens einem PIM und/oder mindestens einer NK-T-Zelle, die durch ein PIM aktiviert wird, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, deren Ursache eine Infektion durch bakterielle Agenzien oder ein Krebs ist.
NK-T-Zellen sind eine besondere Untergruppe der α/β-T-Lymphozyten und exprimieren mit NK- (Natürlichen Killer-) Zellen assoziierte Zelloberflächenmarker, wie NK1.1 (Bendelac et al., 1995) und bestimmte Mitglieder der Ly-49-Familie (Ortaldo et al., 1998). Sie unterscheiden sie zudem von herkömmlichen T-Lymphozyten durch bestimmte Eigenschaften ihrer T-Rezeptoren: Die α-Kette ist invariant und entsteht durch eine Umlagerung zwischen den Segmenten Vα14 und Jα281, die mit einer konservierten CD3-Region assoziiert sind (Koseki et al., 1991; Lantz et al., 1994). Außerdem verwenden sie ein eingeschränktes TCRβ-Repertoire (Bendelac et al., 1997). Schließlich und im Gegensatz zu den üblichen T-Zellen exprimieren die NK-T-Zellen den Rezeptor TCR (T-Zell-Rezeptor) in einer mittleren Menge und sind auf das MHC-Klasse-Ib-Molekül CD1 restringiert (Bendelac et al., 1997). Die Domänen α1 und α2 des CD1d1-Moleküls präsentieren eine hydrophobe Bindungsstelle, die an den Lipidkern von Glycosylceramiden (Brossay et al., 1998) und an durch ein GPI (Glycosylphosphatidylinositol) verankerte Proteine bindet, wodurch CD1-Glycolipid-Komplexe entstehen, die von NK-T-Zellen erkannt werden (Brossay et al., 1998; Kawano et al., 1997; Burdin et al., 1998; Brossay et al., 1998; Schofield et al., 1999).
Die in-vivo-Funktionen von NK-T-Zellen sind noch lange nicht vollständig beschrieben. NK-T-Zellen spielen eine Rolle bei der Abstoßung von Tumoren, die durch IL-12 vermittelt werden (Takeda et al., 1996; Cui et al., 1997; Kawano et al., 1998). Sie sind außerdem bei bestimmten Autoimmunerkrankungen von Menschen und Mäusen und bei Infektionsvorgängen impliziert, entweder durch die Produktion von Cytokin des Th-1-oder Th-2-Typs (Hammond et al., 1998; Flesch et al., 1997; Enomoto et al., 1997) oder durch ein Absinken in der Anzahl dieser Zellen (Mieza et al., 1996; Wilson et al., 1998; Emoto et al., Eur. J. Immunol. 1997; Emoto et al., Inf. & Imm., 1997).
Über die Mechanismen, welche die in-vivo-Aktivierung von NK-T-Zellen einleiten, ist ebenfalls sehr wenig bekannt. Eine Aktivierung dieser Zellen durch ein Ceramid, α-Galactosylceramid, ist gezeigt worden (Kawano et al., 1998, und WO 98/44 928). Ein neuerer Artikel von Schofield et al., 1999, berichtet außerdem die Ergebnisse der in-vivo-Reaktion von peripheren NK-T-Zellen auf verschiedene GPI (Glycosylphosphatidylinositole).
Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben einerseits entdeckt, dass die NK-T-Zellen durch Phosphoinositolmannoside (PIM) aktiviert werden können, und andererseits, dass diese Aktivierung eine granulomatöse Immunreaktion hervorruft.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben ebenfalls gezeigt, dass die Aktivierung von NK-T-Zellen, die für die granulomatöse Reaktion verantwortlich sind, unabhängig vom CD1/TCR-Weg ist und tatsächlich von dem durch CD14 vermittelten Weg der angeborenen Immunität. abhängt. Mittels PIM, welche die NK-T-Zellen aktivieren, lässt sich die Antwort des Wirts auf einen Weg des TH1-Typs ausrichten. Dies konnte von den Erfindern mithilfe direkter Messungen von Cytokinen gezeigt werden, die in des Innere des Granuloms freigesetzt werden.
Auf der Grundlage dieser Ergebnisse schlagen die Autoren der vorliegenden Erfindung die Verwendung von mindestens einem PIM und/oder mindestens einer durch ein PIM aktivierter NK-T-Zelle zur Herstellung eines Medikaments vor, das für die Behandlung einer Erkrankung gedacht ist, bei der eine granulomatöse Immunreaktion gewünscht wird, wobei dies Erkrankungen sind, deren Ursache eine Infektion durch bakterielle Agenzien oder Krebserkrankungen sind.
Erfindungsgemäß kann man das Phosphatidylinositolmannosid (PIM) in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel verwenden.
Das verwendete Phosphatidylinositolmannosid kann durch chemische Synthese, zum Beispiel ausgehend von Inositolphosphat, durch Umsetzung mit einem Diacylglycerin und anschließende Mannosylierung gemäß bekannten Verfahren hergestellt werden. Die verwendeten PIM können ebenfalls durch Reinigung aus Zellwänden von Bakterien erhalten werden.
Die Reinigung von PIM aus den Zellwänden von Bakterien kann gemäß Standardtechniken erfolgen, die dem Fachmann bekannt sind. Vorzugsweise stammt das verwendete PIM aus Mycobakterien und lässt sich beispielsweise aus Mycobacterium tuberculosis erhalten.
Unter den PIM, die verwendet werden können, lassen sich diejenigen der Formel nennen:
worin:
– R₁, R₂, R₃, R₄ und R₅ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus einer Hydroxylgruppe und einer Gruppe (Man)_x,
wobei (Man)_x für mindestens eine an Inositol gebundene Mannosidgruppe steht, x die Anzahl der Mannosemotive ist (die miteinander linear verbunden sind) und vorzugsweise von 1 bis 6 variiert;
– R₆ oder R₇ unabhängig voneinander ein Fettsäurerest ist, der vorzugsweise 18 bis 24 Kohlenstoffatome trägt und vorzugsweise keine Doppelbindung enthält und vorzugsweise zudem keine polare Substitution enthält.
Bevorzugt sind R₁, R₂, R₃, R₄ und R₅ derart, dass nur zwei von ihnen, die vorzugsweise nebeneinander liegen, eine (Man)_x-Gruppe darstellen, wobei die drei übrigen Gruppen somit Hydroxylgruppen sind.
Vorzugsweise haben die verwendeten PIM die Formel (I), worin R₂ und R₃ (Man)_x-Gruppen sind und R₁, R₄ und R₅ OH-Gruppen sind.
Beispielsweise können PIM der Formel (I) verwendet werden, worin:
R₁, R₉ und R₅ OH-Gruppen sind;
R₂ eine Mannosidgruppe [(Man)_x, wobei x = 1] ist; und
R₂ (Man)_x ist, wobei x 1 bis 6 ist.
Es ist außerdem möglich, PIM zu verwenden, die so modifiziert sind, dass sie nicht zwei, sondern nur einen einzigen Fettsäurerest enthalten.
Erfindungsgemäß sind PIM bevorzugt, die 4, 5 oder 6 Mannosemotive tragen.
Die vorliegende Erfindung stellt zudem eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die mindestens eine durch ein PIM aktivierte NK-T-Zelle in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel umfasst.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben entdeckt, dass sich die durch ein PIM aktivierten NK-T-Zellen von NK-T-Zellen unterscheiden, die zum Beispiel durch ein Ceramid aktiviert werden. Die Aktivierung von NK-T-Zellen durch ein PIM ist tatsächlich relativ spezifisch und schließt eine oligoklonale Verteilung ein. Dagegen ist die Aktivierung von NK-T-Zellen beispielsweise durch ein Ceramid polyklonal und ruft keine intensive granulomatöse Antwort hervor.
Erfindungsgemäß kann die Aktivierung von NK-T-Zellen durch ein PIM in vivo oder ex vivo durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur ex-vivo-Aktivierung von NK-T-Zellen bereit, welches das ex-vivo-Zusammenbringen von NK-T-Zellen einer biologischen Probe mit mindestens einem Phosphatidylinositolmannosid (PIM) unter Bedingungen umfasst, die geeignet sind, dass das PIM die NK-T-Zellen aktiviert.
Die durch ein PIM ex vivo aktivierten NK-T-Zellen können somit einer Person verabreicht werden, die eine solche Behandlung benötigt. Diese Verwendung ermöglicht insbesondere die Injektion von aktivierten NK-T-Zellen an einer bestimmten Stelle der Person, an der eine granulomatöse Reaktion erwünscht ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Verwendung von mindestens einem Phosphatidylinositolmannosid (PIM) und/oder mindestens einer NK-T-Zelle, die durch ein PIM aktiviert worden ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, für die eine Immunreaktion des granulomatösen Typs gewünscht ist, wobei die Erkrankung aus den im folgenden beschriebenen Erkrankungen ausgewählt ist.
Unter "Behandlung" wird in der gesamten Erfindung ein heilendes, aber kein vorbeugendes therapeutisches Ziel verstanden.
Diese Erkrankung kann insbesondere eine Erkrankung sein, deren Ursache eine Infektion durch bakterielle Agenzien ist, zum Beispiel durch Mycobakterien, wie die für Lepra und Tuberkulose verantwortlichen Mycobakterien. Die PIM oder die durch PIM aktivierten NK-T-Zellen wirken durch die Stimulati on der lokalen Immunität und insbesondere der Schleimhautimmunität bei einer bakteriellen Infektion.
Die Verabreichungsweisen, die Posologien und die galenischen Formen von erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können auf übliche Weise durch den Fachmann insbesondere nach Kriterien bestimmt werden, die man allgemein fbeim Einsatz einer therapeutischen Behandlung berücksichtigt, die an einen Patienten angepasst ist, wie beispielsweise das Alter oder Körpergewicht des Patienten, die Schwere seines allgemeinen Zustands, das Vertragen der Behandlung usw.
Vorteilhafterweise kann eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung, die ein PIM oder durch ein PIM aktivierte NK-T-Zellen enthält, zum Beispiel auf intravenösem oder subkutanem Weg verabreicht werden.
Das erfindungsgemäße Medikament kann insbesondere zur Behandlung von Krebserkrankungen nützlich sein, wie beispielsweise Melanomen, die bekanntlich bei intensiven granulomatösen Antworten zurückgehen. In diesem Fall werden die PIM oder die durch PIM aktivierten NK-T-Zellen vorteilhafterweise als Adjuvantien zu bekannten Antitumormitteln verwendet.
Die folgenden Beispiele und Figuren veranschaulichen die Erfindung, ohne den Umfang der Erfindung zu beschränken.
FIGURLEGENDE
Die 1A stellt mit Hämatoxylin/Eosin gefärbte Schnitte einer granulomatösen Struktur dar, die durch Injektion von deproteinierten Mycobakterien-Zellwänden verursacht wurde. C57BL/6-Mäusen wurde auf subkutanem Weg das Äquivalent von 10⁶ deproteinierten Mycobakterien-Zellwänden injiziert. Am Tag 7 nach der Infektion wurden die granulomatösen Strukturen, die sich entwickelt hatten, herausgeschnitten, in 4%igem gepuffertem Formalin fixiert, mit Paraffin bedeckt und geschnitten. Die verwendeten Vergrößerungen sind 2,5 (a), 6,3 (b) bzw. 40 (c). Der Balken entspricht 1 mm.
Die 1B stellt die Immunoscope-Analyse (Spectratyping) von Vαl4-Ca- (linke Spalte) und Vαl4-Jα281-Profilen (rechte Spalte) dar, die sieben Tage nach Injektion von PBS oder deproteinisierten Mycobakterien-Zellwänden in C57BKL/6-Mäuse beobachtet wurden:
a und b: Lymphknoten von Mäusen, in die PBS injiziert wurde;
c und d: Lymphknoten von Mäusen, die mit deproteinisierten Mycobakterien-Zellwänden immunisiert wurden;
e und f: Haut und Muskel, die an der Stelle der Injektion von PBS aus den Kontrollmäusen entnommen wurden;
g und h: Struktur des granulomatösen Typs am Tag 7, die durch Injektion von deproteinisierten Mycobakterien-Zellwänden hervorgerufen wurde;
i und j: Zellinfiltration am Tag 3.
Abszisse: Länge der CDR3-Region in Aminosäuren
Ordinate: relative Fluoreszenzintensität.
Die 2 zeigt, dass die Entwicklung einer granulomatösen Struktur von recht beträchtlicher Größe von der Rekrutierung von NK-T-Zellen abhängt.
Die 2A stellt gefärbte Schnitte der Injektionsstelle 7 Tage nach Injektion von deproteinisierten Zellwänden in Mäuse Jα281 –/– (Vergrößerungen: a 2,5, b 6,3, c 40 und d, Öl, 100), Jα281 +/– (e 2,5, f 6,3 und g 40) und C57BL/6 MHC-Klasse II –/– (h 2, 5, i 6, 3 und j 40) dar. Der Balken entspricht 1 mm.
Die 2B zeigt die Verwendung von Vα14 und Vαl4-Jα281 an der Injektionsstelle (linke Spalten) und in den Lymphknoten (rechte Spalten) in Jα281 –/– (a bis d), Jα281 +/– (e bis h) und C57BL/6 MHC-Klasse II –/– (i bis 1). Die Ordinaten sind identisch zu 1.
Die 3 stellt die relativen Mengen an Vαl4- und Jα281-RNA nach Immunisierung mit Alu-Gel-S (Aluminiumhydroxid) (0,25 mg), MDP (40 μg), rohen Mycobakterien-Lipiden und ausgehend von diesen erhaltenen Fraktionen dar. Das in etwa 10⁶ Bakterien enthaltene Material wurde nach Adsorption an Alu-Gel-S injiziert. Die Ergebnisse (ausgedrückt als Verhältnis von PCR-Fluoreszenz unter Verwendung von Vαl4-Jα281-Primern/PCR-Fluoreszenz-Signal unter Verwendung von Primern für Hypoxanthinribosyltransferase (HPRT)) entsprechen dem Mittelwert der aus zwei Tieren gewonnenen Ergebnisse.
Die 4 stellt die FACS-Analyse von Zellen dar, die an der Stelle der subkutanen Injektion von Alu-Gel-S/mycobakteriellen Lipiden in C57BL/6-Mäuse gewonnen wurden. Diesen Experimenten zufolge variiert die Häufigkeit von NK-T-Zellen von 1,7 bis 3,6% der insgesamt nach Ficoll-Fraktionierung gewonnenen Zellen. Die gestrichelte Linie auf dem Histogramm entspricht nicht gefärbten Zellen.
Die 5 stellt die semiquantitative Analyse des Repertoires der TCRβ-Kette von NK-T-Zellen dar, die aus der Leber von Kontrollmäusen isoliert wurden (schraffierte Spalten) oder durch PIM_4–6 (gepunktete Spalten) und T-Zellen der Lymphknoten(offene Spalten) rekrutiert wurden, die hier als interne Kontrolle für die Wirksamkeit der Primer verwendet wurden: Der Wert 1 wird willkürlich der Fläche des höchsten Peaks im Gauss-Profil, das ausgehend von den T-Zellen der Lymphknoten erhalten wird, zugewiesen. Nur die am stärksten in den Strukturen des granulomatösen Typs repräsentierten Vβ-Cβ-Familien wurden mittels semiquantitativer PCR-Analyse untersucht. Vβ6, das in granulomatösen Strukturen fehlt, diente als negative Kontrolle.
BEISPIELE MATERIALIEN UND VERFAHREN
Tiere
Die verwendeten Tiere sind: C57BL/6-Mäuse; C57BL/6-Mäuse MHC-Klasse II –/– (Cosgrove et al., 1991); C57BL/6-Mäuse β2m –/– (Koller et al., 1990); Jα281 –/– Mäuse (Cui et al., 1997) und Jα281 +/– Mäuse wurden zum Zeitpunkt des Experiments 9- bzw. 6mal aus 129/Sv- im genetischen Hintergrund von C57BL/6 rückgekreuzt.
Quellen von Bakterien und Extrakten:
Auf einem halbfesten Medium wurden Mycobacterium tuberculosis-Bakterien (Stamm H37Rv) gezüchtet und anschließend durch Hitze (75°C, 30 Minuten) abgetötet. Nach Ultraschallbehandlung in 10^–2 M Tris, pH 8, 0, 10^–3 M MgCl₂, 10^–3 M CaCl₂, 1,5 × 10^–1 M NaCl wurden die Mycobakterien für 5 Stunden bei 37°C mit 25 mg/ml DNAse und RNAse verdaut. Auf den Verdau folgte eine Inaktivierung durch Hitze. Nach mehreren Waschschritten wurde die Präparation für 24 Stunden bei 37°C mit einem Gemisch aus Trypsin, Chymotrypsin und Subtilisin (Boehringer) in einer Endkonzentration von 200 μg/ml für jedes Enzym im gleichen Puffer, wie vorstehend beschrieben, der zusätzlich 0,5% SDS enthielt, inkubiert. Die Enzyme wurden durch Hitze (10 Minuten bei 70°C) inaktiviert. Die so erhaltenen Teilchen wurden gewaschen und in Phosphatpuffer (PBS) resuspendiert. Anschließend wurde das Fehlen von Proteinen in der Suspension durch Elektrophorese auf PAGE und Aminosäureanalyse bestimmt. Proben wurden bezogen auf ihren Zuckergehalt standardisiert.
Die mycobakteriellen Lipide wurden extrahiert und wie folgt fraktioniert: 4 g durch Hitze abgetötete M. tuberculosis-H37Rv-Bakterien wurden zweimal mit CHCl₃/CH₃OH (1 : 1 Vol./Vol.) extrahiert. Die Extrakte wurden getrocknet, in CHCl₃/H₂O resuspendiert und eine Stunden bei 4°C belassen, bis sie sich in eine organische Phase von rohen Lipiden (Fraktion I) und eine wässrige Phase (einschließlich der Grenzschicht: LAM, Polysaccharide und denaturierte Proteine) (Fraktion II) auftrennten. Die Fraktion I ist beim Menschen verarmt an Phosphoantigenen für die γ/δ-T-Zellen (Constant et al., 1994), umfasst aber zahlreiche Glycolipid-Bestandteile. Diese Fraktion wurde getrocknet und von neuem mittels Fällung in kaltem Aceton (10°C) aufgetrennt, sodass ein löslicher Extrakt (Fett, phenolische Glycolipide) und ein unlöslicher weißer Niederschlag erhalten wurden. Warmes Aceton (50–60°C) wurde zum wachsartigen Rückstand gegeben, wodurch sich die durch eine Trehalose substituierten Mycolsäureantigene und die anderen Glycolipide (Fraktion III) lösen ließen und die Gesamtheit der PIM und Lipooligosaccharide (LOS) (Fraktion IV) ausgefällt werden konnte. Die Fraktion IV wurde getrocknet und mittels Solubilisierung in Methanol aufgetrennt, wodurch PIM (weißer Rückstand, Fraktion V) und lösliche LOS (Fraktion VI) erhalten wurden. Durch Kühlen der Fraktion III wurden einige polare PIM ausgefällt und lieferten die Fraktion VII. Alle Fraktionen wurden mittels Dünnschichtchromatographie (DC) auf Kieselsäure pF254 (Merck) analysiert, die mit CHCl₃/CH₃OH/H₂O 60/35/5 eluiert wurde, wobei M. tuberculosis-PIM2 als Standard verwendet wurde. Die Flecken wurden unter Verwendung eines Anthron-Schwefel-Sprays sichtbar gemacht.
PCR-Primer:
Spezifische Primer für Vβ mit Ausnahme von Vβ8.2 (Regnault et al., 1996) wurden von Pannetier et al., 1993 beschrieben. Das für die PCR verwendete nicht-markierte Cβspezifische Fragment ist GCCCATGGAACTGCACTTGGC. Das markierte Cβ-spezifische Fragment ist FAM-CTTGGGTGGAGTCACATTTCTC. Für die RNA für Vα14-Ketten wurden die folgenden Primer einge setzt: das Vα14-Fragment war CTAAGCACAGCACGCTGCACA; das nicht-markierte Ca-Fragment war TGGCGTTGGTCTCTTTGAAG. Der markierte Ca-spezifische Primer war FAM-ACACRGCAGGTTCTGGGTTC.
Der nicht-markiert Jα281-spezifische Primer war CAGGTATGA-CAATCAGCTGAGTCC. Das markiert Jα281-spezifische Fragment war FAM-CAGCTGAGTCCCAGCTCC. Der markierte spezifische klonotypische Primer war FAM-GCTGAACCTCTATCNCCCACC. Die Primer für CD4 waren das Fragment 5'-CTGAATTCGGCGCTTGCTGCTGC, das Fragment 3'-CACAAGCTTAAGTCTGAGAGTCTTCC und FAM-TGCTGATTCCCCTTCCTTCC. Die CD8-spezifischen Primer waren: das Fragment 5'-TAGAATCC-TAGCTTGACCTAAG, das Fragment 3'-ATGGATCCATATAGACAACGAAGG und FAM-GGATAATCGACTCACCC. Die Primer für HPRT waren FAM-TTCTTTCCAGTTAAAGTTG, das Fragment 5'-GTAATGATCAGTCAACGGGGGAC und das Fragment 3'-CCAGCAAGCTTGCAACCTTAACCA. Die Primer für CD3 waren: das Fragment 5'-GCCTCAGAAGCATGATAAGC und 3'-FAM-CCCAGAGTGATACAGATGTC. Die Primer für die schweren Ketten von IgM waren: FAM-TTCAGTGTTGTTCTGGTAG, das Fragment 3'-CTGGATCC-GGCACATGCAGATCTC, das Fragment 5'-RGTCCTTCCCAAATGTCTTCCC. Die nicht markierten Vγ1-, Cγ-, Vδ2-, Vδ4-, Vδ5, Vδ6- und Cδ-spezifischen Primer wurden in Azuara et al., 1997 beschrieben. Die Vδ1- und Vδ6P-spezifschen Primer waren ATTCAGRAGG-CAACAATGAAAG bzw. CTGTAGTCTTCCAGAAATCAC. Der markierte Cδ-spezifische Primer war FAM-TTTCACCAGACAAGCAACA. Die Vγ2- und Vγ7-spezifischen Primer waren CGGCAAAAAACAAATCAACA bzw. CTA-TAACTTCGTCAGTTCCAC. Der markierte für die Vγ1- und Vγ2-Segmente spezifische Vγ-Primer war FAM-CCTCCTAAGGGTCGTTGATT, und der markierte Vγ7-spezifische Primer war FAM-CTTGTCCGGG-CCTTCRT.
Halbautmatisierte Analyse der Diversität von T-Lymphozyten ( "Immunoscope")
Die von den Autoren der vorliegenden Erfindung verwendete, auf PCR basierende Technik ist in Pannetier et al., 1997; Cibotti et al., 1994; Levraud et al., 1996 beschrieben. Kurz gesagt wurde Gesamt-RNA aus Proben extrahiert, und 10 μg Gesamt-RNA wurden einer reversen Transkription unter Verwendung von reverser Transkriptase aus AMV (Vogel-Myeloblastose-Virus) unterworfen. Die erhaltene cDNA wurde in einem Endvolumen von 100 μl resuspendiert.
Die Qualität und Quantität der cDNA wurde mittels HPRTmRNA-Analyse kontrolliert. Es wurde 1 μl in 40 PCR-Zyklen (1 min 94°C; 1 min 60°C; 4 min 72°C) amplifiziert, wobei entweder die Vα14- und Cα-spezifischen Primer oder jeder der Vβ- und Cβ-spezifischen Primer verwendet wurden. Es wurden 2 μl der PCR-Produkte in Verlängerungsreaktionen ausgehend von den Primern (5 Zyklen) eingesetzt, wobei für die Segmente Jα281 oder Ca spezifische fluoreszierende Primer eingesetzt wurden. Die Länge der CDR3-Region und die Fluoreszenzintensität jeder Familie von Verlängerungsprodukten wurden mit einer automatischen Sequenziervorrichtung (Applied Biosystems) bestimmt. Die Verteilung der Größe der CDR3-Region für jedes V-C-Paar ist als eine Familie von Peaks beschrieben, die durch 3 Nukleotide getrennt sind (die von der mRNA im gleichen Leserahmen stammen) und deren Fläche proportional zur Fluoreszenzintensität und somit zur ursprünglichen cDNA-Menge ist. In Abwesenheit einer Stimulation durch ein spezifisches Antigen wurden 6 bis 8 Peaks mit einer Gauss-Verteilung beobachtet. Eine Antwort von T-Lymphozyten, die durch ein Antigen induziert wird, führt dagegen üblicherweise zu einer nicht gaussförmigen Verteilung der Peaks aufgrund einer selektiven Proliferation von Zellen, die bestimmte besondere V-C-Kombinationen besitzen. Eine semiquantitative PCR wurde durchge führt, wobei ein Verfahren angewendet wurde, das aus dem in Azuara et al., 1997 beschriebenen und durch Standardisierung auf der Basis von CD3ε-RNA adaptiert wurde. 10000 Mäuse-T-Lymphozyten waren zur Durchführung einer semiquantitativen PCR-Analyse des vollständigen Vβ-Cβ-Repertoirs mittels PCR unter Verwendung der Immunoscope-Technik ausreichend.
Antikörper und Analyse mittels FACS:
Zellen: Zellen von Granulomen wurden präpariert, indem die zerkleinerten Granulome über ein Nylon-Zellenfilter (70 um) ("strainer", Becton-Dickinson) geleitet und einmal in Phosphatpuffer (PBS) gewaschen wurden. Die lebensfähigen Zellen wurden mittels Ficoll-Fraktionierung (Lymphocyte-M, Cedar Lane, Hornby, Ontario) abgetrennt. Die Leber-Leukozyten wurden mit einem diskontinuierlichen Percoll-Gradienten gewonnen.
Antikörper: Der biotinylierte Anti-Vαl4-Antikörper-Klon CMS-5 ist zuvor beschrieben worden (Masuda et al., 1997). Die folgenden Antikörper wurden über Pharmingen (San Diego, CA) bezogen: PE-NK.1 (Klon PK136) oder biotinylierter TCRβ (Klon H 57–597), FITC-CD4 (Klon RM4-5), FITC-CD44 (Klon IM7), biotinylierter CD45.2 (Klon 104), PE-B220 (Klon RA3-6B2), FITC-CD19 (Klon 1D3), FITC-CD8 (Klon CT-CD8a), Der Antikörper FITC-CD8 (Klon CT-CD8a) wurde über CALTAG (San Francisco, CA) bezogen. PE-Streptavidin wurden über Pharmingen bezogen, und APC-Streptavidin wurde von Molecular Probes erworben. Die ormalen biotinylierten, FITC- und PE- (Phycoerythrin-) Ig der Maus, die als negative Kontrollen eingesetzt wurden, wurden bei Pharmingen erworben.
Analyse mittels FACS: Vor der Anfärbung mit spezifischen Antikörpern wurden die Zellen mit Mäuseserum inkubiert, um die unspezifische Färbung zu blockieren. Verschiedene Kombinationen von Antikörpern wurden anschließend zugegeben. Die abgestorbenen Zellen wurden mittels Propidiumiodidfärbung unterschieden. Lymphzellen wurden auf FCS und SSC selektiert. Mindestens 100000 Ereignisse wurden im Lymphozytenfenster gezählt. Eine Vierfarbenanalyse wurden unter Verwendung eines FACS-Vantage (Becton-Dickinson) durchgeführt, und eine Dreifarbenanalyse wurden unter Verwendung eines FACS-Scan (Becton-Dickinson) durchgeführt. Die Daten wurden unter Verwendung des Cell-Quest-Programms (Becton-Dickinson) aufgenommen. Die Leber-NK-T-Zellen wurden nach Markieren mit Anti-NK1.1-und Anti-TCRβ-Antikörpern unter Verwendung eines FACStar⁺-Zellsorters von Becton-Dickinson sortiert.
ERGEBNISSE
1. Die Injektion von deproteinisierten Maycobakterien-Zellwänden führt zur Bildung von Läsionen des granulomatösen Typs
Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben vor allem untersucht, ob die Mäuse-NK-T-Zellen an der Injektionsstelle von deproteinisierten Mycobakterien-Zellwänden, die reich an Glycolipiden sind, nachgewiesen werden können.
Zu diesem Zweck wurde die Suspension von deproteinisierten Mycobakterien-Zellwänden in PB5, entsprechend etwa 10⁶ virulenten Mycobacterium tuberculosis-Bakterien, Stamm H37rv, subkutan an der Schwanzbasis von C5.7BL/6-Mäusen injiziert. Die Tiere, in die PBS injiziert worden war, wurden an den Tagen 1, 2, 3 und 7 nach der Immunisierung getötet, und kein Anzeichen für einen Entzündungsvorgang wurden an der PBS-Injektionsstelle beobachtet. Bei den immunisierten Mäusen wurden vorwiegend Neutrophile auf Quetschpräparaten beobachtet, die ausgehend von an den Tagen 1 und 2 gewonnenen Zellinfiltraten hergestellt wurden. Lymphozyten und Makrophagen wurden am Tag 3 nachgewiesen, und später entwickelten sich an der Haut und den Muskeln haftende Läsionen. Sie vergrößerten sich mit der Zeit und erreichten am Tag 7 einen Durchmesser von 4–6 mm. Eine histologische Analyse wurde an den induzierten Läsionen am Tag 7 vorgenommen. Gefärbte Schnitte zeigten Läsionen des granulomatösen Typs mit einem an Neutrophilen reichen Kern, umgeben von einem Rand aus einer dichten Reihe von Makrophagen, Lymphozyten und Fibroblasten (1).
2. NK-T-Zellen sind die einzigen Vα14⁺-T-Zellen, die die granulomatösen Läsionen infiltrieren
Die granulomatösen Strukturen ließen sich am Tag 7 weder auf manuelle Weise noch durch enzymatischen Verdau in Suspensionen einzelner lebensfähiger Zellen trennen, was eine FACS-Analyse verhinderte. Eine auf RT-PCR basierende Technik (Immunoscope^®) wurde statt dessen eingesetzt, um die mRNAs zu untersuchen, die für spezifische Marker von NK-T-Zellen codieren. Weil eine nahezu Invariante Vαl4-Jα281-TCR-Kette mit einer CDR3 von 10 Aminosäuren Länge das Kennzeichen für Mäuse-NK-T-Zellen ist (Lantz et al., 1994), wurden die für Vαl4 codierenden cDNAs, die aus Kontroll- und experimentellen Proben präpariert wurden, mittels PCR amplifiziert und bezüglich der Diversität in der CDR3-Länge mittels Verlängerung von Primern analysiert, wobei entweder spezifische Cα-Primer oder spezifische Jα281-Primer verwendet wurden. Die Cαspezifischen Primer erzeugten Signale, die für die Diversität der Vαl4⁺-α-Ketten der Proben repräsentativ waren. Mehrere Peaks wurden in den Lymphknoten nachgewiesen, die bei Kontroll- und immunisierten Mäusen von der Injektionsstelle ableiteten (1B, a und c). Die allgemeine Gauss-Verteilung der CDR3-Größe war durch einen vorherrschenden Peak verändert, der einer CDR3-Länge von 10 Aminosäuren entsprach und Vα14-Jα281-umgelagerte TCR-α-Ketten enthielt (1B, b und d) und somit NK-T-Zellen einschloss. Kein Signal wurde in der Haut und in den Muskeln nachgewiesen, die an der Stelle der Injektion von PBS entnommen wurden (1B, e und f). Dagegen führten die cDNAs, die für Vα15 codierten und aus granulomatösen Strukturen am Tag 7 präpariert wurden, unter Verwendung von entweder Jα-spezifischen Primern oder Cαspezifischen Primern zu einem einzigen Peak mit einer CDR3-Größe von 10 Aminosäuren (1B, g und h). Die direkte Sequenzierung von Produkten einer Vαl4-Cα-PCR, die ausgehend von diesen Läsionen durchgeführt wurde, ermöglichte die Identifizierung von für NK-T-Zellen spezifischen TCR-α-Ketten. Die vier das Codon 31 betreffenden Nukleotidsubstitutionen führten zu der Diversität der Vα14-Jα281-Ketten, die in den infiltrierenden T-Zellen vorlagen. Somit sind im Gegensatz zu den Zellen der Lymphknoten, die viele herkömmliche Vα14⁺-T-Zellen enthalten, alle Vαl4⁺-Zellen, die in den Strukturen des granulomatösen Typs am Tag 7 rekrutiert werden, NK-T-Zellen. Ein einziger Vα14-Cα-Peak mit einer CDR3 von 10 Aminosäuren Länge, der das Jα281-Segment enthielt, wurde am Tag 3 nach der Injektion nachgewiesen (1B, i und j) und im Folgenden unter Verwendung einer klonotypischen Sonde als spezifisch für NK-T-Zellen identifiziert.
Folglich werden die NK-T-Zellen auf sehr frühen Stufen der Zellinfiltration rekrutiert, die durch Injektion von deproteinisierten Mycobakterien-Zellwänden hervorgerufen wird, und stellen die einzigen Vαl4-T-Zellen dar, die am Tag 7 in den Läsionen vorhanden sind.
Die Verwendung der gleichen RT-PCR-Technik ermöglichte es den Autoren der vorliegenden Erfindung, umgelagerte β-Ketten unter Verwendung der Segmente Vβ8.l, 7, 3, 5,2, 10 nachzuweisen. Nur seltene herkömmliche CD4⁺-α/β-T-Zellen können die Läsionen des granulomatösen Typs infiltrieren, weil keine für CD8 codierende mRNA und wenig für CD4 codierende mRNA unter Verwendung der entsprechenden Primer nachgewiesen werden konnte. Schließlich zeigen die Ergebnisse der PCR-Analyse unter Verwendung von spezifischen Primern für Igμ und TCR-γ/δ das Vorliegen signifikanter Anzahlen von B-Zellen und γ/δ-T-Zellen, wobei insbesondere die Primer Vδ5 und Vδ6 eingesetzt wurden.
3. Beteiligung von α/β-T-Zellen an der granulomatösen Reaktion auf deproteinisierte Mycobakterien-Zellwände
Die granulomatösen Antworten sind das Ergebnis eines multizellulären Vorgangs mit mehreren Stufen. Zur Bestimmung der möglichen Beteiligung von α/β-T-Zellen am granulomatösen Vorgang haben die Autoren der vorliegenden Erfindung Mäuse immunisiert, die in mehreren T-Zell-Untergruppen genetisch defizient waren.
Es wurden deproteinisierte Mycobakterien-Zellwände in Jα281 –/– Mäuse (Cui et al., 1997) injiziert, die eine Defizienz der NK-T-Zellen aufwiesen, in denen sich aber die herkömmlichen T-Zellen und die NK-Zellen normal entwickelten. In 5 der 7 Mäuse, die einer Injektion unterworfen wurden, wurde an der Injektionsstelle keine Läsion des granulomatösen Typs, sondern stattdessen eine kleines flaches Infiltrat beobachtet. Bei den beiden anderen Mäusen entwickelte sich ein kleines strukturiertes Zellinfiltrat, das fast ausschließlich aus Makrophagen bestand (2A, a bis d). In keinem der Infiltrate wurde für Vα14 codierende mRNA (2B, a und b) noch VβCβ-Umlagerung gefunden. Ein Gauss-Profil für Vαl4-Ca wurde aus Lymphknoten bei den immunisierten Jα281 –/– Mäusen erhalten, was eine normale Verwendung des Vα14-Segments durch die herkömmlichen T-Zellen in Abwesenheit von NK-T-Zellen anzeigt (2B, c und d).
Der RT-PCR-Analyse zufolge wurde keine μ-Kette nachgewiesen, und es wurden umgelagerte TCR-γ-Ketten wurden gefunden. Als Kontrolle ergaben die sechs Jα281 +/– Mäuse, in die deproteinisierte Mycobakterien-Zellwände injiziert worden waren, die gleichen Ergebnisse wie die C57BL/6 +/+ Mäuse ( 2A, e bis g; 2B, e bis h). Die Bildung einer ausreichend großen Läsion des granulomatösen Typs erfordert somit das Vorliegen von NK-T-Zellen.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben anschließend die mögliche Beteiligung herkömmlicher CD4⁺-T-Zellen untersucht. Bei den MHC II –/– Mäusen, die eine Defizienz in herkömmlichen CD4⁺-T-Zellen aufweisen, in denen sich aber die NK-T-Zellen normal differenzieren, führte die Injektion von deproteinisierten Mycobakterien-Zellwänden zur Entwicklung von Läsionen des granulomatösen Typs wie bei den C57BL/6 +/+ Tieren (2A, h bis j). Der Immunoscope-Analyse von Proben zufolge war die Invariante Vαl5-Jα281-TCR-α-Kette die einzige nachgewiesene Vα14-Kette (2B, i und j). Die Vα14-Cα- und Vαl4-Jα281-Profile in den Lymphknoten von Klasse II –/– Mäusen sind die gleichen wie bei den C57BL/6 +/+ Tieren (2B, k und l). Außerdem zeigte das TCR-β-Repertoire von Zellen, die in den Läsionen von MHC II –/– Zellen am Tag 7 vorliegen, die gleiche Selektivität bei der Vβ-Verwendung wie bei den C57BL/6 +/+ Mäusen. Außerdem wurden die mRNAs, die für die μ-Kette von Ig und für die TCR-γ/δ-Ketten codieren, wie bei den C57BL/6 +/+ Mäusen nachgewiesen.
Die verschiedenen Zelltypen in den Läsionen des granulomatösen Typs, die durch deproteinisierte Mycobakterien-Zellwände induziert werden, lagern sich folglich in Abwesenheit von CD4⁺-T-Zellen zu einer hochorganisierten Struktur zusammen, organisieren sich aber nicht in Abwesenheit von NK-T-Zellen.
Das Fehlen der für CD8 codierenden mRNA schließt eine Hauptrolle für die herkömmlichen CD8⁺-T-Zellen aus. Die Rolle von CD1-Molekülen im granulomatösen Prozess wurde unter Verwendung von β2m –/– Mäusen getestet, die keine von CD1 abhängigen NK-T-Zellen besitzen. Es entwickelten sich große granulomatöse Läsionen. Ihr Gehalt an Lymphozyten unterschied sich jedoch auf deutliche Weise von dem in den granulomatösen Strukturen, die bei C57BL/6 +/+ Mäusen induziert wurden, beobachteten: laut RT-PCR und Immunoscope-Analyse waren die mRNAs, die für die TCR-β- und TCR-Vαl4⁺-Ketten, CD4, CD8 und die μ-Ketten von IgM codierten, nicht nachweisbar. Dagegen waren die für die γ/δ-Ketten des TCR codierenden mRNAs wie bei den C57BL/6 +/+ Mäusen vorhanden.
Die phänotypischen Änderungen aufgrund der Veränderung des β2m-Gens verhindern somit die Akkumulation von B-Lymphozyten und α/β-T-Zellen in den Läsionen, die durch deproteinisierte Mycobakterien-Zellwände hervorgerufen werden, und verhindern außerdem die Akkumulation von seltenen NK-T-Zellen in den Läsionen, die in den Lymphknoten der gleichen Tieren unter Verwendung einer klonotypischen Sonde nachgewiesen werden.
4. Die Aktivität der Rekrutierung von NK-T-Zellen steht in Verbindung mit mycobakteriellen Glycolipiden, insbesondere mit PIM
Um die Nicht-Peptid-Bestandteile von Mycobakterien zu identifizieren, die für die Akkumulation von NK-T-Zellen verantwortlich sind, wurde das Material fraktioniert, und die Aktivität der Rekrutierung von NK-T-Zellen von verschiedenen Fraktionen wurden in vivo untersucht. Die relativen Mengen an NK-T-Zellen, die am Tag 7 an der Injektionsstelle vorlagen, wurden mittels RT-PCR und Immunoscope-Analyse bestimmt. Um mögliche Unterschiede im in-vivo-Verhalten der injizierten Moleküle zu vermeiden (zum Beispiel Unterschiede im diffusionsfähigen Anteil oder beim spezifischen Aufnahmevorgang) wurde das injizierte Material mit einem neutralen Alumniumhydroxid-Vehikel (Alu-Gel-S, Serva) konjugiert. Die C57BL/6 +/+ Mäuse, in die subkutan 0,25 mg Alu-Gel-S in Form von Teilchen injiziert wurde, entwickelten ein schwaches Infiltrat mit kaum nachweisbarer Vαl4-Jα281-mRNA (3).
Die rohen Lipide von H37rv-Zellfraktionen (Fraktion I), die an Alu-Gel-S adsorbiert waren, erzeugten große organisierte Zellinfiltrate mit einem Kern, der aus dem Vehikel und Neutrophilen gebildet wurde und von einem dicken Rand aus Makrophagen und Lymphozyten umgeben war. Die Bildung dieser Strukturen erwies sich ebenfalls als anhängig vom Vorliegen von NK-T-Zellen, weil sie sich nicht bei Jα281 –/– Mäusen bildeten. Jedoch und im Gegensatz zu den Strukturen, die durch die deproteinisierten Mycobakterien-Zellwänden induziert wurden, konnten die organisierten Zellinfiltrate, die durch die rohen Glycolipide induziert wurden, in einzelne lebensfähige Zellen dissoziiert werden, sodass die direkte Identifizierung von NK-T-Zellen in den Infiltraten mittels FACS-Analyse möglich war. Die toten Zellen und die Makrophagen wurden mittels Ficoll-Fraktionierung beseitigt. Der Großteil von 2 × 10⁶ lebensfähigen Zellen, die aus einem solchen Granulom gewonnen wurden, wurden als Neutrophile identifiziert. Die 4 zeigt, dass alle anderen Zellen CD45⁺-Leukozyten waren. Keine CD19⁺B220⁺-B-Zelle wurde gefunden. Alle α/β-T-Lymphozyten waren Vα14⁺, β^int (mittlere Expression) und NK1.1⁺, d. h. NK1.1⁺-T-Zellen. Keine CD8⁺-Zelle und seltene CD4⁺-Zellen wurden nachgewiesen. Etwa 0,3% waren Nicht-T-NK-Zellen, und etwa 0,1% waren γ/δ-T-Zellen. Die Analysen mittels RT-PCR und Immunoscope bestätigten das Fehlen von B-Zellen und das Vorliegen von umgelagerten TCR-γ/δ-Ketten in den Infiltraten, die durch Injektion von Fraktion I hervorgerufen wurden. Nahezu alle T-Zellen, die die durch rohe Lipide verursachten Läsionen infiltrierten, waren somit CD4^–CD8^–-NK-T-Zellen. Gemäß RT-PCR-Analyse erwies sich, dass das durch Fraktion I induzierte Infiltrat bis zu 200fach mehr Vα14-Jα281-mRNA enthielt als die Zellen, die an der Injektionsstelle von Alu-Gel-S rekrutiert wurden (3). Obwohl sie beim Menschen γ/δ-T-Zellen aktivieren kann (Constant et al., 1994), war die Nicht-Lipid-Fraktion (Fraktion II) unwirksam bei der Rekrutierung von NK-T-Zellen (3). Das Immunadjuvans Muramyldipeptid (MDP, Sigma), ein Bestandteil mycobakterieller Zellwände, führte zu einem Zellinfiltrat ohne Erhöhung der Vαl4-Jα281-mRNA verglichen mit Alu-Gel-S allein (3). Die Fraktion I wurde fraktioniert und die Aktivität der Rekrutierung von NK-T-Zellen von Fraktionen mittels RT-PCR untersucht. Fast die gesamte Aktivität wurde in den Fraktionen nachgewiesen, die PIM enthielten (Fraktionen III, IV, V und VII) (3), und die Fläche des Vαl4-Jα281-Peaks war proportional zur Menge an injiziertem Material. Gemäß der Analyse wirksamer Fraktionen mittels DC durch "Flash LC^®" (Merck) mit einem "Kieselgel G60 Silicagel"-Gel waren die zur Rekrutierung von NK-T-Zellen wirksamten Fraktionen diejenigen, die stark polare PIM enthielten, deren Struktur gemäß Massenspektrometrieanalyse mit PIM übereinstimmt, die 4 bis 6 Mannosemotive enthalten.
Um zu bestimmen, ob sich die NK-T-Zellen zufällig in den Infiltraten anhäufen, die durch PIM 4–6 induziert werden, wurde eine von Immunoscope hergeleitete, semiquantitative PCR-Technik eingesetzt, um ihr TCRβ-Repertoire zu bestimmen und mit dem Repertoire von Leber-NK-T-Zellen zu vergleichen, die als repräsentativ für periphere NK-T-Zellen (Watanabe et al., 1995) zufällig ausgewählt wurden (5). Es wurde bestätigt, dass die Leber-NK-T-Zellen im Vergleich zu herkömmlichen T-Zellen eine gegenüber Vβ8 und Vβ7 eingeschränkte Vβ-Verwendung aufweisen. Jede Familie von Vβ-Cβ-Umlagerungen zeigt eine Gauss-Verteilung der CDR3-Länge, was auf ein polyklonales und diversifiziertes TCR-β-Repertoire hindeutet.
Dagegen zeigen die NK-T-Zellen, die in dem durch Injektion von PIM 4–6 induzierten Infiltrat vorliegen, eine auf andere Weise eingeschränkte Vβ-Verwendung (5). Außerdem zeigten die Umlagerungen, die mit einer gegebenen CDR3-Länge einhergehen (wie die Vβ8.1-Cβ-Umlagerungen mit einer CDR3-Länge von 9 Aminosäuren, wie in der 5), die man verglichen mit der in den Kontrollen beobachteten Gauss-Verteilung in einem hohen Überschuss findet, eine oligoklonale Verteilung von NK-T-Zellen in den Infiltraten. Die gleiche Einschränkung in der Vβ-Verwendung, die mit oligoklonalen Verteilungen in Verbindung steht, wurden bei allen untersuchten Mäusen beobachtet, aber die Länge der CDR3-Regionen variierte in Abhängigkeit von den Tieren.
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Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mindestens eine NK-T-Zelle ("Natürliche Killer"-T-Lymphocyte), die durch ein Phosphatidylinositolmannosid (PIM) aktiviert wird, in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das PIM aus Mycobakterien stammt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das PIM 4, 5 oder 6 Mannose-Motive trägt.
Verfahren zur ex vivo-Aktivierung von NK-T-Zellen, umfassend das ex vivo-Zusammenbringen von NK-T-Zellen aus einer biologischen Probe mit mindestens einem Phosphatidylinositolmannosid (PIM) unter Bedingungen, die geeignet sind, dass das PIM die NK-T-Zellen aktiviert.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das PIM aus Mycobakterien stammt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5, wobei das PIM 4, 5 oder 6 Mannose-Motive trägt.
Verwendung von mindestens einem Phosphatidylinositolmannosid (PIM) und/oder mindestens einer NK-T-Zelle, die durch ein PIM aktiviert wird, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, deren Ursache eine Infektion durch bakterielle Agenzien, zum Beispiel Mycobakterien, ist.
Verwendung von mindestens einem Phosphatidylinositolmannosid (PIM) und/oder mindestens einer NK-T-Zelle, die durch ein PIM aktiviert wird, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Krebses.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Erkrankung ein Melanom ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei das PIM aus Mycobakterien stammt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei das PIM 4, 5 oder 6 Mannose-Motive trägt.