JP2003502284A - Ｐｉｍ−活性化ｎｋｔ細胞を含む医薬組成物、およびその治療における使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、少なくとも一つのＰＩＭ−活性化ＮＫＴ細胞を含む医薬組成物、および肉芽腫タイプの免疫反応が必要とされる疾患治療用の、少なくとも一つのＰＩＭおよび／またはＰＩＭ−活性化ＮＫＴ細胞の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、肉芽腫タイプの免疫反応が必要とされる疾患の治療用の、少なくと
も一つのＰＩＭ、および／または少なくとも一つのＰＩＭ−活性化ＮＫＴ細胞の
使用に関する。

【０００２】 ＮＫＴ細胞は、ＮＫ１．１（Ｂｅｎｄｅｌａｃ ｅｔ ａｌ．，１９９５）お
よびＬｙ−４９系のある種のメンバー（Ｏｒｔａｌｄｏ ｅｔ ａｌ．，１９９
８）などのＮＫ（ナチュラルキラー）細胞に結合する細胞表面標識を発現するα
／βＴリンパ球の特定のサブグループである。それらは、また、それらのＴ受容
体のいくつかの特徴により従来のＴリンパ球とは異なる：α鎖は不変であって、
ＣＤＲ３の保存領域と結合するＶα１４およびＪα２８１セグメント間の転移か
らもたらされる（Ｋｏｓｅｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｌａｎｔｚ ｅｔ
ａｌ．，１９９４）。それらは、また、限定ＴＣＲβレパートリーを用いる（Ｂ
ｅｎｄｅｌａｃ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。最終的に、従来のＴ細胞とは違っ
て、ＮＫＴ細胞は中間体レベルでＴＣＲ受容体（Ｔ細胞受容体）を発現すると共
に、クラスＩｂＭＨＣ分子ＣＤ１（Ｂｅｎｄｅｌａｃ ｅｔ ａｌ．，１９９７
）により限定される。ＣＤ１ｄ１分子のα１およびα２領域は、グリコシルセラ
ミドの脂質核（Ｂｒｏｓｓａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８）およびＧＰＩ（グリ
コシルホスファチジルイノシトール）を介して固定されるタンパク質に適合する
疎水性結合部位を有し、ＮＫＴ細胞により認識されるＣＤ１−糖脂質複合体を創
り出す（Ｂｒｏｓｓａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｋａｗａｎｏ ｅｔ ａｌ
．，１９９７；Ｂｕｒｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｂｒｏｓｓａｙ ｅｔ
ａｌ．，１９９８，Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。

【０００３】 生体内でのＮＫＴ細胞の機能は、決して十分に述べきれるものではない。これ
らのＮＫＴ細胞はＩＬ−１２介在腫瘍拒絶反応において役割を演じる（Ｔａｋｅ
ｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｋａｗａｎ
ｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。それらは、また、Ｔｈ−１またはＴｈ−２型の
サイトカインの生成（Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｆｌｅｓｃｈ
ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｅｎｏｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７）または
これら細胞数の減少（Ｍｉｅｚａ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｗｉｌｓｏｎ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９８；Ｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１９９７；Ｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆ．＆ Ｉｍｍ．，１９９７）
を通して、一層、ある種のヒトおよびマウスの自己免疫疾患および感染過程に関
与していることがわかる。

【０００４】 ＮＫＴ細胞の生体内活性化を開始する機構もまた十分には理解されていない。
セラミド、α−ガラクトシルセラミドによるこれら細胞の活性化は実証されてき
た（Ｋａｗａｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８およびＷＯ９８／４４９２８）。そ
のうえ、Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９９による最近の論文は、生
体内での種々のＧＰＩｓ（グリコホスファチジルイノシトール）への末梢ＮＫＴ
細胞の反応結果を報告している。

【０００５】 本発明の著者らは、第一にＮＫＴ細胞はホスホイノシトールマンノシド（ＰＩ
Ｍｓ）により活性化することが可能であり、第二にこの活性化は肉芽腫タイプの
免疫反応を引き起こすことを見出してきた。

【０００６】 本発明の著者らは、また、肉芽腫反応の原因となるＮＫＴ細胞の活性化はＣＤ
１／ＴＣＲ経路には独立であり、実際にはＣＤ−１４介在生得免疫の経路に応じ
て決まることを実証してきた。ＮＫＴ−細胞を活性化するＰＩＭｓは、宿主の反
応をＴＨ１型の経路に向けることを可能とするであろう。発明者らは、肉芽腫内
に放出されたサイトカインの直接測定により、これを示すことができた。

【０００７】 これらの結果に基づき、本発明の著者らは、肉芽腫タイプの免疫反応が必要と
される疾患の治療に、少なくとも一つのＰＩＭおよび／または少なくとも一つの
ＰＩＭ−活性化ＮＫＴ細胞を用いることを提案する。

【０００８】 本発明により、ホスホチジルイノシトールマンノシド（ＰＩＭ）は、医薬とし
て許容される賦形剤と組み合わせて用いることが可能である。

【０００９】 用いられるホスファチジルイノシトールマンノシドは、例えば、ジアシルグリ
セリンとの反応その後の知られた方法によるマンノシレーションによる、イノシ
トールホスフェートからの化学合成により得ることが可能である。用いられるＰ
ＩＭｓはバクテリア壁からの精製により得ることも可能である。

【００１０】 ＰＩＭｓは当業者に知られる標準的な技術により、バクテリア壁から精製する
ことができる。好ましくは、用いられるＰＩＭはマイコバクテリア起源であり、
例えばミコバクテリウム結核菌から得ることが可能である。

【００１１】 用いることが可能であるＰＩＭｓの中で、式（Ｉ）に対応するものに言及する
ことが可能である：

【００１２】

【化１】

【００１３】 式中： −Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅は、互いに独立にヒドロキシル基および（Ｍａ
ｎ）_x基から選択され、 式中（Ｍａｎ）_xはイノシトールに連結された少なくとも一つのマンノシド基
であり、ｘは、好ましくは１〜６の間のマンノース単位（互いに直鎖状に接続さ
れる）の数であり； −Ｒ₆またはＲ₇は、互いに独立に、好ましくは１８〜２４炭素原子を含み、好ま
しくは二重結合を含まず、さらにより好ましくは極性置換基を含まない脂肪酸残
基である。

【００１４】 有利には、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅は、それらの好ましくは互いに隣接
した２個のみが（Ｍａｎ）_x基であり、そして他の３つの基がヒドロキシル基で
あるようなものである。

【００１５】 好ましくは、用いられるＰＩＭｓは、Ｒ₂およびＲ₃が（Ｍａｎ）_x基であり、
Ｒ₁、Ｒ₄およびＲ₅がＯＨ基である式（Ｉ）のＰＩＭｓである。

【００１６】 また、例えば、式中、 Ｒ₁、Ｒ₄およびＲ₅がＯＨ基であり； Ｒ₂がマンノシド基［ｘ＝１の（Ｍａｎ）_x］であり；および Ｒ₃がｘ＝１〜６の（Ｍａｎ）_xである、 式（Ｉ）のＰＩＭｓを用いることも可能である。

【００１７】 それが二つでなくただ一つだけの脂肪酸残基を含有するように変更されるＰＩ
Ｍを用いることも可能である。

【００１８】 本発明により、４、５または６個のマンノース単位を含むＰＩＭｓが好ましい
。

【００１９】 本発明は、また、医薬として許容される賦形剤と組み合わせて少なくとも一つ
のＰＩＭ−活性化ＮＫＴ細胞を含む医薬組成物を提供する。

【００２０】 本発明の著者らは、ＰＩＭ−活性化ＮＫＴ細胞が例えばセラミド−活性化ＮＫ
Ｔ細胞とは異なることを発見した。ＰＩＭによるＮＫＴ細胞の活性化は、実際に
、比較的特殊であり、少クローン性分布をまねくと考えられる。他方、例えばセ
ラミドによるＮＫＴ細胞の活性化は多クローン性であると考えられ、強力な肉芽
腫反応を引き起こすとは考えられない。

【００２１】 本発明により、ＰＩＭによるＮＫＴ細胞の活性化は生体内または生体外で行う
ことが可能である。

【００２２】 従って、本発明は、本質的に、 ｉ）医薬として許容される賦形剤と組み合わせて少なくとも一つのＰＩＭを個
体に投与し、 ｉｉ）前記ＰＩＭにより生体内で活性化されたＮＫＴ細胞を含有する生体試料
を前記個体から採取すること、 を含む、生体内でＮＫＴ細胞を活性化するための方法をも提供する。

【００２３】 その後、生体内でＰＩＭにより活性化されたＮＫＴ細胞は、生体試料を採取し
た個体でもまたは別の個体でも可能であるがこうした治療を必要とする個体に投
与することができる。特に、こうした方法は、肉芽腫反応が必要とされる個体の
特定の部位に、これらの活性化ＮＫＴ細胞を注入することを可能とする。

【００２４】 また、本発明は、生体外でＮＫＴ細胞を活性化するための本質的に以下の段階
を含む方法を提供する： ｉ）ＮＫＴ細胞を含む生体試料を採取し、 ｉｉ）ＰＩＭがＮＫＴ細胞を活性化するための適する条件下で、ＮＫＴ細胞を少
なくとも一つのホスファチジルイノシトールマンノシド（ＰＩＭ）と接触させる
こと。

【００２５】 その後、生体外でＰＩＭにより活性化されたＮＫＴ細胞は、こうした治療を必
要とする個体に投与することができる。特に、こうした方法は、これらの活性化
ＮＫＴ細胞を肉芽腫反応が必要とされる個体の特定の部位に注入することを可能
とする。

【００２６】 従って、本発明は肉芽腫タイプの免疫反応が必要とされる疾患の治療処置用の
方法をも提供し、前記方法は少なくとも一つのＰＩＭおよび／またはＰＩＭ−活
性化ＮＫＴ細胞の治療的に有効な量の、こうした治療を必要とする個体への投与
を含む。

【００２７】 本発明は、また、肉芽腫タイプの免疫反応が必要とされる疾患の治療を意図し
た医療品を製造するための、少なくとも一つのホスファチジルイノシトールマン
ノシド（ＰＩＭ）、および／または少なくとも一つのＰＩＭ−活性化ＮＫＴ細胞
の使用に関する。

【００２８】 用語「治療」は、予防的でなく治療するための治療目的用のあらゆる関与を意
味することを意図している。

【００２９】 前記疾患は、特に、原因がバクテリア作用物質、例えばらい病および結核菌の
原因であるマイコバクテリアなどのマイコバクテリアによる感染である疾患であ
りえる。ＰＩＭｓまたはＰＩＭ−活性化ＮＫＴ細胞は、バクテリア感染の間に局
部免疫、特に粘膜免疫を刺激することにより作用する。

【００３０】 投与の様式、投与量および本発明による医薬組成物の薬剤形状は、当業者によ
る従来の方法において、特に、例えば患者の年齢または体重、患者の全般症状の
重篤度、治療への耐性などの、患者に適する治療処置を設定する時に一般に考慮
される基準により決定することが可能である。

【００３１】 ＰＩＭまたはＰＩＭ−活性化ＮＫＴ細胞を含有する本発明による医薬組成物は
、有利には、例えば静脈内または皮下に投与することが可能である。

【００３２】 本発明による医療品は、例えば強い肉芽腫反応の間に退行するすることが知ら
れる黒腫などの癌の治療に特に有用でありえる。この場合に、ＰＩＭｓまたはＰ
ＩＭ−活性化ＮＫＴ細胞は、有利には知られた抗腫瘍剤への抗原性補強剤として
用いることが可能である。

【００３３】 以下の実施例および図は、本発明の範囲を限定することなく本発明を説明する
。

【００３４】 実施例 材料および方法 動物 用いた動物は：Ｃ５７ＢＬ／６マウス；Ｃ５７ＢＬ／６クラスＩＩＭＨＣ−／
−マウス（Ｃｏｓｇｒｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１）；Ｃ５７ＢＬ／６β２
ｍ−／−（Ｋｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）；Ｊα２８１−／−（Ｃｕ
ｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７）であり、Ｊα２８１＋／−マウスは実験時にＣ５
７ＢＬ／６遺伝的背景中の１２９／Ｓｖ−を用いてそれぞれ９回および６回戻し
交配した。

【００３５】 バクテリア変種および抽出物： ミコバクテリウム結核菌バクテリア（Ｈ３７Ｒｖ変種）を半固形培地上で培養
し、その後、熱（７５℃、３０分）で殺した。１０^-2Ｍトロメタミン（Tris）、
ｐＨ８．０、１０^-3ＭＭｇＣｌ₂、１０^-3ＭＣａＣｌ₂および１．５×１０^-1ＭＮ
ａＣｌ中での音波破砕後、マイコバクテリアを、３７℃で５時間にわたり２５ｍ
ｇ／ｍｌのＤＮＡ分解酵素および同量のリポヌクレアーゼで蒸解した。蒸解に次
いで熱不活性化を行った。数回の洗浄後、０．５％のＳＤＳが添加される上述と
同じ緩衝剤中において、各酵素最終濃度２００μｇ／ｍｌでのトリプシン、キモ
トリプシンおよびサブチリシン（ベーリンガー）の混合物により３７℃で２４時
間にわたり、標本を培養した。酵素を熱不活性化した（７０℃で１０分）。得ら
れた粒子を洗浄し、燐酸緩衝剤（ＰＢＳ）中に再懸濁した。その後、懸濁液中に
タンパク質がないことを、ＰＡＧＥ電気泳動およびアミノ酸分析により測定した
。試料をそれらの糖含有量に基づき標準化した。

【００３６】 マイコバクテリア脂質を抽出し以下のように分留した：４ｇの熱殺Ｍ．結核菌
Ｈ３７Ｒｖ病原菌をＣＨＣｌ₃／ＣＨ₃ＯＨ（１：１、ｖ／ｖ）により２回抽出し
た。抽出物を乾燥し、ＣＨＣｌ₃／Ｈ₂Ｏ中に再懸濁し、粗脂質（画分Ｉ）の有機
相が水性相（界面：ＬＡＭｓ、多糖類および変性タンパク質を含む）（画分ＩＩ
）から分離されるように４℃で１時間にわたり放置した。画分Ｉにはヒト中のγ
／δＴ細胞（Ｃｏｎｓｔａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９４）用のホスホアンチゲ
ンがないが、しかしいくつかの糖脂質成分が含まれる。この画分を乾燥し、もう
一度冷アセトン（１０℃）中の沈殿により分離して、可溶性抽出物（脂肪、フェ
ノール性糖脂質）および不溶性白色沈殿物を生成した。熱アセトン（５０〜６０
℃）を蝋質のペレットに添加し、それによりトレハロースおよび他の糖脂質によ
り置換されたミコール酸の抗原を再懸濁する（画分ＩＩＩ）と共に、すべてのＰ
ＩＭｓおよびリポオリゴ糖（ＬＯＳの）を沈殿させる（画分ＩＶ）ことを可能と
した。画分ＩＶを乾燥し、メタノールでの可溶化により分離してＰＩＭｓ（白色
ペレット、画分Ｖ）および可溶性ＬＯＳ′ｓ（画分ＶＩ）を生成した。画分ＩＩ
Ｉの冷却において、いくつかの極性ＰＩＭｓが沈殿し、画分ＶＩＩを生成する。
すべての画分をＣＨＣｌ₃／ＣＨ₃ＯＨ／Ｈ₂Ｏ、６０／３５／５で溶出するケイ
酸ｐＦ２５４（メルク）を用いる薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）により、Ｍ．
結核菌ＰＩＭ２を標準として用いて分析し、斑点はアントロン／硫酸噴霧を用い
て明らかにした。

【００３７】 ＰＣＲプライマー： Ｖβ８．２（Ｒｅｇｎａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９６）を除く特定のＶβ
プライマーはＰａｎｎｅｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３に記載された。ＰＣ
Ｒ用に用いられた非標識特定ＣβプライマーはＧＣＣＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＣＡ
ＣＴＴＧＧＣである。標識化特定ＣβプライマーはＦＡＭ−ＣＴＴＧＧＧＴＧＧ
ＡＧＴＣＡＣＡＴＴＴＣＴＣである。Ｖα１４鎖のｍＲＮＡに関して、以下のプ
ライマーを用いた：Ｖα１４プライマーはＣＴＡＡＧＣＡＣＡＧＣＡＣＧＣＴＧ
ＣＡＣＡであり；非標識ＣαプライマーはＴＧＧＣＧＴＴＧＧＴＣＴＣＴＴＴＧ
ＡＡＧであった。標識化特定ＣαプライマーはＦＡＭ−ＡＣＡＣＡＧＣＡＧＧＴ
ＴＣＴＧＧＧＴＴＣであった。非標識特定Ｊα２８１プライマーはＣＡＧＧＴＡ
ＴＧＡＣＡＡＴＣＡＧＣＴＧＡＧＴＣＣであった。標識化特定Ｊα２８１プライ
マーはＦＡＭ−ＣＡＧＣＴＧＡＧＴＣＣＣＡＧＣＴＣＣであった。標識化特定ク
ローンタイプのプライマーはＦＡＭ−ＧＣＴＧＡＡＣＣＴＣＴＡＴＣＮＣＣＣＡ
ＣＣであった。ＣＤ４のためのプライマーは５′プライマーＣＴＧＡＡＴＴＣＧ
ＧＣＧＣＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣ、３′プライマーＣＡＣＡＡＧＣＴＴＡＡＧＴＣ
ＴＧＡＧＡＧＴＣＴＴＣＣおよびＦＡＭ−ＴＧＣＴＧＡＴＴＣＣＣＣＴＴＣＣＴ
ＴＣＣであった。特定のＣＤ８プライマーは：５′プライマーＴＡＧＡＡＴＣＣ
ＴＡＧＣＴＴＧＡＣＣＴＡＡＧ、３′プライマーＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＡＴＡＧ
ＡＣＡＡＣＧＡＡＧＧおよびＦＡＭ−ＧＧＡＴＡＡＴＣＧＡＣＴＣＡＣＣＣであ
った。ＨＰＲＴのためのプライマーはＦＡＭ−ＴＴＣＴＴＴＣＣＡＧＴＴＡＡＡ
ＧＴＴＧ、５′プライマーＧＴＡＡＴＧＡＴＣＡＧＴＣＡＡＣＧＧＧＧＧＡＣお
よび３′プライマーＣＣＡＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＣＣＴＴＡＡＣＣＡであっ
た。ＣＤ３εのためのプライマーは：５′プライマーＧＣＣＴＣＡＧＡＡＧＣＡ
ＴＧＡＴＡＡＧＣおよび３′−ＦＡＭ−ＣＣＣＡＧＡＧＴＧＡＴＡＣＡＧＡＴＧ
ＴＣであった。ＩｇＭ重鎖のためのプライマーは：ＦＡＭ−ＴＴＣＡＧＴＧＴＴ
ＧＴＴＣＴＧＧＴＡＧ、３′プライマーＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＣＡＴＧＣＡ
ＧＡＴＣＴＣおよび５′プライマーＡＧＴＣＣＴＴＣＣＣＡＡＡＴＧＴＣＴＴＣ
ＣＣであった。非標識特定Ｖγ１、Ｃγ、Ｖδ２、Ｖδ４、Ｖδ５、Ｖδ６およ
びＣδプライマーはＡｚｕａｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９７に記載された。Ｖδ
１−およびＶδ６Ｐ−特定プライマーはそれぞれＡＴＴＣＡＧＡＡＧＧＣＡＡＣ
ＡＡＴＧＡＡＡＧおよびＣＴＧＴＡＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＡＴＣＡＣであった
。標識化特定ＣδプライマーはＦＡＭ−ＴＴＴＣＡＣＣＡＧＡＣＡＡＧＣＡＡＣ
Ａであった。Ｖγ２−およびＶγ７−特定プライマーはそれぞれＣＧＧＣＡＡＡ
ＡＡＡＣＡＡＡＴＣＡＡＣＡおよびＣＴＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＣＡＧＴＴＣＣＡ
Ｃであった。Ｖγ１およびＶγ２セグメントに特有の標識化ＶγプライマーはＦ
ＡＭ−ＣＣＴＣＣＴＡＡＧＧＧＴＣＧＴＴＧＡＴＴであり、標識化Ｖγ７−特定
プライマーはＦＡＭ−ＣＴＴＧＴＣＣＧＧＧＣＣＴＴＣＡＴであった。

【００３８】 Ｔリンパ球相違の半自動分析（免疫鏡）： 本発明の著者らが用いたＰＣＲベースの技術は、Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ ｅｔ
ａｌ．，１９９７；Ｃｉｂｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｌｅｖｒａｕｄ
ｅｔ ａｌ．，１９９６に記載されている。簡単に言うと、全ＲＮＡは試料か
ら抽出され、全ＲＮＡの１０μｇはＡＭＶ（鳥骨髄芽球症ウイルス）逆転写酵素
を用いて逆転写を受ける。得られるｃＤＮＡを最終１００μｌ体積中に再懸濁す
る。

【００３９】 ｃＤＮＡの質と量を、ＨＰＲＴｍＲＮＡをアッセイすることにより制御した。
特定のＶα１４およびＣαプライマー、またはそれぞれの特定ＶβおよびＣβプ
ライマーのいずれかを用いる、４０ＰＣＲサイクル（９４℃、１分；６０℃、１
分；７２℃、４分）を介して、１μｌを増幅した。２μｌのＰＣＲ生成物を、Ｊ
α２８１またはＣαセグメントに特有な蛍光プライマーを用いるプライマー進展
（５サイクル）に用いた。ＣＤＲ３領域の長さおよび各伸展生成物系の蛍光強度
を自動シーケンサ（アプライド・バイオシステムズ）を用いて測定した。各Ｖ−
Ｃ対のＣＤＲ３領域に対するサイズ分布は、その面積が蛍光の強度、従って当初
のｃＤＮＡ量に比例する３ヌクレオチド（骨組みのできたｍＲＮＡから誘導され
た）により分離されたピークの系として説明される。特定の抗原刺激がない場合
に、ガウシアン型分布を持つ６〜８ピークが観察された。他方、抗原誘導Ｔ−リ
ンパ球反応は、一般にある種の特定Ｖ−Ｃ結合を含有する細胞の選択的な増殖の
せいで、ピークの非ガウシアン分布をもたらす。Ａｚｕａｒａ ｅｔ ａｌ．，
１９９７に記載されたものから採用した手順を用い、ＣＤ３εｍＲＮＡに基づく
標準化により半定量ＰＣＲを行った。１００００のマウスＴリンパ球は、免疫鏡
技術を用いる完全なＶβ−Ｃβレパートリーの半定量ＰＣＲ分析を行うに十分で
あった。

【００４０】 抗体およびＦＡＣＳ分析： 細胞：ナイロン細胞フィルター（７０μｍ）（ベクトン−デイキンソン濾過器
）に粉砕された肉芽腫細胞を通すことにより、肉芽腫細胞を作成し、一度燐酸緩
衝剤（ＰＢＳ）中で洗浄した。フィコール（リンパ球−Ｍ、シーダーレーン、ホ
ーンビイ、オンタリオ州）分別により、生きている細胞を分離した。不連続パー
コル勾配により肝白血球を得た。

【００４１】 抗体：ビオチニル化（biotinylated）抗−Ｖα１４抗体クローンＣＭＳ−５は
、以前から記載されてきた（Ｍａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。以下の
抗体をファーミンゲン（サンデイエゴ、ＣＡ）から購入した：ＰＥ−ＮＫ．１（
クローンＰＫ１３６）、またはビオチニル化ＴＣＲβ（クローンＨ５７−５９７
）、ＦＩＴＣ−ＣＤ４（クローンＲＭ４−５）、ＦＩＴＣ−ＣＤ４４（クローン
ＩＭ７）、ビオチニル化ＣＤ４５．２（クローン１０４）、ＰＥ−Ｂ２２０（ク
ローンＲＡ３−６Ｂ２）、ＦＩＴＣ−ＣＤ１９（クローン１Ｄ３）およびＦＩＴ
Ｃ−ＣＤ８（クローンＣＴ−ＣＤ８ａ）。ＦＩＴＣ−ＣＤ８抗体（クローンＣＴ
−ＣＤ８ａ）はカルタグ（ＣＡＬＴＡＧ）（サンフランシスコ、ＣＡ）から入手
した。ＰＥ−ストレプトアビジンをファーミンゲンから入手し、ＡＰＣ−ストレ
プトアビジンをモレキュラープローブズから入手した。ネガテイブ対照として用
いた正常のマウスからのビオチニル化、ＦＩＴＣ−、およびＰＥ−（フィコエリ
トリン）Ｉｇｓをファーミンゲンから購入した。

【００４２】 ＦＡＣＳ分析：特定の抗体による染色の前に、非特定染色を阻止するためにマ
ウス血清で細胞をインキュベートした。その後、異なった抗体組み合わせを添加
した。プロピジウム（propidium）ヨウ化物染色法を用いて死亡細胞を廃棄した
。リンパ球様の細胞をＦＣＳおよびＳＳＣを用いて選択した。最低１０００００
の事象がリンパ球窓において計数された。ＦＡＣＳ−Ｖａｎｔａｇｅ（ベクトン
−デイッキンソン）を用いて４色分析を実施し、ＦＡＣＳ−Ｓｃａｎ（ベクトン
−デイッキンソン）を用いて３色分析を行った。Ｃｅｌｌ−Ｑｕｅｓｔプログラ
ム（ベクトン−デイッキンソン）を用いてデータを作成した。肝臓からのＮＫＴ
細胞を、ベクトン−デイッキンソンＦＡＣＳｔａｒ⁺細胞ソータを用いて抗−Ｎ
Ｋ１．１および抗−ＴｃＲβ抗体で標識後、選び出した。

【００４３】 結果 １．脱タンパク質化マイコバクテリア細胞壁の注入は肉芽腫タイプの病巣の形成
をもたらす。 本発明の著者らは、まず第一にマウスＮＫＴ細胞が糖脂質に富む脱タンパク質
化マイコバクテリア細胞壁の注入部位で検出されうるかどうかを検査した。

【００４４】 この目的に対して、約１０⁶ミコバクテリウム結核菌系Ｈ３７Ｒｖ毒性バクテ
リア同等の、ＰＢＳ中の脱タンパク質化マイコバクテリア細胞壁の懸濁液を、Ｃ
５７ＢＬ／６マウスの尾の根元に皮下注入した。ＰＢＳを注入した動物は免疫化
後１、２、３および７日目に犠牲に供されたが、ＰＢＳ注入部位での炎症過程の
兆候は全く見ることができなかった。免疫化マウスにおいて、好中球が、１日目
および２日目に採集された細胞浸潤から作成された塗末標本上にはっきりと観察
された。リンパ球およびマクロファージは３日目に検出され、次いで皮膚および
筋肉に付着する病巣が発生していた。それらは時間と共にサイズが増大し７日目
には４〜６ｍｍの直径に達した。７日目に誘発された病巣について組織学的分析
を行った。染色部分は、マクロファージ、リンパ球および繊維芽細胞の濃い列か
らなる境界により囲まれた好中球濃厚芯を持つ肉芽腫タイプの病巣を示した（図
１Ａ）。

【００４５】 ２．ＮＫＴ細胞は肉芽腫性病巣を浸潤するＶα１４⁺細胞のみである。 ７日目の肉芽腫タイプ構造は、手動であろうが、ＦＡＣＳ分析を妨げる酵素蒸
解であろうが、生きている単一細胞の懸濁液に解離することはできなかった。Ｎ
ＫＴ細胞に特有の標識を符号化するｍＲＮＡｓを追求するために、ＲＴ−ＰＣＲ
（免疫鏡（登録商標））に基づく技術を代わりに用いた。１０アミノ酸長のＣＤ
Ｒ３を持つ殆ど不変のＶα１４−Ｊα２８１ＴＣＲ鎖はマウスＮＫＴ細胞（Ｌａ
ｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９４）の折記号であるので、対照および実験試料か
ら作成された、Ｖα１４を符号化するｃＤＮＡｓを、ＰＣＲにより増幅し、Ｃα
に特有なプライマーかＪα２８１に特有なプライマーかのいずれかを用いるプラ
イマー伸展によりＣＤＲ３サイズ相違を分析した。特定のＣαプライマーは試料
のＶα１４⁺α鎖の相違を代表する信号を生み出した。数点のピークが、対照お
よび免疫化マウスへの注入部位から抜くリンパ節中に検出された（図ＩＢ、ａお
よびｃ）。ＣＤＲ３サイズの全体ガウシアン分布は、１０アミノ酸のＣＤＲ３長
に対応し、Ｖα１４−Ｊα２８１転移ＴＲＣα鎖を含有し（図１Ｂ、ｂおよびｄ
）、よってＮＫＴ細胞を含む強いピークにより変更された。ＰＢＳ注入部位で切
断された皮膚および筋肉には何の信号も検出されなかった（図ＩＢ、ｅおよびｆ
）。他方、７日目の肉芽腫タイプ構造から作成された、Ｖα１４を符号化するｃ
ＤＮＡｓは、特定Ｊαプライマーまたは特定Ｃαプライマーのいずれかを用いて
、１０アミノ酸のＣＤＲ３サイズを持つ単一ピークを生み出した（図ＩＢ、ｇお
よびｈ）。これらの病巣上で行われるＶα１４−ＣαＰＣＲ生成物の直接配列は
、ＮＫＴ細胞に特有のＴＣＲα鎖を識別することを可能とした。コドン３１に影
響を及ぼす四つのヌクレオチド置換が、浸潤するＴ細胞中に存在するＶα１４−
Ｊα２８１鎖の相違の原因となっている。従って、多くの従来のＶα１４⁺Ｔ細
胞を含有するリンパ節の細胞のようではなく、７日目の肉芽腫タイプ構造中に漸
増したすべてのＶα１４⁺Ｔ細胞はＮＫＴ細胞である。１０アミノ酸長のＣＤＲ
３を持ちＪα２８１セグメントを含有する単一のＶα１４−Ｃαピークを注入後
３日目に検出し（図ＩＢ、ｉおよびｊ）、その後、クローン型プローブを用いて
ＮＫＴ細胞に特有であるものとして識別した。

【００４６】 結局、ＮＫＴ細胞は脱タンパク質化マイコバクテリア細胞壁の注入のせいで細
胞浸潤の最も早い段階で漸増し、７日目の病巣中にはＶα１４Ｔ細胞のみが存在
することを示す。

【００４７】 同じＲＴ−ＰＣＲ技術の使用は、本発明の著者らがＶβ８．１、７、３、５．
２および１０セグメントを用いて転移β鎖を検出することを可能とした。適する
プライマーを用いても、ＣＤ８を符号化するｍＲＮＡは全く検出できず、ＣＤ４
を符号化するｍＲＮＡは殆ど検出できなかったという理由により、従来のα／β
ＣＤ４⁺Ｔ細胞は極めてまれにしか肉芽腫タイプの病巣に浸潤することができな
い。最終的に、Ｉｇμｓ、およびＴＣＲγ／δに特有のプライマーを用いるＰＣ
Ｒ分析の結果において、Ｂ細胞および特にＶδ５およびＶδ６セグメントを用い
るγ／δＴ細胞の顕著な数の存在が示される。

【００４８】 ３．脱タンパク質化マイコバクテリア細胞壁に対する肉芽腫反応におけるα／β
Ｔ細胞の関与 肉芽腫反応はいくつかの段階を含む多細胞プロセスの結果である。肉芽腫プロ
セスにおけるα／βＴ細胞の可能な関与を評価するために、本発明の著者らは遺
伝子的にいくつかのＴ細胞サブグループを欠くマウスを免疫化した。

【００４９】 ＮＫＴ細胞を欠くが、しかし従来のＴ細胞およびＮＫ細胞は正常に発達してい
るＪα２８１−／−マウス（Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７）に、脱タンパク
質化マイコバクテリア細胞壁を注入した。注入を受けた７マウス中の５マウスに
おいて、肉芽腫タイプの病巣はなく、むしろ小さく平らにされた浸潤巣が注入部
位で観察された。他の２マウスにおいて、微小構造の細胞浸潤巣は殆ど排他的に
発達したマクロファージから成っていた（図２Ａ、ａ〜ｄ）。浸潤巣のいずれに
おいても、Ｖα１４を符号化するいかなるｍＲＮＡ（図２Ｂ、ａおよびｂ）もい
かなるＶβＣβ転移も見出されなかった。免疫化Ｊα２８１−／−マウス中のリ
ンパ節から、ＮＫＴ細胞のない従来のＴ細胞によるＶα１４セグメントの通常の
使用を示すＶα１４−Ｃαガウシアンプロフィールが得られた（図２Ｂ、ｃおよ
びｄ）。

【００５０】 ＲＴ−ＰＣＲにより、μ鎖は全く検出されず、転位ＴＣＲγ鎖が見出された。
対照として、脱タンパク質化マイコバクテリア細胞壁を注入した６個のＪα２８
１−／−マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６＋／＋マウスと同じ結果を出した（図２Ａ、
ｅ〜ｇ；図２Ｂ、ｅ〜ｈ）。従って、肉芽腫タイプの相当に大きい病巣の形成は
ＮＫＴ細胞の存在を必要とする。

【００５１】 その後、本発明の著者らは従来のＣＤ４₊Ｔ細胞の可能な関与を試験した。従
来のＣＤ４₊Ｔ細胞を欠くが、しかしＮＫＴ細胞は正常に分化しているＭＨＣＩ
Ｉ−／−マウスにおいて、脱タンパク質化マイコバクテリア細胞壁の注入は、Ｃ
５７ＢＬ／６＋／＋動物におけるように、肉芽腫タイプの病巣の発生をもたらし
た（図２Ａ、ｈ〜ｊ）。試料の免疫鏡分析により、Ｖα１４−Ｊα２８１不変の
ＴＣＲα鎖が検出された唯一のＶα１４鎖であった（図２Ｂ、ｉおよびｊ）。ク
ラスＩＩ−／−マウスのリンパ節におけるＶα１４−ＣαおよびＶα１４−Ｊα
２８１プロフィールは、Ｃ５７ＢＬ／６＋／＋動物におけるのと同じである（図
２Ｂ、ｋおよびｌ）。加えて、ＭＨＣＩＩ−／−細胞の、７日目の病巣に存在す
る細胞のＴＣＲβレパートリーは、Ｃ５７ＢＬ／６＋／＋マウスにおけるのと同
じＶβ使用量における偏りを示した。加えて、Ｉｇμ鎖およびＴＣＲγ／δ鎖を
符号化するｍＲＮＡｓは、Ｃ５７ＢＬ／６＋／＋マウスにおけるように検出され
た。

【００５２】 従って、マイコバクテリア細胞壁により誘発された肉芽腫タイプの病巣中に存
在する異なった細胞タイプは、ＣＤ４⁺Ｔ細胞のない高度に組織化された構造中
に集まるが、しかしＮＫＴ細胞がないと組織化されることはない。

【００５３】 ＣＤ８を符号化するｍＲＮＡの不在は、従来のＣＤ８⁺Ｔ細胞への強い役割を
排除する。肉芽腫プロセスにおけるＣＤ１分子の役割を、ＣＤ１−依存ＮＫＴ細
胞を欠くβ２ｍ−／−マウスを用いて評価した。肉芽腫タイプの大きな病巣が発
生した。しかし、それらのリンパ球含有量はＣ５７ＢＬ／６＋／＋マウス中に誘
発された肉芽腫タイプ構造中に見られるものとは著しく異なっていた：ＲＴ−Ｐ
ＣＲｓおよび免疫鏡分析により、ＴＣＲβ鎖およびＴＣＲＶα１４⁺鎖、ＣＤ４
、ＣＤ８およびＩｇＭμ鎖を符号化するｍＲＮＡｓは検出できなかった。他方、
ＴＣＲのγ／δ鎖を符号化するｍＲＮＡｓはＣ５７ＢＬ／６＋／＋マウスにおけ
るように存在した。

【００５４】 従って、β２ｍ遺伝子の変更による表現型の変化は、脱タンパク質化マイコバ
クテリア細胞壁により引き起こされる病巣中のＢリンパ球およびα／βＴ細胞の
集積を防止し、且つクローン型プローブを用いて同じ動物のリンパ節の中に検出
されるまれなＮＫＴ細胞の病巣中への集積をも防止する。

【００５５】 ４．ＮＫＴ細胞漸増の活性度は糖バクテリア糖脂質、さらに詳細にはＰＩＭｓと
関係する。 ＮＫＴ細胞集積の原因である非ペプチドマイコバクテリア成分を識別するため
に、材料を分留し、種々画分のＮＫＴ細胞漸増の活性度を生体内で評価した。注
入部位で７日目に存在するＮＫＴ細胞の相対量を、ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫鏡分
析により測定した。注入分子の生体内動作の可能な相違（例えば、拡散速度また
は特定内在化プロセスの相違）を避けるために、注入材料を中性賦形剤、水酸化
アルミニウム（Ａｌｕ−Ｇｅｌ−Ｓ、サーバ）に共役させた。０．２５ｍｇの粒
子形態を取るＡｌｕ−Ｇｅｌ−Ｓを皮下注入されたＣ５７ＢＬ６＋／＋マウスは
、殆ど検出されないＶα１４−Ｊα２８１ｍＲＮＡを伴う微弱な浸潤物を発生し
た（図３）。

【００５６】 Ａｌｕ−Ｇｅｌ−Ｓ上に吸着されたＨ３７Ｒｖ細胞画分（画分Ｉ）の粗脂質は
、マクロファージおよびリンパ球の厚い境界により取り囲まれた賦形剤および好
中球からなる芯を持つ組織化された大きな細胞浸潤物を生み出した。また、これ
ら構造の形成は、それらがＪα２８１−／−マウス中には形成されないので、Ｎ
ＫＴ細胞の存在に応じて決まることを証明した。しかし、脱タンパク質化細胞壁
により誘発された構造のようではなく、粗糖脂質により誘発された組織化細胞浸
潤物は単一の生きた細胞に解離でき、その結果、ＦＡＣＳ分析により浸潤物中の
ＮＫＴ細胞の直接識別を可能とした。死亡細胞およびマクロファージをフィコー
ル分別により除去した。各肉芽腫から採集した２×１０⁶の生きた細胞の大部分
を好中球であるとして識別した。図４はすべての他の細胞はＣＤ４５⁺白血球で
あったことを示す。ＣＤ１９⁺Ｂ２２０⁺Ｂ細胞は全く見出されなかった。すべて
のα／βＴリンパ球はＶα１４⁺、ＴＣＲβ^int（中間発現）およびＮＫ１．１⁺
、すなわち、ＮＫ１．１⁺Ｔ細胞であった。ＣＤ８⁺細胞は全く検出されず、ＣＤ
４⁺細胞はまれにしか検出されなかった。約０．３％は非−ＴＮＫ細胞であり、
約０．１％はγ／δＴ細胞であった。ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫鏡分析は、Ｂ細胞
の不在および画分Ｉの注入により引き起こされた浸潤物中の転位ＴＣＲγ／δ鎖
の存在を裏付けた。従って、粗脂質により引き起こされた病巣を浸潤する殆どす
べてのＴ細胞はＣＤ⁴ＣＤ⁸ＮＫＴ細胞であった。画分Ｉにより誘発された浸潤物
は、ＲＴ−ＰＣＲ分析によりＡｌｕ−Ｇｅｌ−Ｓの注入部位で漸増した細胞より
も２００倍まで多いＶα１４−Ｊα２８１ＲＮＡを含有することが判明した（図
３）。ヒトのγ／δＴ細胞（Ｃｏｎｓｔａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９４）を活
性化することは可能であるが、非脂質画分（画分ＩＩ）はＮＫＴ細胞を漸増する
ことにおいて効果がなかった（図３）。免疫抗原性補強剤ムラミルジペプチド（
ＭＤＰ、シグマ）、マイコバクテリア細胞壁の成分は、Ａｌｕ−Ｇｅｌ−Ｓ単独
に比べて、Ｖα１４−Ｊα２８１ｍＲＮＡを増大することなく細胞浸潤を生み出
した（図３）。画分Ｉを分別蒸留し、画分のＮＫＴ細胞漸増の活性度をＲＴ−Ｐ
ＣＲにより監視した。殆どすべての活性度はＰＩＭｓを含有する画分（画分ＩＩ
Ｉ、ＩＶ、ＶおよびＶＩＩ）中に検出され（図３）、Ｖα１４−Ｊα２８１ピー
クの面積は注入材料の量に比例した。「キーセルゲルＧ６０シリカゲル」での「
フラッシュＬＣ（登録商標）」（メルク）を用いるＴＬＣによる反応性画分の分
析により、ＮＫＴ細胞漸増において最も活性な画分は、その構造が質量分析によ
り４〜６個のマンノース単位を含むＰＩＭｓと適合する高度に極性のＰＩＭｓを
含有するものであった。

【００５７】 ＮＫＴ細胞がＰＩＭｓ４〜６により誘発された浸潤物中に任意に集積するかど
うかを決定するために免疫鏡誘導半定量ＰＣＲ技術を用いて、それらのＴＣＲβ
レパートリーを定義し、それを任意に末梢ＮＫＴ細胞（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ
ａｌ．，１９９５）を代表するように選択された肝臓からのＮＫＴ細胞のレパ
ートリーと比較した（図５）。肝臓からのＮＫＴ細胞は従来のＴ細胞と比較して
、Ｖβ８およびＶβ７に対して限定されるＶβ使用量を有することが確認された
。それぞれのＶβ−Ｃβ転位系は、多クローン性および多様化ＴＣＲβレパート
リーを表示するＣＤＲ３長に対してガウシアン分布を示した。

【００５８】 他方、ＰＩＭｓ４〜６の注入により引き起こされる浸潤物中に存在するＮＫＴ
細胞は異なって制限されるＶβ使用量を示した（図５）。加えて、与えられたＣ
ＤＲ３長に関係する（図５に見られるように、９アミノ酸のＣＤＲ３長を持つＶ
β８．１−Ｃβ転位などの）と共に、対照群において見られるガウシアン分布と
比較して大きく過剰にあると見られる転位は、浸潤物中のＮＫＴ細胞の乏クロー
ン性分布を表した。乏クローン性分布に関係するＶβ使用量における同じ制限が
すべての研究したマウス中に観察されたが、しかしＣＤＲ３領域の長さは動物に
応じて変った。

【表１】

【表２】

【表３】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 脱タンパク質化マイコバクテリア細胞壁の注入により引き起こされる肉芽腫タ
イプ構造のヘマトキシリン／エオシン染色断面を示す。 １０⁶脱タンパク質化マイコバクテリア細胞相当量をＣ５７ＢＬ／６マウス中
に皮下注入した。注入後７日目に、発生した肉芽腫タイプ構造を切除し、４％緩
衝ホルマリン中に固定し、パラフィンで覆い、切断した。用いた対物レンズはそ
れぞれ２．５（ａ）、６．３（ｂ）および４０（ｃ）である。バーは１ｍｍに相
当する。

【図１Ｂ】 ＰＢＳまたは脱タンパク質化マイコバクテリア細胞壁のＣ５７ＢＬ／６マウス
中への注入後７日目に観察されたＶα１４−Ｃα（左側欄）およびＶα１４−Ｊ
α２８１（右側欄）プロフィールの免疫鏡による分析を示す。 ａおよびｂ：ＰＢＳが注入されたマウスのリンパ節。 ｃおよびｄ：脱タンパク質化マイコバクテリア細胞壁により免疫性を与えられた
マウスのリンパ節。 ｅおよびｆ：対照マウス中のＰＢＳ注入部位で切断された皮膚および筋肉。 ｇおよびｈ：脱タンパク質化マイコバクテリア細胞壁の注入により引き起こされ
た、７日目の肉芽腫タイプ構造。 ｉおよびｊ：３日目の細胞浸潤。 ｘ−軸：ＣＤＲ３領域のアミノ酸の長さ。 ｙ−軸：蛍光の比較強度。

【図２Ａ】 比較的サイズの大きい肉芽腫タイプ構造の成長はＮＫＴ細胞の漸増に応じて決
まることを示す。図２Ａは、脱タンパク質化細胞壁のＪα２８１−／−（対物レ
ンズ：ａ、２．５；ｂ、６．３；ｃ、４０およびｄ、オイル、１００）、Ｊα２
８１＋／−（ｅ、２．５；ｆ、６．３およびｇ、４０）およびＣ５７ＢＬ／６ク
ラスＩＩＭＨＣ−／−（ｈ、２．５；ｉ、６．３およびｊ、４０）マウス中への
注入後７日目の注入部位の染色断面を示す。バーは１ｍｍに相当する。

【図２Ｂ】 比較的サイズの大きい肉芽腫タイプ構造の成長はＮＫＴ細胞の漸増に応じて決
まることを示す。図２Ｂは、Ｊα２８１−／−（ａ〜ｄ）、Ｊα２８１＋／−（
ｅ〜ｈ）およびＣ５７ＢＬ／６クラスＩＩＭＨＣ−／−（ｉ〜ｌ）の注入部位（
左側欄）およびリンパ節（右側欄）でのＶα１４およびＶα１４−Ｊα２８１の
使用を示す。

【図３】 Ａｌｕ−Ｇｅｌ−Ｓ（アルミニウム水酸化物）（０．２５ｍｇ）、ＭＤＰ（４
０μｇ）、粗マイコバクテリア脂質およびそれらから得られる画分での免疫処置
後のＶα１４およびＪα２８１ｍＲＮＡの相対量を示す。約１０⁶バクテリア中
に含有される物質をＡｌｕ−Ｇｅｌ−Ｓ上に吸着後注入した。結果（ヒポキサン
チンリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）プライマー比率を用いる、Ｖα１
４−Ｊα２８１プライマー／蛍光ＰＣＲ信号を用いる蛍光ＰＣＲとして表現され
る）は、２動物において得られる結果の平均値に相当する。

【図４】 Ｃ５７ＢＬ／６マウス中へのＡｌｕ−Ｇｅｌ−Ｓ／マイコバクテリア脂質の皮
下注入部位で採集された細胞のＦＡＣＳ分析を示す。実験により、ＮＫＴ細胞の
頻度はフィコール分別後採集された全細胞の１．７〜３．６％の範囲にある。ヒ
ストグラム上の破線は非染色細胞に相当する。

【図５】 対照マウスの肝臓から単離され（ハッチング柱）およびＰＩＭｓ_4〜6により漸
増された（分散点柱）ＮＫＴ細胞、およびプライマー効力に対する内部対照とし
て本明細書に用いられるリンパ節からのＴ細胞（無色柱）のＴＣＲβ鎖レパート
リーの半定量分析を示す：値１は、任意にリンパ節からのＴ細胞を用いて得られ
たガウシアンプロフィールの最も高いピークの面積によるものとされる。肉芽腫
タイプ構造中の最も代表的なＶβ−Ｃβ系のみを、半定量ＰＣＲ分析により研究
した。肉芽腫タイプ構造のないＶβ６をネガテイブ対照として用いた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/06 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 5/00 ＺＮＡＥ //(Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｅ Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 アンスティテュ パストゥール ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＰＡＳＴＥＵＲ フランス国・75724 パリ セデ 15・リ ュ デュ ドクトゥール ルー，28 28， ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒ ｏｕｘ／75724 ＰＡＲＩＳ ＣＥＤＥＸ 15／ＦＲＡＮＣＥ (72)発明者 アポストロブ，イリナ フランス国，エフ−75020 パリ，リュ デ エエ，11 (72)発明者 ガシェラン，ガブリエル フランス国，エフ−75012 パリ，リュ ドゥ ピクプ，54 (72)発明者 クリルスキ，フィリップ フランス国，エフ−75001 パリ，リュ ドゥ モンペンシェール，26 (72)発明者 高濱 洋介 徳島県徳島市国府町井戸北屋敷45−１ Ｆターム(参考） 4B065 AA94X AC20 BB17 BB18 CA44 4C086 AA01 AA02 EA09 MA02 MA04 NA14 ZB26 4C087 AA01 AA02 BB34 BC29 DA14 NA14 ZB26

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 医薬として許容される賦形剤と組み合わせた、少なくとも一
   つのホスファチジルイノシトールマンノシド（ＰＩＭ）−活性化ＮＫＴ細胞を含
   む医薬組成物。
2. 【請求項２】 前記ＰＩＭがマイコバクテリア起源である、請求項１に請求
   の医薬組成物。
3. 【請求項３】 前記ＰＩＭが４、５または６のマンノース単位を含む、請求
   項１または２のいずれかに請求の医薬組成物。
4. 【請求項４】 生体外でＮＫＴ細胞を活性化するための方法であって、 ｉ）ＮＫＴ細胞を含む生体試料を採取し、 ｉｉ）ＮＫＴ細胞を、少なくとも一つのホスファチジルイノシトールマンノシド
   （ＰＩＭ）に、該ＰＩＭが前記ＮＫＴ細胞を活性化するために適した条件下で接
   触させること、 を含む方法。
5. 【請求項５】 前記ＰＩＭがマイコバクテリア起源である、請求項４に請求
   の方法。
6. 【請求項６】 前記ＰＩＭが４、５または６のマンノース単位を含む、請求
   項４または５のいずれかに請求の方法。
7. 【請求項７】 肉芽腫タイプの免疫反応が必要とされる疾患の治療を意図し
   た医療品を製造するための、少なくとも一つのホスファチジルイノシトールマン
   ノシド（ＰＩＭ）、および／または少なくとも一つのＰＩＭ−活性化ＮＫＴ細胞
   の使用。
8. 【請求項８】 前記ＰＩＭがマイコバクテリア起源である、請求項７に記載
   の使用。
9. 【請求項９】 前記ＰＩＭが４、５または６のマンノース単位を含む、請求
   項７または８のいずれかに請求の使用。
10. 【請求項１０】 前記疾患の原因がバクテリア作用物質、例えばマイコバク
    テリアの感染である、請求項７〜９のいずれかに請求の使用。
11. 【請求項１１】 前記疾患が癌である、請求項７〜１０のいずれかに請求の
    使用。
12. 【請求項１２】 前記疾患が黒色種である、請求項１１に請求の使用。