DE581687C - Verfahren zur mikroskopischen Untersuchung lebender Objekte - Google Patents

Description

DEUTSCHES REICH

AUSGEGEBEN AM !.AUGUST 1933

. REICHSPATENTAMT

Die übliche histologische Technik gestattet nur die mikroskopische Beobachtung von Organschnitten. Dabei kann man nur ein Augenblicksbild erfassen und auch das nur in einer schwer kontrollierbaren, durch Tod und Präpariermethoden veränderten Form. Funktionsstudien sind nur an lebendem Gewebe möglich. Bisher war eine solche Untersuchung nur dann in einfacher Weise durchführbar, wenn es sich um die spärlich vorhandenen durchscheinenden Organe handelte, wie z. B. die Schwimmhäute des Frosches, und zwar mit Hilfe des gewöhnlichen Mikroskops unter Verwendung durchfallenden Lichtes. Alle dickeren Organe konnten nur in auffallendem Licht beobachtet werden. Dieser Beobachtung haften schwere methodische Fehler an. Es gelingt nur, die oberflächigen Schichten des Organs zu erkennen, und auch in diesen ist eine feinere Differenzierung nur schwer möglich. Versuche zur Verbesserung der Differenzierungsmöglichkeit durch Einführung von Reflektoren ins Gewebe verbesserten diese wohl in gewissem Ausmaß, beeinflußten aber in erheblichem Maße die Organfunktion, so daß etwaige Verbesserungen in der Sichtbarkeit der Strukturen durch die Organschädigungen voll aufgehoben wurden.

Zu überraschenden Ergebnissen führte die Einführung der Fluoreszenzmikroskopie. Der grundlegende Gedanke der hier vorliegenden Erfindung, der Intravitalmikroskopie, war der, die zur mikroskopischen Beobachtung notwendige Lichtquelle in das Objekt selbst zu verlegen. Das gelang dadurch, daß man dem zu untersuchendem Tier fluoreszierende Stoffe, wie z. B. Eosin, Erythrosin, Magdalarot oder Aesculin, in das Unterhautzellgewebe oder in die Blutbahn einführte. Der betreffende Stoff dringt über Blut- und Lymphwege in alle Organe ein und erleuchtet, durch ultraviolettes Licht zum Selbstleuchten angeregt, das gesamte Objekt gleichmäßig. Einen wesentlichen Vorteil bedeutet jedoch die Einführung solcher Fluoreszenzstoffe, die geeignet sind, an bestimmten Zellbestandteilen angereichert oder gebunden zu werden, wie z. B. die Verwendung des Fluoreszeins, das sich nur mit den basischen, oder des Trypaflavins, das sich nur mit den sauren Zellbestandteilen verbindet. Auf diese Weise war es nicht nur möglich, besser differenzierte Bilder zu erhalten, sondern man konnte sich sofort über die Reaktion des betreffenden " Gewebes oder über die Änderung der Reaktion bei dem Lebensprozesse orientieren. Die einzuführenden Stoffe müssen ungiftig sein, um die Funktion der Organe nicht zu schädigen. Das sind aber die erwähnten Farbstoffe im hohen Maße. Noch mehrere Tage nach der Einbringung des Farbstoffes kann die Funktion der einzelnen Organe unverändert beobachtet werden.

Die mikroskopische Beobachtung des von ultraviolettem Licht erregten Fluoreszenzleuchtens von Schnitten oder Dünnschliffen im durchfallenden Licht ist schon durchgeführt worden, worüber von H. Lehmann, in der Zeitschr. f. Wissenschaft!. Mikroskopie 1913, Bd. 30, S. 417 bis 470 berichtet ist. Die Anordnung war dort hinsichtlich des Strahlen-

ganges ähnlich der, wie sie bei der Mikroskopie im durchfallendem Licht üblich ist.

Eine wesentliche Störung der Beobachtung in auffallendem Licht erfolgt leicht dadurch, daß ein Teil des Lichtes zerstreut oder reflektiert vom Objekt ins Auge gelangt und so durch Überstrahlung des Objektbildes die Beobachtung stört. Dieser Mangel ist beim Erfindungsgegenstand dadurch vermieden, daß zur Erregung der ίο Fluoreszenz in an sich bekannter Weise unsichtbares, und zwar ultraviolettes Licht benutzt wird und daß etwaige reflektierte Anteile dieses Lichtes durch ein Filter abgefangen werden, das das erregte Fluoreszenzlicht fast ungehindert durchläßt, die kurzwelligen erregenden Strahlen aber restlos absorbiert.

Weiterhin wirkte auch die von der Lichtquelle ausgehende Wärme schädigend auf die untersuchten lebenden Organe ein. Dies läßt sich in ebenfalls bekannter Weise dadurch vermeiden, daß das Licht der Bogenlampe durch eine mit Wasser oder Kupfersulfat gefüllte Kühlküvette hindurchgeschickt wird, die sowohl die Wärme wie auch die roten Strahlen absorbiert. Durch ein zweites Filter werden alle sichtbaren Strahlen zurückgehalten und mit Hilfe eines total reflektierenden Prismas die verbleibenden ultravioletten Strahlen durch das Objektiv in das Objekt geworfen. Zu diesem Zweck müssen alle Glasarten, die zwischen der Lichtquelle und dem Objekt sich, befinden, für ultraviolettes Licht gut durchlässig sein. Weiterhin müssen sich die anzuwendenden fluoreszierenden Substanzen durch das ultraviolette Licht zum Selbstleuchten erregen lassen.

Damit die Oberfläche des Organs bei der Bestrahlung nicht austrocknet, wird sie dauernd mit einer physiologischen Nährlösung, z. B. Ringerlösung, berieselt. Von der Verwendung von Trockensystemen mußte daher abgesehen und auch für schwache Vergrößerungen mußten besonders konstruierte Immersionen benutzt werden, die eine dauernde Berieselung ermöglichen. Die Berieselungsvorrichtung war so zu konstruieren und das Objektiv mit einer solchen Vorrichtung zu versehen, daß die Flüssigkeit dauernd der Frontlinse zuläuft. Die Objektive sind für die Spülflüssigkeit adaptiert. Der Objekttisch ist mit einer Abflußvorrichtung versehen und in drei aufeinander senkrechten Richtungen verschiebbar, um das Objekt bequem an das Objektiv heranzuführen. Wegen der verhältnismäßig geringen Helligkeit des Fluoreszenzlichtes war es notwendig, die Lichtquelle und das ganze System bis zu dem Ultraviolettfilter lichtdicht einzubauen.

Schon die erste praktische Anwendung der Methode nach der Erfindung führte zu erheblichen Erfolgen. Es gelang, eine Frage der Nierenphysiologie aufzuklären. Es konnte festgestellt werden, daß bestimmte Abschnitte der Froschniere, nämlich die zweiten gewundenen Kanälchen, Farbstoffe sowohl sezernieren wie rückresorbieren können und daß die Richtung des Farbstofftransportes in diesen Gebieten abhängt von den Druckverhältnissen in den Gefäßen der Nierenknäuelchen und der Kanälchen. Weiterhin gelang der Nachweis, daß die Gallenkapillaren in der Leber ein zusammenhängendes Netz rings um die Leberepithelzellen bilden.

Die Versuchsanordnung eignet sich nicht nur zur Beobachtung lebender Organe, sondern es gelingt mit ihr, alle Körper, die durch kurzwelliges Licht zum Selbstleuchten gebracht werden, mikroskopisch zu beobachten.

Eine Ausführungsform der Apparatur geht aus der Zeichnung hervor:

A stellt die als Lichtquelle verwandte Bogenlampe dar, deren Licht durch die Kollektorlinsen B und B' gesammelt wird. C zeigt die Lichtschutzvorrichtung des Strahlenganges, der durch zwei zueinander senkrecht stehende Zahn- und Triebbewegungen D zentrierbar ist. Die Vorrichtung C trägt die planparallele, mit Kupfersulfat gefüllte Kühlküvette E sowie eine Irisblende F und das Filter G' im Filterhalter G. Das Filter G' läßt nur ultraviolettes Licht hindurch. Der Strahlenschutz ist ebenso wie das MikroskopstativH auf einem Grundbrettl gelagert. Die Strahlung wird durch eine Vorrichtung / mit Hilfe eines total reflektierenden Prismas oder Plättchens in das Objektiv K und von da in das Objekt L geworfen, worin das Fluoreszenzlicht erregt wird, das das Organbild durch das Objektiv und das Okular M dem Auge N des Beobachters sichtbar macht. Auch läßt es sich durch geeignete Instrumente (photographische Kamera, lichtelektrische Zelle) auffangen. Zwischen Objektiv und Okular ist das Filter O eingeschaltet, das alles ultraviolette Licht zurückhält, für sichtbares Licht aber gut durchlässig ist. Der Objekttisch P ist in drei zueinander senkrechten Richtungen verschiebbar und trägt eine Platte Q mit umgeschlagenem Rand, Wasserrinne und Ablauf. Die Objektive führen durch eine Nut R in der Fassung die Immersions- bzw. Spülungsflüssigkeit an die Frontlinse heran. Die Flüssigkeit wird durch ein geeignet angebrachtes verstellbares Röhrchen 5 an die Nut herangebracht. Am oberen Ende des Röhrchens befindet sich ein Schlauch, der mit einem Flüssigkeitsbehälter T verbunden ist. Der Ausfluß der Flüssigkeit aus diesem Behälter kann reguliert und beobachtet werden.

Claims (6)

1. Patentansprüche:

   i. Verfahren zur mikroskopischen Untersuchung lebender Objekte, wie beispielsweise menschlicher, tierischer und pflanzlicher Organe in Funktion in auffallendem erregendem Licht, dadurch gekennzeichnet,

   daß diese Objekte durch Zuführung fluoreszierender Stoffe, wie beispielsweise Erythrosin oder Aesculin, zur Fluoreszenzerregung geeignet gemacht werden.
2. 2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß fluoreszierende Stoffe benutzt werden, die von bestimmten Bestandteilen der zu untersuchenden Objekte im Gegensatz zu anderen Bestandteilen vorzugsweise gebunden werden, wie z. B. Fluoreszein von den basischen Bestandteilen und Trypaflavin von den sauren Bestandteilen der Zelle.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Objektiv und das zu untersuchende Objekt an der Oberfläche dauernd mit einer geeigneten Flüssigkeit, wie beispielsweise Ringerlösung, bespült werden.
4. 4. Einrichtung zur Ausübung des Verfahrens nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vorrichtung vorgesehen ist, die den dauernden Durchfluß einer Spülflüssigkeit zwischen Objektiv und Objekt gestattet, wie beispielsweise ein Flüssigkeitsbehälter mit regelbarem Ausfluß, eine Zuführungsröhre zum Objektiv und eine Führungsnut in der Objektivfassung für die Flüssigkeit.
5. 5. Einrichtung zur Ausübung des Verfahrens nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch einen Objekttisch, der in drei zueinander senkrechten Richtungen beweglich ist und den dauernden Abfluß der zugeführten Spülflüssigkeit in einen Ausguß gestattet.
6. 6. Einrichtung zur Ausübung des .Verfahrens nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Objektiv auf die Spülflüssigkeit adaptiert ist.

   Hierzu 1 Blatt Zeichnungen