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Verfahren zur Gewinnung und Anwendung spezifischer Sera zur Differenzierung
verschiedener Milcharten Die amtliche Untersuchung von Milch auf Herkunft und Nährwert
im Vergleich zu anderer Milch ist für manche Länder, in denen Milch mehrerer Tierarten
(Kühe, Büffel, Schafe, Ziegen usw.) benutzt wird, von sehr großer Bedeutung, weil
die meisten und häufigsten Verfälschungen der Milch hier ihren Ausgangspunkt haben.
Eine auf 1/3 entrahmte oder dreifach mit Wasser verdünnte Büffelmilch kann z. B.
immer noch als gute Kuhmich verkauft werden, weil die Büffelmilch oft 8 bis ro
%
Fett enthält und für Kuhmilch nur ein Fettgehalt von 3 bis 3,5 °/o vorgeschrieben
ist. In Wahrheit wird aber der Käufer dabei insofern betrogen, als er statt der
gewünschten Milch minderwertige erhält.
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Die Prüfung der verschiedenen Milcharten (mit Ausnahme der Ziegenmilch)
ist nach chemischen Verfahren nicht durchführbar. Die biologischen Verfahren, und
zwar die Präzipitationsreaktion, die Komplementbindungsreaktion und die Anaphylaxie,
sind sehr umständlich und aus vielen Gründen undurchführbar. Das am weitesten verbreitete
Verfahren zur Untersuchung von Eiweißkörpern überhaupt ist die Präzipitation. Bereits
mehrfach wurde vorgeschlagen, die Reaktion auch zur Untersuchung von Milch zu benutzen.
Die Herstellung milchpräzipitierender Sera (Lactosera) ist aber sehr schwer,".weil
nur ein geringer Prozentsatz von geimpften Tieren, z. B. Kaninchen, ein brauchbares
Lactoserum liefert. Die Reaktion wird in besonderen Reagenzgläsern auf besonderen
Gestellen durchgeführt und dauert '/2 bis 24 Stunden. Mit jeder Untersuchung muß
man eine große Zahl von Kontrolluntersuchungen vornehmen, um Fehler zu vermeiden.
Die Reaktion kann nur von Sachverständigen ausgeführt werden, weil sie sehr verwickelt
ist. Der größte Nachteil der Präzipitationsreaktion ist, daß sie nicht streng spezifisch
ist, d, h. das mit einer bestimmten Milchart hergestellte Serum präzipitiert auch
andere Milcharten. Moro, Baumann u. a. haben bei Behandlung mit Kuhmilch Lactosera
bekommen, die auch Ziegen- und evtl. Schafmilch präzipitierten. W. Ernst hält auf
Grund der Versuche von Uhlenhuth, Moro und Gengou die Untersuchung der verwandten
Milcharten (Schaf- und Ziegenmilch) für unmöglich. Nach Uhlenhuth und Seiffert ist
die Unterscheidung der Schaf- von Ziegenmilch wegen Verwandtschaftsreaktionen mit
der Präzipitatiorsreaktion nicht erreichbar (vgl. Handbuch der phatogenen Mikroorganismen,
Bd. III, Lieferung 23, S. 384). Nach einer drei] ährigenVersuchszeit, während der
x2o Kaninchen, 40 Meerschweinchen, 4 Schafe, 2 Esel und z Pferd geimpft wurden,
ergab sich, daß die Untersuchung verwandter Milcharten (Büffel-, Kuh-, Schaf- und
Ziegenmilch)
nach den heutigen biologischen Verfahren nur mit einzelnen
Sera (3 bis q. °/o) möglich und der Nachweis von Zusatz einer Milchart in eine andere
ihr verwandte unmöglich ist.
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Die beiden anderen Verfahren, Komplementbindungsreaktion und Anaphylaxie
dürften etwas empfindlicher sein, haben aber praktisch keinen Wert, weil sie noch
verwickelter sind als die Präzipitation, wie durch zahlreiche Untersuchungen festgestellt
wurde.
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Gegenstand der Erfindung ist ein neues praktisches Verfahren zur Untersuchung
verschiedener und verwandter Milcharten auf Herkunft und zum Nachweis des Zusatzes
einer Milchart zu einer anderen bis herab zum Betrage von 1 °%.
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Das Verfahren nach der Erfindung bietet im Vergleich zu den bisher
bekannten eine Reihe von Vorteilen.
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Während die bekannten Untersuchungsverfahren nur im Laboratorium anwendbar
sind, kann die Untersuchung nach dem Verfahren gemäß der Erfindung überall angewendet
werden. Das teure Laboratoriumsgerät kann entbehrt werden, weil die Untersuchung
auf einem Objektträger und mit Hilfe nur eines Glasstäbchens gemacht wird, die beide
nach dem Waschen mit gewöhnlichem Wasser gebrauchsfertig sind. Ferner ist die Ausführung
der Reaktion so einfach, daß jede Hausfrau hierzu imstande ist, während die anderen
Untersuchungsverfahren nur von geschulten Personen ausgeführt werden können. Im
Gegensatz zu den bekannten Verfahren, die für eine Untersuchung eine Zeit von mehreren
Stunden (bis 2q.) erfordern, sind für die Untersuchung nach dem Verfahren gemäß
der Erfindung nur i bis 3 Minuten nötig. Bei den bekannten Verfahren werden weiter
für eine vollständige Untersuchung mit den nötigen Kontrollen mehrere cm3 Serum
gebraucht, beim Verfahren nach der Erfindung jedoch nur einige Tropfen (o,o5 bis
o,2 cm3). Auch die Herstellung der spezifischen Sera gemäß der Erfindung ist sehr
einfach und billig. Im Gegensatz zu den Verfahren zur Herstellung von Lactosera,
nach welchen man nur von einigen Tieren (3 bis q. °%) ein brauchbares Serum erhält,
liefert jedes Tier ein gutes Serum gemäß der Erfindung. Während bei den bekannten
Verfahren die Herstellung der Sera unter Umständen 35 bis 6o Tage dauert, werden
nach dem Verfahren gemäß der Erfindung nur 12 bis 15 Tage zur Herstellung eines
guten Serums benötigt. Die von einem Kaninchen gelieferte Serummenge ist beim Verfahren
nach der Erfindung bis doppelt so groß wie bei den bekannten Verfahren, weil dieselbe
sich bei der Bearbeitung der Sera verdoppelt. Im Gegensatz zu den Lactosera, die
gegen Licht, Wärme und sonstige Mittel sehr empfindlich sind und sich daher nicht
lange halten, ist das Serum gemäß der Erfindung gegen alle diese Einwirkungen so
gut wie unempfindlich. Dasselbe ist stark konserviert, erhitzt usw. und kann daher
ohne Gefahr überall hin verschickt werden.
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Während nach den bekannten Verfahren die Milcharten nur schwer erkennbar
sind, ist nach dem Verfahren gemäß der Erfindung bereits 10/0
Zusatz einer
artfremden Milch zu einer anderen mit Leichtigkeit makroskopisch nachzuweisen. Geringere
Zusätze haben praktisch keine Bedeutung.
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Die Schwierigkeiten bei der Durchführung der Reaktion in Gemischen
verwandter Milcharten, die bei den bekannten Verfahren die Untersuchung stören und
unter Umständen unmöglich machen, sind beim Verfahren nach der Erfindung vollkommen
beseitigt.
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Während nach den bekannten Verfahren die Milch möglichst frisch, unerhitzt
und nicht konserviert untersucht werden muß, weil sonst das Ergebnis nachteilig
beeinflußt und die Untersuchung gestört wird, kann mit dem Verfahren nach der Erfindung
auch pasteurisierte, gekochte und selbst bei 12o° C und i Atm. Druck erhitzte Milch,
ferner konservierte Milch (mit Formalin, Kaliumbichromat u. a. Chemikalien) ohne
weiteres untersucht werden. Letzteres ermöglicht das Versenden von Milchproben und
das Aufheben von Gegenproben bei amtlichen Untersuchungen, was von sehr großer Bedeutung
ist. Kondensierte Milch kann nach entsprechender Verdünnung mit Wasser genau wie
frische Milch untersucht werden.
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Zur Ausführung der Untersuchung nach dem Verfahren gemäß der Erfindung
wird die zu untersuchende Milch gut umgeschüttelt. Darauf werden mit einem kleinen
Glasstäbchen nebeneinander i bis q. Tropfen (o,oi bis 0,03 cm3 groß) von
der fraglichen Milch, je nachdem man auf eine oder mehrere Arten Milch nachprüfen
will, auf einen zweckmäßig auf eine schwarze Unterlage gelegten Objektträger gebracht.
Auf jeden Tropfen Milch werden sodann i bis 2 Tropfen (etwa 0,05 cm3) von
den verschiedenen, spezifischen Lactosera gemäß der Erfindung getropft. Soll z.
B. auf Kuh-, Büffel-, Schaf- und Ziegenmilch geprüft werden, so werden auf das erste
Tröpfchen Milch i bis 2 Tröpfchen spezifisches Serum für Kuhmilch, auf das zweite
Tröpfchen Milch Serum für Büffehnilch, auf das dritte Serum für Schaf-und auf das
vierte Serum für Ziegenmilch getropft. Hiernach werden die einzelnen Tropfen mit
einem jeweils gesäuberten Glasstäbchen nacheinander gut umgerührt.
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Unter leichtem Schwenken des flachgehaltenen Objektträgers beobachtet
man nun den Ablauf der Reaktion, die innerhalb i bis 3 Minuten vor sich geht.
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Die positive Reaktion zeigt sich durch Gerinnen
und
Ausflocken der Milch an. Die Größe der einzelnen Flocken ist verschieden und hängt
von vielen Umständen (von dem Serum und der Milchzrt selbst, von der Geschwindigkeit
und Dauer des Schwenkens des Objektträgers usw.) ab. Die zum größten Teil aus geronnenen
Kaseinmassen bestehenden Flocken haben die Neigung, beim Schwenken nach dem Umfange
der Tröpfchen hin zu wandern. Der Rest der Flüssigkeit wird nach der vollständigen
Ausflockung klar. Beim Weiterschwenken sammeln sich alle Flocken am Rande der Tropfens,
so daß sich um einen solchen »positiven« Tropfen zum Schluß ein weißer. Kranz bildet.
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Ist die Reaktion negativ, so tritt keine Gerinnung und Ausflockung
ein. Der Tropfen bleibt trübe. Manchmal (besonders bei Milcharten mit höherem Fettgehalt)
wird ein Feinkörnigwerden beobachtet. Die wie feiner Sand aussehenden Körnchen haben
im Gegensatz zu den Flocken die Neigung, beim weiteren Schwenken des Objektträgers
sich nach der Mitte der Tropfen zu sammeln. Die Körnchen sind Fetttröpfchen, die
sich auf dem höchsten Punkt des Tropfens (in der Mitte) sammeln. Das Unterscheiden
einer positiven von einer negativen Reaktion bietet somit gar keine Schwierigkeiten.
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Bei Mischmilch tritt folgendes ein: Diejenige Milchart, mit deren
spezifischem, gemäß der Erfindung hergestelltem Serum eingewirkt wird, wird ausgefällt.
Die übrigen Milcharten bleiben ungeronnen. Bei einem solchen Tropfen beobachtet
man Ausflockung, die übrige Flüssigkeit wird aber nicht klar, wie das bei einartiger
Milch der Fall ist, weil in dem Tropfen noch die anderen Milcharten, die von dem
betreffenden Serum nicht ausgefällt werden konnten, enthalten sind. Je nach der
Menge der zugesetzten Milch treten mehr oder weniger Flocken auf, so daß man den
Anteil jeder Milchart auch grob schätzen kann.
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Das Ergebnis wird makroskopisch abgelesen. Bei zweifelhaften Fällen
wird ein gewöhnliches Vergrößerungsglas (sechs- bis zehnmalige Vergrößerung) zu
Hilfe genommen.
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Je nachdem, in wie vielen und in welchen Tropfen eine Ausflockung
eingetreten ist, ergibt sich, aus wie vielen und welchen Milcharten die fragliche
Milch zusammengesetzt ist. Es ist nicht nötig, besondere Kontrollen anzusetzen,
wenn das Ergebnis bei einem der Tropfen negativ ist. Ist jedoch das Ergebnis bei
allen Tropfen positiv, so wird mit normalem Kaninchenserum eine Nachprüfung vorgenommen,
um sich zu überzeugen, daß keine unspezifische Reaktion vorliegt. Dies ist gewöhnlich
überflüssig, weil auf dem Markt nie Mischmilch aus allen vier Arten vorkommt.
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Das Eintropfen des Serums gemäß der Erfindung geschieht entweder unmittelbar
aus der Flasche (Tropfflasche) oder mit einem Guttator oder einer Pipette.
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Die Herstellung des Serums gemäß der Erfindung ist sehr einfach. Dem
Versuchstier (am besten Kaninchen) wird rohe, gekochte oder sterilisierte Milch
einer bestimmten Art fünf- bis zehnmal innerhalb io bis 15 Tagen intravenös oder
intraperitoneal eingespritzt, und zwar jeweils 5 bis 2o cm3. Die Menge der Milch
spielt keine große Rolle. Jedenfalls sollen nicht weniger als 5 cm3 gespritzt werden.
Die Zahl der Injektionen ist ebenfalls nicht von besonderer Bedeutung. Drei Injektionen
innerhalb io Tagen genügen schon. Bessere Sera werden allerdings erhalten, wenn
mehr als fünfmal injiziert wird. Die intravenöse Injektion ist peritonealen vorzuziehen.
Die peritoneale Impfung darf nur mit gut sterilisierter Milch vorgenommen werden,
weil die Tiere sonst an Bauchfellentzündung erkranken und sterben. Die intravenöse
Injektion ist noch deswegen vorzuziehen, weil hierbei -den Kaninchen auch rohe,
bakterienhaltige Milch nicht schadet. Es ist am besten, rohe, womöglich bakterienfreie
Milch intravenös einzuspritzen.
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Einige Tage (2 bis q.) nach der letzten Injektion, also am 12. bis
1q.. Tage nach der ersten, wird eine Blutprobe entnommen und nach dem beschriebenen
Verfahren geprüft, ob das Tier genügend Milchantikörper gebildet hat. Ist das der
Fall, so wird eine größere Menge Blut durch Herzpunktion entnommen. Das Tier wird
entweder weiter leben gelassen oder vollkommen entblutet. Die Entblutung braucht
nicht streng steril gemacht zu werden, weil das Serum sofort konserviert wird und
danach Bakterienfilter passiert.
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Das so gewonnene Serum ist das bereits bekannte Lactoserum. Es ist
unspezifisch und fällt, wenn auch verschieden stark, fast alle Milcharten. Aus diesen
rohen, unspezifischen Lactosera werden die spezifischen Sera gemäß der Erfindung
hergestellt, die jeweils nur eine bestimmte Milchart ausfällen.
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Zu diesem Zwecke werden die von mehreren Tieren (2o bis 30) gewonnenen
Immunsera gemischt. In einzelnen Versuchen mit den verschiedenen Milcharten werden
die Eigenschaften dieser Serummischung genau geprüft.
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Um die Serummischung nur für eine bestimmte Milchart streng spezifisch
zu machen, wird sie mit einer oder mehreren Milcharten elektiv abgesättigt.
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Um zu erkennen, welche Milchart für die Absättigung am geeignetsten
ist, werden in mehrere kleine Zentrifugenröhrchen je i oder z cm3 der Serummischung
eingebracht und je 0,25 bis o,5 cm3 von je einer der verschiedenen Milcharten
(Kuh-, Büffel-, Schaf-, Ziegenmilch usw.) unverdünnt hinzugefügt. Darauf wird ein
paarmal kräftig umgeschüttelt. Die Röhrchen
werden 5 bis io Minuten
stehengelassen und zentrifugiert. Dann wird in der beschriebenen Weise auf Objektträgern
geprüft, durch welche Milchart die unspezifischen Antikörper am meisten gebunden
sind. Erforderlichenfalls ist dieser Versuch mit größeren oder kleineren Mengen
Milch zu wiederholen.
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Nach Feststellung der für die elektive Absättigung geeignetsten Milchart
ist die Milchmenge zu bestimmen, die zur Absättigung der Serummischung nötig ist.
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Zu diesem Zweck werden wieder in mehrere kleine Zentrifugenröhrchen
je i oder 2 cm3 der ursprünglichen Serummischung eingebracht und zunehmende Mengen
(z. B. 0,25, 0,5o, o,75 und =,o cm3) von der durch den ersten Versuch bestimmten
Milchart hinzugefügt. Darauf wird mehrmals umgeschüttelt. Die Röhrchen werden 5
bis io Minuten stehengelassen undzentrifugiert. Nach der Feststellung der zum Spezifischmachen
von = em3 Serum erforderlichen Milchmenge wird die ganze Serummischung mit der entsprechenden
Milchmenge (in einer Flasche oder in einem Kolben) versetzt, io bis 2o Minuten geschüttelt
und dann zentrifugiert. Darauf wird unter dem Mikroskop (Vergrößerung vierhundertfach)
geprüft, ob das Serum in denjenigen Milcharten, für die es nicht spezifisch sein
soll innerhalb 2o bis 30 Minuten keine Veränderungen hervorruft. Ist das
der Fall, so ist eine weitere Absättigung nicht erforderlich. Andernfalls wird das
Absättigen in derselben Weise wiederholt. Zweckmäßig wird vor demAbsättigen der
ganzen Serummenge die Absättigung an einer kleinen Menge (5 bis =o cm3) noch einmal
ausprobiert.
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Manche Sera lassen sich mit nur einer Milchart nicht einwandfrei absättigen.
Iii solchen Fällen muß in derselben Weise mit zwei evtl. drei Milcharten gleichzeitig
oder hintereinander abgesättigt werden. Das Kuhmilchlaktoserum z. B. läßt sich fast
immer nur mit Büffelmilch spezifisch machen, das Büffelmilchlaktoserum aber selten
nur mit Kuhmilch, vielmehr muß es auch mit Schaf- und Ziegenmilch abgesättigt werden.
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Bei der Absättigung soll nicht mehr Milch verwendet werden, als nötig
ist, weil sonst die spezifische Wirkung des Laktotestes unter Umständen leidet.
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Um das so erhaltene spezifische Serum beständig zu machen, wird es
im Wasserbad bei 60° C ein bis eineinhalb Stunden erhitzt. Es wird dabei gleichzeitig
steril gemacht. Jetzt läßt man das Serum bei gewöhnlicher Temperatur stehen. Es
fallen dabei alle labilen Eiweißkörper aus, und das Serum wird ganz klar.
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Der obere Teil kann jetzt abpipettiert und abgefüllt werden, oder
er wird durch ein Bakterienfilter filtriert und erst dann abgefüllt. Letzteres ist
zu empfehlen, wenn das Serum nach außerhalb verschickt wird. Durch das Erhitzen
und hiltrieren durch Bakterienfilter wird das Serum vollständig steril und klar,
ohne von seiner spezifischen Wirkung etwas zu verlieren. Etwaige zurückgebliebene
unspezifische Wirkungen werden hierbei ganz beseitigt.
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Das Serum ist mit Phenol konservierbar und verdirbt nicht leicht.
Es verträgt lange Zeit Lichteinwirkung (sogar- Sonnenlicht), Wärme usw. Selbst durch
Bakterien oder Schimmelpilze verdorbene Sera behalten ihre Wirkung lange Zelt.
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Das Verfahren nach der Erfindung kann auch zur Unterscheidung von
verschiedenen Milcherzeugnissen (Sahne, saure Milch, Yoghurt, Butter u. a.) sowie
zur Feststellung anderer eiweißhaltiger Lebensmittel (verschiedene Mehlarten, Eierpräparate
u. a.) benutzt werden.