DE4420571C2 - Vorrichtung zur Verdünnung einer Probe für einen Analysator zur Bestimmung spezifischer Komponenten - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Verdünnung einer Probe mit den Merkma­ len des Oberbegriffs des Anspruchs 1. Anwendungsgebiete der Erfindung sind On-line- Messungen in Biotechnologie, Lebensmitteltechnologie und Umweltschutz unter besonderer Berücksichtigung der Wasserbestimmungen.

Durch den Einsatz eines Biosensors zur Bestimmung des Analyten müssen vom Analysator die spezifischen Bedingungen für die Wirk- und Lebensweise des Biosen­ sors bereitgestellt und aufrechterhalten werden. Da Biosensoren im Vergleich zu herkömmlichen chemisch physikalischen Sensoren in der Regel nur einen relativ beschränkten linearen Meßbereich besitzen, gewinnt die Verdünnung als wesentlicher Präparationsschritt insbesondere im On-line-Einsatz eine hohe Bedeutung und muß innerhalb der Messung einfach variierbar sein.

Um den Vorteil eines Biosensors, vor allem seine hohe spezifische Wirkungsweise gegenüber dem Analyten, voll ausnutzen zu können, soll im allgemeinen auf über die Verdünnung hinausgehende Präparationsschritte verzichtet werden. Dadurch wird das Analysensystem mit Proben beaufschlagt, die sich selbst in ihren biologischen Eigen­ schaften verändern (z. B. Eiweißanteile), die kleinere Partikel enthalten können und die noch Abbau- und Wachstumsprozessen unterliegen.

Um Drifteinflüsse zu minimieren, wird meistens der dynamische Bereich der Sen­ sorantwort beim Übergang vom unbelasteten Zustand (blank, Spülmedium bzw. Puffer) zum belasteten Zustand (verdünnte Probe) für die Detektion mit herangezogen und die gesamte Signal-Zeit-Antwort des Biosensors gemessen. Diese Vorgehensweise erfordert entsprechend der Antwortzeit des Biosensors einen raschen Übergang vom unbelasteten Zustand zum belasteten Zustand, die möglichst gute Nachbildung eines Konzentrations­ sprunges im Fließsystem. Die Vorrichtung muß aus diesem Grunde neben der hohen Störsicherheit trotz eventuell leicht abrasiver Medien eine minimierte Fließstrecke vom Umschaltpunkt zwischen blank und zu beaufschlagender Probe aufweisen und sollte im nachfolgenden Weg zum Sensor möglichst keine Totvolumina aufweisen.

Für die Herstellung von Verdünnungen ähnlicher Analysegeräte werden im allgemeinen zur Verdünnung als Vorrichtungen eingesetzt:

• - Kolbenpumpen (Dosierer);
• - kontinuierlich arbeitende Schlauch-Dosierpumpen mit unterschiedlichen, unabhängig steuerbaren Volumenströmen
• - eine Ausnutzung der Dispersion im Schlauch nach Einschieben eines Probesegmentes in einen Trägerstrom (FIA-Prinzip).

Die beiden ersten Vorrichtungen haben für den beschriebenen Einsatz den Nachteil einer hohen Störanfälligkeit und erfordern zusätzliche Maßnahmen zur laufenden Rekalibrierung sowie zur Spülung und Reinigung der Dosierkomponenten. Beim Einsatz von Schlauchpumpen können zusätzliche Ungenauigkeiten in Folge von Schlauchermüdung entstehen.

Die Verdünnung des Probesegmentes durch Dispersion im Trägerstrom (FIA-Prinzip) erfordert zur Realisierung von stark unterschiedlichen Verdünnungsraten im Prozeß einen sehr hohen technischen Aufwand und ist darüber hinaus durch das sich einstellen­ de verschliffene Konzentrationsprofil zur Beaufschlagung des Biosensors ungeeignet, da die Responsezeit des Sensors und die verschliffenen Flanken der eingeschleusten Probekonzentration zeitlich übereinanderfallen und nicht notwendig interferieren. Dadurch erhöht sich der notwendige Kalibrieraufwand enorm, insbesondere müßten Kalibrierlösungen unterschiedlicher Konzentrationen unter den Bedingungen des On­ line-Einsatzes laufend bereitgestellt werden.

Aus der DE 30 39 126 A1 ist eine Vorrichtung bekannt, bei der die vorgesehene Verdün­ nungsrate durch Regeln des Verhältnisses der Drehgeschwindigkeit von zwei Schlauch­ pumpen erzeugt wird. Dabei dient eine Schlauchpumpe zum Ansaugen und Fördern der Flüssigkeitsprobe und eine zweite Schlauchpumpe zum Ansaugen und Fördern der Verdünnungslösung.

Nachteil dieser bekannten Einrichtung sind eine rasche Schlauchermüdung sowie vorzeitiger Verschleiß und in der Folge Ungenauigkeiten beim Dosieren und häufig notwendiges Kalibrieren der Vorrichtung.

In der DE 39 40 113 A1 wird eine Vorrichtung beschrieben, mit der der gesamte Volumenstrom vor dem Biosensor mittels Luft zerstäubt wird. Diese Maßnahme dient der Sättigung des Flüssigkeitsstroms mit Luftsauerstoff, um beim Messen des Sauer­ stoffverbrauches mit einem Biosensor (O₂-Detektion) ein konstantes Sauerstoff­ verhältnis einzustellen. Die vorgeschlagene Einrichtung dient somit nicht der aufgaben­ gemäßen Verdünnung von Flüssigproben.

Aus der US 4 244 919 ist eine automatische Vorrichtung zum Verdünnen von Flüssig­ keitsproben bekannt, die mit zwei Drei/-Zwei-Wegeventilen oder alternativ mit nur einer Schlauchschleife arbeitet.

Die Probenflüssigkeit wird durch das Verdünnungsmittel über eine Volumenschleife in das Mischgefäß dosiert. Das Verdünnungsmittel selbst wird in der entsprechenden Menge durch eine konventionelle Förderpumpe zugeführt. Da das Verdünnungsmittel nicht über eine zweite Volumenschleife mit definiertem Volumen dosiert wird, treten deutliche Schwankungen des Fördervolumens auf.

In der DE 28 54 303 C2 wird ein Flüssigkeits-Transferventil für ein Verdünnungs­ system beansprucht, das eine Rohrleitungsschleife mit präzisem Innenvolumen auf­ weist. Derartige Flüssigkeits-Transferventile sind fertigungstechnisch aufwendig ge­ staltet und ermöglichen keine einfache Anpassung an geänderte Fördervolumina von Probe- und Verdünnungsflüssigkeit, insbesondere bei großen Verdünnungsbereichen, wie z. B. 1 + 1 bis 1 + 100.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Verdünnungsvorrichtung für den On­ line-Betrieb des Biosensors zu schaffen, die einen sehr großen Verdünnungsbereich in für den Meßprozeß relevanten Schritten überdecken kann und die, gesteuert durch die in der vorhergehenden Messung ermittelte Probekonzentration, innerhalb der Rückstellzeit des Sensors eine neue Verdünnung vorbereiten kann.

Diese Notwendigkeit ergibt sich aus der Tatsache, daß der lineare Meßbereich des Biosensors nur etwa eine Zehnerpotenz (z. B. 2 bis 22 mg/l) beträgt. Im ungünstigen Falle wird oberhalb des etwa 15-fachen der unteren Nachweisgrenze des Sensors bedingt durch die biologischen Komponenten ein Sättigungsverhalten erreicht, bei dem das gemessene Signal keinen Rückschluß auf die beaufschlagte Konzentration zuläßt. Darüber hinaus wird der Sensor in diesen Fällen nicht nur im Signalverhalten, sondern auch im zur biologischen Detektion eingesetzten Verhalten (enzymkatalysierte Reakti­ on, mikrobielles Stoffwechselverhalten) in Sättigung gefahren und braucht eine sehr lange Rückstellzeit.

Die Erfindung löst diese Aufgabe mit den Merkmalen des Kennzeichens des Anspruchs 1. Die Unteransprüche sind vorteilhafte Ausgestaltungen.

Gegenüber dem so beschränkten linearen Meßbereich des Biosensors kann die im Prozeß zu vermessende Probekonzentration um mindestens drei Zehnerpotenzen schwanken.

Bedingt durch diese Konzentrationsverhältnisse sowie durch die Notwendigkeit einer gezielten Suche des geeigneten Verdünnungsverhältnisses bei unbekannter Probe­ konzentration innerhalb realer Prozeßzeiten wurde die Verdünnungsvorrichtung nach dem Patentanspruch 1 für den Betrieb des Sensors 1 als automatischer Analyser eingesetzt. Dabei arbeiten je zwei gleichzeitig geschaltete 3/2-Wege-Ventile zusammen. Zwischen jedem Paar dieser 3/2-Wege-Ventile ist eine Schlauchschleife mit im allgemeinen unterschiedlichen Volumina angeordnet. In einer Stellung des gleichzeitig und gemeinsam geschalteten Ventilpaares wird fortwährend Flüssigkeit (Probe oder blank) durch die Schlauchschleife gepumpt und diese gefüllt, in der alternativen Schaltstellung des Ventilpaares wird die in die Schlauchschleife eingebrachte definierte Flüssigkeitsmenge mittels Druckluft in ein Mischgefäß ausgeblasen. Beide Ventilpaare sind dabei unabhängig voneinander ansteuerbar, so daß durch Festlegung der jeweiligen Anzahl Dosierungen pro Schlauchschleife ein Verdünnungsverhältnis realisiert wird. Die Verdünnungsvorrichtung erlaubt damit z. B. bei einem Volumenverhältnis der Schlauchschleifen von 1 : 10 eine Änderung der Verdünnung der Ausgangsprobe von der Verdünnung 1 + 1 bis zur Verdünnung 1 + 100 zwischen zwei aufeinanderfolgenden Messungen.

Die Mindestprobenmenge (V_min) und die maximale Füllmenge des Mischbehälters (V_max) bestimmen die erreichbaren (ganzzahligen) Teilerverhältnisse m + n durch

V_min ≦ m . V (Probeschleife) + n . V (blank) ≦ V_max

mit der Wahl von 2 ≦ n zur Realisierung einer optimalen Vermischung.

Die Erfindung soll nachstehend anhand eines Ausführungsbeispieles näher erläutert werden.

In der Zeichnung zeigen

Fig. 1 zwei miteinander korrespondierende 3/2 Wege-Ventile,

Fig. 2 das Ventilpaar gemäß Fig. 1 in einem Blockschaltbild,

Fig. 3 eine schematisierte Darstellung der gesamten Verdünnungseinheit.

Dabei wird im Analysator ein mikrobieller Biosensor zur Bestimmung des Bio­ chemischen Sauerstoffbedarfes (BOD) eingesetzt. Der lineare Meßbereich des Sensors liegt zwischen 2 und 22 mg/l BOD, bis 33 mg/l BOD ist eine Schätzung der dem Sensor zugeführten Konzentration möglich. Die Konzentration der aus dem Klärprozeß zu bestimmenden Probe kann sich zum Beispiel am Einlauf einer kommunalen Kläranlage zwischen ca. 40 mg/l BOD im Minimum und 2000 mg/l im Extremum ändern.

In Fig. 1 ist ein Paar korrespondierender 3/2-Wege-Ventile, bestehend aus den Ventilen 1 und 2 dargestellt. Dieses Ventilpaar wird gleichzeitig und gemeinsam elektronisch angesteuert, so daß die zwischengeschaltete Volumenschleife 3 entweder zwischen dem Eingang E1 und dem Ausgang A1 geschaltet oder zwischen dem Eingang E2 und dem Ausgang A2 geschaltet ist. Bei Schaltung E1-A1 wird fortwährend Flüssigkeit mit einer Pumpe durch die Ventile und die Volumenschleife 3 gefördert, so daß die Volumenschleife 3 vollständig mit Flüssigkeit gefüllt wird. Bei Schaltung E2- A2 wird die eingebrachte definierte Flüssigkeitsmenge von E2 aus dem Druckluft oder unter Druck stehendem Gas über A2 ausgetrieben und somit das definierte Volumen dosiert.

In Fig. 2 ist die Schaltung des Ventilpaares mit den alternierenden Stellungen als Blockschaltbild dargestellt. Schaltungstechnisch wird realisiert, daß beide im Paar zusammenarbeitenden Ventile durch das Rückstellelement 4 in einer Grundstellung gehalten werden und durch das Betätigungselement 5 in die alternative Stellung schalten.

Im Ausführungsbeispiel wurden Membran-Magnetventile entsprechender elektronischer Güte mit einem Anschlußdurchmesser von 1,6 mm und 5 µl Totvolumen verwendet. Die Totvolumina der Ventile sind durch die geometrisch vorgegebenen inneren Raumverhältnisse im Ventilblock bestimmt und werden bei der Erstinbetriebnahme des Analysators einkalibriert.

Fig. 3 stellt die gesamte Verdünnungseinheit schematisch dar.

Die Volumenschleife 7 für die Probe hatte ein Volumen von 50 µl, die für die Dosie­ rung des Blanks respektive der Pufferlösung 9 ein Volumen von 500 µl. Durch geeigne­ te Wahl der Volumenschleifen 7 und 9 können, vorausgesetzt die für die weitere Verarbeitung erforderliche Probemenge muß nicht ein definiertes Volumen haben, Verdünnungen in bestimmten Schritten erreicht werden. Für einige ausgewählte Verdünnungen sind Verdünnungsrate 1 + x, der Verdünnungsfaktor, die Anzahl der Dosierungen n für die Volumenschleife Puffer 9 und das Gesamtvolumen in der folgenden Tabelle zusammengefaßt:

Im erprobten Prozeß kann damit die Maximalkonzentration von 2000 mg/l einfach und ohne enormen Reagenzienaufwand in den Meßbereich des Sensors verdünnt werden. Durch Auswahl der definierten Volumina der Volumenschleifen 7 und 9 können die Verdünnungsverhältnisse auch anderen Prozessen angepaßt werden.

Über EV1-9-AV1 wird im Ruhezustand die Volumenschleife 9 mit dem Blank (Puffer­ lösung) durchströmt, über EP1-7-AP1 entsprechend mit Probe. Zur Ablage des Blanks bzw. der Probe liegt an EV2 bzw. EP2 Druckluft bzw. unter Druck stehendes Gas verbunden durch den Gasverteiler 10 an. Ensprechend der geforderten Anzahl der Dosierungen wird, beginnend und endend mit dem Volumen des Blank 9 nacheinander blank n-mal und Probe 7m-mal im Mischgefäß 11 abgelegt. Der Einströmkanal 13 für das Blank ins Mischgefäß 11 ist so gewählt, daß gleichzeitig eine ausreichende Ver­ mischung von Probe und Blank durch die Einströmung der Druckluft erreicht wird. Wenn die Dosierungen über beide Volumenschleifen 7 und 9 abgearbeitet sind, wird die im Mischgefäß 11 befindliche Verdünnung dem Biosensor über das motorgetriebene Ventil 15 zugeführt. Abhängig vom jeweils vorherigen Meßergebnis wird die neue Verdünnung durch Veränderung von m und n gesteuert. Bei vollkommen unbekannter Probekonzentration startet die rechnerkontrollierte Verdünnungssteuerung mit einer vorzugebenden Erwartungskonzentration; bei zu niedriger Verdünnung wird im nächsten Maßablauf etwa 1/3 der vorhergehenden am Sensor angebotenen Konzen­ tration erzeugt. Damit braucht der Analysator bei vollkommen unbekannter oder im Bereich der Grenzkonzentration liegenden Werten höchstens fünf Verdünnungsschritte, um sicher in den Sensormeßbereich zu treffen. Bei einer Proberate von 3 Minuten pro Messung ergibt sich für derartige Randwerte einschließlich Kalibrierung ein Zeitbedarf von etwa 20 Minuten; diese maximale Meßdauer ist für den überwachten Prozeß des Kläranlageneinlaufes quasikontinuierlich.

Claims (6)

1. Vorrichtung zur Verdünnung einer Probe für einen Analysator zur Bestimmung spezifischer Komponenten mit einem Biosensor, dadurch gekennzeichnet, daß jeweils zwischen zwei gemeinsam und gleichzeitig gesteuerten Drei-/Zwei- Wegeventilen (1, 2) eine Schlauchschleife definierten Volumens angebracht ist, die alternierend mittels einer Pumpe mit einer Flüssigkeit gefüllt wird und deren Inhalt nach vollständiger Füllung durch das gleichzeitige Umschalten der beiden zugehörigen Drei-/Zwei-Wegeventile (1, 2) durch ein Gas in ein Mischgefäß (11) dosiert wird, wobei eine erste Schlauchschleife (7) mit der Probe und mindestens eine weitere Schlauchschleife (9) mit dem Verdünnungsreagenz beschickt werden und das Volumenverhältnis der Schlauchschleifen (7, 9) zuein­ ander so gewählt wird, daß es eine abgestufte Verdünnungsreihe gestattet, indem die Schlauchschleifen (7, 9) unabhängig voneinander gefüllt und unterschiedlich oft in das Mischgefäß (11) entleert werden und der Biosensor nach Abschluß dieser Dosierzyklen mit der im Mischgefäß vorliegenden verdünnten Probe bestimmter Konzentration beaufschlagt wird.

2. Analysator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Biosensor ein mikrobieller Sensor zur BSB-Bestimmung ist.

3. Analysator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden korrespondierenden Drei-/Zwei-Wegeventile (1, 2) in einen Ventilblock integriert werden und daß zwischen ihnen ein definiertes Volumen ausgespart ist.

4. Analysator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß durch Rückkopplung des Sensorsignals aus der jeweils vorhergehenden Messung auf die Steuerung der jeweils paarweise korrespondierend arbeiten­ den Drei-/Zwei-Wegeventile (1, 2) eine optimale Konzentration für den Bio­ sensor eingestellt wird.

5. Analysator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zum Austreiben der Flüssigkeiten aus den Schlauchschleifen (7, 9) Luft, ein anderes Gas oder ein Gasgemisch eingesetzt wird.

6. Analysator nach den Ansprüche 1 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß das die Flüssigkeit aus den Schlauchschleifen (7, 9) austreibende Gas (10) derart in das Mischgefäß (11) eingeleitet wird, vorzugsweise durch Düsen, daß gleichzeitig eine Durchmischung der verschiedenen Komponenten bewirkt wird.