DE4420571A1 - Analysator mit Biosensor zur Bestimmung spezifischer Komponenten in Proben - Google Patents

Analysator mit Biosensor zur Bestimmung spezifischer Komponenten in Proben

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Description

Die Erfindung "Analysator mit Biosensor zur Bestimmung spezifischer Komponenten in Proben" betrifft einen on-line Analysator.
Anwendungsgebiete der Erfindung sind on-line Messungen in Biotechnologie, Lebensmitteltechnologie und Umweltschutz unter besonderer Berücksichtigung der Wasserbestimmungen.
Durch den Einsatz eines Biosensors zur Bestimmung des Analyten müssen vom Analysator die spezifischen Bedingungen für die Wirk- und Lebensweise des Biosensors bereitgestellt und aufrechterhalten werden. Da Biosensoren im Vergleich zu herkömmlichen chemisch physikalischen Sensoren in der Regel nur einen relativ beschränkten linearen Meßbereich besitzen, gewinnt die Verdünnung als wesentlicher Präparationsschritt insbesondere im on-line Einsatz eine hohe Bedeutung und muß innerhalb der Messung einfach variierbar sein.
Um den Vorteil eines Biosensors, vor allem seine hohe spezifische Wirkungsweise gegenüber dem Analyten, voll ausnutzen zu können, soll im allgemeinen auf über die Verdünnung hinausgehende Präparationsschritte verzichtet werden. Dadurch wird das Analysensystem mit Proben beaufschlagt, die sich selbst in ihren biologischen Eigenschaften verändern (z. B. Eiweißanteile), die kleinere Partikel enthalten können und die noch Abbau- und Wachstumsprozessen unterliegen.
Um Drifteinflüsse zu minimieren, wird meistens der dynamische Bereich der Sensorantwort beim Übergang vom unbelasteten Zustand (blank, Spülmedium bzw. Puffer) zum belasteten Zustand (verdünnte Probe) für die Detektion mit herangezogen und die gesamte Signal-Zeit-Antwort des Biosensors gemessen. Diese Vorgehensweise erfordert entsprechend der Antwortzeit des Biosensors einen raschen Übergang vom unbelasteten Zustand zum belasteten Zustand, die möglichst gute Nachbildung eines Konzentrationssprunges im Fließsystem. Die Vorrichtung muß aus diesem Grunde neben der hohen Störsicherheit trotz eventuell leicht abrasiver Medien eine minimierte Fließstrecke vom Umschaltpunkt zwischen blank und zu beaufschlagender Probe aufweisen und sollte im nachfolgenden Weg zum Sensor möglichst keine Totvolumina aufweisen.
Für die Herstellung von Verdünnungen ähnlicher Analysegeräte werden im allgemeinen zur Verdünnung als Vorrichtungen eingesetzt:
  • - Kolbenpumpen (Dosierer);
  • - kontinuierlich arbeitende Schlauch-Dosierpumpen mit unterschiedlichen, unabhängig steuerbaren Volumenströmen;
  • - eine Ausnutzung der Dispersion im Schlauch nach Einschieben eines Probesegmentes in einen Trägerstrom (FIA-Prinzip).
Die beiden ersten Vorrichtungen haben für den beschriebenen Einsatz den Nachteil einer hohen Störanfälligkeit und erfordern zusätzliche Maßnahmen zur laufenden Rekalibrierung sowie zur Spülung und Reinigung der Dosier­ komponenten. Beim Einsatz von Schlauchpumpen können zusätzliche Ungenauigkeiten in Folge von Schlauchermüdung entstehen. Die Verdünnung des Probesegmentes durch Dispersion im Trägerstrom (FIA- Prinzip) erfordert zur Realisierung von stark unterschiedlichen Verdünnungsraten im Prozeß einen sehr hohen technischen Aufwand und ist darüberhinaus durch das sich einstellende verschliffene Konzentrationsprofil zur Beaufschlagung des Biosensors ungeeignet, da die Responsezeit des Sensors und die verschliffenen Flanken der eingeschleusten Probekonzentration zeitlich übereinanderfallen und nicht notwendig interferieren. Dadurch erhöht sich der notwendige Kalibrieraufwand enorm, insbesondere müßten Kalibrierlösungen unterschiedlicher Konzentrationen unter den Bedingungen des on-line Einsatzes laufend bereitgestellt werden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, für den Betrieb des Biosensors im on­ line Betrieb eine Verdünnungsvorrichtung zu schaffen, die einen sehr großen Verdünnungsbereich in für den Meßprozeß relevanten Schritten überdecken kann und die, gesteuert durch die in der vorhergehenden Messung ermittelte Probe­ konzentration, innerhalb der Rückstellzeit des Sensors eine neue Verdünnung vorbereiten kann.
Diese Notwendigkeit ergibt sich aus der Tatsache, daß der lineare Meßbereich des Sensors nur etwa eine Zehnerpotenz (z. B. 2 bis 22 mg/l) beträgt. Im ungünstigen Falle wird oberhalb dem etwa 15fachen der unteren Nachweisgrenze des Sensors bedingt durch die biologischen Komponenten ein Sättigungs­ verhalten erreicht, bei dem das gemessene Signal keinen Rückschluß auf die beaufschlagte Konzentration zuläßt. Darüberhinaus wird der Sensor in diesen Fällen nicht nur im Signalverhalten, sondern auch im zur biologischen Detektion eingesetzten Verhalten (enzymkatalysierte Reaktion, mikrobielles Stoffwechselverhalten) in Sättigung gefahren und braucht eine sehr lange Rückstellzeit.
Die Erfindung wird gemäß Anspruch 1 realisiert, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.
Gegenüber dem so beschränkten linearen Meßbereich des Biosensors kann die im Prozeß zu vermessende Probekonzentration um mindestens drei Zehnerpotenzen schwanken.
Bedingt durch diese Konzentrationsverhältnisse sowie durch die Notwendigkeit einer gezielte Suche des geeigneten Verdünnungsverhältnisses bei unbekannter Probekonzentration innerhalb realer Prozeßzeiten wurde die im Patentanspruch 1 formulierte Verdünnungsvorrichtung für den Betrieb des Sensors als automatischer Analyser eingesetzt. Dabei arbeiten je zwei gleichzeitig geschaltete 3/2-Wege-Ventile zusammen. Zwischen jedem Paar dieser 3/2-Wege- Ventile ist eine Volumenschleife mit im allgemeinen unterschiedlichen Volumina angeordnet. In einer Stellung des gleichzeitig und gemeinsam geschalteten Ventilpaares wird fortwährend Flüssigkeit (Probe oder blank) durch die Volumenschleife gepumpt und diese gefüllt, in der alternativen Schaltstellung des Ventilpaares wird die in die Volumenschleife eingebrachte definierte Flüssigkeitsmenge mittels Druckluft in ein Mischgefäß ausgeblasen. Beide Ventilpaare sind dabei unabhängig voneinander ansteuerbar, so daß durch Festlegung der jeweiligen Anzahl Dosierungen pro Volumenschleife ein Verdünnungsverhältnis realisiert wird.
Die erfindungsgemäße Verdünnungsvorrichtung erlaubt damit z. B. bei einem Volumenverhältnis der Volumenschleifen von 1 : 10 eine Änderung der Verdünnung der Ausgangsprobe von der Verdünnung 1+1 bis zur Verdünnung 1+100 zwischen zwei aufeinanderfolgenden Messungen.
Die Mindestprobenmenge (Vmin) und die maximale Füllmenge des Mischbehälters (Vmax) bestimmen die erreichbaren (ganzzahligen) Teilerverhältnisse m+n durch
Vmin m*V(Probeschleife)+ n*V(blank) Vmax
mit der Wahl von 2 n zur Realisierung einer optimalen Vermischung.
Die Erfindung soll nachstehend durch ein Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.
Dabei wird im Analysator ein mikrobieller Biosensor zur Bestimmung des Biochemischen Sauerstoffbedarfes (BOD) eingesetzt. Der lineare Meßbereich des Sensors liegt zwischen 2 und 22 mg/l BOD, bis 33 mg/l BOD ist eine Schätzung der dem Sensor zugeführten Konzentration möglich.
Die Konzentration der aus dem Klärprozeß zu bestimmenden Probe kann sich zum Beispiel am Einlauf einer kommunalen Kläranlage zwischen ca. 40 mg/l BOD im Minimum und 2000 mg/l im Extremum ändern.
Erfindungsgemäß ist in Fig. 1 ein Paar korrespondierender 3/2 Wege-Ventile bestehend aus den Ventilen (1) und (2) dargestellt. Dieses Ventilpaar wird gleichzeitig und gemeinsam elektronisch angesteuert, so daß die zwischengeschaltete Volumenschleife (3) entweder zwischen dem Eingang E1 und dem Ausgang A1 geschaltet oder zwischen dem Eingang E2 und dem Ausgang A2 geschaltet ist. Bei Schaltung E1 - A1 wird fortwährend Flüssigkeit mit einer Pumpe durch die Ventile und die Volumenschleife (3) gefördert, so daß die Volumenschleife (3) vollständig mit Flüssigkeit gefüllt wird. Bei Schaltung E2 - A2 wird die eingebrachte definierte Flüssigkeitsmenge von E2 aus mit Druckluft oder unter Druck stehendem Gas über A2 ausgetrieben und somit das definierte Volumen dosiert.
In Fig. 2 ist die Schaltung des Ventilpaares mit den alternierenden Stellungen als Blockschaltbild dargestellt. Schaltungstechnisch wird realisiert, daß beide im Paar zusammenarbeitenden Ventile durch das Rückstellelement (4) in einer Grundstellung gehalten werden und durch das Betätigungselement (5) in die alternative Stellung schalten.
Im Ausführungsbeispiel wurden Membran-Magnetventile entsprechender elektronischer Güte mit einem Anschlußdurchmesser von 1,6 mm und 5 µl Totvolumen verwendet. Die Totvolumina der Ventile sind durch die geometrisch vorgegebenen inneren Raumverhältnisse im Ventilblock bestimmt und werden bei der Erstinbetriebnahme des Analysators einkalibriert.
Fig. 3 stellt die gesamte Verdünnungseinheit schematisch dar.
Die Volumenschleife (7) für die Probe hatte ein Volumen von 50 µl, die für die Dosierung des Blanks respektive der Pufferlösung (9) ein Volumen von 500 µl. Durch geeignete Wahl der Volumenschleifen (7) und (9) können, vorausgesetzt die für die weitere Verarbeitung erforderliche Probemenge muß nicht ein definiertes Volumen haben, Verdünnungen in bestimmten Schritten erreicht werden. Für einige ausgewählte Verdünnungen sind Verdünnungsrate 1+x, der Verdünnungsfaktor, die Anzahl der Dosierungen m für die Volumenschleife Probe (7), die Anzahl der Dosierungen n für die Volumenschleife Puffer (9) und das Gesamtvolumen in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.
Im erprobten Prozeß kann damit die Maximalkonzentration von 2000 mg/l einfach und ohne enormen Reagenzienaufwand in den Meßbereich des Sensors verdünnt werden.
Durch Auswahl der definierten Volumina der Volumenschleifen (7) und (9) können die Verdünnungsverhältnisse auch anderen Prozessen angepaßt werden.
Über EV1-(9)-AV1 wird im Ruhezustand die Volumenschleife (9) mit dem Blank (Pufferlösung) durchströmt, über EP1-(7)-AP1 entsprechend mit Probe. Zur Ablage des Blanks bzw. der Probe liegt an EV2 bzw. EP2 Druckluft bzw. unter Druck stehendes Gas verbunden durch den Gasverteiler (10) an. Entsprechend der geforderten Anzahl der Dosierungen wird, beginnend und endend mit dem Volumen des Blank (9) nacheinander blank n-mal und Probe (7) m-mal im Mischgefäß (11) abgelegt. Der Einströmkanal (13) für das Blank ins Mischgefäß (11) ist so gewählt, daß gleichzeitig eine ausreichende Vermischung von Probe und Blank durch die Einströmung der Druckluft erreicht wird.
Wenn die Dosierungen über beide Volumenschleifen (7) und (9) abgearbeitet sind, wird die im Mischgefäß (11) befindliche Verdünnung dem Biosensor über das motorgetriebene Ventil (15) zugeführt. Abhängig vom jeweils vorherigen Meßergebnis wird die neue Verdünnung durch Veränderung von m und n gesteuert. Bei vollkommen unbekannter Probekonzentration startet die rechnerkontrollierte Verdünnungssteuerung mit einer vorzugebenden Erwartungskonzentration; bei zu niedriger Verdünnung wird im nächsten Meßablauf etwa 1/3 der vorhergehenden dem Sensor angebotenen Konzentration erzeugt. Damit braucht der Analysator bei vollkommen unbekannter oder im Bereich der Grenzkonzentration liegenden Werten höchsten fünf Verdünnungsschritte, um sicher in den Sensormeßbereich zu treffen. Bei einer Proberate von 3 Minuten pro Messung ergibt sich für derartige Randwerte einschließlich Kalibrierung ein Zeitbedarf von etwa 20 Minuten; diese maximale Meßdauer ist für den überwachten Prozeß des Kläranlageneinlaufes quasikontinuierlich.
Bezugszeichenliste
1 erstes 3/2 Wege-Ventil eines Ventilpaares
2 zweites, korrespondierendes 3/2 Wegeventil eines Ventilpaares
3 zwischen beiden Ventilen eingebrachte Volumenschleife definierten Volumens
E1 Eingang 1 von 1
E2 Eingang 2 von 1 bei alternativer Schaltstellung
M Ausgang 1 von 2
A2 Ausgang 2 von 2 bei alternativer Schaltstellung
4 Rückstellelement im Blockschaltbild des gemeinsam und gleichzeitig geschalteten Ventilpaares 1 + 2
5 Betätigungselement im Blockschaltbild des gemeinsam und gleichzeitig geschalteten Ventilpaares 1 + 2
6 Ventilpaar für Probedosierung in Blockschaltung
7 Volumenschleife für Probedosierung
EP1 Eingang 1 des Ventilpaares für Probedosierung
EP2 Eingang 2 des Ventilpaares für Probedosierung
AP1 Ausgang 1 des Ventilpaares für Probedosierung
AP2 Ausgang 2 des Ventilpaares für Probedosierung
8 Ventilpaar für Blank-Dosierung in Blockschaltung
9 Volumenschleife für Blank-Dosierung
EV1 Eingang 1 des Ventilpaares für Blank-Dosierung
EV2 Eingang 2 des Ventilpaares für Blank-Dosierung
AV1 Ausgang 1 des Ventilpaares für Blank-Dosierung
AV2 Ausgang 2 des Ventilpaares für Blank-Dosierung
10 Druckluft bzw. unter Druck zugeführtes Gas
11 Mischgefäß
12 Probe-Zuleitung zum Mischgefäß
13 Blank-Zuleitung zum Mischgefäß
14 Zuführung zum Verteiler
15 Verteiler als motorgetriebenes 3/2-Wege-Ventil
16 Zuführung des Blanks zum Verteiler
17 Ausgang vom Verteiler zum Meßtrakt des Sensors.

Claims (6)

1. Analysator mit Biosensor zur Bestimmung spezifischer Komponenten in Proben, vorzugsweise für den on-line Einsatz, enthaltend eine Vorrichtung zur automatischen Verdünnung der Proben im Meßbereich des Biosensors, dadurch gekennzeichnet, daß jeweils zwischen zwei gemeinsam und gleichzeitig gesteuerten Drei-/Zwei-Wegeventilen eine Schlauchschleife definierten Volu­ mens angebracht ist, die alternierend mittels einer Pumpe mit einer Flüssigkeit gefüllt wird und deren Inhalt nach vollständiger Füllung durch das gleichzeitige Umschalten der beiden zugehörigen Drei-/Zwei-Wegeventile mit einem Gas in ein Mischgefäß dosiert wird, wobei eine Volumenschleife mit der Probe und mindestens eine weitere mit dem Verdünnungsreagenz beschickt wird und das Volumenverhältnis der Schleifen zueinander so gewählt wird, daß es eine abgestufte Verdünnungsreihe gestattet, indem die Volumenschleifen unabhängig voneinander gefüllt und unterschiedlich oft in das Mischgefäß entleert werden und der Sensor nach Abschluß dieser Dosierzyklen mit der im Mischgefäß erzielten Verdünnung bestimmter Konzentration beaufschlagt wird.
2. Analysator nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Biosensor ein mikrobieller Sensor zur BSB-Bestimmung ist.
3. Analysator nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die beiden korrespondierenden Drei-/Zwei-Wegeventile in einen Ven­ tilblock integriert werden und daß zwischen ihnen ein definiertes Volumen ausgespart ist.
4. Analysator nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß durch Rückkopplung des Sensorsignals aus der jeweils vorhergehenden Messung auf die Steuerung der jeweils paarweise korrespondierend arbeiteten Drei-/Zwei-Wegeventile eine optimale Konzentration für den Biosensor eingestellt wird.
5. Analysator nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß zum Austreiben der Flüssigkeiten aus den Volumenschleifen Luft, ein anderes Gas oder ein Gasgemisch eingesetzt wird.
6. Analysator nach den Ansprüchen 1 und 5, gekennzeichnet dadurch, daß das die Flüssigkeit aus den Volumenschleifen austreibende Gas derart in das Mischgefäß eingeleitet wird, vorzugsweise durch Düsen, daß gleichzeitig eine Durchmischung der verschiedenen Komponenten bewirkt wird.
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