DE3940113A1

DE3940113A1 - Messanordnung zur sofortbestimmung von gasen und/oder fluessigen substanzen, die fuer ihren nachweis luftsauerstoff oder gase benoetigen, mittels biosensoren

Info

Publication number: DE3940113A1
Application number: DE19893940113
Authority: DE
Inventors: Rudolf Dipl Chem Gruss; Ulla Dipl Phys Dr Wollemberger; Peter Dipl Ing Dr Ing Ott; Klaus-Peter Dipl Biol Dr Lange; Norbert Kliemes; Klaus Dipl Biol Dr Rer Riedel; Bernd Fahrenbruch; Frieder Dipl Chem Pro Scheller
Original assignee: Medizin und Labortechnik Leipzig VEB
Current assignee: Pruefgeraete-Werk Medingen O-8210 Freital D GmbH
Priority date: 1989-01-02
Filing date: 1989-12-05
Publication date: 1990-07-05
Anticipated expiration: 2009-12-06
Also published as: DE3940113C2; DD279262B5

Description

Die Erfindung ist anwendbar im Umweltschutz, in der medizini schen Laboratoriumsdiagnostik, der Toxikologie, der Lebensmit telindustrie und Biotechnologie. Sie ist insbesondere geeignet zur Bestimmung des biochemischen Sauerstoffverbrauchs (BSB) und von Substanzen, für deren Nachweis Sauerstoff benötigt wird einschließlich der Bestimmung von Enzymaktivitäten sowie zur Bestimmung von gasförmigen bzw. flüchtigen Substanzen und toxi schen Stoffen in der Luft, Aerosolen und wäßrigen Lösungen.

Zur Bestimmung von Gasen (z. B. NH₃) sowie von flüchtigen Substanzen (z. B. Alkohol) werden Biosensoren eingesetzt, die an Stelle einer Dialysemembran eine gasdurchlässige Membran aufweisen, so daß nur die gasförmigen Bestandteile der Meßflüs sigkeit in die biokatalytische Schicht des Biosensors gelangen können (Karube, I and Suzuki, S. Jon. Select. Elec. Rev. 6, 15-59 (1984); Karube et al. Enzyme Engineering (Ed. Weertall, M. M. and Royer, G. P.) 5, 563 (1980); JP 5 41 28 393). Darüber hinaus sind Meßsysteme für Biosensoren auf der Basis amperometrischer Sauerstoffelektroden bekannt, die nach dem Durchflußprinzip arbeiten, z. B. zur Bestimmung des biochemischen Sauerstoffbe darfs (BSB) (Hikuma et al. Europ J. Appl. Microbiol. 8, 289 (1979); GP 15 86 291). Dieses Meßsystem ist dadurch charakteri siert, daß ein Luft-Flüssigkeits-Strom am Sensor vorbeigeführt wird, der etwa die 100-200fache Luftmenge im Vergleich zur Flüssigkeit enthält. Mit dieser bekannten Anordnung sind keine Meßzeiten unter 8-18 min. erreichbar und keine schnellen (kinetischen) Messungen möglich. Deshalb ist diese Apparatur nur für relativ langsame Endpunktbestimmungen einsetzbar. Die Vorteile der im DD-Patent 2 53 045 A1 beschriebenen Sofortbe stimmung können nicht genutzt werden. Es sind keine Gase meßbar und außerdem sind die Messungen mit Fehlern behaftet infolge großer Schwankungen der Null-Linie des Grundstromes.

Ziel der Erfindung ist es, ein kontinuierlich arbeitendes (Durchfluß) Biosensorsystem zu entwickeln, das eine Sofortbe stimmung sowohl von Gasen bzw. der Beeinflussung von Reaktionen durch Gase als auch die Bestimmung von Substanzen, für deren Nachweis Sauerstoff benötigt wird, wie z. B. BSB, nach dem kinetischen Meßprinzip ermöglicht.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, mittels einer Geräte anordnung im Durchflußsystem Gase bzw. flüchtige Substanzen sowie die Beeinflussung von Enzymen durch Gase und von Substan zen, die für ihren Nachweis Sauerstoff benötigen, sofort zu bestimmen.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß eine Mischkammer (7) mit einer Substanzpumpe (3) und einer Gaspumpe (4) gekoppelt ist und der Mischkammer (7) ein temperiertes Austauscherrohr (8) mit hydrophober Innenfläche nachgeschaltet ist. Das Austauscherrohr (8) mündet unmittelbar in eine Meßzel le (10), die den Biosensor (11) enthält. Die Mischkammer (7) in Verbindung mit dem Austauscherrohr (8) dient dazu, eine gleichmäßige und konstante Luft-Flüssigkeits-Suspension aus einem Teil Flüssigkeit und ca. hundert bis fünfhundert Teilen Luft bzw. Gas zu erzeugen und zentral auf den Biosensor (11) in der Meßzelle (10) zu sprühen. Dadurch wird eine vollständige Sättigung der Probenflüssigkeit mit Luft oder Gas erreicht. Er findungsgemäß weist das Austauscherrohr (8) eine Länge von 1000 mm und einen Innendurchmesser von 1 mm auf und ist mit einem Durchmesser von 50 mm gewendelt. Mit dieser Art der Dimensionierung des Austauscherrohres (8) wird gewährleistet, daß bei einer hohen Fließgeschwindigkeit ein optimaler Gas- Flüssigkeitsaustausch erreicht wird. Gleichzeitig ermöglicht die hydrophobe Innenfläche und die wendelförmige Ausführung des Austauscherrohres (8) einen verschleppungsarmen Transport der Proben und eine optimale Reinigung von der Probelösung. Vor zugsweise wird eine hydrophobe Innenfläche durch Einsatz von Polytetrafluoräthylen erreicht.

Eine optimale Temperierung des Austauscherrohrs (8) und der Meßzelle (10) wird ermöglicht durch Umwickeln des Austauscher rohrs (8) mit einer Heizwendel bei gleichzeitigem Umwickeln der Meßzelle (10). Zwei Temperaturfühler (9) an der Heizwendel sorgen für eine konstante Temperierung des Flüssigkeits-Gas- Gemisches.

Ein konstantes Flüssigkeits-Gas-Verhältnis hoher Präzision wird durch ein zwangsgekoppeltes System (6) von Substanz- (3) und Gaspumpe (4) realisiert.

Um höher konzentrierte Proben vorverdünnen zu können, ist der Mischkammer (7) eine im Mischverhältnis variable Verdünnungs pumpe (5) zugeordnet.

Die Meßzelle (10) enthält je nach zu bestimmender Substanz einen Enzym- oder mikrobiellen Sensor.

Mit der erfindungsgemäßen Meßanordnung werden Ansprechzeiten von 15-30 sek. bei einer hohen Nullstabilität des Grundstro mes der Elektrode und einer hohen Präzision sowie hoher Lang zeitstabilität erreicht, was über eine Auswerteeinheit (12) erfaßt wird.

Die Erfindung wird nachfolgend an Beispielen näher erläutert.

Die Abb. 1 zeigt den prinzipiellen Aufbau der erfindungsgemäßen Meßanordnung.

Beispiel 1: Bestimmung des biochemischen Sauerstoffbedarfs (BSB)

Zur BSB-Bestimmung wird eine in der Abbildung wiedergegebene Apparatur benutzt, wobei ein Biosensor mit Trichosporon cuta neum eingesetzt wird. Durch die Meßzelle (10) wird pro min. ca. 1,5 ml 0,1 mol Phosphatpuffer mit der Substanzpumpe (3) und 250 ml Luft mit der Gaspumpe (4) gepumpt, wobei das Luft-Flüssig keits-Gemisch nach Einsprühen der Flüssigkeit in den Luftstrom Durchmesser von 0,5 mm und einer Länge von 500 mm, das mit einer Heizwendel umwickelt und darüber hinaus um die Meßzelle (10) gewickelt ist, zentral auf die Membran des mikrobiologi schen Sensors (11) gesprüht wird. Die Messung wird bei 30°C durchgeführt.

Zur Dosierung der Proben wird der Pufferstrom durch den Probe strom mittels Umschalten von Ventil 1 (1) ersetzt. Als Meßsi gnal dient das Maximum der Stromänderung (kinetische Messung), welches einer Auswerteeinheit (12) zugeführt wird, wobei die Probendosierung nach Erreichen des Maximums der Stromänderung beendet wird. Die Probedosierung und die Messung dauert durch schnittlich 15 bis 30 sec. Nach Erreichen des Grundstromes wird die nächste Probe automatisch dosiert. Der Meßbereich (Linearitätsbereich) beträgt nach Kalibrierung mit Glucose- Glutaminsäure-Standardlösung (150 mg/l Glucose und 150 mg/l- Glutaminsäure entsprechen 220 mg/l BSB) 1 bis 100 mg/l BSB. Bei 22 mg/l BSB wurde ein Variationskoeffizient von 3% ermit telt. Die Untersuchung eines peptidhaltigen Modellabwassers erbrachte bei einer Verdünnung von 1 : 25 einen Meßwert von 75 mg/l (=1500 mg/l der Probe) im Vergleich zum BSB₅ mit 1800.

Beispiel 2: Bestimmung des BSB bei automatischer Verdünnung

Die BSB-Bestimmung wird wie im Beispiel 1 beschrieben mit einer Durchflußapparatur, die zusätzlich eine Pumpe (Verdünnungspumpe (5)) zum Verdünnen der Abwasserprobe enthält. Diese Verdün nungspumpe (5) erlaubt eine Verdünnung der Abwasserprobe im Verhältnis 1 : 25, so daß eine Vorverdünnung der Probe ent fällt. Die im Beispiel 1 eingesetzte Probe erbrachte direkt einen BSB-Wert von 1550 mg/l.

Beispiel 3: Bestimmung von flüchtigem Alkohol

Zur Bestimmung von Ethanol wird ein Trichosporon cutaneum- Sensor eingesetzt. Mittels Gaspumpe (4) über Ventil 2 (2) wird ein Luft- bzw. als Probe ein Luft-Ethanolgemisch mit 250 ml/min. angesaugt und mit 1,5 mg Puffer, der mit der Substanz pumpe (3) gefördert wird in die Mischkammer (7) gebracht und durch das Austauscherrohr (8) gemischt und der Meßzelle (10) mit dem Biosensor (11) und einer Referenzsauerstoffelektrode (13) zugeführt. Das als Probe mit Luft angesaugte dampfförmige Ethanol bewirkt auch eine Verminderung der Sauerstoffmenge des angesaugten Gasgemisches, die mit der Referenzelektrode erfaßt wird. Eine Ethanolprobe führt zu einer Reduzierung des Stromes der Referenzelektrode und des Biosensors gemessen als Stromän derung pro min. Die gemessenen Signale, die einer Auswerte einheit (12) zugeführt werden, betragen bei dem Biosensor 250 nA/min und bei der Referenzelektrode 50 nA/min. Die Differenz von 200 nA/min repräsentiert den Ethanolwert. Eine Kalibrierung des Biosensors mit definierten Ethanollösungen wird mittels Probestrom über die Substratpumpe (3) vorgenommen. Der ermit telte Ethanolwert der gasförmigen Probe entspricht 1 mmol. Ethanol.

Beispiel 4: Bestimmung von Glukose

Zur Bestimmung von Glukose wird ein Biosensor mit Glukoseoxy dase eingesetzt. Die Meßbedingungen und die Meßprozedur ent sprechen dem Beispiel 1. Der Variationskoeffizient bei 12 mMol Glukose wurde zu 2% ermittelt.

Beispiel 5: Bestimmung von Glutamat in Lösungen schwankenden Sauerstoffgehalts

Die in der Abbildung dargestellte Apparatur wird in Verbindung mit einem L-Glutamatsensor auf der Basis von Polyurethan immo bolisierter Glutamatoxydase und einer Sauerstoffelektrode eingesetzt. Durch die Meßzelle (10) werden pro min. 0,7 ml 0,1 mol Phosphatpuffer nach Sörensen pH 7,2 und 250 ml Luft ge pumpt, wobei das Luft-Flüssigkeits-Gemisch durch das Aus tauscherrohr (8) mit einem Durchmesser von 0,5 mm und einer Länge von 500 mm, das wie im Beispiel 1 beschrieben temperiert wird. Zur Dosierung der Proben wird der Pufferstrom für 10-15 sek. durch den Probestrom mittels umschalten von Ventil 1 (1) ersetzt. Bei Erreichen der Meßkammer wird das im Luft-Flüssig keits-Gemisch enthaltene Glutamat, das zu einer Stromänderung der Enzymelektrode führt, nach Kalibrierung mit Glutamat be kannter Konzentration, unabhängig vom Sauerstoffgehalt der 0 Probe bestimmt.

Beispiel 6: Bestimmung von Transaminasen

Das im Beispiel 5 beschriebene Meßprinzip mit der im Beispiel 1 dargestellten Apparatur dient als Meßsystem zur Bestimmung von Transaminasen. Temperierte vorinkubierte Lösungen enthalten 10 mMol alpha-Ketoglutarat und 240 mMol L-Alanin bzw. 120 mMol L- Aspartat bei pH 7,4 bzw. 7,8 zur Bestimmung von Alanin- bzw. Aspartataminotransferase in Serumproben. Den Vorinkubationslö sungen werden je 10 : 1 mit Serumproben versetzt. Nach defi nierten Zeitintervallen wird die Vorinkubationslösung dem Pro bestrom der Durchflußmeßanordnung zugeführt. Das in der Vorin kubation gebildete Glutamat wird ohne Störung durch L-Alanin und L-Aspartat bestimmt. Über eine Eichkurve mit Glutamat und unter Berücksichtigung der Zeitdifferenz der Probenahme aus der Vorinkubationslösung ist die Aktivität der Transaminasen be stimmbar.

Beispiel 7: Erfassung toxischer Produkte in Luft, Aerosolen und in wäßrigen Lösungen

Durch Nutzung eines Biosensors auf der Basis immobilisierter Cholinesterase werden mit der in der Abbildung beschriebenen Apparatur toxische Stoffe, wie Organophosphate, Carbamate als auch reversible Inhibitoren o. g. Enzyme nachgewiesen bzw. bestimmt. Hierzu wird entsprechend Anwendungsbeispiel 3 verfah ren, in dem Luft, Aerosole bzw. wäßrige Lösungen in definier ter Menge über die Gaspumpe (4) zur Pufferlösung eingesaugt wird. Über die Substanzpumpe (3) wird in definierten Zeitab ständen Substrat (Thiocholinester) gesaugt. Bei der Substratzu gabe entsteht ein Signal, das bei Vorhandensein von Inhibitoren in Abhängigkeit von ihrer Konzentration und Einwirkungszeit abnimmt. Die Kalibrierung der Apparatur erfolgt in definierten Zeitabständen mit einer Bezugslösung aus Butylrylthiocholinimid. Bei dem Anwendungsbeispiel wird für die Bestimmung kein Sauer stoff benötigt, die Luft dient nur als Träger der zu vermessen den Substanzen.

Beispiel 8: Simultane Bestimmung von Glukose undGlutaminsäure in einer Probe

Zur gleichzeitigen Bestimmung von Glukose und Glutaminsäure in einer Probe werden zwei Meßzellen in Reihe geschaltet, wobei die eine Meßzelle einen Biosensor mit Glukoseoxydase zur Be stimmung der Glukose und die andere Meßzelle einen Glutamatoxy dase-Biosensor zur Bestimmung der Glutaminsäure enthält. Die Meßbedingungen entsprechen den in den Beispiel 4 und 5 be schriebenen.

Aufstellung der verwendeten Bezugszeichen:

1 Ventil 1
2 Ventil 2
3 Substanzpumpe
4 Gaspumpe
5 Verdünnungspumpe
6 Kopplung
7 Mischkammer
8 Austauscherrohr
9 Temperaturfühler
10 Meßzelle
11 Biosensor
12 Auswerteeinheit
13 Sauerstoffelektrode

Claims

1. Meßanordnung zur Sofortbestimmung von Gasen, leicht flüchti gen und/oder flüssigen Substanzen, die für ihren Nachweis Luftsauerstoff oder Gas benötigen mittels Biosensoren in einem Durchflußsystem, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mischkammer (7) mit einer Substanzpumpe (3) und einer Gaspumpe (4) gekop pelt ist, der Mischkammer (7) ein mit Temperaturfühler (9) versehenes temperiertes gewendeltes Austauscherrohr (8) mit hydrophober Innenfläche nachgeschaltet ist, welches in eine Meßzelle (10), die den Biosensor (11) enthält, mündet.

2. Meßanordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Austauscherrohr (8) eine Länge von 1000 mm, einen In nendurchmesser 1 mm und mit einem Durchmesser von 50 mm gewendelt ist.

3. Meßanordnung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Austauscherrohr (8) um die Meßzelle (10) gewickelt ist.

4. Meßanordnung nach Anspruch 1, 2 und 3, dadurch gekenn zeichnet, daß Austauscherrohr (8) aus Polytetrafluoräthylen besteht.

5. Meßanordnung nach Anspruch 1, 2 und 3, dadurch gekenn zeichnet, daß um das Austauscherrohr (8) eine Heizwendel ge wickelt ist.

6. Meßanordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanzpumpe (3) und die Gaspumpe (4) eine Zwangskopplung (6) aufweisen.

7. Meßanordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mischkammer (7) zusätzlich eine Verdünnungspumpe (5) zuge ordnet ist.

8. Meßanordnung nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßzelle (10) neben dem Biosensor (11) eine Sauer stoffreferenzelektrode (13) enthält.

9. Meßanordnung nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Biosensor ein Enzymsensor ist.

10. Meßanordnung nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Biosensor ein mikrobiologischer Sensor ist.

11. Meßanordnung nach Anspruch 1 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßanordnung zur Bestimmung des biochemischen Sauer stoffverbrauchs eingesetzt wird.

12. Meßanordnung nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung toxischer Substanzen in Luft, Aerosolen und wäßrigen Lösungen Luft als Trägermedium dient in Verbindung mit einem Biosensor auf der Basis immobilisierter Cholineste rase und einer Thioverbindung anzeigenden Elektode.

13. Meßanordnung nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Meßzellen mit jeweils verschiedenen Biosensoren zur Bestimmung verschiedener Substrate in einer Probe in Reihe angeordnet sind.