DE4317596A1 - DNA-Sequenzen und Plasmide zur Herstellung von Zuckerrüben mit veränderter Saccharose-Konzentration - Google Patents

DNA-Sequenzen und Plasmide zur Herstellung von Zuckerrüben mit veränderter Saccharose-Konzentration

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen und Plasmide, die bei Integration in das Genom einer Zuckerrübenpflanze den Zuckermetabolismus verändern sowie die mit Hilfe dieser Sequenzen hergestellten transgenen Pflanzen.
Saccharose ist von zentraler Bedeutung für die Pflanze und dient vielfältigen Funktionen.
Für den Langstreckentransport von Photoassimilaten bzw. Energie zwischen verschiedenen Organen in Pflanzen wird fast ausschließlich Saccharose verwendet. Die Saccharose, die in ein bestimmtes heterotrophes Organ transportiert wird, determiniert das Wachstum und die Entwicklung dieses Organs. So ist z. B. aus der EP 442 592 bekannt, daß transgene Pflanzen, bei denen der Abtransport der Saccharose aus den exportierenden Blättern durch Expression einer apoplastischen Invertase inhibiert wird, eine starke Reduktion des Wachstums von Wurzeln oder Knollen der Kartoffelpflanzen zeigen. Für Tabakpflanzen ist die prinzipielle Bedeutung der Saccharose als zentrale Funktion für den Langstreckentransport von Energieträgern innerhalb der Pflanze beschrieben (von Schaewen et al, 1990, EMBO J 9 : 3033-3044).
Ferner ist aus der EP 455 316 bekannt, daß auf Plasmiden befindliche DNA- Sequenzen nach Einführung in ein pflanzliches Genom einer Kartoffelpflanze in die Stärkebiosynthese eingreifen sowie die Menge und Zusammensetzung des in der Kartoffelknolle enthaltenen Proteins verändern können.
Während es bekannt ist, daß eine Verringerung der Menge der in die heterotrophen Organe wie Knolle und Samen importierten Saccharose zu einem Ertragsverlust führt, ist nicht bekannt, ob eine Erhöhung der Saccharosemenge in den photosynthetisch aktiven Teilen der Pflanze, also primär den Blättern, zu einer verbesserten Versorgung der heterotrophen Organe und damit zu einer Erhöhung des Ertrags führt.
Weiterhin besitzt Saccharose bzw. die von der Saccharose abgeleiteten Hexosen Glukose und Fruktose die Eigenschaft, Pflanzen vor Frostschäden bei niedrigen Temperaturen zu schützen. Schäden durch Frost stellen in der nördlichen Hemisphäre einen der begrenzenden Faktoren landwirtschaftlicher Produktivität dar. Temperaturen unterhalb des Gefrierpunkts führen zur Bildung von Eiskristallen. Da die wachsenden Eiskristalle aus reinem Wasser bestehen, wird den Zellen bei sinkenden Temperaturen Wasser entzogen. Diese Dehydratation hat mindestens zwei potentiell schädliche Folgen:
  • 1. Alle gelösten Stoffe innerhalb einer Zelle werden stark konzentriert und die Zelle kontrahiert sich infolge des Wasserverlustes. Hochkonzentrierte Salze und organische Säuren führen zu Membranschädigungen.
  • 2. Bei der Rehydratation beim Tauen expandiert die vorher kontrahierte Zelle wieder. Die Zellmembranen dehnen sich wieder aus. Die Volumenexpansion stellt eine große mechanische Belastung der Membranen dar.
Es ist also offensichtlich, daß ein Gefrier/Tau Zyklus zu einer starken Membranschädigung der Zellen führen kann und somit zu einer Schädigung der Pflanze.
Es erscheint von daher erstrebenswert, das Gefrieren zu verhindern. Eine der möglichen Strategien ist die verstärkte Bildung von osmotisch aktiven Substanzen im Cytosol pflanzlicher Zellen. Dies sollte zu einer Erniedrigung des Gefrierpunktes führen. Osmotisch aktive Substanzen sind u. a. Saccharose bzw. die beiden aus der Saccharose abgeleiteten Hexosen.
Die vermehrte Bildung von Saccharose bzw. den beiden Hexosen bei niedrigen Temperaturen ist in der wachsenden Pflanze erwünscht. Eine andere Situation kann bei geernteten Teilen einer Pflanze, insbesondere bei deren Lagerung vorliegen.
In Bezug auf wirtschaftliche Aspekte besitzt die Saccharose demnach zwei besonders wichtige Funktionen:
  • 1. Die Funktion als Transportform für den Ferntransport von Photoassimilaten,
  • 2. Die Funktion als osmotisch aktive Substanz mit der erwünschten Wirkung einer Gefrierpunktserniedrigung in der intakten, wachsenden Pflanze.
Die Biosynthesewege zur Bildung von Saccharose entweder aus den primären Photosyntheseprodukten (im Blatt) oder über den Abbau von Stärke (in Speicherorganen wie z. B. der Kartoffel) sind bekannt.
Es ist aber nicht bekannt, wie und über welche Wege in der Zuckerrübe eine Änderung der Kohlenhydratkonzentration erreicht werden kann, da es nicht möglich ist, selbst sehr ähnliche Gene, wie z. B. Gene, die für eine Saccharosesynthase, ADP-Glucose-Pyrophosphorylase oder Saccharosephosphat- Synthase der Kartoffel kodieren, mit zufriedenstellendem Erfolg zur Herstellung von Zuckerrüben mit veränderter Saccharose-Konzentration zu verwenden. Eine genaue Analyse und Bestimmung der für die Zuckerrübe in Betracht kommenden DNA-Sequenzen bzw. Sequenzfragmente ist somit erforderlich.
Für eine Veränderung der Zuckerkonzentration in der Zuckerrübe werden nun DNA-Sequenzen, die für die kleine und große Untereinheit der ADP-Glucose- Pyrophosphorylase, die Saccharose-Synthase und die Saccharosephosphat- Synthase der Zuckerrübe (Seq. ID Nr. 1-4) kodieren, zur Verfügung gestellt.
Diese DNA-Sequenzen können in Plasmide eingebracht und dabei mit Steuerelementen für Expression in eukaryontischen Zellen kombiniert werden. Derartige Steuerelemente sind einerseits Transkriptions-Promotoren und andererseits Transkriptions-Terminatoren.
Jedes Plasmid umfaßt
  • a) einen geeigneten Promotor, der sicherstellt, daß die kodierende Sequenz zum geeigneten Zeitpunkt oder in einem bestimmten Entwicklungszustand in der transgenen Pflanze oder in bestimmten Geweben von transgenen Pflanzen abgelesen wird,
  • b) mindestens eine kodierende Sequenz für Zuckerrübe, die
    • i) so an den Promotor gekoppelt ist, daß die Bildung einer in ein Protein translatierbaren RNA erlaubt wird, wobei das Protein eine enzymatische Aktivität aufweist, die zu einer Veränderung der Saccharosekonzentration in der Pflanze führt oder
    • ii) die so an den Promotor gekoppelt ist, daß der nicht-kodierende Strang abgelesen wird, was zur Bildung einer sog. "anti-sense" RNA führt, die die Bildung des von einem endogenen Gen in der Pflanze kodierten Proteins, das in der Saccharosebiosynthese involviert ist, unterdrückt und
  • c) eine nicht-kodierende Terminations-Sequenz, die die Signale zur Termination und Poly-Adenylierung des Transkripts enthält.
Die unter b) genannten kodierenden Sequenzen sind die Sequenzen, die für die große und kleine Untereinheit der ADP-Glucose-Pyrophosphorylase, für die Saccharosephosphat-Synthase und für die Saccharosesynthase aus Zuckerrübe kodieren.
Die große Untereinheit der ADP-Glucose-Pyrophosphorylase hat die folgende Nukleotidabfolge (Seq. ID Nr. 1):
Die kleine Untereinheit der ADP-Glucose-Pyrophosphatase hat die folgende Nukleotidabfolge (Seq. Nr. 2):
Die Saccharosephosphat-Synthase hat die folgende Nukleotidabfolge (Seq. ID Nr. 3):
Die Saccharose-Synthase hat die folgende Nukleotidabfolge (Seq. ID Nr. 4):
Diese Sequenzen können in einem geeigneten Plasmid auch untereinander kombiniert werden, was zu einer Kombination der einzelnen, durch die Expression der Proteine bedingten Merkmale in der Pflanze führt.
Der Promotor soll sicherstellen, daß das fremde Gen in der Pflanze exprimiert wird. Der Promotor kann dabei so gewählt sein, daß die Expression nur in einem bestimmten Gewebe, zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung oder zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt erfolgt. Der Promotor kann homolog oder heterolog in Bezug auf die Pflanze sein. Sinnvoll ist die Verwendung von Promotoren sind wie z. B. des Promotors der 35S RNA des Cauliflower-Mosaik Virus, des Patatin-Promotors B33 (Rocha-Sosa et al. (1989) EMBO J 8 : 23-29) oder eines Promotors, der eine Expression lediglich in photosynthetisch aktiven Geweben sicherstellt. Weiterhin können Promotoren verwendet werden, die eine Expression lediglich in bestimmten Organen wie Wurzel, Rübe, Knolle, Samen, Stamm oder bestimmten Zelltypen wie Mesophyll, Epidermis, Geleitzellen u.ä. sicherstellen.
Die hier beschriebenen kodierenden Sequenzen enthalten die vollständige Information zur Bildung einer Boten-Ribonukleinsäure (mRNA) für die die große Untereinheit der ADP-Glucose-Pyrophosphorylase und der Saccharosephosphat- Synthase (SPS) und einen Teil der Information zur Bildung der kleinen Untereinheit der ADP-Glucose-Pyrophosphorylase sowie der Saccharose­ synthase, die zur Bildung von anti-sense Ribonukleinsäuren zu den entsprechenden Genen geeignet sind. Ob eine translatierbare Boten- Ribonukleinsäure oder eine anti-sense Nukleinsäure gebildet wird, hängt von der Orientierung der kodierenden Sequenz bezogen auf den Promotor ab. Wenn das 3′ Ende der kodierenden Sequenz an das 3′ Ende des Promotors fusioniert wird, entsteht eine anti-sense RNA, bei Fusion des 5′ Endes der Kodierregion an das 3′ Ende des Promotors entsteht eine translatierbare RNA. Letzteres führt zu einer Steigerung der Enzymaktivität in der Zelle, ersteres zu einer Absenkung der Enzymaktivität in der Zelle.
Die kodierenden Sequenzen für die große und kleine Untereinheit der ADP- Glucose-Pyrophosphorylase, der Saccharosephosphat-Synthase und der Saccharosesynthase können denjenigen entsprechen, die in dieser Erfindung beschrieben werden, oder durch Veränderungen aus den beschriebenen Sequenzen hervorgehen. Dabei ist insbesondere an Veränderungen der Sequenzen zu denken, die zu einer Umgehung der pflanzeneigenen Regulationsmechanismen führen. Veränderungen an den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen lassen sich mittels bekannter Methoden, wie z. B. Basenaustausch oder zielgerichtete oder nicht-zielgerichtete Mutagenese bewirken. Die so gebildeten Derivate der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Die Terminationssequenz dient der korrekten Beendigung der Transkription und der Anheftung eines Poly-Adenylrestes an die Ribonukleinsäure. Dieser Poly- Adenylrest hat eine wichtige Funktion bei der Stabilisierung von RNA-Molekülen in der Zelle.
Mit Plasmiden, die eine oder mehrere der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen enthalten, können Zuckerrüben transformiert werden mit dem Ziel der Erhöhung bzw. Verringerung der Enzymaktivität bzw. der Veränderung der Saccharose- Konzentration.
Zur Vorbereitung der Einführung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen in Zuckerrüben sind eine große Anzahl Klonierungsvektoren verfügbar, die ein Replikationssignal für E. coli und einen Marker beinhalten, der eine Selektion der transformierten Zellen erlaubt.
Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanze können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti- und Ri- Plasmid T-DNA, als Flankenbereich den einzuführenden Genen angefügt werden. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120 516; Hoekama, In: The Binary Plant Vektor System, Offset-drukkerÿ Kanters B.V. Alblasserdam, (1985), Chapter V; Fraley, et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4 : 1-46 und An et al. (1985) EMBO J. 4 : 277-287 beschrieben worden. Ist die eingeführte DNA einmal im Genom integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin oder Hygromicin u. a. vermittelt. Der individuell verwendete Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingefügte DNA fehlt, gestatten.
Für die Einführung von DNA in eine Pflanze stehen neben der Transformation mit Hilfe von Agrobakterien viele andere Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Fusion von Protoplasten, die Mikroinjektion von DNA, die Elektroporation sowie ballistische Methoden und Virusinfektion. Aus dem transformierten Pflanzenmaterial können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA getestet werden. Bei der Injektion und Elektroporation sind an sich keine speziellen Anforderungen an die Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z. B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig. Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanzen in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5 : 81-84). Die Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.
Zum besseren Verständnis der dieser Erfindung zugrundeliegenden Ausführungsbeispiele wird vorab eine Aufstellung aller für diese Versuche notwendigen und an sich bekannten Verfahren gegeben:
1. Klonierungsverfahren
Zur Klonierung wurden die Vektoren pUC 18/19 und M13mp10 Serien (Yanisch- Perron et al. (1985) Gene 33 : 103-119) verwendet, sowie der Vektor EMBL 3 (Frischauf et al. (1983) J Mol Biol 170 : 827-842).
Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären Vektor BIN 19 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res 12 : 8711-8720) kloniert.
2. Bakterienstämme
Für die pUC- und M13mp-Vektoren wurden die E. coli-Stämme BMH71-18 (Messing et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci 24 : 6342-6346) oder TB1 benutzt.
Für den Vektor BIN 19 wurde ausschließlich der E. coli-Stamm TB1 benutzt. TB1 ist ein rekombinationsnegatives, Tetracyclin-resistentes Derivat des Stammes JM101 (Yanisch-Perron et al. (1985) Gene 33 : 103-119). Der Genotyp des TB1- Stammes ist (Bart Barrel, persönliche Mitteilung): F′(traD36, proAB, Lacl, LacZA M15), Δ(lac, pro), SupE, thiS, recA, Sr1::Tn10(TcR).
Die Transformation der Plasmide in die Kartoffelpflanze wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes LBA4404 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res 12 : 8711-8720) durchgeführt.
3. Transformation von Agrobakterium tumefaciens
Bei BIN 19 Derivaten erfolgt der Transfer der DNA in die Agrobakterien durch direkte Transformation nach der Methode von Holsters et al. (1978) (Mol Gen Genet 163 : 181-187). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim & Doly (1979) (Nucl Acids Res 7 : 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch analysiert.
4. Saccharosephosphat-Synthase-Aktivitätstest
Die Saccharosephosphat-Synthase-Aktivität wurde nach Siegel und Stitt (1990, Plant Scienc 66 : 205-210) in einer zweistufigen Analyse bestimmt. Zu einem Volumen von 180 µl einer Lösung von 50 mM HEPES/KOH (pH 7,4), 5 mM MgCl2, 5 mM Fruktose-6-phosphat, 25 mM Glukose-6-phosphat und 6 mM Uridin-5′- diphosphoglukose werden 20 µl Probe gegeben und für 10 Minuten bei 25°C inkubiert. Für 3 Minuten wird auf 95°C erhitzt, um die Reaktion zu beenden. Nach Zentrifugation wird der Überstand spektroskopisch bezüglich der Freisetzung von Uridin-5′-diphosphat analysiert, wobei eine mit Pyruvat-Kinase gekoppelte Enzymreaktion ausgenutzt wird. Ansätze ohne Hexosephosphat sowie die Messung der Rückgewinnung zugesetzten Uridin-5′-diphosphats dienen als Kontrollen.
Ausführungsbeispiele Ausführungsbeispiel 1 Klonierung von cDNA zu großer und kleiner Untereinheit der ADP-Glucose-Pyrophosphorylase aus Zuckerrübe
Aus Speicherwurzeln von im Gewächshaus gewachsenen 3-4 Monate alten Zuckerrübenpflanzen wurde RNA nach der Methode von Logemann et al. (1987, Anal Biochem 163, 16-20) isoliert. Ausgehend von poly-A+-RNA wurde eine cDNA-Bibliothek nach der Methode von Gubler und Hoffmann (1983, Gene 25, 263) im Expressionsvektor Lambda Zap II XR angelegt. Hierzu wurde ein mit einer Xhol-Erkennungsstelle versehener Oligo-dT-primer verwendet, zur Synthese des ersten cDNA-Stranges wurden methylierte Cytidinnukleotide eingesetzt. Nach Synthese des zweiten Strangs wurde ein EcoRl-Adapter angefügt und auf einer Seite durch Schnitt mit der Restriktionsendonuklease Xhol wieder entfernt. Dabei verhindert die Hemimethylierung der cDNA, daß an internen Xhol Erkennungsstellen geschnitten wird. Durch diese Vorgehensweise entsteht eine Population von cDNA-Molekülen, die in EcoRl/Xhol geschnittene DNA des Phagen Lambda gerichtet kloniert werden können. Nach dem Verpacken rekombinanter Phagen-DNA in Phagenköpfe wurden 200 000 "Plaque forming units" der Bank zur Infektion eines Bakterienrasens ausplattiert und anschließend jeweils mit dem gesamten cDNA Fragment der großen bzw. der kleinen Untereinheit der AGPase von Kartoffel (Müller-Roeber et al., 1990, MGG 224, 136-146) als EcoRl-Fragment sondiert. Die den Hybridisierungssignalen entsprechenden rekombinanten Phagen wurden vereinzelt. Durch in vivo Excision wurden Plasmide aus dem Lambda zap- Genom ausgeschnitten, die eine doppelsträngige cDNA als Insertion tragen. Die Plasmide wurden in Bakterienzellen transformiert. Anschließend wurde die Plasmid-DNA in den Bakterien vermehrt. Nach Überprüfung der Größe der Insertionen wurden einzelne Klone durch Bestimmung der Primärsequenz analysiert.
Ausführungsbeispiel 2 Klonierung von cDNA zu Saccharosephosphat-Synthase (SPS) aus Zuckerrübe
Aus Speicherwurzeln von im Gewächshaus gewachsenen 3 - 4 Monate alten Zuckerrübenpflanzen wurde RNA nach der Methode von Logemann et al. (1987, Anal Biochem 163, 16-20) isoliert. Ausgehend von poly-A+-RNA wurde eine cDNA-Bibliothek nach der Methode von Gubler und Hoffmann (1983, Gene 25, 263) im Expressionsvektor Lambda Zap II XR angelegt. Hierzu wurde ein mit einer Xhol-Erkennungsstelle versehener Oligo-dT-primer verwendet, zur Synthese des ersten cDNA-Stranges wurden methylierte Cytidinnukleotide eingesetzt. Nach Synthese des zweiten Strangs wurde ein EcoRl-Adapter angefügt und auf einer Seite durch Schnitt mit der Restriktionsendonuklease Xhol wieder entfernt. Dabei verhindert die Hemimethylierung der cDNA, daß an internen Xhol Erkennungsstellen geschnitten wird. Durch diese Vorgehensweise entsteht eine Population von cDNA-Molekülen, die in EcoRl/Xhol geschnittene DNA des Phagen Lambda gerichtet kloniert werden können. Nach dem Verpacken rekombinanter Phagen-DNA in Phagenköpfe wurden 200 000 "Plaque forming units" der Bank zur Infektion eines Bakterienrasens ausplattiert und anschließend mit dem gesamten cDNA Fragment der Saccharosephosphat-Synthase (SPS) aus Spinat (Sonnewald, 1992, Planta) als Notl sondiert. Die den Hybridisierungssignalen entsprechenden rekombinanten Phagen wurden vereinzelt. Durch in vivo Excision wurden Plasmide aus dem Lambda zap-Genom ausgeschnitten, die eine doppelsträngige cDNA als Insertion tragen. Die Plasmide wurden in Bakterienzellen transformiert. Anschließend wurde die Plasmid-DNA in den Bakterien vermehrt. Nach Überprüfung der Größe der Insertionen wurden einzelne Klone durch Bestimmung der Primärsequenz analysiert.
Ausführungsbeispiel 3 Klonierung von cDNA zu Saccharosesynthase aus Zuckerrübe
Aus Speicherwurzeln von im Gewächshaus gewachsenen 3-4 Monate alten Zuckerrübenpflanzen wurde RNA nach der Methode von Logemann et al. (1987, Anal Biochem 163, 16-20) isoliert. Ausgehend von poly-A+-RNA wurde eine cDNA-Bibliothek nach der Methode von Gubler und Hoffmann (1983, Gene 25, 263) im Expressionsvektor Lambda Zap II XR angelegt. Hierzu wurde ein mit einer Xhol-Erkennungsstelle versehener Oligo-dT-primer verwendet, zur Synthese des ersten cDNA-Stranges wurden methylierte Cytidinnukleotide eingesetzt. Nach Synthese des zweiten Strangs wurde ein EcoRl-Adapter angefügt und auf einer Seite durch Schnitt mit der Restriktionsendonuklease Xhol wieder entfernt. Dabei verhindert die Hemimethylierung der cDNA, daß an internen Xhol Erkennungsstellen geschnitten wird. Durch diese Vorgehensweise entsteht eine Population von cDNA-Molekülen, die in EcoRl/Xhol geschnittene DNA des Phagen Lambda gerichtet kloniert werden können. Nach dem Verpacken rekombinanter Phagen-DNA in Phagenköpfe wurden 200 000 "Plaque forming units" der Bank zur Infektion eines Bakterienrasens ausplattiert und anschließend parallel mit den beiden EcoRl/BgIII Subfragmenten der Saccharosesynthase aus Mais (Worrell et al., 1991, Plant Cell 3, 1121-1130) sondiert. Die den Hybridisierungssignalen entsprechenden rekombinanten Phagen wurden vereinzelt. Durch in vivo Excision wurden Plasmide aus dem Lambda zap-Genom ausgeschnitten, die eine doppelsträngige cDNA als Insertion tragen. Die Plasmide wurden in Bakterienzellen transformiert. Anschließend wurde die Plasmid-DNA in den Bakterien vermehrt. Nach Überprüfung der Größe der Insertionen wurden einzelne Klone durch Bestimmung der Primärsequenz analysiert.
Ausführungsbeispiel 4 Bestimmung der Nukleotidsequenzen von ADP-Glukose-Pyrophosphorylase, Saccharosephosphat-Synthase und Saccharosesynthase aus Zuckerrüben sowie Ableitung der entsprechenden Aminosäuresequenzen
Die Nukleotidsequenzen der nach den Ausführungsbeispielen 1-3 erhaltenen Insertionen wurden nach Standardverfahren mittels der Dideoxymethode (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467) bestimmt. Die Nukleotidsequenzen und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen sind in den Sequenzprotokollen Seq. ID Nr. 1-4 angegeben.
SEQ ID NO: 1
ART DER SEQUENZ: Nucleotid mit entsprechendem Protein
SEQUENZLÄNGE: 1924 Basenpaare
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: cDNA
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT
ORGANISMUS: Beta vulgaris
UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: cDNA Bibliothek im Phagen Lamda zap
MERKMALE:
von 206 bis 1770 Kodierregion
EIGENSCHAFTEN:
ADP-Glukose-Pyrophosphorylase, große Untereinheit
SEQ ID NO: 1
SEQUENCE TYPE: Nucleitide with corresponding protein
SEQUENCE LENGH: 1924 base pairs
STRANDEDNESS: single
TOPOLOGY: linear
MOLECULE TYPE: cDNA
ORIGINAL SOURCE
ORGANlSM: Beta vulgaris
IMMEDLATE EXPERIMENTAL SOURCE: cDNA library in Phage Lamda zap
FEATURES:
from 206 to 1770 coding region
PROPERIES: ADP-Glucose-Pyrophosphorylase, large subunit
SEQ ID NO: 2
ART DER SEQUENZ: Nucleotid mit entsprechendem Protein
SEQUENZLÄNGE: 1763 Basenpaare
STRANG FORM: Einzelstrang
TOPOLOGlE: linear
ART DES MOLEKÜLS: cDNA
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT
ORGANISMUS: Beta vulgaris
UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: cDNA Bibliothek im Phagen Lamda zap
MERKMALE:
von 3 bis 1469 Kodierregion
EIGENSCHAFTEN:
ADP-Glukose-Pyrophosphorylase kleine Untereinheit
SEQ ID NO: 2
SEQUENCE TYPE: Nucleitide with corresponding protein
SEQUENCE LENGH: 1763 base pairs
STRANDEDNESS: single
TOPOLOGY: linear
MOLECULE TYPE: cDNA
ORIGINAL SOURCE
ORGANISM: Beta vulgaris
IMMEDIATE EXPERIMENTAL SOURCE: cDNA library in Phage Lamda zap
FEATURES:
from 3 to 1469 coding region
PROPERIES: ADP-Glucose-Pyrophosphorylase, small subunit
SEQ ID NO: 3
ART DER SEQUENZ: Nucleotid mit entsprechendem Protein
SEQUENZLÄNGE: 3635 Basenpaare
STRANG FORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: cDNA
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT
ORGANISMUS: Beta vulgaris
UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: cDNA Bibliothek im Phagen Lamda zap
MERKMALE:
von 31 bis 3164 Kodierregion
EIGENSCHAFTEN:
Saccharosephosphat-Synthase
SEQ ID NO: 3
SEQUENCE TYPE: Nucleitide with corresponding protein
SEQUENCE LENGH: 3635 base pairs
STRANDEDNESS: single
TOPOLOGY: linear
MOLECULE TYPE: cDNA
ORIGINAL SOURCE
ORGANISM: Beta vulgaris
IMMEDLATE EXPERIMENTAL SOURCE: cDNA library in Phage Lamda zap
FEATURES:
from 31 to 3164 coding region
PROPERIES: Saccharosephosphat-Synthase
SEQ ID NO: 4
ART DER SEQUENZ: Nucleotid mit entsprechendem Protein
SEQUENZLÄNGE: 2563 Basenpaare
STRANG FORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: cDNA
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT
ORGANISMUS: Beta vulgaris
UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: cDNA Bibliothek im Phagen Lamda zap
MERKMALE:
von 3 bis 2300 Kodierregion
EIGENSCHAFTEN:
Saccharosesynthase
SEQ ID NO: 4
SEQUENCE TYPE: Nucleitide with corresponding protein
SEQUENCE LENGH: 2563 base pairs
STRANDEDNESS: single
TOPOLOGY: linear
MOLECULE TYPE: cDNA
ORIGINAL SOURCE
ORGANISM: Beta vulgaris
IMMEDIATE EXPERIMENTAL SOURCE: cDNA library in Phage Lamda zap
FEATURES:
from 3 to 2300 coding region
PROPERIES: Saccharosesynthase

Claims (9)

1. DNA-Sequenz mit der kodierenden Region für die große Untereinheit der ADP- Glukose-Pyrophosphorylase zur Herstellung von Zuckerrüben mit veränderter Saccharose-Konzentration, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz die folgende Nukleotidabfolge (Seq. ID No. 1) hat:
2. DNA-Sequenz mit der kodierenden Region für die kleine Untereinheit der ADP- Glukose-Pyrophosphorylase zu Herstellung von Zuckerüben mit veränderter Saccharose-Konzentration, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz die folgende Nukleotidabfolge (Seq. ID No. 2) hat:
3. DNA-Sequenz mit der kodierenden Region für Saccharosephosphat-Synthase zur Herstellung von Zuckerrüben mit veränderter Saccharose-Konzentration, dadurch gekennzeichnet, daß diese Sequenz die folgende Nukleotidabfolge (Seq ID No. 3) hat:
4. DNA-Sequenz mit der kodierenden Region für Saccharosesynthase zur Herstellung von Zuckerrüben mit veränderter Saccharosekonzentration, dadurch gekennzeichnet, daß diese Sequenz die folgende Nukleotidabfolge (Seq. ID No. 4) hat:
5. Derivate von DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß diese Derivate durch Austausch einzelner Basen oder durch zielgerichtete oder nicht-zielgerichtete Mutagenese erhalten werden.
6. Plasmide enthaltend
  • a) einen geeigneten Promotor, der sicherstellt, daß die kodierende Sequenz zum geeigneten Zeitpunkt oder in einem bestimmten Entwicklungszustand in der transgenen Zuckerrübe oder in bestimmten Geweben von transgenen Zuckerrübenpflanzen abgelesen wird,
  • b) mindestens eine kodierende Sequenz für Zuckerrübe gemäß den Ansprüchen 1-5, die
    • i) so an den Promotor gekoppelt ist, daß die Bildung einer in ein Protein translatierbaren RNA erlaubt wird, wobei das Protein eine enzymatische Aktivität aufweist, die zu einer Veränderung der Saccharosekonzentration in der Pflanze führt oder
    • ii) die so an den Promotor gekoppelt ist, daß der nicht-kodierende Strang abgelesen wird, was zur Bildung einer sog. "anti-sense" RNA führt, die die Bildung des von einem endogenen Gen in der Pflanze kodierenden Proteins, das in der Saccharosebiosynthese involviert ist, unterdrückt und
  • c) eine nicht-kodierende Terminations-Sequenz, die die Signale zur Termination des Transkriptes über eine Poly-Adenylierung enthält, umfaßt.
7. Verwendung der DNA-Sequenzen und Plasmide gemäß den Ansprüchen 1-6, zur Herstellung von Zuckerrüben mit veränderter Saccharose-Konzentration.
8. Verwendung der DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1-4 zur Herstellung von Derivaten durch zielgerichtete oder nicht-zielgerichtete Mutagenese.
9. Zuckerrüben, enthaltend eine DNA-Sequenz gemäß den Ansprüchen 1-5.
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