SE537679C2 - Genetisk modifierad Beta vulgaris - Google Patents

Abstract

SAMMANDRAG Foreliggande uppfinning hanfor sig till vaxtceller och vaxter, vilka är genetiskt modifierade, varmed den genetiska modifieringen leder till en andring i lagringsforeningsdeponering i palrot hos Beta vulgaris, sa.som palrot hos sockerbeta eller palrot hos foderbeta. Genom andringen sá ackumulerar palroten hos vaxterna starkelse jamfort med de motsvarande palrotterna has vildtypsvaxt. Utover detta avser uppfinningen medel och metoder for tillverkningen av sa.dana vaxtceller och vaxter. Foreliggande uppfinning avser aven starkelsen syntetiserad fran palroten has dessa vaxter, metoder for att tillverka dessa starkelser. Vidare hanfor sig aven foreliggande uppfinning till nukleinsyror, kodande for generna involverade i syntesen av starkelse, vektorer, vardceller, vaxtceller, och vaxter innehallande sadana nukleinsyramolekyler.

Description

Genetisk modifierad Beta vulgaris UPPFINNINGENS OMRADE Foreliggande uppfinning hanfor sig till vaxtceller och vaxter, vilka är genetiskt modifierade, varmed den genetiska modifieringen leder till en forandring av lagringsforeningsdeponering i palrot hos Beta vulgaris, sasom palrot fran sockerbeta eller palrot fran foderbeta. Genom forandringen, sâ ackumulerar vaxtens pa.lrot starkelse i jamforelse med motsvarande vildtypsvaxtenspalrot som nastan enbart ackumulerar sackaros. Utover detta, sá avser foreliggande uppfinning medel och metoder for att framstalla sadana vaxtceller och vaxter. Foreliggande uppfinning avser Oven starkelsen som syntetiseras i pakoten hos dessa vaxter och metoder for att framstalla starkelsen. Vidare hanfor sig aven foreliggande uppfinning till funktioner hos och motsvarande nukleinsyror, kodande for gener involverade i och underhallande syntesen av starkelse, vektorer, vardceller, vaxtceller och vaxter innehallande sadana nukleinsyramolekyler.

UPPFINNINGENS BAKGRUND StarkeIse är den huvudsakliga lagringsforening som extraheras fran grodor skordade i jordbruk runt om i varlden. De huvudsakliga grodorna som anvands for starkelseproduktion är majs, vete, potatis och kassava. Potatis och kassava är exempel pa viktiga stamknolar eller rotknolar for starkelseproduktion.

I Europa är potatis en viktig starkelsegroda. Arligen uppgar produktionen till nastan 2 miljoner ton. Den huvudsakliga produktionen sker i norra Europa och de storsta produktionslanderna är Tyskland och Holland. En annan groda av betydelse for extrahering av material är sockerbeta dar den huvudsakliga extraherade produkten är sackaros. Sackaros är i huvudsak exportprodukten fran fotosyntesen vilken i potatis konverteras till starkelse i rotknolarna sá kan det aven vara mojligt att forandra sockerbetan till en starkelsegroda. I jamforelse med potatis, sa har sockerbeta en hogre produktivitet, kraver en mindre mangd vatten och kemikalier, den hanteras som en vanlig frogroda i jamforelse med utsadesknolar fran potatis och den är aven mindre arbetskravande pa faltet. Vidare sá är aven sockerbetan mer frosttolerant an potatis vilket ger mojlighet till langre kampanjer for produktion av den uppkomna produkten. Denna sista del ar mycket viktig i en bransch dar infrastrukturen for produktion anyands under en begransad tid, det vill saga host for potatisstarkelseproduktion. En okad kampanjperiod skulle kunna öka anvandningen och kostnadseffektiviteten f6r produktionsfaciliteter.

FOljaktligen skulle sockerbeta som producerar starkelse i palrotterna istallet for sackaros kunna vara ett overlagset alternativ till potatis for produktionen av starkelse i anlaggningar 1 som for narvarande anvands for potatisstarkelseproduktion. Fran ett fysiologiskt perspektiv sa kan potatis och sockerbeta bearbetas for starkelseproduktion i samma anlaggningar med vissa modifikationer.

For starkelse finns manga viktiga tillampningar inom livsmedel saval som inom tekniska tillampningar. Fram tills nu sá har starkelsen fysikaliskt eller kemiskt modifierats for att for att optimera anvandningen for olika tillampningar. Huvudsaklig anvandning av starkelse inom livsmedelsindustrin är som ett fortjockningsmedel och for belaggning av matprodukter. I tekniska tillampningar sa anvands stora mangder av starkelse i pappersindustrin sa.val som i textilindustrin. Andra anvandningar är i dispersioner, adhesiver och borrapplikationer.

StarkeIse aterfinnes som sma granuler vars form och storlek beror pa botaniskt ursprung. StarkeIse är en polymer av glukosenheter och en blandning av tva olika komponenter eller molekyler, dvs amylopektin och amylos. Amylopektin är en mycket star forgrenad molekyl och amylos är avsevart mindre och i huvudsak linjar. Baba innehaller samma kemiska bindningar mellan glukosenheterna Vanliga stam- eller rotknolsstarkelser är sammansatta av 75-80% amylopektin och 20-25% amylos av vikt. StarkeIse är en mycket vanlig lagringskomponent bland forstorade primara rotter och stamknolar aven am de absoluta mangderna av farsk eller torr vikt kan variera beroende pa Ulla. StarkeIse kan fargas av jod och denna fargning kan med latthet visualiseras med bara ogat eller genom anvandning av ett mikroskop. Vad som är ovanligt bland palrots- och rotknolgrodor är att man inte kan se nagon fargning med jod has sockerbeta och nagra starkelsestrukturer kan inte heller visualiseras under ett mikroskop.

StarkeIse bildas i plastider som är subcellulara organeller. I fotosyntetiska celler kallas dessa kloroplaster medan i heterotrofa organ kallas de amyloplaster aven am starkelse bildas i bada differentieringarna av plastidorganeller. I dikotyledoner, sa importeras glukos-6-fosfat in i amyloplasten och konverteras darefter till glukos-1-fosfat genom plastidiskt fosfoglukomutas. Glukos-1-fosfat konverteras sedan till ADP-glukos genom ADP-glukospyrofosforylas genom anvandning av ATP med PPi som en biprodukt. I vaxter är ADPglukos-pyrofosforylas en heterotetramer som bestar av tva olika subenheter, en star och en liten. Olika losliga starkelsesyntaser polymeriserar ADP-glukos till a-1, 4-lankade glukosrester. De olika formerna av losligt starkelsesyntas har visat sig vara ansvarigt for olika kedjelangder i amylopektinet. Ett starkelsesyntas bundet till starkelse är ansvarigt for syntesen av den langa a-1, 4-kedjorna av amylos. Starkelseforgrenande enzymer är ansvariga for a-1, 6-lankningarna av speciellt amylopektin via brytning av en kedja vid en a1, 4-lankning och fasta den i en a-1, 6-position pa ett annat stalle. Foljaktligen sá ges ingen ny nettoproduktion av starkelse genom det starkelseforgrenande enzymet utan enbart en 2 omarrangering. For att starkelsemolekylerna eller mer specifikt amylopektinet skall samlas i sin starkeslegranulatstruktur, har det visat sig att isoamylaser är viktiga for denna sammanslagning.

SAMMANFATTNING AV UPPFINNINGEN Andamdlet med fareliggande uppfinning är att producera starkelse i pairoten hos underarter av Beta vulgaris sasom sockerbeta, foderbeta och strandbeta. Produktion av starkelse har tills nu inte pavisats i palroten hos Beta vulgaris vilken normalt anvands for produktionen av sacker och da primart i formen av sackaros.

I en aspekt hanfor sig uppfinningen till en genetiskt modifierad Beta vulgaris som ar underart till sockerbeta-, fodervaxt- eller strandbeta-vaxt och som har starkelseackumulering i palroten. Genom att anvanda genetisk modifiering for att introducera nya gener saval som for att rikta de motsvarande polypeptiderna till plastiden sá är det for forsta garigen mojligt att producera starkelse i palroten has Beta vulgaris. Foljaktligen sâ är det for forsta gangen mojligt att anvanda Beta vulgaris inom omradet for starkelseproduktion vilket gör starkelseextrahering mer flexibel och mojlig att utfora under langre perioder av dret inom industrin som anvander potatis for starkelseextrahering. Anvandningen av Beta vulgaris inom denna typ av produktion har vidare fordelarna med att minska insatsen vid odling i form av arbete, vatten och kemikalier.

I en andra aspekt, sá hanfor sig uppfinningen till genetiskt modifierad vdxtcell av Beta vulgaris innefattade alminstone en heterolog gen vald frail gruppen besta.ende av SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 12 eller 14 eller en gen som har 70, 75, 80, 85, 90, 95 eller 99% identitet med SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 12, eller 14.

I en tredje aspekt hanfor sig uppfinningen till en genetiskt modifierad Beta vulgarisvaxt cell som kodar for alminstone en polypeptid vald fran gruppen bestdende av SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, eller 10 eller en heterolog polypeptid som har 70, 75, 80, 85, 90, 95 eller 99% identitet med SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 eller 10.

I en fjarde aspekt hanfor sig uppfinningen till en metod for att tillverka starkelse frail en genetiskt modifierad Beta vulgaris i enlighet med nagot av de foregdende patentkraven som har starkelseackumulering i paloten innefattande att extrahera starkelse fran pakoten.

I en femte aspekt hanfor sig uppfinningen till starkelse erhallen fran den genetiskt modifierade Beta vulgaris som definierat ovan. 3 I en slutlig aspekt hanfor sig uppfinningen till anvandningen av den erhallna starkelsen i tekniska och i livsmedelstillampningar.

Ytterligare fordelar och andamal med foreliggande uppf inning kommer att beskrivas i mer detalj, bland annat med referens till de medfoljande ritningarna.

KORT BESKRIVNING AV RITNINGARNA Fig 1 beskriver en generisk plastid med kolforeningsflode och omvandling fran glukos-6- fosfat till starkelse omfattande energiimport vilket behovs for starkelsebiosyntes. Forklaringar av forkortningar av funktioner enligt uppfinningen; OPT = G-6-P/Pi-antiporter, pPGM = plastidiskt fosfoglukomutas, AGPas = ADP-glukospyrofosforylas, PPa6 = plastidiskt oorganiskt pyrofosfatas och NTT = ATP/ADP-translokator. Fig 2 visar en vektorkarta innehallande en Solanum tuberosum PPa6-gen, tillverkad genom anvandning av rekombinering vilket är indikerat med de narvarande attB-stdllena.

Fig 3 visar en vektorkarta innehallande en Solanum tuberosum NTT1-gen, tillverkad genom anvandning av rekombinering vilket är indikerat med de narvarande attB-stdllena.

Fig 4 visar en vektorkarta innehallande Solanum tuberosum PPa6- och NTT1-gener tillverkad genom dubbel rekombinering vilket är indikerat med de narvarande attB-stallena. Fig 5 visar en process for tillverkningen av starkelse.

DETALJERAD BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN Definitioner I sammanhanget for foreliggande ansokning och uppf inning filial-I-pas de foljande definitionerna: Termen "pa.lrot" avses betyda en forstorad, tamligen rak till spetsig vaxtrot som vaxer nedat. Den bildar ett centrum fran vilket andra ratter gror lateralt.

Termen "genetisk modifiering" avser introduktionen av homologa och/eller heterologa frammande nukleinsyramolekyler in i genomet hos en vaxtcell eller in i genomet has en vaxt, varvid namnda introduktion av dessa molekyler leder till en ackumulering av starkelse i palroten has en utvecklad vaxt.

Termen "heterolog" som den anvandes hari beskriver ett forhallande mellan tvá eller fler element vilka indikerar att elementen inte normalt aterfinnes i ndrhet till varandra i naturen. Foljaktligen, till exempel, sa ãr en polynukleotid "heterolog till" en organism eller en andra polynukleotidsekvens am den har sitt ursprung i en frammande art, eller, am fran samma art, den har modifierats fran dess ursprungliga form. Till exempel sâ ref ererar en promotor som är operabelt lankad till en heterolog kodande sekvens till en kodande sekvens fran en art som är en annan an den fran vilken promotorn harstammade, eller, am fran samma art, en 4 kodande sekvens vilken inte är naturligt associerad med promotorn (till exempel en genetiskt manipulerad kodande sekvens eller en allell fran en annan ekotyp eller variant). Ett exempel pa en heterolog peptid är en polypeptid som uttrycks fran en rekombinant polynukleotid i en transgen organism. Heterologa polynukleotider och polypeptider är former av rekombinanta molekyler.

Beta vulgaris Beta vulgaris, till exempel sockerbeta, producerar som andra vaxter starkelse i gron vavnad nar fotosyntes är mer aktiv och mer sackaros produceras i kallvavnader an vad som kan anvandas i heterotrofa vavnader. Starkelsen lagras som granuler pa samma satt som mer langsiktig lagringsstarkelse men bryts ner under vane mork period som en del av dagscykeln. Avsaknaden av starkelse i pa.lrot hos sockerbeta gör att det kan det antas att viss central aktivitet av starkelsesyntes eller hopsattning saknas i pa.lrot hos sockerbeta. Palsternacka är en rotgroda vilken mestadels lagrar starkelse men aven till viss grad sockerarter i palroten och valdes darfor som en relevant jamforelse med avseende pa vilka starkelsebiosyntetiska aktiviteter som skulle kunna detekteras i sockerbeta och till vilken grad de manifesterades.

Var mikroskopiska analys av palrot under utveckling avslojade ett gemensamt forsta utvecklingsstadium vilket aven kan synas i andra lagringsvavnader under jord. Det är celler som är fyllda med en expanderad vakuol innehallande sacker. Med utveckling, kommer palsternacka- och andra starkelselagrande vavnader under jord att initialt bilda sma starkelsegranuler vilka är forskjutna till ytterkanterna av cellen av vakuolen. Senare i utvecklingen sá fortsatter starkelsegranulerna att vaxa pa bekostnad av rummet som finns tillgangligt f6r vakuolen. Sam en kontrast sã uppvisar celler fran palrot has sockerbeta en huvudsakligen oforandrad cellstruktur genom hela utvecklingen med en star vakuol. Foljaktligen verkar lagringsceller Iran sockerbeta kvarsta i ett juvenilt tillstand genom hela utvecklingen. Da starkelse till viss omfattning produceras i kanda lagringsorgan under jord sa kan det spekuleras i am det finns nagon defekt i enzymaktiviteten i palrot has sockerbeta vilket resulterar i en fullstandig avsaknad av starkelseproduktion.

Undersokning av centrala biosyntetiska aktiviteter som ADP-glukos-pyrofosforylas, losligt starkelsesyntas och forgrenade enzymaktiviteter analyserades och jamfordes. Overraskande sá kunde enzymaktiviteter som var nadvandiga for produktionen av starkelse aterfinnas i palrot has sockerbeta och vidare pa en niva i samma omfattning som i ett jamforbart organ av en starkelselagrande groda. Foljaktligen sa finns det ett starkelse-biosyntetiskt maskineri tillgangligt i palroten has sockerbeta vilket av andra skal an centrala biosyntetiska aktiviteter inte kanaliserar exporterat kol fran kallvavnader till starkelse i heterotrof vavnad utan enbart sackaros.

Transkriptomanalys av palrot hos sockerbeta under utvecklingen utfordes. Detta genomfordes med transkriptomet fran palrot hos palsternacka som en jamforelse dá palsternacka deponerar starkelse saval som socker i palroten under utveckling. Vad som kunde noteras fran denna analys var att det mesta av starkelse-biosyntesgenerna uttrycktes pa en lagre niva men detta kunde inte forklara den fullstandiga avsaknaden av starkelse. Detta understodjes aven av de olika enzymanalyserna vilka vi fann vara inom samma omfattning for bada arter. De fiesta andra generna som kodar for enzymer involverade i metabolisk bearbetning av socker befanns uttryckas i bada arter. Ett antal gener vilkas produkter utovar eller skulle kunna forutses att utova kontrollpunkter med avseende pa ackumuleringen av starkelse identifierades och vilkas uttryck till olika omfattningar framjar starkelseackumulering. Fran dessa gener, sá kunde fern klart identifieras som att ha en avsevart lagre transkriptionsniva i ett utvecklingsstadium hos palrot hos sockerbeta som jamfort med den hos palrot hos plasternacka, dessa fern funktioner framhavs i figur 1.

Gener och enzymer for produktionen av starkelse StarkeIse produceras i speciella organeller kallade plastider. Generellt sa innehaller gener och kodade enzymer en signalsekvens av betydelse for makiktning av ett enzym till plastiden. For fackmannen inom omradet sá är det tydligt att denna signalsekvens skulle kunna bytas ut till andra signalsekvenser som riktas mot proteinet tillhandahallande en specifik funktion till plastiden. Granskningen av databaser, sasom gjorts tillgangliga, till exempel genom EMBL-websidan (se Toolbox vid EBI) eller NCBI (National Center for Biotechnology Information) websidan, kan ocksa anvandas for att identifiera homologa sekvenser till generna namnda ovan, vilka kodar for de olika polypeptiderna namnda nedan. I detta fall, sa specificeras en eller flera sekvenser som en sa kallad fraga (eng. query). Denna fragesekvens jamfors sedan med hjdlp av statistiska datorprogram med sekvenser vilka är innehallna i de utvalda databaserna. Sadana databasforfragningar (till exempel blast- eller fasta-sokningar) är kanda for fackmannen inom omradet och kan utforas genom olika leverantorer.

Om en sadan databasforfragan utfors, till exempel vid NCBI (National Center for Biotechnology Information) websidan, dá ska standardinstallningar, vilka är specificerade for den speciella jamforelseforfragan, anvandas. For proteinsekvensjamforelser (blastp), sa finns det foljande installningarna: Limit entrez=not activated; Filter=low complexity activated; Expect value=10; word size=3; Matrix=BLOSUM62; Gap costs: Existence=11, Extension=1. For nukleinsyrajamforelser (blastn), sá maste de foljande parametrarna sattas: Limit entrez=not activated; Filter=low compexity activated; Expect value=10; word size=11. 6 Med en sadan databassokning, sá kan sekvenserna beskrivna i foreliggande uppf inning anvandas som en fragesekvens for att identifiera ytterligare nukleinsyramolekyler och/eller proteiner, tillhandahallande funktioner vilka skulle kunna anvandas for att ackumulera starkelse i palroten av Beta vulgaris.

Med hjalp av de beskrivna metoderna, sá är det amen mojligt att identifiera och/eller isolera nukleinsyramolekyler i enlighet med uppfinningen, vilka hybridiserar med sekvensen specificerad under SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 12 och 14, vilka kodar for olika polynukleotider vilka är namnda nedan. lnom omfattningen for foreliggande uppfinning, sá avser termen "hybridisering" hybridisering under konventionella hybridiseringsforhallanden, foretradesvis under stranga forhallanden sasom till exempel som beskrivna i Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, tredje upplagan (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbour, N.Y. ISBN:0879695773, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; femte upplagan (2002), ISBN:0471250929). I synnerhet avser foretradesvis "hybridisering" hybridisering under de foljande forhallandena.

Hybridiseringsbuffert: 2.ganger.SSC; 10.ganger.Denhardtlosning (Ficoll 400+PEG+BSA; Kvot 1:1:1); 0,1% SDS; 5 mM EDTA; 50 mM Na2HPO4; 250 pg/mIsillsperma DNA; 50 pg/mItRNA; eller 25 M natriumfosfatbuffert pH 7,2; 1 mM EDTA; 7% SDS Hybridiseringstemperatur: T=65 till 68 grader C. Tvattbuffert: 0.1.ganger.SSC; 0,1% SDS Tvattemperatur: T=65 till 68.grader. C. I princip, sá kan nukleinsyramolekyler, vilka hybridiserar med nukleinsyramolekylerna i enlighet med uppfinningen, ha sitt ursprung frail vilken vaxtart som heist, vilken kodar for ett protein som tillhandahaller en lamplig funktion, foretradesvis sa har de sitt ursprung frail starkelselagrande vaxter och uttrycks i lagringsorgan under jord, men om samma funktion kan tillhandahallas sá är dess ursprung inte av betydelse. Nukleinsyramolekyler, vilka hybridiserar med molekylerna i enlighet med uppfinningen, kan, till exempel, isoleras fran genomiskt eller fran cDNA-bibliotek. ldentifieringen och isoleringen av nukleinsyramolekyler av denna typ kan utforas genom att anvanda nukleinsyramolekylerna i enlighet med uppfinningen eller delar av dessa molekyler eller de motsatta komplementen till dessa molekyler, till exempel genom hybridisering i enlighet med standardmetoder (se till exempel, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, tredje upplagan, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. ISBN: 0879695773, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5th edition (2002), ISBN: 0471250929) eller genom amplifiering genom att anvanda PCR.

Nukleinsyramolekyler, vilka exakt eller i huvudsak har nukleotidsekvensen specificerad under SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 12 och 14 eller delar av dessa sekvenser, kan anvandas som hybridiseringsprov. Fragmenten som anvands som hybridiseringsprover kan aven vara 7 syntetiska fragment eller oligonukleotider, vilka har tillverkats genom att anvanda etablerade syntetiseringstekniker och sekvensen vilken i huvudsak motsvarar den hos en nukleinsyramolekyl i enlighet med uppfinningen.

I samband med foreliggande uppf inning, sá avser termen "identitet" en sekvensidentitet over hela langden av den kodande regionen med avdrag av flagon sekvens kodande for malinriktade signaler av atminstone 70%, sasom 85%, 90%, 950/0 960/0 9-0, / /0 98% eller 99%. I samband med foreliggande uppf inning, sá avses termen "identitet" avse antalet aminosyror/nukleotider (identitet) motsvarande andra proteiner/nukleinsyror, uttryckt som ett procenttal. ldentitet bestams foretradesvis genom att jamfora SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 11, 13, eller 15 for aminosyror SEQ 10 NO:1, 3, 5, 7, 9, 12 eller 14 for nukleinsyror med andra proteiner/nukleinsyror med hjalp av datorprogram. Om sekvenser som jamfors med varandra har olika langder, sâ skall identiteten bestammas pa ett saclant satt att antalet aminosyror, vilka har den kortare sekvensen gemensamt med den langre sekvensen, bestammer procentkvoten hos identiteten. Foretradesvis sá bestams identitet med hjalp av datorprogrammet ClustalW, vilket är valkant och tillgangligt for allmanheten (Thompson et al., Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680). ClustalW Ors allmant tillgangligt genom Julie Thompson (Thompson@EMBL-Heidelberg.DE) och Toby Gibson (Gibson@EMBLHeidelberg.DE), European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofstrasse 1, D 69117 Heidelberg, Germany. ClustalW kan aven laddas ned fran olika Internetplatser, inkluderande IGBMC (Institut de Genetique et de Biologie Moleculaire et Cellulaire, B.P.163, 67404 Illkirch Cedex, France; ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/)och EBI (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/)) saval som frail alla speglade Internetplatser frail EBI (European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK).

I.Glukos-6-fosfat/fosfattranslokator (SEQ ID NO:1 och 2) I en aspekt s hanfor sig uppfinningen till en genetiskt modifierad Beta vulgaris, sasom sockerbeta, foderbeta eller strandbeta vilken har en av flera gener som har introducerats in i vaxten och vaxtcellerna, varvid den introducerade genen är involverad i produktionen av starkelse. En av generna kan vara en gen kodande for en Glukos-6-fosfat/fosfattranslokator visad i SEQ ID NO:1 och 2 eller en heterolog gen eller peptid som har 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 eller 99% identitet med SEQ ID NO:1 eller 2. Glukos-6-fosfatgosfattranslokatorn är aktiv vid plastidorganellmembranet i en antiporteraktivitet som importerar hexosfosfat in i plastiden i utbyte for fosfat. Denna translokator är av betydelse for importen av glukos-6- fosfat in i plastiden där glukos-6-fosfat är en nodvandig prekursor for starkelsebiosyntes i heterotrofa organ. Tva former uttrycks i palsternacka, men an viktigare är att enbart en uttrycks i palrot hos sockerbeta. 8 Plastidiskt fosfoglukomutas (SEQ ID NO:3, 4 och 11) I en annan aspekt sá hanfor sig uppfinningen till en genetiskt modifierad Beta vulgaris, sasom sockerbeta, foderbeta eller strandbeta vilken har en av flera av dess gener som har introducerats in i vaxten och vaxtceller, varvid den introducerade genen är involverad i produktionen av stdrkelse. En av generna kan vara en gen som kodar for ett plastidiskt fosfoglukomutas visat i SEQ ID NO: 3, 4, och 11 eller en heterolog gen eller peptid som har 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 eller 99% identitet till SEQ ID NO:2, 3 eller 11. Plastidiskt fosfoglukomutas katalyserar interkonversionen av glukos-6-fosfat och glukos-1-fosfat via fosfotransferasaktivitet. Det plastidiska fosfoglukomutaset kan foljaktligen transformera glukos-6-fosfat som importerats in i plastiden till glukos-1-fosfat vilken är en prekursor nedstroms om glukos-6-fosfat i starkelsebiosyntes. Kvoten mellan plastidisk fosfoglukomutasuttryck i palsternacka jarnfort med sockerbeta fanns vara hog.

Stor subenhet av ADP-glukos-pyrofosforylas (SEQ ID NO:5 och 6) I en annan aspekt hanfor sig uppfinningen till en genetiskt modifierad Beta vulgaris, sasom sockerbeta, foderbeta eller strandbeta vilken har en av flera av dess gener som har introducerats in i vaxten och vdxtcellerna, varvid den introducerade genen är involverad i produktionen av stdrkelse. En av generna kan vara en gen som kodar for en stor subenhet av ADP-glukospyrofosforylas visad i SEQ ID NO:5 och 6 eller en heterolog gen eller peptid som har 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 eller 99% identitet med SEQ ID NO:5 och 6. ADPglukospyrofosforylas katalyserar produktionen av ADP-glukos genom att anvanda glukos-1- fosfat och ATP som substrat. Detta enzymatiska steg tillhandahailer det direkta aktiverade sockersubstratet for stdrkelsebiosyntes och syns som det forsta steget som hanfor sig till starkelsebiosyntes. I vaxter sá är ADP-glukos-pyrofosforylas en heterotetramer pa 2 stora subenheter och 2 sma subenheter amen om generna som kodar for bada typer av subenheter innehaller omfattande homologi. Tva olika former av stora subenheter befanns uttryckas i palotter hos bada arter. Bada formerna av stora subenheter i sockerbeta befanns uttryckas pa en ganska lag niva och sá var dven en form i palsternacka medan en form i palsternacka befanns vara Mgt uttryckt och pa en mycket hogre niva an den hogst uttryckta stora subenhetsformen i sockerbeta.

ATP/ADP-translokator (SEQ ID NO:7, 8, 12 och 13) I en annan aspekt sá hdnfor sig uppfinningen till en genetiskt modifierad Beta vulgaris, sasom sockerbeta, foderbeta eller strandbeta vilken har en av flera gener som har introducerats in i vaxten och vdxtceller, varvid den introducerade genen är involverad i produktionen av starkelse. En av generna kan vara en gen som kodar for en ATP/ADP- 9 translokator visad i SEQ ID NO:7, 8, 12 och 13 eller en heterolog gen eller peptid som har 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 eller 99% identitet med SEQ ID NO: 7,8, 12 och 13. ATP/ADP-translokatorn tillhandahaller energi i formen av ATP till plastiden i ett motutbyte av ADP vid plastidmembranet. ATP krams av ADP-glukospyrofosforylas i produktionen av det aktiverade socker-ADP-glukos vilket är ett direkt substrat for starkelsebiosyntes via starkelsesyntaser. Tva olika men valdigt nara beslaktade former befanns uttrycktas i palrot frail palsternacka med en form pa valdigt lag niva. En form av ATP/ADP-translokatorn befanns uttryckas i sockerbeta. Kvoten av uttryck av ATP/ADP-translokator mellan de tva arterna befanns vara mycket hog med det hogre uttrycket i palsternacka.

V.Plastidiskt oorganiskt pyrofosfatas (SEQ ID NO:9, 10, 14 och 15) I en annan aspekt sá hanfor sig uppfinningen till en genetiskt modifierad Beta vulgaris, sasom sockerbeta, foderbeta eller strandbeta vilken har en av flera gener som har introducerats in i vaxten och vdxtceller, varvid den introducerade genen är involverad i produktionen av starkelse. En av generna kan vara en gen som kodar for ett plastidisk oorganiskt pyrofosfatas visat i SEQ ID NO:9, 10, 14 och 15 eller en heterolog gen eller peptid som har 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 eller 99% identitet med SEQ ID NO: 9, 10, 14 och 15. Oorganiskt pyrofosfatas delar pyrofosfat i tva enheter av oorganiskt fosf at. Pyrofosfat är en biprodukt av ADP-glukosproduktion genom ADP-glukospyrofosforylas. Som en biprodukt sâ behover fosfat transporteras ut ur plastiden for att inte ha en inhibitorisk effekt pa starkelsebiosyntes. En form av det plastidiska oorganiska pyrofosfataset uttrycks i palsternacka saval som palrot hos sockerbeta. I palsternacka sá uttrycks denna gen pa en mycket hogre niva jamfort med i palrot hos sockerbeta.

I en annan aspekt sá hanfor sig denna uppfinning till en genetiskt modifierad Beta vulgaris, sasom sockerbeta, foderbeta eller strandbeta vilken har 1, 2, 3, 4, 5 eller flera gener introducerade i genomet hos vaxten, varvid namnda gener är involverade i produktionen av starkelse. Starkelsen kan visualiseras genom ett mikroskop och/eller jod.

Foljaktligen aterfanns fem gener av betydelse for att stodja stdrkelsebiosyntes och att ha ett mycket hogre uttryck i starkelseackumulerande palrot under utveckling sasom palsternacka jamfort med den exklusivt sackarosackumulerande palroten hos sockerbeta.

Aven om de namnda generna inte befanns vara fullstandigt tysta i palrot hos sockerbeta sa bestamdes de ha suboptimalt uttryck och i vissa exempel sakna tillracklig manifestation for att driva stdrkelsebiosyntes. I synnerhet sá behovs uttryck av ATP/ADP-translokatorn for att forse ett heterotroft organ sasom sockerbeta med tillräcklig energi for stdrkelsebiosyntes och 10 ATP som behovs for produktionen av ADP-glukos genom ADP-glukos-pyrofosforylas vilket bildar det forsta steget som hanfor sig till biosyntes av stdrkelse. ldentifierade gener kodar for enzymer och transportorer som tillhandahaller funktioner av betydelse for start av starkelseackumulering i palrot hos sockerbeta. Start av starkelsesyntes kan astadkommas genom uppreglering i den lampliga vavnaden av nativa Beta vulgarisgener tillhandahallande de identifierade funktionerna. Emellertid kan gener som tillhandahaller de identifierade funktionerna dven isoleras frail andra kdllor och uttryckas i den lampliga vavnaden hos sockerbeta. En uppenbar kdlla fran vara utforda studier skulle kunna vara palsternacka. En annan kdlla till gener tillhandahallande namnda funktioner skulle kunna vara potatis. Det kan vara en skillnad i funktionell effektivitet hos namnda funktioner beroende pa genkalla. Gener tillhandahallande enzymer och funktioner redan i drift i lagringsvdvnader under jord sasom potatis skulle kunna vara en foredragen kdlla dven om onskade effekter med avseende pa start av starkelseackumulering i palrot has sockerbeta skulle kunna tillhandahallas av gener tillhandahallande samma funktioner fran andra källor. Selektionen av genkdllor for dessa funktioner är inte begransade till potatis utan gener kodande for enzymer med en motsvarande enzymatisk funktion och lokalisering skulle kunna isoleras fran andra organismer. Selektion av organismer skulle foljaktligen inte vara begransad till vaxter.

Namnda funktioner kommer i sig sja.lva ndr de manifesteras i pa.lrot has sockerbeta frdmja starkelseproduktion. Nar de uttrycks i kombination sá kan de tillhandahalla en ytterligare forbdttrad effekt i stdrkelseproduktion i palrot hos sockerbeta. Foljaktligen kan vane funktion tillhandahalla en losning for start av starkelseackumulering i sockerbeta men de kommer ocksa i kombination tillhandahalla forbattrad effekt som ger en forbdttrad formaga att extrahera stdrkelse frail pa.lrotsvavnad hos sockerbeta.

Som namnt sa uppvisade en gen kodande for en form av en plastid ATP/ADP-translokator som är ansvarig fOr att forse plastiden med energi motsvarande Arabidopsis NTT1, en mycket stor skillnad i uttryck mellan palrot hos sockerbeta och palrot hos palsternacka. En annan gen kodade for plastid oorganiskt pyrofosfat vilken kan vara ansvarig for hydrolysering av PPi vilket produceras som en restprodukt av ADP-glukosproduktion.

Gener motsvarande en plastid ATP/ADP-translokator och plastidiskt oorganiskt pyrofosfatas isolerades fran ett potatis-cDNA-bibliotek och bendmndes StNTT1 respektive StPPa6.

Expressionsvektorer, transformering och analys av material Vidare hanfor sig uppfinningen till rekombinanta nukleinsyramolekyler innehallande en nukleinsyramolekyl enligt uppfinningen. 11 1 samband med foreliggande uppfinning, sá avses termen "rekombinant nukleinsyramolekyl" sasom en bindr vektor att betyda en nukleinsyramolekyl vilken innehaller ytterligare sekvenser utover nukleinsyramolekyler i enlighet med uppfinningen, vilka inte naturligt forekommer i kombinationen i vilken de forekommer i rekombinanta nukleinsyror i enlighet med uppfinningen. Has' kan de ovannamnda ytterligare sekvenserna vara vilka sekvenser som heist, foretradesvis sá är de regulatoriska sekvenser (promotorer, termineringssignaler, enhancers), i synnerhet foretradesvis sa är de regulatoriska sekvenser som är aktiva i vdxtvavnad, och speciellt i synnerhet sa dr de regulatoriska sekvenser som är aktiva i sockerbetans palrot, i vilken lagringsstarkelse syntetiseras.

Metoder for skapandet av rekombinanta nukleinsyramolekyler i enlighet med uppfinningen är kdrida for fackmannen inom omradet och inkluderar genetiska metoder sasom bindande nukleinsyror genom ligering, genetisk rekombinering eller nysyntes av nukleinsyramolekyler, till exempel (se till exempel Sambrok et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, tredje upplagan (2001) Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, N.Y. ISBN: 0879695773, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5th edition (2002), ISBN: 0471250929).

Till exempel sá kan man for att uttrycka onskade funktioner for start av starkelsebiosyntes i palrot hos sockerbeta anvanda uttryck av en promoter med Mgt och specifikt uttryck i palrot, sasom gener kodande for onskade funktioner fuserades till den huvudsakliga latex-lika genpromotern (Mu) has sockerbeta. Andra promotersekvenser kan aven anvandas antingen hdrstammande frail sockerbeta eller fran andra arter sá large som de resulterar i uttryck av den fuserade genen i palrotsvdvnad hos sockerbeta. En specificitet av uttryck i palrotsvdvnad är foredragen dven am den inte behovs for att utova uppfinningen. Exempel pa promotorer vilka skulle kunna vara av anvandning f6r att utova uppfinningen utover M11- promotorn är Tlp-promotern och SRD1-promotern (Oltmann et al., 2006 and Noh et al., 2012), valkanda for en fackman inom omradet.

Andra exempel pa promotorer är, till exempel, promotorn for 35S-RNA hos mosaikvirus frail blomkal och ubikvitinpromotorn fran majs for konstitutivt uttryck, patatinpromotorn B33 for stamknolsspecifikt uttryck i potatis, USP-promotorn, faseolin-promotorn, promotorer for zeingener frail majs, glutelinpromotor eller shrunken-1-promotor.

Vidare kan en term ineringssekvens (polyadenyleringssignal) vara narvarande, vilken kan anvandas for att tillsatta en poly-A-svans till transkriptet. En funktion i stabiliseringen av transkripten är tillskriven poly-A-svansen. Element av denna sort beskrivs i litteraturen och kan bytas ut vid behov. 12 lntronsekvenser kan ocksá vara narvarande mellan promotorn och den kodande regionen. Sadana intronsekvenser kan leda till stabilitet av uttryck och till okat uttryck i vaxter vilket är valkant for fackmannen inom omra.det.

I en utforingsform, sá hanfor sig uppfinningen till vardceller, i synnerhet prokaryota eller eukaryota celler, vilka transformerades med en nukleinsyramolekyl i enlighet med uppfinningen eller med en vektor i enlighet med uppfinningen, sasom en bindr vektor, saval som vdrdceller, vilka har sitt ursprung fra.n dessa typer av vdrdceller, och vilka innehaller de beskrivna nukleinsyramolekylerna i enlighet med uppfinningen eller vektorerna.

Vdrdcellerna kan vara bakterieceller, sdsom E.coli eller bakterier frail genus Agrobacterium. Till exempel Agrobacterium tumefaciens eller Agrobacterium rhizogenes.

Hdr avser termen "transformera" att cellerna i enlighet med uppfinningen är genetiskt modifierade med en nukleinsyramolekyl i enlighet med uppfinningen, i den betydelsen att de innehaller a.tminstone en nukleinsyramolekyl i enlighet med uppfinningen utover dess naturliga genom. Detta kan ske fritt i cellen, mojligen som en sjalvreplikerande molekyl, eller sa kan den vara stabilt integrerad i genomet has vardcellen.

Till exempel sá är agrobakteriumtransformering en omfattande anvand metod for transformering av sockerbeta och generellt en foredragen metod for introduktionen av frammande genmaterial in i kromosomer has sockerbeta. Andra medel for transformering, sasom biolistiska, injektion och infiltrering kan anvandas for att utova uppfinningen och sâ lange som det onskade genetiska materialet blir stabilt integrerat i sockerbetan.

Heterologt DNA skulle kunna overga.ende bibehallas i cellen, replikeras autonomt eller infogas stabilt antingen i kromosomalt eller plastid-DNA.

Transformering Rekombinanta nukleinsyramolekyler/DNA-konstrukt enligt uppfinningen kan introduceras in i genomet av Beta vulgaris genom en mangfald av konventionella tekniker. Tekniker for att transformera en vid omfattning av hogre vaxtarter är valkanda och beskrivna i den tekniska och vetenskapliga litteraturen. Se till exempel Payne, Gamborg, Croy, Jones, etc. all supra, saval som, till exempel, Weising et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421 och U.S. Pat. Nos. 5,889,191, 5,889,190, 5,866,785, 5,589,367 och 5,316,931. Ldmpliga metoder for att introducera nukleotidsekvenser in i vaxtceller och efterfoljande infogning in i vaxtgenomet inkluderar mikroinjektion, elektroporering, Agrobakterium-medierad transformering, direkt genoverforing, och ballistisk partikelacceleration. Till exempel sa. kan DNA introduceras direkt in i det genomiska DNA:t has en vdxtcell genom att anvanda tekniker sasom elektroporering och mikroinjektion av vaxtcellprotoplaster, eller sa. kan DNA-konstrukten 13 introduceras direkt till vaxtvavnad genom att anvanda ballistiska metoder, sasom DNApartikelbombardement. Alternativt sá kan DNA-konstrukten kombineras med lampliga TDNA-flankerande regioner och introduceras in i en konventionell Agrobacterium tumefaciensvardvektor. Virulensfunktionerna hos Agbrobakteriumvarden kommer att rikta infogningen av konstruktet och ndrliggande mark& in i vaxtcell-DNA ndr vdxtcellen infekterats med bakterien.

Till exempel sa. skulle Agrobakterium-medierade transformeringstekniker kunna anvandas for att overfora sekvenserna enligt uppfinningen till transgena vaxter. Agrobakterium-medierad transformering är vitt anvant for transformering av dikotyledon.

Regenerering av transgena vaxter Transformerade vaxtceller vilka harstammar fran vaxttransformeringstekniker kan odlas for att regenerera en hel vaxt vilken innehar den transformerade genotypen (det vill saga nukleotidsekvenserna namnda ovan involverade i syntesen av starkelse). Sadana regenereringstekniker forlitar sig pa manipulering av vissa fytohormoner i ett vavnadsodlingstillvaxtmedium, typiskt forlitande sig pa en biocid- och/eller herbicidmarkor vilken har introducerats tillsammans med de onskade nukleotidsekvenserna. Metoder for transformering och regenerering av sockerbeta är kanda inom omradet och tillsammans med transformering beskrivna under Exempel X. ger ledning till den genetiska manipuleringen av sockerbeta (Lindsey and Gallois, 1990; Krens et al., 1996; Joersbo et al., 1998; Hisano et al., 2004; Norouzi et al., 2005), W001/42480, W002/14523.

Transformerade vdxtceller, calli- eller explantat kan odlas pa regenereringsmedium i morkret under flera veckor, generellt omkring 1 till 3 veckor for att tillata de somatiska embryona att mogna. Foredraget regenereringmedium inkluderar medium innehallande MS-salter. Vaxtcellerna, calli- eller explantat odlas sedan typiskt pa rotningsmedium i en ljus/mork cykel till dess att skott och rotter utvecklas. Metoder for vaxtregenerering är kanda inom omradet.

Sma vaxter kan sedan overforas till ror eller andra lampliga behallare innehallande rotningsmedium och som tillats \taxa och utveckla mer roger till synlig verifiering. Vaxterna kan sedan transplanteras till jordblandning i krukor i vaxthuset.

Regenerering av vaxter innehallande den frammande genen introducerad genom Agrobakterium kan uppnas som beskrivet av Horsch et al., Science, 227:1229-1231 (1985) och Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:4803 (1983). Denna procedur producerar typiskt skott inom tva till fyra veckor och dessa transformantskott overfors sedan till ett lampligt rot-inducerande medium innehallande det selektiva medlet och ett antibiotikum for att forhindra bakteriell 14 Transgena vaxter enligt foreliggande uppfinning kan vara fertila eller sterila. Regenerering kan aven erhallas fra.n vaxtcallus, explantat, organ eller delar darav. Sadana regenereringstekniker är generellt beskrivna i Klee et al., Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467486 (1987). Regenereringen av vaxter fran antingen protoplaster eller olika explantat är valkanda inom omradet. Se till exempel, Methods for Plant Molecular Biology, A. Weissbach and H. Weissbach, eds., Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1988).

Efter transformering med Agrobakterium, sâ overfors typiskt explantaten till selektionsmedium. En fackman inom omradet kommer att inse att selektionsmediumet beror pa den selekterbara markoren som sam-transfekterades in i explantaten. Efter en lamplig tidslangd, sá kommer transformanter att borja bilda skott. Efter att skotten är omkring 1-2 cm langa, sá bar skotten overforas till ett lampligt rot- och skottmedium. Selektionstryck bor bibehallas i rot- och skottmediumet.

Typiskt sá kommer transformanterna utveckla rotter inom omkring 1-2 veckor och bilda sma plantor. Efter att plantorna är omkring 3-5 cm i hojd, sá placeras de i steril jord i fiberkrukor. Fackmannen inom omradet kommer att inse att olika acklimatiseringsprocedurer anvands for att erhalla transformerade vaxter av olika arter. Till exempel, efter utveckling av rot och skott, sà overfors sticklingar, saval som somatiska embryon av transformerade vaxter till medium for etablering av plantor. For en beskrivning av selektion och regenerering av transformerade vaxter, se till exempel Dodds and Roberts (1995) Experiments in Plant Tissue Culture, 3.sup.rd Ed., Cambridge University Press.

De transgena vaxterna enligt denna uppf inning kan karaktariseras antingen genotypiskt eller fenotypiskt for att bestamma narvaro av den introducerade polynukleotiden enligt uppfinningen. Genotypisk analys kan utforas genom nagot av ett antal av valkanda tekniker, inkluderande PCR-amplifiering av genomiskt DNA och hybridisering av genomiskt DNA med specifikt inmarkta prober. Fenotypisk analys inkluderar till exempel ackumulering av starkelse i paloten.

En fackman inom omradet kanner igen att efter att uttryckskassetten innehallande de heterologa nya generna stabilt inkorporerats i transgena vaxter och bekraftats vara driftsduglig, sá kan den introduceras in i andra vaxter genom sexuell korsning. Vilken som heist av ett antal av standardiserade fortplantningstekniker kan anvandas, beroende pa de arter som skall korsas.

Vid vegetativt propagerande metoder, sá kan mogna transgena vaxter propageras genom att man tar sticklingar eller genom vavnadsodlingstekniker for att producera multipla identiska v5xter. Selektion av onskad transgenetik gars och nya varianter erhalls och propageras vegetativt for kommersiell anvandning. I fropropagerade grodor, sá kan mogna transgena vaxter sjalvkorsas for att producera en homozygot inavlad vaxt. Den inavlade vaxten producerar fron innehallande den nyligen introducerade heterologa nukleinsyran. Dessa fron kan fa vaxa till att producera vaxter som skulle producera den valda fenotypen.

Transgena vaxter uttryckande en selekterbar mark& kan screenas for overforing av de introducerade nukleinsyrasekvenserna, till exempel genom standard immunoblots och DNAdetektionstekniker. Transgena linjer utvarderas aven typiskt pa niva.er av uttryck av den heterologa nukleinsyran. Uttryck pa RNA-nivan kan bestammas initialt for att identifiera och kvantifiera uttrycks-positiva vaxter. Standardtekniker for RNA-analys kan anvandas och inkluderar PCR-amplifieringsanalyser anvandande oligonukleotidprimers konstruerade att amplifiera enbart de heterologa RNA-templaten och losningshybridiseringsanalyser genom att anvanda heterologa nukleinsyra-specifika prober. De RNA-positiva vaxterna kan sedan analyseras for proteinuttryck av Western immunoblot-analys genom att anvanda de specifikt reaktiva antikropparna enligt foreliggande uppf inning. Utover detta kan hybridisering och immunocytokemi i enlighet med standardprotokoll utforas genom att anvanda heterologa nukleinsyraspecifika polynukleotidprober respektive antikroppar for att lokalisera stallen for uttryck inom transgen vavnad. lntroducerade funktioner kan analyseras med hjalp av enzymanalyser. Generellt sá analyseras vanligtvis ett antal transgena linjer efter den infogade nukleinsyran for att identifiera och selektera vaxter med de mest lampliga uttrycksprofilerna.

Metod for att tillverka starkelse fran palrot fran vaxten Vidare hanfor sig foreliggande uppf inning till en metod for tillverkningen av starkelse fran Beta vulgaris, sasom sockerbeta, foderbeta eller strandbeta inkluderande steget att extrahera starkelsen frail paloten hos skordade vaxter i enlighet med uppfinningen.

Metoder for att extrahera starkelse fran vaxter eller fran starkelse-lagrande delar av vaxter är kanda kir fackmannen inom omradet. Vidare beskrivs metoder for att extrahera starkelse frail olika starkelse-lagrande vaxter, till exempel i Starch: Chemistry and Technology (Publisher: Whistler, BeMiller and Paschall (1994), 2nd Edition, Academic Press Inc. London Ltd; ISBN 0-12-746270-8; se till exempel Kapitel XII, sidor 412-468: Maize and Sorghum Starches: Manufacture; by Watson; Chapter XIII, sidor 469-479: Tapioca, Arrowroot and Sago Starches: Manufacture; by Corbishley and Miller; Chapter XIV, sidor 479-490: Potato starch: Manufacture and Uses; by Mitch; Chapter XV, sidor 491 to 506: Wheat starch: Manufacture, Modification and Uses; by Knight and Oson; och Chapter XVI, Page 507 to 528: Rice starch: Manufacture and Uses; by Rohmer and Klem; Maize starch: Eckhoff et al., Cereal Chem. 73 (1996), 54-57, extraktionen av majsstarkelse pa en industriell skala uppnas 16 generellt genom sá kallad "wet milling".). Anordningar, vilka vanligtvis anvands i metoder for att extrahera starkelse frail vaxtmaterial är separatorer, dekanterare, hydrocykloner, centrisiler, vakuumfilter, varmluftstorkare, spraytorkare och fluidbaddtorkare.

Uppfinningen hanfor sig aven till starkelsen som erhalles fran den genetiskt modifierade Beta vulgaris definierad ovan sa.val som anvandningen av starkelse i tekniska och livsmedelstillampningar.

De foljande exemplen är avsedda att illustrera, men inte begransa, uppfinningen pa nagot satt, gestalt eller form, antingen explicit eller implicit.

EXEMPEL Exempel 1: Jamforelse av transkriptomdata-uppsattningar mellan pa/rot hos palsternacka och pa/rot hos sockerbeta.

Total RNA-extrahering Rot- och bladvavnad frail vaxtvavnad under utvekling av sockerbeta vid 54 dagar efter plantering (DAP) och palsternacka 61 DAP, homogeniserades i flytande kvave. Totalt RNA extraherades med Vaxt-RNA-reagens (Invitrogen, Life Technologies Ltd). Koncentration mattes pa en NanoDrop (NanoDropTM 1000 spektrofotometer, Thermo Scientific) och kvalitet bekraftades pa en 1,2% E-gel (lnvitrogen, Life technologies Ltd). cDNA-bibliotekssyntes DNA-sekvensering och databearbetning tillhandaholls av Eurofins som en service. Tva normaliserade slumpvis primade cDNA-bibliotek producerades fran blandat mRNA fran blad och pa.lrot frail sockerbeta respektive palsternacka. Dessa utsattes darefter for sekvensiering genom att anvanda Roche GS FLX-Titaniumserie-kemi pa en skala pa 1/2 segment av en fullstandig Miming pa vane cDNA-bibliotek.

Efter kvalitetsanalys, sá samlades kvalitetsgodkanda sekvenser i storre segment och segment samlades i en referensfil for respektivesockerbeta och palsternacka. Tvá3'-fragment cDNA-bibliotek med bar-kodade adaptorer producerades frail mRNA frail palrot hos sockerbeta respektive hos palsternacka. Dessa utsattes darefter for sekvensering genom att anvanda IIlumina HiSeq 2000 teknologi anvandande en kanal totalt for bada prover.

Efter kvalitetsanalys, mappades godkanda sekvenser till referensfilerna producerade for sockerbeta och palsternacka. Antalet avlasningar mappade till vane segment gay en uppskattning pa genuttryck motsvarande det specifika segmentet i jamforelse med antalet avlasningar mappade till andra contiger.

Transkriptom av rotvavnad i en aktiv lagringsfas, sockerbeta (54 DAP) och palsternacka 17 (61 DAP) jamfordes mellan sockerbeta och palsternacka. Efter kvalitetsklippning av Illumina HiSeq 2000 data, sa. erholls 1,62-faldigt mer rena avlasningar for palrot cDNA fran P.sativa jamfort med pa.lrot hos B.vulgaris. Detta betyder att det fanns 1,62 ganger avlasningar tillgangliga att mappas till GS FLX-referenssammansattningen frail P.sativa jamfort med sammansattningen harstammande frail B.vulgaris-data. Kvoten mellan avlasningar frail P.sativa och B.vulgaris som faktiskt mappade till respektive ref erensfil var 1,68. Detta uppvisade en konsekvens mellan de olika uppsattningarna av referensdata och kvaliteten pa mappning till de respektive sammansattningarna av referensdata. Foljaktligen anvandes siffran 1,68 for att justera mappningsdatan for B.vulgaris for att vara jamforbar med data erhallna frail P.sativa. Denna analys visade att alla huvudsakliga gener kodande for starkelsebiosyntetiska enzymer eller gener kodande for hexos-fosfatkonversion uttrycks i pa.lrot hos sockerbeta trots att ingen starkelse produceras.

Mappade Illumina HiSeq 2000 avlasningar Gener/funktioner B.vulgaris P.sativa ATP/ADP-translokator form 1 18213 ATP/ADP-translokator form 2 0 1164 plastidiskt pyrofosfatas 166 2051 GTP form 1 3679 4234 GTP form 2 0 10974 plastidiskt PGM 92 21 cytosoliskt PGM 801617 AGPas stort 554 15366 AGPas litet 1384 6592 losligt starkelsesyntas 1218 1199 granulatbundet starkelsesyntes 860 29 starkelseforgrenande enzym 1374 4867 Antalet mappade Illumina HiSeq 2000 avlasningar av pa.lrot pa samlingar av B.vulgaris och P.sativa motsvarande olika cDNA av gener av potentiell betydelse for starkelsebiosyntes. Resultatet visat for B.vulgaris multiplicerades med 1,68 for att kompensera for skillnader i totalt mappade avlasningar mellan B.vulgaris och P.sativa.

Exempel 2: Starkelsebiosyntetiska enzymer är aktiva i pa/rot hos sockerbeta Fosfoglukomutas 18 PGM-aktivitet bestamdes i en spektrofotometriskt kopplad analys. Konversion av glukos-1- fosfat (G1 P) katalyserades genom PGM och det resulterande glukos-6-fosfatet (G6P) katalyserades darefter genom glukos-6-fosfat-dehydrogenas till 6-fosfoglukonat. ParallelIt med den andra reaktionen, sa. reduceras NADP till NADPH och reaktionen mats vid 340 nm (Daugherty et al., 1975). Extrakt motsvarande 20 jig losligt protein tillsattes en substratlosning och forandringen i absorbans vid 340 nm mattes efter 2, 5, 10, 15 och 25 minuter. En standardkurva gjordes genom att analysera olika koncentrationer av fosfoglukomutas (Fosfoglukomutas fran kaninmuskel, P3397, SIGMA Aldrich) under samma forhallanden som proverna. Analysens specificitet testades genom att exkludera G1P fran substratet. Enzymaktivitet beraknades som G1P konverterat till G6P (i..tmol) genom losligt obearbetat protein (ng) per minut.

ADP-glukos-pyrofosforylas AGPas-aktivitet bestamdes (Fusari C, Demonte AM; Figuerola CM, Aleanzi M, Iglesias AA (2006). Analytical Biochemistry 352: 145-147) pa ett 20 jig obearbetat protein. Proverna mattes efter 0, 30 och 90 minuter.

AGPas katalyserar reaktionskonversionen av ATP och G1P till ADP-glukos och pyrofosfat (PPi). Analysen mater fosfat efter splittning producerat PPi genom oorganiskt pyrofosfatas. En standardkurva for fosfat gjordes genom att blanda olika koncentrationer av KH2PO4 med Mg-Am-fargning och foljande matningsprotokoll som i analysen. Fosfatinnehall i losligt proteinextrakt mattes genom att inaktivera det losliga enzymextraktet vid 60°C under 10 minuter och sedan mata proverna som beskrivet for standardkurvan. Bakgrundsinnehallet av pyrofosfat mattes genom att inkubera det inaktiverade losliga extraktet med oorganiskt pyrofosfatas och sedan analysera fosfatinnehall samma procedur som standardkurvan. Enzymaktivitet beraknades som producerad ADP-glukos (nmol) per losligt protein (rig) per minut.

Analysens specificitet undersoktes genom att exkludera G1P och ATP fran substratet bade separat och i kombination for att bestamma och exkludera den cytosola UDP-glukospyrofosforylasaktiviteten.

Losligt starkelsesyntas 10 jig losligt rotproteinextrakt analyserades for starkelsesyntasaktivitet. Aktivitet beraknades genom matningar efter 0, 30, 60, 90 och 120 minuter. Starkelsesyntasanalysen utfordes som tidigare beskrivet men med en liten modifikation, dar amylopektin i substratlosningen utbyttes till glykogen (Abel et al., 1996). Reaktionen avslutades vid 95°C under 2 minuter och falldes ut och tvattades i enlighet med protokollet och lostes upp i 1 ml ddH20. Fem ml scintillationsblandning (Ultima-Flo, Packard) tillsattes 0,5 ml av den upplosta 19 starkelseprodukten och radioaktivitet mattes i en vatskescintillationsmatare (Philips PW 4700). Starkelsesyntasaktiviteten beraknades som mangden ADP-glukos konverterad till starkelse per minut och jig totalt protein.

Starkelseforgrenande enzym 20 jig losligt protein analyserades for starkelseforgrenande enzymaktivitet (Hawker et el., 1974). Aktivitet beraknades genom matningar efter 45 och 90 minuter. Utfallning, upplosning och berakning av radioaktivitet utfordes som beskrivet i starkelsesyntasanalysen. Den starkelseforgrenande enzymaktiviteten beraknades som mangden glukos-1-fosfat konverterat till forgrenad starkelse per minut och pg totalt protein.

Tabell 1 Starkelsebiosyntetisk enzymaktivitet i losliga proteinextrakt Iran palrotter fran sockerbeta och palotter hos palsternacka.

Enzymaktivtet PGMAGPasSSSBE Rotvavnad och utvecklingsstadium (enheter(nmol ADP-(nmol G-IP konverterande (nmol ADP-glukoskonverterat till 1 pmol G1Pglukos *pgkonverteratforgrenad till G6Plosligt protein-till starkelse*starkelse* pg *ng losligtI min-1)*pg losligtlosligt protein-I protein -I min-1)protein -I min-min-1) Palsternacka 48 DAP (ljus) 0,07+0.01 0,005±0,001 0,24±0.01 0,54±0,02 Palsternacka 48 DAP (mark) 0,06±0,000,004±0,001 0,25±0,01 0,50±0,03 Palsternacka 61 DAP (ljus) 0,05±0,004 0,005±0,001 0,35±0,01 0,65±0 03 Palsternacka 61 DAP (mork) 0,06±0,01 0,005±0,002 0,26±0,01 0,59±0,02 Sockerbeta 41 DAP (ljus) 0,07±0,01 0,006±0,002 0,16±0,01 0,43±0,0 Sockerbeta 41 DAP (mork) 0.07±0,004 0,006±0,001 0.09±0.01 0.49±0 06 Sockerbeta 54 DAP (ljus) 0,07±0,01 0,005±0,002 0,18±0,01 0,63±0,0 Sockerbeta 54 DAP (mork) 0,07±0.01 0,008±0,002 0,15±0.02 0,47±0,02 Vardena for enzymaktivitet bestamdes genom matningar i triplikat fran ett enda extrakt bestaende av ett homogenat av 3 sammanslagna rotter.

Exempel 3: lsolering av gener fran potatis Gener kodande for funktioner av intresse isolerades fran ett cDNA-bibliotek frail potatisknol genom PCR-amplifiering. Oligonukleotider for amplifieringen av generna konstruerades med en framat primer overlappande startkodonet i 5'-anden och en omvand primer overlappande stopkodonet i 3'-anden av motsvarande gener givet som SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 och 9.

Efter amplifiering och kloning i ett vektorssystem genom att anvanda CloneJet PCT Cloning Kit (Fermentas) sa sekvenserades vane gen som en kvalitetskontroll for att undvika nagra mutationer introducerade genom PCR. For gener ddr inga sekvenser var tillgangliga sa gjordes jamforelser med avseende pa aminosyrasekvenser av motsvarande gener fran andra vaxtarter an potatis. NI& nadvandigt sá korrigerades sekvenser genom att anvanda specifika oligonukleotider och fusera korrigerade fragment samman fore ytterligare en runda av DNA-sekvensering for att bekratta att onskade forandringar hade skett. Denna operation resulterade i att sekvenser SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, och 9 var tillgangliga for vidare anvandning i transformation av sockerbeta.

Exempel 4: Genkonstruktioner for uttryck i pa/rot hos sockerbeta En Gateway® teknologi (Life Technologies) i kombination med PCR-fusionsteknologi anvandes for att introducera ett effektivt system for att mojliggora kombinationen av olika gener kodande for identifierade funktioner. Promotor-, gen- och terminatorkombinationer producerades genom amplifiering av respektive fragment genom att anvanda oligonukleotider med overlappande sekvenser (20 nukleotiders overlapp) mojliggorande en efterfoljande fusionspromotor, gen- och terminatorfragment genom att hybridisera via overlappande sekvenser (40 nukleotider vid fusion) och fylla i fullstandiggorande en fuserad gen genom att anvdnda ett termostabilt DNA-polymeras, Phusion (Thermo Scientific). Gemensamt for alla genkonstrukt som skapades var Mil-promotorn och T35S-terminatorn. Via PCR-reaktionen introducerades olika rekombineringsstallen kompatibla med MultiSite Gateway® vid 5'- och 3'-driden av de fuserade genkonstrukten. For uttryck pa egen hand sá placerades generna i en sá kallad intradesvektor och ddrefter rekombinerades de in i en destinationsvektor via en LR-rekombinering. Tva-genkonstrukt gjordes pa samma salt men vid rekombinering in i destinationsvektorn sá behover en ande av bada gener ett kompatibelt rekombineringsstalle medan den andra anden är kompatibel med destinationsvektorn i LRrekombinationen. Tre-genkonstrukt skapades sedan genom en ande av gen 1 kompatibel med en ande av gen 2 och den andra anden av gen 2 kompatibel med gen 3 och sedan en dnde av gen 1 och en ande av gen 3 kompatibel med destinationsvektorn i en LR-reaktion. Storre genkonstrukt var sedan upprepningar av anvandning av samma systematiska teknologi. Destinationsvektorn som anvandes var i samtliga fall en bindr vektor lamplig for propagering i Agrobakterium tumefaciens och anvandes for transformering av sockerbeta. Exempel pa rekombinant nukleinsyramolekyl tillverkad for att uttrycka gener individuellt, var pK7MIIStPPa6T35S (Fig. 2) och pKMIIStNTT1T35S (Fig. 3), savalsom rekombinant nukleinsyramolekyl for uttrycket av tva gener i sockerbeta som pK42MIIStNTT1StPPa6T35S (Fig. 4).

Exempel 5: Trans formering och regenerering av sockerbeta 21 Agrobacterium tumefaciens innehallande de individuella vektorerna forokades i LB-medium kompletterat med lampliga antibiotika (50 jig m1-1 rifampicin och 50 jig m1-1 kanamycin eller 50 jig m1-1 spektinomycin) vid 28°C over natt tills en optisk densitet (0D600) pa 0,6-0,7 uppnatts. Bakterierna skordades sedan genom centrifugering vid 4000 X g under 10 minuter vid 4°C och resuspenderades i bakterie-induktionsmedium till en 0D600 pa 0,3. Agrobacterium fick vaxa under ytterligare 5 timmar vid 28°C fore inokulering med vaxtvavnader. Bladvavnad med exponerad skottbas skadades med en skalpell och sanktes ned i Agrobacterium-losningen under 20 minuter. Overskottsvatska torkades mellan tva filterpapper fore explantaten Overfordes till sam-odlingsmedium. Efter 4 dagars sam-odling under svagt ljus vid 23°C, sa skoljdes vavnadsdelarna i tvattbuffert och torkades mellan tva filterpapper och placerades pa selektionsmedium med skadad bladbas vettandes uppat. Vavnadsdelarna overfordes till farskt selektionsmedium var fjortonde dag. Formodade transgena skott analyserades for narvaro av nptll med konventionell PCR (S100 termal cycler, Bio-Rad) genom att anvanda REDExtract-N-Amp Plant PCR Kit (Sigma) med primers nptIlf 5"-CCTGTCATCTCACCTTGCTC-3"och nptIlr 5"-AGT000GCTCAGAAGAACTC-3". Transgena linjer overfordes till rotningsmedium for rotbildning. Nar val rotter var synliga sá overfordes skotten till MS30 400claf for fortsatt rotutveckling fore plantering i en fytotron eller vaxthus.

Medium for transformering av sockerbeta Bakterie-induktionsmedium 0,5* MS-salter och B5-vitaminer 50 uM acetosyringon 50 g I' glukos pH 5, Sam-odlingsmedium 0,5* MS-salter och B5-vitaminer 50 jiM acetosyringon 30 g I-1 sukros pH 5,8 8 g I 1 fytoagar Tvattmedium 0,5* MS-salter och B5-vitaminer 500 mg 1-1 klaforan pH 5,8 Selektionsmedium 22 1* MS-salter och B5-vitaminer 0,25 mg 1-1 N6-bensyladenin 0,10 mg r1 indo1-3-smorsyra 400 mg 1-1klaforan 200 mg 1-1 kanamycin 30 g 1-1 sackaros 8 g 1-1fytoagar Tillvaxtmedium 1* MS-salter och B5-vitaminer 0,25 mg r1 N6-bensyladenin 0,10 mg r1 indo1-3-smorsyra 125 mg r1klaforan 30 g 1-1 sackaros 8 g 1-1fytoagar Exempel 6: Produktion av palrotsvavnad Efter overforing av isolerade skott till rotningsmedium och den efterfoljande etableringen av rotter, sá overfordes skott till jord och mangfaldigades ytterligare i en tillvaxtkammare eller i vaxthuse. Pa.lrot frail sockerbeta skordades och blixtfrystes i flytande kvave for fortsatt analys av metaboliter och starkelse.

Rotningsmedium 1* MS-salter och B5-vitaminer 2,00 mg r1 NAA 1,50 mg 1-1 IBA 30 g 1-1 sackaros pH 5,8 6 g 1-1 fytoagar 400 mg r1 klaforan Exempel 7: Visuell analys av starkelsedeponering Palrotter has sockerbeta odlade i jord sektionerades och skivades tunt. Sektioner fargades med Lugols losning och starkelsegranuler visualiserades under ett ljusmikroskop. Storre sektion av pa.lrot has sockerbeta homogeniserades och starkelsegranuler separerades frail cellvavnadsmaterial, fargades genom att anvanda Lugol's och visualiserades under ett ljusmikroskop. 23 Exempel 8: Enzymatisk analys av starkelse Starkelseinnehall analyserades genom aft anvanda standardmetod AOAC Metod 996.11 och AACC Metod 76.13-01, dal- a-amylas och amyloglukosidas anvandes for starkelsesmaltning foljande matning av det frisatta glukoset via en glukosoxidasreaktion (Total Starch kit, Megazyme). Vid tillampning av metoden sá befanns palrotsvavnad frail sockerbeta innehalla avsevarda mangder av starkelse i jamforelse med icke-transformerad pakotsvavnad.

Exempel 9: Rening av starkelse StarkeIse renades i enlighet med figur 5. 24 Ref erenser Abel GJW, Springer F, Willmitzer L, Kossmann J (1996) Cloning and functional analysis of a cDNA encoding a novel 139 kDa starch synthase from potato (Solanum tuberosum L.). The Plant Journal 10: 981-991 Daugherty JP, Kraemer WF, Joshi JG (1975) PURIFICATION AND PROPERTIES OF PHOSPHOGLUCOMUTASE FROM FLEISCHMANNS YEAST. European Journal of Biochemistry 57: 115-126 Fusari C, Demonte AM, Figueroa CM, Aleanzi M, Iglesias AA (2006) A colorimetric method for the assay of ADP-glucose pyrophosphorylase. Analytical Biochemistry 352: 145-147 Hawker JS, Ozbun JL, Ozaki H, Greenber.E, Preiss J (1974) INTERACTION OF SPINACH LEAF ADENOSINE-DIPHOSPHATE GLUCOSE ALPHA-1,4-GLUCAN ALPHA-4- GLUCOSYL TRANSFERASE AND ALPHA-1,4-GLUCAN, ALPHA-1,4-GLUCAN-6- GLYCOSYL TRANSFERASE IN SYNTHESIS OF BRANCHED ALPHA-GLUCAN. Archives of Biochemistry and Biophysics 160: 530-551 Hisano H, Kimoto Y, Hayakawa H, Takeichi J, Domae T, Hashimoto R, Abe J, Asano S, Kanazawa A, Shimamoto Y (2004) High frequency Agrobacterium-mediated transformation and plant regeneration via direct shoot formation from leaf explants in Beta vulgaris and Beta maritima. Plant Cell Reports 22: 910-918 Joersbo M, Donaldson I, Kreiberg J, Petersen SG, Brunstedt J, Okkels FT (1998) Analysis of mannose selection used for transformation of sugar beet. Molecular Breeding 4: 111-117 Krens FA, Trifonova A, Keizer LCP, Hall RD (1996) The effect of exogenously-applied phytohormones on gene transfer efficiency in sugarbeet (Beta vulgaris L). Plant Science 116: 97-106 Lindsey K, Gallois P (1990) TRANSFORMATION OF SUGAR-BEET (BETA-VULGARIS) BY AGROBACTERIUM-TUMEFACIENS. Journal of Experimental Botany 41: 529-536 Noh SA, Lee H-S, Huh GH, Oh M-J, Paek K-H, Shin JS, Bae JM (2012) A sweetpotato SRD1 promoter confers strong root-, taproot-, and tuber-specific expression in Arabidopsis, carrot, and potato. Transgenic Research 21: 265-278 Norouzi P, Malboobi MA, Zamani K, Yazdi-Samadi B (2005) Using a competent tissue for efficient transformation of sugarbeet (Beta vulgaris L.). In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant 41: 11-16 Oltmanns H, Kloos DU, Briess W, Pflugmacher M, Stahl DJ, Hehl R (2006) Taproot promoters cause tissue specific gene expression within the storage root of sugar beet. Planta 224: 485-49 26

Claims (12)

NYA PATE NTKRAV

1. En genetiskt modifierad sockerbets-, foderbets- eller strandbetsvaxt av underart av Beta vulgaris varvid den genetiska forandringen, kodande for den enzymatiska funktionaliteten hos dtminstone en heterolog polypeptid vald frail gruppen bestdende av SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 11, 13 eller 15 eller en heterolog polypeptid som har 70% identitet med SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 11, 13 eller 15 varvid namnda polypeptider är involverade i syntesen av starkelse, leder till att en ackumulering av starkelse sker i palroten.

2. Den genetiskt modifierade Beta vulgaris i enlighet med patentkrav 1, varvid starkelsen visualiseras med ett mikroskop och/eller jod.

3. Den genetiskt modifierade Beta vulgaris i enlighet med patentkrav 2, kodande for de heterologa polypeptiderna SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, eller 10 eller heterologa polypeptider som har 70% identitet med SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, eller 10.

4. Den genetiskt modifierade Beta vulgaris i enlighet med patentkrav 2, kodande for de heterologa polypeptiderna SEQ ID NO:2, 6, 11, 13 eller 15 eller heterologa polypeptider som har 70% identitet med SEQ ID NO:2, 6, 11, 13 eller 15.

5. Den genetiskt modifierade Beta vulgaris i enlighet med patentkrav 2-4 kodande for en eller flera polypeptider som har 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 eller 99 % identitet med SEQ ID NO:2, 4, 6, 8,10, 11, 13 eller 15.

6. Den genetiskt modifierade Beta vulgaris i enlighet med patentkrav 1-5 varvid vaxten är sockerbetsvaxt eller foderbetsvaxt.

7. En genetiskt modifierade sockerbets-, foderbets- eller strandbetsvaxtcell av underart av Beta vulgaris varvid den genetiska forandingen leder till att en ackumulering av starkelse sker i palroten, omfattande dtminstone en heterolog gen vald fran gruppen bestdende av SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 12 eller 14 eller en gen som har 70, 75, 80, 85, 90, 95 eller 99% identitet med SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 12 eller 14.

8. Den genetiskt modifierade sockerbets-, foderbets- eller strandbetsvdxtcell av underart Beta vulgaris, varvid den genetiska forandingen leder till att en ackumulering av starkelse sker i palroten, kodande for dtminstone en polypeptid vald fran gruppen bestdende av SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 eller 10 eller en heterolog polypeptid som har 70, 75, 80, 85, 90, 95 eller 99 % identitet med SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 eller 10.

9. Metod for att tillverka stdrkelse frail en genetiskt modifierad Beta vulgaris i enlighet med nagot av de foregdende patentkraven som har starkelseackumulering i palroten omfattande att extrahera starkelsen fran palroten. 27 1 S!d SIT Id d-9-D Lt) ..., N v 8ij Iff SEQUENCE LISTING <110> Sverigens Starkelseproducenter Sveriges Starkelseproducenter <120> Genetically modified plant <130> P10341SE00 <160> <170> PatentIn version 3. <210> 1 <211> 1206 <212> DNA <213> Solanum tuberosum-glucoese-6-phosphate transporter <400> 1 atggcctttt ctgctggaaa atcttatgca ttttcaacaa attttgatcc cttgcaacaa60 aatttatggg gttctaagcc tcctatttca tcattatcca tcaaagatat cgacttcaaa1 caatgtgata agcataacat cttgtctaaa aaacctctat acatttcagc agtactaagt180 ggatttggac atgctgatga atcaaaagag ttcaaatcta gggacccttt agtccaatgc2 aatgcatatg aagctagtca accacaatcg ataccaatcg acattgagtt tggccaagaa300 gctcaggctg ctgctactca gaagctcaag attggactct attttgcaac atggtgggct360 ttgaatgttg ttttcaatat ttacaacaag aaggttttga atgcatttcc atttccatgg4 cttacttcta ctctttctct ggctgctggc tctcttatga tgttggtttc ttgggctact480 aagattgctg aaactccaaa gactgacttt gatttttgga aagccttgtt tcctgttgct5 gtggctcaca caattggtca tgtggctgca acagtgagca tgtcaaaagt tgctgtttca600 ttcactcata ttattaagag tggagagcct gcttttagtg ttttggtttc aagattgtta660 ggtgaaactt tcccattgcc agtgtacctt tcacttttgc caattattgg tggttgtgga7 cttgctgcta ttactgaact caacttcaat ctaataggtt ttatgggggc aatgatatca780 aacttggcat ttgtattcag aaacatattt tcaaagaaag gcatgaaggg gaaatcagtt8 ggagggatga attactatgc ttgtttatca atgatgtctc tattgattct gattcccttt900 gctattgctg tggagggtcc acaagtatgg gcacttggat ggcagaatgc agtctcccaa960 attggcccaa attttatatg gtgggtggtg gctcaaagtg tgttctatca cttgtacaat10 caagtctcct acatgtccct aaatgagatc tccccattga catttagtat tggtaacact1080 atgaagagaa tttctgtcat agtctcatcc atcatcatct ttcaaattcc aattcaacca11 atcaatgccc ttggtgctgc tattgcaatc ttgggaactt tcctctactc tcaggctaaa1200 cagtaa1206 <210> 2 <211> 401 <212> PRT <213> solanum tuberosum-Glucose-6-phosphate transporter <400> 2 Met Ala Phe Ser Ala Gly Lys Ser Tyr Ala Phe Ser Thr Asn Phe Asp 1 Pro Leu Gln Gln Asn Leu Trp Gly Ser Lys Pro Pro Ile Ser Ser Leu Ser Ile Lys Asp Ile Asp Phe Lys Gin Cys Asp Lys His Asn Ile Leu Ser Lys Lys Pro Leu Tyr Ile Ser Ala Val Leu Ser Gly Phe Glv His 560 Ala Asp Glu Ser Lys Glu Phe Lys Ser Arg Asp Pro Leu Val Gin Cys 670780 Asn Ala Tyr Glu Ala Ser Gin Pro Gin Ser Ile Pro Ile Asp Ile Glu 8909 Phe Gly Gin Glu Ala Gin Ala Ala Ala Thr Gin Lys Leu Lys Ile Gly 100101 Leu Tyr Phe Ala Thr Trp Trp Ala Leu Asn Val Val Phe Asn Ile Tyr 111 Asn Lys Lys Val Leu Asn Ala Phe Pro Phe Pro Trp Leu Thr Ser Thr 111 Leu Ser Leu Ala Ala Gly Ser Leu Met Met Leu Val Ser Trp Ala Thr 1115160 Lys Ile Ala Glu Thr Pro Lys Thr Asp Phe Asp Phe Trp Lys Ala Leu 1617017 Phe Pro Val Ala Val Ala His Thr Ile Gly His Val Ala Ala Thr Val 18018190 Ser Met Ser Lys Val Ala Val Ser Phe Thr His Ile Ile Lys Ser Gly 1920020 Glu Pro Ala Phe Ser Val Leu Val Ser Arg Leu Leu Gly Glu Thr Phe 222 Pro Leu Pro Val Tyr Leu Ser Leu Leu Pro Ile Ile Gly Gly Cys Gly 2222 Leu Ala Ala Ile Thr Glu Leu Asn Phe Asn Leu Ile Gly Phe Met Gly 2225 Ala Met Ile Ser Asn Leu Ala Phe Val Phe Arg Asn Ile Phe Ser Lys 26026270 Lys Gly Met Lys Gly Lys Ser Val Gly Gly Met Asn Tyr Tyr Ala Cys 2728028 Leu Ser Met Met Ser Leu Leu Ile Leu Ile Pro Phe Ala Ile Ala Val 29029300 Glu Gly Pro Gin Val Trp Ala Leu Giy Trp Gin Asn Ala Val Ser Gin 30333 Ile Gly Pro Asn Phe Ile Trp Trp Val Val Ala Gin Ser Val Phe Tyr 333 His Leu Tyr Asn Gin Val Ser Tyr Met Ser Leu Asn Glu Ile Ser Pro 333 Leu Thr Phe Ser Ile Gly Asn Thr Met Lys Arg Ile Ser Val Ile Val 3536036 Ser Ser Ile Ile Ile Phe Gin Ile Pro Ile Gin Pro Ile Asn Ala Leu 37037380 Gly Ala Ala Ile Ala Ile Leu Gly Thr Phe Leu Tyr Ser Gin Ala Lys 3839039400 Gin <210> 3 <211> 1899 <212> DNA <213> Solanum tuberosum- plastidic phosphoglucomutase <400> 3 atggctatgg agagtgcatt gacatccaca cgagtttcaa ttccatcgtt gtgttctggg60 atcagttcat ctcatcatca ccatagatcc ttatcatttc tcaatttccc caaattgtct1 tcattcaaat actcttttcg aacaatttca cctgttcctt tcgttgtcag tgcatcctct180 gtttctccat catctccttc tacatctgtt gcccaatctc aggatctcaa gattaaatca2 gttcctacca agcctattga aggtcaaaag accggtacca gtggtctacg caaaaaggtt300 aaagtgttta tgcaggacaa ttaccttgcc aattggatac aggcattgtt taattctttg360 ccgttagagg attataagaa tggactcttg gtcttaggag gtgatggtcg atatttcaat4 cgagaagctg cacagataat cattaaaatt gctgcgggta acggtgttgg taaaatattg480 gttggcaagg acggtatact gtctactcaa gctgtgtctg ctgtgatacg gaaaagagag5 gcaaatggtg gctttataat gagtgcaagc cataaccctg gtggtcccga gtatgattgg600 ggtatcaagt tcaattatag cagcggccaa ccagctcccg agtctatcac ggacaagatc660 tatggaaata ccctttctat ttctgaaata aaaattgctg acattcctga tgttgatctt7 tctcaacttg gagttacaaa atatggaaat tttagtgtgg aggtggttga ccctgtggct780 gattatttgg aactaatgga aaatgtattt gatttttcac tcattagaag tcttgtttca8 cgaccagatt tcaggtttgt atttgatgcc atgcatgcag ttacaggggc ttatgcaaag900 cccatttttg ttgacaaact aggagctagc ctggagtcta ttgcaaatgg agtgccactg960 gaagattttg gacatggtca tccagaccct aaccttacgt atgctgagga tttggtgaat10 atcctgtatg gagagaatgg acctgacttt ggtgctgcaa gcgatggaga tggtgataga1080 aacatgattc ttggaagaag cttttttgtt actccatctg attctgttgc aattattgct11 gcccaatgcc aatatgctat ccattatttc cagtccgggc ctaagggttt ggctcgatca1200 atgcccacta gcggttctct agatcgcgtt gcccaaaagc taaacctccc cttttttgag1260 gtgccaactg gttggaaatt ctttggtaat ctaatggatg ctggaaaatt gtcaatctgt13 ggcgaagaaa gttttgggac tggttctgac cacatccgtg aaaaagatgg tatatgggct1380 gttttagctt ggctttcaat acttgcatat cggaacaagg acaaaaaatc aggggagaaa14 ttggtttctg ttgctgatgt tgtgaaggat cattgggcca cttatggaag gaacttcttt1500 tcgagatatg actatgagga gtgtgaatca gaaggagcaa acaacatgat tgagtatctt1560 cgggatttga tttctaaaag caaggctggt gataagtatg gaagttatag cctagatttt16 gctgatgact tcgcctatac tgatcctgtc gatggaagtg ttgcatccaa acagggggtt1680 cgctttgttt ttagtgatgg gtcacggatc atctttcgac tatcgggtac tggttctgct17 ggtgcaacag tcagaatata tatcgaacag tttgagccgg atgtttccaa acacgacatg1800 gatgctcaaa ttgcattgaa accattgata gatctcgctc tttctgtatc aaagctaaag1860 gacttcaccg gaagagaaaa gcctactgtc atcacataa1899 <210> 4 <211> 632 <212> PRT <213> Solanum tuberosum-Plastidic phosphoglucomutase <400> 4 Met Ala Met Glu Ser Ala Leu Thr Ser Thr Arg Val Ser Ile Pro Ser 1 Leu Cys Ser Gly Ile Ser Ser Ser His His His His Arg Ser Leu Ser Phe Leu Asn Phe Pro Lys Leu Ser Ser Phe Lys Tyr Ser Phe Arg Thr Ile Ser Pro Val Pro Phe Val Val Ser Ala Ser Ser Val Ser Pro Ser 560 Ser Pro Ser Thr Ser Val Ala Gin Ser Gin Asp Leu Lys Ile Lys Ser 670780 Val Pro Thr Lys Pro Ile Glu Gly Gin Lys Thr Gly Thr Ser Gly Leu 8909 Arg Lys Lys Val Lys Val Phe Met Gin Asp Asn Tyr Leu Ala Asn Trp 100101 Ile Gin Ala Leu Phe Asn Ser Leu Pro Leu Glu Asp Tyr Lys Asn Gly 111 Leu Leu Val Leu Gly Gly Asp Gly Arg Tyr Phe Asn Arg Glu Ala Ala 111 Gln Ile Ile Ile Lys Ile Ala Ala Gly Asn Gly Val Gly Lys Ile Leu 1115160 Val Gly Lys Asp Gly Ile Leu Ser Thr Gin Ala Val Ser Ala Val Ile 1617017 Arg Lys Arg Glu Ala Asn Gly Gly Phe Ile Met Ser Ala Ser His Asn 18018190 Pro Gly Gly Pro Glu Tyr Asp Trp Gly Ile Lys Phe Asn Tyr Ser Ser 1920020 Gly Gin Pro Ala Pro Glu Ser Ile Thr Asp Lys Ile Tyr Gly Asn Thr 222 Leu Ser Ile Ser Glu Ile Lys Ile Ala Asp Ile Pro Asp Val Asp Leu 2222 Ser Gin Leu Gly Val Thr Lys Tyr Gly Asn Phe Ser Val Glu Val Val 2225 Asp Pro Val Ala Asp Tyr Leu Glu Leu Met Glu Asn Val Phe Asp Phe 26026270 Ser Leu Ile Arg Ser Leu Val Ser Arg Pro Asp Phe Arg Phe Val Phe 2728028 Asp Ala Met His Ala Val Thr Gly Ala Tyr Ala Lys Pro Ile Phe Val 29029300 Asp Lys Leu Gly Ala Ser Leu Glu Ser Ile Ala Asn Gly Val Pro Leu 30333 Glu Asp Phe Gly His Gly His Pro Asp Pro Asn Leu Thr Tyr Ala Glu 333 Asp Leu Val Asn Ile Leu Tyr Gly Glu Asn Gly Pro Asp Phe Gly Ala 333 Ala Ser Asp Gly Asp Gly Asp Arg Asn Met Ile Leu Gly Arg Ser Phe 3536036 Phe Val Thr Pro Ser Asp Ser Val Ala Ile Ile Ala Ala Gin Cys Gin 37037380 Tyr Ala Ile His Tyr Phe Gin Ser Gly Pro Lys Gly Leu Ala Arg Ser 3839039400 Met Pro Thr Ser Gly Ser Leu Asp Arg Val Ala Gin Lys Leu Asn Leu 4044 Pro Phe Phe Glu Val Pro Thr Gly Trp Lys Phe Phe Gly Asn Leu Met 444 Asp Ala Gly Lys Leu Ser Ile Cys Gly Glu Glu Ser Phe Gly Thr Gly 444 Ser Asp His Ile Arg Glu Lys Asp Gly Ile Trp Ala Val Leu Ala Trp 445460 Leu Ser Ile Leu Ala Tyr Arg Asn Lys Asp Lys Lys Ser Gly Glu Lys 4647047480 Leu Val Ser Val Ala Asp Val Val Lys Asp His Trp Ala Thr Tyr Gly 4849049 Arg Asn Phe Phe Ser Arg Tyr Asp Tyr Glu Glu Cys Glu Ser Glu Gly 500505 Ala Asn Asn Met Ile Glu Tyr Leu Arg Asp Leu Ile Ser Lys Ser Lys 555 Ala Gly Asp Lys Tyr Gly Ser Tyr Ser Leu Asp Phe Ala Asp Asp Phe 555 Ala Tyr Thr Asp Pro Val Asp Gly Ser Val Ala Ser Lys Gln Gly Val 5555560 Arg Phe Val Phe Ser Asp Gly Ser Arg Ile Ile Phe Arg Leu Ser Gly 5657057 Thr Gly Ser Ala Gly Ala Thr Val Arg Ile Tyr Ile Glu Gin Phe Glu 58058590 Pro Asp Val Ser Lys His Asp Met Asp Ala Gin Ile Ala Leu Lys Pro 5960060 Leu Ile Asp Leu Ala Leu Ser Val Ser Lys Leu Lys Asp Phe Thr Gly 666 Arg Glu Lys Pro Thr Val Ile Thr 66 <210> <211> 1563 <212> DNA <213> Solanum tuberosum-Glucose-l-phosphate adeny1transferase large subunit <400> atgaaatcga cggtccattt ggggagagtg agcactggtg gctttaacaa tggagagaag60 gagtttttcg gggagaagat cagagggagt ttgaacagca atctcaggat taatcagttg1 tcgaaaagtt tgaaacttga gaagaaggag aacaagatca aacctggggt tgcttactct180 gtgatcacta ctgaaaatga cacacagact gtgttcgtag atatgccacg tcttgagaga2 cgccgggcaa atccaaagga tgtggctgca gtcatactag gaggaggaga agggaccaag300 ttattcccac ttacaagtag aactgcaacc cctgctgttc cggttggagg atgctacagg360 ctaatagaca tcccaatgag caactgtatc aacagtgcta ttaacaagat ttttgtgctg4 acacagtaca attctgctcc cctgaatcgt cacattgctc gaacatattt tggcaatggt480 gtgagctttg gagatggatt tgtcgaggta ctagctgcaa ctcagacacc tggggaagca5 ggaaaaaaat ggtttcaagg aacagcagat gctgttagaa aatttatatg ggtttttgag600 gacgctaaga acaagaatat tgaaaatatc cttgtattat ctggggatca tctttatagg660 atggattata tggagttggt gcagaaccat attgacagga atgctgatat tactctttca7 tgtgcaccag ctgaggacag ccgagcatca gattttgggc tggtcaagat tgacagcaga780 ggcagagttg tccagtttgc tgaaaaacca aaaggttttg atcttaaagc aatgcaagta8 gatactactc ttgttggatt atctccacaa gatgcgaaga aatcccccta tattgcttca900 atgggagttt atgtattcaa gacagatgta ttgttgaagc tcttgaaatg gagctatccc960 acttctaatg attttggctc tgaaattata ccagcagcta ttgacgatta caatgtccaa10 537 gcatacattt tcaaagacta ttgggaggac attggaacaa agcttggcac tcacacaaga gtttccagag ttccaatttt 679 ttaaatcttt acgatccaaa ttataatgct aacacctttt 1080 11 tacacatctc ctaggttcct tccaccaacc aagatagaca attgcaagat taaggatgcc 1200 ataatctctc atggatgttt cttgcgagat tgttctgtgg aacactccat agtgggtgaa 1260 agatcgcgct tagattgtgg tgttgaactg aaggatactt tcatgatggg agcagactac 13 taccaaacag aatctgagat tgcctccctg ttagcagagg ggaaagtacc gattggaatt 1380 ggggaaaata caaaaataag gaaatgtatc attgacaaga acgcaaagat aggaaagaat 14 gtttcaatca taaataaaga cggtgttcaa gaggcagacc gaccagagga aggattctac 1500 atacgatcag gcataatcat tatattagag aaagccacaa ttagagatgg aacagtcata 1560 tga 1563 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Solanum tuberosum-Glucose-l-phosphate adenyltrasnferase large subunit <400> 6 Met Lys Ser Thr Val His Leu Gly Arg Val Ser Thr Gly Gly Phe Asn 1 Asn Gly Glu Lys Glu Phe Phe Gly Glu Lys Ile Arg Gly Ser Leu Asn Ser Asn Leu Arg Ile Asn Gin Leu Ser Lys Ser Leu Lys Leu Glu Lys Lys Glu Asn Lys Ile Lys Pro Gly Val Ala Tyr Ser Val Ile Thr Thr 560 Glu Asn Asp Thr Gin Thr Val Phe Val Asp Met Pro Arg Leu Glu Arg 670780 Arg Arg Ala Asn Pro Lys Asp Val Ala Ala Val Ile Leu Gly Gly Gly 8909 Glu Gly Thr Lys Leu Phe Pro Leu Thr Ser Arg Thr Ala Thr Pro Ala 100101 Val Pro Val Gly Gly Cys Tyr Arg Leu Ile Asp Ile Pro Met Ser Asn 111 Cys Ile Asn Ser Ala Ile Asn Lys Ile Phe Val Leu Thr Gin Tyr Asn 111 Ser Ala Pro Leu Asn Arg His Ile Ala Arg Thr Tyr Phe Gly Asn Gly 1115160 Val Ser Phe Gly Asp Gly Phe Val Glu Val Leu Ala Ala Thr Gin Thr 1617017 Pro Gly Glu Ala Gly Lys Lys Trp Phe Gin Gly Thr Ala Asp Ala Val 18018190 Arg Lys Phe Ile Trp Val Phe Glu Asp Ala Lys Asn Lys Asn Ile Glu 1920020 Asn Ile Leu Val Leu Ser Gly Asp His Leu Tyr Arg Met Asp Tyr Met 222 Glu Leu Val Gin Asn His Ile Asp Arg Asn Ala Asp Ile Thr Leu Ser 2222 Cys Ala Pro Ala Glu Asp Ser Arg Ala Ser Asp Phe Gly Leu Val Lys 2225 Ile Asp Ser Arg Gly Arg Val Val Gin Phe Ala Glu Lys Pro Lys Gly 26026270 Phe Asp Leu Lys Ala Met Gin Val Asp Thr Thr Leu Val Gly Leu Ser 2728028 Pro Gin Asp Ala Lys Lys Ser Pro Tyr Ile Ala Ser Met Gly Val Tyr 29029300 Val Phe Lys Thr Asp Val Leu Leu Lys Leu Leu Lys Trp Ser Tyr Pro 30333 Thr Ser Asn Asp Phe Gly Ser Glu Ile Ile Pro Ala Ala Ile Asp Asp 333 Tyr Asn Val Gin Ala Tyr Ile Phe Lys Asp Tyr Trp Glu Asp Ile Gly 333 Thr Ile Lys Ser Phe Tyr Asn Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gin Glu Phe 3536036 Pro Glu Phe Gin Phe Tyr Asp Pro Lys Thr Pro Phe Tyr Thr Ser Pro 37037380 Arg Phe Leu Pro Pro Thr Lys Ile Asp Asn Cys Lys Ile Lys Asp Ala 3839039400 Ile Ile Ser His Gly Cys Phe Leu Arg Asp Cys Ser Val Glu His Ser 4044 Ile Val Gly Glu Arg Ser Arg Leu Asp Cys Gly Val Glu Leu Lys Asp 444 Thr Phe Met Met Gly Ala Asp Tyr Tyr Gin Thr Glu Ser Glu Ile Ala 444 Ser Leu Leu Ala Glu Gly Lys Val Pro Ile Gly Ile Gly Glu Asn Thr 445460 Lys Ile Arg Lys Cys Ile Ile Asp Lys Asn Ala Lys Ile Gly Lys Asn 4647047480 Val Ser Ile Ile Asn Lys Asp Gly Val Gin Glu Ala Asp Arg Pro Glu 4849049 Glu Gly Phe Tyr Ile Arg Ser Gly Ile Ile Ile Ile Leu Glu Lys Ala 500505 Thr Ile Arg Asp Gly Thr Val Ile 55 <210> 7 <211> 1896 <212> DNA <213> Solanum tuberosum-Plastidic ATP/ADP translocator <400> 7 atggaaggtg ttttacaaac aagagggctt ctttctttgc cttctaaacc caaaatcaag60 gctttttacc cattgcctca agggggtcta aggaacagat tcaattcttt aagtagttta1 aagcctaatc ctcttaatgg ggtttcttta tcttcaaatg ggtttcaaaa agttcaaggc180 tttgacacaa agcctcagtt gtttggccaa aagaagaggt gttttccaat atgcaaagct2 gaggctgctg ctgctgctgg tgcagctgat ggacagccac tttttgttga aaaggagcaa300 cctaagttta tggggattga acttgtgacc cttaagaaaa ttataccact tggggcgatg360 ttcttttgta ttctgtttaa ttatacaatc cttagggata ctaaggatgt gttggttgta4 acagctaaag ggtccagtgc tgagattatc cctttcttga aaacttgggt gaatttgcct480 atggctattg gattcatgct tttgtacaca aagttggcta atgtgttgtc aaaggaggct5 cttttttata ctgttatact tccttttatt gcattctttg gggcgtttgg ttttgttttg600 tatcctctta gcaattactt tcaccctaca gcttttgctg ataagcttct caataccctt660 ggtccaagat ttcttggacc aattgctatt ctgaggatct ggagtttctg cttgttctat7 gtcatggctg agctttgggg aagtgtggtg gtttcagtac tcttttgggg atttgctaat780 cagattacaa ctatcgatga ggctaagaga ttctatcctt tgtttggact tggagcgaat8 gttgctctta ttttctctgg tcgcacagtg aagtactttt ctagcttgag aagctcttta900 ggtcctggag ttgatggttg ggctatctcc ctgaaaggaa tgatgagcat tgttgtgatg960 atgggtgggg caatctgttt cttttactgg tgggtgaata gaaatgttgc tctcccaact10 cgtagcaaga agaagaaggt aaaacctaac atgaccacaa tggagagctt gaagttcttg1080 gtctcttcaa aatatatcag ggatottgcc acattggttg tagcatatgg cattagtatc11 aaccttgttg aagttacatg gaagtcaaag ctcaaagctc agttcccaag ccccaatgaa1200 tactcctcat tcatgggtga cttctcaact gctactggaa tagcaacttt cacaatgatg1260 ttgttaagtc aatggatttt cgacaagtat gggtggggag cagcagccaa gataacacct13 acagtcttgc tcctaaccgg agttggtttc ttctccctgc ttttgtttgg tgcccctcta1380 gcacctactc ttgcgaagtt tggaatgact cctcttctag cagctgtcta tgtgggtgca14 atgcagaaca ttttcagtaa gagtgcaaag tatagtttgt ttgacccctg caaagaaatg1500 gcctacattc ctttggatga ggacaccaag gttaaaggga aggcagcaat cgatgttgtc1560 tgcaatccac tgggaaagtc tggaggagct ttgatacaac aattcatgat tttgactttt16 ggttcacttg ccagctcgac accctacctc ggcggtgtgc tcttagtaat tgttcttgca1680 tggttgggag cagccaagtc tttggatgga cagttcactc aattacgcca agaagaagat17 cttgagaagg aaatggagag agcatcgttg aagatccctg tcgtgtctca aaatgaaaat1800 ggaaatggtc ctctctcaag tgggtcatca ctaaatcccg ctggaggtga ctctaccaac1860 gcttcatcag aaccctcctc cccaaggagc ctgtaa1896 <210> 8 <211> 631 <212> PRT <213> Solanum tuberosum-plastidic ATP/ADP translocator <400> 8 Met Glu Gly Val Leu Gin Thr Arg Gly Leu Leu Ser Leu Pro Ser Lys 1 Pro Lys Ile Lys Ala Phe Tyr Pro Leu Pro Gin Gly Gly Leu Arg Asn Arg Phe Asn Ser Leu Ser Ser Leu Lys Pro Asn Pro Leu Asn Gly Val Ser Leu Ser Ser Asn Gly Phe Gin Lys Val Gin Gly Phe Asp Thr Lys 560 Pro Gin Leu Phe Gly Gin Lys Lys Arg Cys Phe Pro Ile Cys Lys Ala 670780 Glu Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Asp Gly Gin Pro Leu Phe Val 8909 Glu Lys Glu Gin Pro Lys Phe Met Gly Ile Glu Leu Val Thr Leu Lys 100101 Lys Ile Ile Pro Leu Gly Ala Met Phe Phe Cys Ile Leu Phe Asn Tyr 111 Thr Ile Leu Arg Asp Thr Lys Asp Val Leu Val Val Thr Ala Lys Gly 111 Ser Ser Ala Glu Ile Ile Pro Phe Leu Lys Thr Trp Val Asn Leu Pro 1115160 Met Ala Ile Gly Phe Met Leu Leu Tyr Thr Lys Leu Ala Asn Val Leu 1617017 Ser Lys Glu Ala Leu Phe Tyr Thr Val Ile Leu Pro Phe Ile Ala Phe 18018190 Phe Gly Ala Phe Gly Phe Val Leu Tyr Pro Leu Ser Asn Tyr Phe His 1920020 Pro Thr Ala Phe Ala Asp Lys Leu Leu Asn Thr Leu Gly Pro Arg Phe 222 Leu Gly Pro Ile Ala Ile Leu Arg Ile Trp Ser Phe Cys Leu Phe Tyr 2222 Val Met Ala Glu Leu Trp Gly Ser Val Val Val Ser Val Leu Phe Trp 2225 Gly Phe Ala Asn Gln Ile Thr Thr Ile Asp Glu Ala Lys Arg Phe Tyr 26026270 Pro Leu Phe Gly Leu Gly Ala Asn Val Ala Leu Ile Phe Ser Gly Arg 2728028 Thr Val Lys Tyr Phe Ser Ser Leu Arg Ser Ser Leu Gly Pro Gly Val 29029300 Asp Gly Trp Ala Ile Ser Leu Lys Gly Met Met Ser Ile Val Val Met 30333 Met Gly Gly Ala Ile Cys Phe Phe Tyr Trp Trp Val Asn Arg Asn Val 333 Ala Leu Pro Thr Arg Ser Lys Lys Lys Lys Val Lys Pro Asn Met Thr 333 Thr Met Glu Ser Leu Lys Phe Leu Val Ser Ser Lys Tyr Ile Arg Asp 3536036 Leu Ala Thr Leu Val Val Ala Tyr Gly Ile Ser Ile Asn Leu Val Glu 37037380 Val Thr Trp Lys Ser Lys Leu Lys Ala Gln Phe Pro Ser Pro Asn Glu 3839039400 Tyr Ser Ser Phe Met Gly Asp Phe Ser Thr Ala Thr Gly Ile Ala Thr 4044 Phe Thr Met Met Leu Leu Ser Gln Trp Ile Phe Asp Lys Tyr Gly Trp 444 Gly Ala Ala Ala Lys Ile Thr Pro Thr Val Leu Leu Leu Thr Gly Val 444 Gly Phe Phe Ser Leu Leu Leu Phe Gly Ala Pro Leu Ala Pro Thr Leu 445460 Ala Lys Phe Gly Met Thr Pro Leu Leu Ala Ala Val Tyr Val Gly Ala 4647047480 Met Gln Asn Ile Phe Ser Lys Ser Ala Lys Tyr Ser Leu Phe Asp Pro 4849049 Cys Lys Glu Met Ala Tyr Ile Pro Leu Asp Glu Asp Thr Lys Val Lys 500505 Gly Lys Ala Ala Ile Asp Val Val Cys Asn Pro Leu Gly Lys Ser Gly 555 Gly Ala Leu Ile Gln Gln Phe Met Ile Leu Thr Phe Gly Ser Leu Ala 555 Ser Ser Thr Pro Tyr Leu Gly Gly Val Leu Leu Val Ile Val Leu Ala 5555560 Trp Leu Gly Ala Ala Lys Ser Leu Asp Gly Gin Phe Thr Gln Leu Arg 5657057 Gin Glu Glu Asp Leu Glu Lys Glu Met Glu Arg Ala Ser Leu Lys Ile 58058590 Pro Val Val Ser Gin Asn Glu Asn Gly Asn Gly Pro Leu Ser Ser Gly 5960060 Ser Ser Leu Asn Pro Ala Gly Gly Asp Ser Thr Asn Ala Ser Ser Glu 666 Pro Ser Ser Pro Arg Ser Leu 66 <210> 9 <211> 873 <212> DNA <213> Solanum tuberosum-Plastidic inorganic pyrophosphatase <400> 9 atggcggcgg caagagtcat ggtatcagcc agcaacactt taacggcttc gctcctatcg60 aaaggtccat tacgaaagcc caacaatttc agcctttgct tcagaaacgg accggtgcaa1 aagaggcgtc ttttcacgtg cagtgcaatc tacaatccac agattcagac tatagaagaa180 ggacagcccg aaaccctaga ttaccgtgtg ttttttgcag acaattccgg caadaagata2 tccccttggc atgacatacc actacatttg ggtgatggtg ttttcaattt tgttgttgag300 atccccaaag aatcaagtgc aaagatggaa gttgctacag atgagcaaca cactccaatt360 aaacaagaca cgaagaaggg gaaacttcga tactatccat ataatattca ctggaactat4 ggattgcttc ctcaaacatg ggaagatcct acttttgcga acaccgaagt tgagggggca480 tttggtgata atgaccctgt tgatgttgtt gagattgggg aaagccgagg taaaattggc5 caggttctga aggtcaaacc tttagctgct ctggcaatga ttgatgaagg agaacttgac600 tggaaaatag ttgctatttc actagatgat ccaagagctt cacttgttaa tgatgttgat660 gatgtggaaa aacattttcc gggcactctc acagcaatca gggattggtt tagagactat7 aagatacctg atggaaaacc tgccaatagg tttgctcttg gcaacaagcc agcaaacaag780 gattacgctc ttaagattat tacggaaacc aatgaatctt gggcaaagct ggtcaagaga8 tcaatcgctg ctggtgagct ttcacttgta taa873 <210> <211> 290 <212> PRT <213> Solanum tuberosum-Plastidic inorganic pyrophoshatase <400> Met Ala Ala Ala Arg Val Met Val Ser Ala Ser Asn Thr Leu Thr Ala 1 Ser Leu Leu Ser Lys Gly Pro Leu Arg Lys Pro Asn Asn Phe Ser Leu Cys Phe Arg Asn Gly Pro Val Gin Lys Arg Arg Leu Phe Thr Cys Ser Ala Ile Tyr Asn Pro Gin Ile Gin Thr lie Giu Giu Gly Gin Pro Giu 560 Thr Leu Asp Tyr Arg Val Phe Phe Ala Asp Asn Ser Gly Lys Lys Ile 670780 Ser Pro Trp His Asp Ile Pro Leu His Leu Gly Asp Gly Val Phe Asn 8909 Phe Val Val Giu Ile Pro Lys Giu Ser Ser Ala Lys Met Giu Val Ala 100101 Thr Asp Giu Gin His Thr Pro Ile Lys Gin Asp Thr Lys Lys Gly Lys 111 Leu Arg Tyr Tyr Pro Tyr Asn Ile His Trp Asn Tyr Gly Leu Leu Pro 111 Gin Thr Trp Giu Asp Pro Thr Phe Ala Asn Thr Giu Val Giu Gly Ala 1115160 Phe Gly Asp Asn Asp Pro Val Asp Val Val Giu Ile Gly Giu Ser Arg 1617017 Gly Lys Ile Gly Gin Val Leu Lys Val Lys Pro Leu Ala Ala Leu Ala 18018190 Met Ile Asp Giu Gly Giu Leu Asp Trp Lys Ile Val Ala Ile Ser Leu 1920020 Asp Asp Pro Arg Ala Ser Leu Val Asn Asp Val Asp Asp Val Giu Lys 222 His Phe Pro Gly Thr Leu Thr Ala Ile Arg Asp Trp Phe Arg Asp Tyr 2222 Lys Ile Pro Asp Gly Lys Pro Ala Asn Arg Phe Ala Leu Gly Asn Lys 2225 Pro Ala Asn Lys Asp Tyr Ala Leu Lys Ile Ile Thr Giu Thr Asn Giu 26026270 Ser Trp Ala Lys Leu Val Lys Arg Ser Ile Ala Ala Gly Giu Leu Ser 2728028 Leu Val 290 <210> 11 <211> 57 <212> PRT <213> Solanum tuberosum-Plastidic phosphoglucomutase <400> 11 Ala Ser Ser Val Ser Pro Ser Ser Pro Ser Thr Ser Val Ala Gln Ser 1 Gln Asp Leu Lys Ile Lys Ser Val Pro Thr Lys Pro Ile Glu Gly Gin Lys Thr Gly Thr Ser Gly Leu Arg Lys Lys Val Lys Val Phe Met Gln Asp Asn Tyr Leu Ala Asn Trp Ile Gln Ala Leu Phe Asn Ser Leu Pro 560 Leu Glu Asp Tyr Lys Asn Gly Leu Leu Val Leu Gly Gly Asp Gly Arg 670780 Tyr Phe Asn Arg Glu Ala Ala Gln Ile Ile Ile Lys Ile Ala Ala Gly 8909 Asn Gly Val Gly Lys Ile Leu Val Gly Lys Asp Gly Ile Leu Ser Thr 100101 Gln Ala Val Ser Ala Val Ile Arg Lys Arg Glu Ala Asn Gly Gly Phe 111 Ile Met Ser Ala Ser His Asn Pro Gly Gly Pro Glu Tyr Asp Trp Gly 111 Ile Lys Phe Asn Tyr Ser Ser Gly Gln Pro Ala Pro Glu Ser Ile Thr 1115160 Asp Lys Ile Tyr Gly Asn Thr Leu Ser Ile Ser Glu Ile Lys Ile Ala 1617017 Asp Ile Pro Asp Val Asp Leu Ser Gln Leu Gly Val Thr Lys Tyr Gly 18018190 Asn Phe Ser Val Glu Val Val Asp Pro Val Ala Asp Tyr Leu Glu Leu 1920020 Met Glu Asn Val Phe Asp Phe Ser Leu Ile Arg Ser Leu Val Ser Arg 222 Pro Asp Phe Arg Phe Val Phe Asp Ala Met His Ala Val Thr Gly Ala 2222 Tyr Ala Lys Pro Ile Phe Val Asp Lys Leu Gly Ala Ser Leu Glu Ser 2225 Ile Ala Asn Gly Val Pro Leu Glu Asp Phe Gly His Gly His Pro Asp 26026270 Pro Asn Leu Thr Tyr Ala Glu Asp Leu Val Asn Ile Leu Tyr Gly Glu 2728028 Asn Gly Pro Asp Phe Gly Ala Ala Ser Asp Gly Asp Gly Asp Arg Asn 29029300 Met Ile Leu Gly Arg Ser Phe Phe Val Thr Pro Ser Asp Ser Val Ala 30333 Ile Ile Ala Ala Gin Cys Gin Tyr Ala Ile His Tyr Phe Gin Ser Gly 333 Pro Lys Gly Leu Ala Arg Ser Met Pro Thr Ser Gly Ser Leu Asp Arg 333 Val Ala Gin Lys Leu Asn Leu Pro Phe Phe Glu Val Pro Thr Gly Trp 3536036 Lys Phe Phe Gly Asn Leu Met Asp Ala Gly Lys Leu Ser Ile Cys Gly 37037380 Glu Glu Ser Phe Gly Thr Gly Ser Asp His Ile Arg Glu Lys Asp Gly 3839039400 Ile Trp Ala Val Leu Ala Trp Leu Ser Ile Leu Ala Tyr Arg Asn Lys 4044 Asp Lys Lys Ser Gly Glu Lys Leu Val Ser Val Ala Asp Val Val Lys 444 Asp His Trp Ala Thr Tyr Gly Arg Asn Phe Phe Ser Arg Tyr Asp Tyr 444 Glu Glu Cys Glu Ser Glu Gly Ala Asn Asn Met Ile Glu Tyr Leu Arg 445460 Asp Leu Ile Ser Lys Ser Lys Ala Gly Asp Lys Tyr Gly Ser Tyr Ser 4647047480 Leu Asp Phe Ala Asp Asp Phe Ala Tyr Thr Asp Pro Val Asp Gly Ser 4849049 Val Ala Ser Lys Gin Gly Val Arg Phe Val Phe Ser Asp Gly Ser Arg 500505 Ile Ile Phe Arg Leu Ser Gly Thr Gly Ser Ala Gly Ala Thr Val Arg 555 Ile Tyr Ile Glu Gin Phe Glu Pro Asp Val Ser Lys His Asp Met Asp 555 Ala Gin Ile Ala Leu Lys Pro Leu Ile Asp Leu Ala Leu Ser Val Ser 5555560 Lys Leu Lys Asp Phe Thr Gly Arg Glu Lys Pro Thr Val Ile Thr 5657057 <210> 12 <211> 1659 <212> DNA <213> Solanum tuberosum-plastidic ATP/ADP translocator <400> 12 gctgaggctg ctgctgctgc tggtgcagct gatggacagc cactttttgt tgaaaaggag60 caacctaagt ttatggggat tgaacttgtg acccttaaga aaattatacc acttggggcg1 atgttctttt gtattctgtt taattataca atccttaggg atactaagga tgtgttggtt180 gtaacagcta aagggtccag tgctgagatt atccctttct tgaaaacttg ggtgaatttg2 cctatggcta ttggattcat gcttttgtac acaaagttgg ctaatgtgtt gtcaaaggag300 gctctttttt atactgttat acttcctttt attgcattct ttggggcgtt tggttttgtt360 ttgtatcctc ttagcaatta ctttcaccct acagcttttg ctgataagct tctcaatacc4 cttggtccaa gatttcttgg accaattgct attctgagga tctggagttt ctgcttgttc480 tatgtcatgg ctgagctttg gggaagtgtg gtggtttcag tactcttttg gggatttgct5 aatcagatta caactatcga tgaggctaag agattctatc ctttgtttgg acttggagcg600 aatgttgctc ttattttctc tggtcgcaca gtgaagtact tttctagctt gagaagctct660 ttaggtcctg gagttgatgg ttgggctatc tccctgaaag gaatgatgag cattgttgtg7 atgatgggtg gggcaatctg tttcttttac tggtgggtga atagaaatgt tgctctccca780 actcgtagca agaagaagaa ggtaaaacct aacatgacca caatggagag cttgaagttc8 ttggtctctt caaaatatat cagggatctt gccacattgg ttgtagcata tggcattagt900 atcaaccttg ttgaagttac atggaagtca aagctcaaag ctcagttccc aagccccaat960 gaatactcct cattcatggg tgacttctca actgctactg gaatagcaac tttcacaatg10 atgttgttaa gtcaatggat tttcgacaag tatgggtggg gagcagcagc caagataaca1080 cctacagtct tgctcctaac cggagttggt ttcttctccc tgcttttgtt tggtgcccct11 ctagcaccta ctcttgcgaa gtttggaatg actcctcttc tagcagctgt ctatgtgggt1200 gcaatgcaga acattttcag taagagtgca aagtatagtt tgtttgaccc ctgcaaagaa1260 atggcctaca ttcctttgga tgaggacacc aaggttaaag ggaaggcagc aatcgatgtt13 gtctgcaatc cactgggaaa gtctggagga gctttgatac aacaattcat gattttgact1380 tttggttcac ttgccagctc gacaccctac ctcggcggtg tgctcttagt aattgttctt14 gcatggttgg gagcagccaa gtctttggat ggacagttca ctcaattacg ccaagaagaa1500 gatcttgaga aggaaatgga gagagcatcg ttgaagatcc ctgtcgtgtc tcaaaatgaa1560 aatggaaatg gtcctctctc aagtgggtca tcactaaatc ccgctggagg tgactctacc16 aacgcttcat cagaaccctc ctccccaagg agcctgtaa1659 <210> 13 <211> 552 <212> PRT <213> Solanum tuberosum-Plastidic ATP/ADP translocator <400> 13 Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Asp Gly Gin Pro Leu Phe 1 Val Glu Lys Glu Gin Pro Lys Phe Met Gly Ile Glu Leu Val Thr Leu Lys Lys Ile Ile Pro Leu Gly Ala Met Phe Phe Cys Ile Leu Phe Asn Tyr Thr Ile Leu Arg Asp Thr Lys Asp Val Leu Val Val Thr Ala Lys 560 Gly Ser Ser Ala Glu Ile Ile Pro Phe Leu Lys Thr Trp Val Asn Leu 670780 Pro Met Ala Ile Gly Phe Met Leu Leu Tyr Thr Lys Leu Ala Asn Val 8909 Leu Ser Lys Glu Ala Leu Phe Tyr Thr Val Ile Leu Pro Phe Ile Ala 100101 Phe Phe Gly Ala Phe Gly Phe Val Leu Tyr Pro Leu Ser Asn Tyr Phe 111 His Pro Thr Ala Phe Ala Asp Lys Leu Leu Asn Thr Leu Gly Pro Arg 111 Phe Leu Gly Pro Ile Ala Ile Leu Arg Ile Trp Ser Phe Cys Leu Phe 1115160 Tyr Val Met Ala Glu Leu Trp Gly Ser Val Val Val Ser Val Leu Phe 1617017 Trp Gly Phe Ala Asn Gin Ile Thr Thr Ile Asp Glu Ala Lys Arg Phe 18018190 Tyr Pro Leu Phe Gly Leu Gly Ala Asn Val Ala Leu Ile Phe Ser Gly 1920020 Arg Thr Val Lys Tyr Phe Ser Ser Leu Arg Ser Ser Leu Gly Pro Gly 222 Val Asp Gly Trp Ala Ile Ser Leu Lys Gly Met Met Ser Ile Val Val 2222 Met Met Gly Gly Ala Ile Cys Phe Phe Tyr Trp Trp Val Asn Arg Asn 2225 Val Ala Leu Pro Thr Arg Ser Lys Lys Lys Lys Val Lys Pro Asn Met 26026270 Thr Thr Met Glu Ser Leu Lys Phe Leu Val Ser Ser Lys Tyr Ile Arg 2728028 Asp Leu Ala Thr Leu Val Val Ala Tyr Gly Ile Ser Ile Asn Leu Val 29029300 Glu Val Thr Trp Lys Ser Lys Leu Lys Ala Gin Phe Pro Ser Pro Asn 30333 Glu Tyr Ser Ser Phe Met Gly Asp Phe Ser Thr Ala Thr Gly Ile Ala 333 Thr Phe Thr Met Met Leu Leu Ser Gin Trp Ile Phe Asp Lys Tyr Gly 333 Trp Gly Ala Ala Ala Lys Ile Thr Pro Thr Val Leu Leu Leu Thr Gly 3536036 Val Gly Phe Phe Ser Leu Leu Leu Phe Gly Ala Pro Leu Ala Pro Thr 37037380 Leu Ala Lys Phe Gly Met Thr Pro Leu Leu Ala Ala Val Tyr Val Gly 3839039400 Ala Met Gln Asn Ile Phe Ser Lys Ser Ala Lys Tyr Ser Leu Phe Asp 4044 Pro Cys Lys Glu Met Ala Tyr Ile Pro Leu Asp Glu Asp Thr Lys Val 444 Lys Gly Lys Ala Ala Ile Asp Val Val Cys Asn Pro Leu Gly Lys Ser 444 Gly Gly Ala Leu Ile Gln Gln Phe Met Ile Leu Thr Phe Gly Ser Leu 445460 Ala Ser Ser Thr Pro Tyr Leu Gly Gly Val Leu Leu Val Ile Val Leu 4647047480 Ala Trp Leu Gly Ala Ala Lys Ser Leu Asp Gly Gln Phe Thr Gln Leu 4849049 Arg Gln Glu Glu Asp Leu Glu Lys Glu Met Glu Arg Ala Ser Leu Lys 500505 Ile Pro Val Val Ser Gln Asn Glu Asn Gly Asn Gly Pro Leu Ser Ser 555 Gly Ser Ser Leu Asn Pro Ala Gly Gly Asp Ser Thr Asn Ala Ser Ser 555 Glu Pro Ser Ser Pro Arg Ser Leu 55 <210> 14 <211> 729 <212> DNA <213> Solanum tuberosum-Plastidic inorganic pyrosphosphatase <400> 14 gcaatctaca atccacagat tcagactata gaagaaggac agcccgaaac cctagattac60 cgtgtgtttt ttgcagacaa ttccggcaaa aagatatccc cttggcatga cataccacta1 catttgggtg atggtgtttt caattttgtt gttgagatcc ccaaagaatc aagtgcaaag180 atggaagttg ctacagatga gcaacacact ccaattaaac aagacacgaa gaaggggaaa2 cttcgatact atccatataa tattcactgg aactatggat tgcttcctca aacatgggaa300 gatcctactt ttgcgaacac cgaagttgag ggggcatttg gtgataatga ccctgttgat360 gttgttgaga ttggggaaag ccgaggtaaa attggccagg ttctgaaggt caaaccttta4 gctgctctgg caatgattga tgaaggagaa cttgactgga aaatagttgc tatttcacta480 gatgatccaa gagcttcact tgttaatgat gttgatgatg tggaaaaaca ttttccgggc5 actctcacag caatcaggga ttggtttaga gactataaga tacctgatgg aaaacctgcc600 aataggtttg ctcttggcaa caagccagca aacaaggatt acgctcttaa gattattacg660 gaaaccaatg aatcttgggc aaagctggtc aagagatcaa tcgctgctgg tgagctttca7 cttgtataa729 <210> <211> 242 <212> PRT <213> Solanum tuberosum-plastidic inorganic pyrophosphatase <400> Ala Ile Tyr Asn Pro Gin Ile Gin Thr Ile Glu Glu Gly Gin Pro Glu 1 Thr Leu Asp Tyr Arg Val Phe Phe Ala Asp Asn Ser Gly Lys Lys Ile Ser Pro Trp His Asp Ile Pro Leu His Leu Gly Asp Gly Val Phe Asn Phe Val Val Glu Ile Pro Lys Glu Ser Ser Ala Lys Met Glu Val Ala 560 Thr Asp Glu Gin His Thr Pro Ile Lys Gln Asp Thr Lys Lys Gly Lys 670780 Leu Arg Tyr Tyr Pro Tyr Asn Ile His Trp Asn Tyr Gly Leu Leu Pro 8909 Gln Thr Trp Glu Asp Pro Thr Phe Ala Asn Thr Glu Val Glu Gly Ala 100101 Phe Gly Asp Asn Asp Pro Val Asp Val Val Glu Ile Gly Glu Ser Arg 111 Gly Lys Ile Gly Gin Val Leu Lys Val Lys Pro Leu Ala Ala Leu Ala 111 Met Ile Asp Glu Gly Glu Leu Asp Trp Lys Ile Val Ala Ile Ser Leu 1115160 Asp Asp Pro Arg Ala Ser Leu Val Asn Asp Val Asp Asp Val Glu Lys 1617017 His Phe Pro Gly Thr Leu Thr Ala Ile Arg Asp Trp Phe Arg Asp Tyr 18018190 Lys Ile Pro Asp Gly Lys Pro Ala Asn Arg Phe Ala Leu Gly Asn Lys 1920020 Pro Ala Asn Lys Asp Tyr Ala Leu Lys Ile Ile Thr Glu Thr Asn Glu 222 Ser Trp Ala Lys Leu Val Lys Arg Ser Ile Ala Ala Gly Glu Leu Ser 2222 Leu Val