DE4240545A1 - Peptide(s) prepn. using proteolytic enzymes - carried out in the absence of solvents, using substance contg. water of crystallisation to provide necessary water - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden mit Hilfe proteolytischer Enzyme, das auf der Um­ setzung einer Amino-geschützten Aminosäure oder eines Ami­ no-geschützten Peptids als Acylierungskomponente mit einer Aminosäure oder einem Peptid als Aminokomponente in Gegen­ wart eines proteolytischen Enzyms beruht.

Es ist bekannt, daß proteolytische Enzyme, welche die Hydrolyse von Peptidbindungen katalysieren, unter bestimm­ ten Bedingungen auch zur umgekehrten Reaktion, d. h. zur Synthese von Peptidbindungen, verwendet werden können (vgl. V. Cerovsky, Vesmir 69 (1990) 76; H.-D. Jakubke, P. Kuhl und A. Könnecke, Angew. Chem. 24 (1985) 85-93; K. Morihara, Trends. Biotechnol. 5 (1987) 164).

Die Synthese von Peptiden mit Hilfe proteolytischer Enzyme wird nach dem Stand der Technik in wäßrigen Lösungen, ggfs. unter Zusatz von mit Wasser mischbaren Lösungsmit­ teln, in einphasigen, zweiphasigen oder mehrphasigen Systemen oder auch in organischen Lösungsmitteln mit einem geringen Wassergehalt durchgeführt. Bei diesen Reaktions­ systemen spielen die Löslichkeit der Reaktanten, der pH- Wert des Mediums sowie die Stabilität der Enzyme eine ent­ scheidende Rolle und müssen entsprechend bei der Auswahl der Reaktionsbedingungen in Betracht gezogen werden.

Im Zusammenhang mit der Suche nach im Hinblick auf die Peptidausbeute optimalen Reaktionssystemen wurden zahlrei­ che Wege beschritten, zu denen neben den oben genannten auch die enzymatische Synthese unter hohem Druck (Kunugi et al., J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1987, 1335-1336) so­ wie die Synthese in Eis (M. Schuster et al., Tetrahedron 46 (1990) 8093-8102) gehören. Die Peptidsynthese unter Verwendung einer Suspension von pulverförmigem Chymo­ trypsin in nichtpolaren organischen Lösungsmitteln in Ge­ genwart von Na₂CO₃·10H₂O als Wasserquelle für das Enzym wurde ebenfalls beschrieben (P. Kuhl et al., Tetrahedron Lett. 81 (1990) 5213-5216).

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde nun in völlig überraschender Weise festgestellt, daß eine Peptidsynthese auch auf völlig trockenem Wege ohne Verwendung irgendeines Lösungsmittels durch bloße mechanische Beanspruchung der Peptidbildungsreaktanten in Gegenwart eines proteolyti­ schen Enzyms möglich ist, sofern das Reaktionsgemisch eine Kristallwasser enthaltende Substanz enthält, die als Was­ serquelle für das Enzym dienen kann.

Rein mechanochemische bzw. tribochemische Reaktionen sind in der Chemie zwar im Prinzip bekannt, jedoch im wesentli­ chen aus der anorganischen Chemie. Für organische Synthe­ sereaktionen mit Enzymen in lösungsmittelfreien Systemen gibt es nur außerordentlich wenige Beispiele, zu denen die Acylierung von Zuckeracetalen mit langkettigen Fettsäuren und ihren Methylestern durch Lipase gehört, wobei diese Reaktion unter Vakuum durchgeführt wurde, um eine Ver­ schiebung des Reaktionsgleichgewichts zur Seite der End­ produkte durch Verdampfen des bei der Reaktion gebildeten Wassers bzw. Methanols zu erzielen (vgl. K. Aldehorst et al., Synthesis (1990) 112-115; G. Fregapane et al., Enzyme Microb. Technol. 13 (1991) 796-800).

Im Hinblick auf den oben erläuterten Stand der Technik war es im Rahmen der vorliegenden Erfindung sehr überraschend, daß eine rein mechanochemische bzw. tribochemische Reak­ tion ohne Anwesenheit irgendeines Lösungsmittels zu einer enzymatisch katalysierten Peptidsynthese in guten Ausbeu­ ten führt, wenn das Reaktionssystem in irgendeiner Form Kristallwasser enthält. Dies bedeutet mit anderen Worten, daß das Kristallwasser sowohl durch einen der Reaktanten als auch durch das in fester Form eingesetzte proteolyti­ sche Enzym als auch durch Zusatz einer Kristallwasser ent­ haltenden und vorzugsweise basischen Substanz vorliegen kann.

Der Erfindung liegt entsprechend die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Peptidsynthese durch Umsetzung entsprechen­ der Aminosäurederivate als Acylierungskomponente bzw. als Aminokomponente in Gegenwart eines proteolytischen Enzyms anzugeben, das die mit der Verwendung anorganischer und oder organischer Lösungsmittel verbundenen Probleme ver­ meidet und in einfacher Weise zu Peptiden führt.

Die Aufgabe wird gemäß dem Anspruch 1 gelöst. Die Unteran­ sprüche betreffen vorteilhafte Ausführungsformen der Er­ findungskonzeption.

Die Erfindung beruht wesentlich darauf, daß ein Gemisch einer Amino-geschützten Aminosäure oder eines Amino-ge­ schützten Peptids als Acylierungskomponente mit einer Ami­ nosäure oder einem Peptid als Aminokomponente in Gegenwart des proteolytischen Enzyms in trockenem Zustand, d. h. ohne Lösungsmittel, einer mechanischen Beanspruchung unterzogen wird, wobei das Gemisch eine Kristallwasser enthaltende Substanz enthält.

In Vergleichsversuchen wurde festgestellt, daß die Anwe­ senheit des proteolytischen Enzyms hierbei erforderlich ist, da sonst, auch in Gegenwart einer basischen, Kri­ stallwasser enthaltenden zusätzlichen Substanz, keine Peptidbildungsreaktion auftritt.

Die Erfindungskonzeption führt zu den großen Vorteilen, daß die Peptidsynthese sowohl sehr wirtschaftlich als auch unter ökologisch sehr günstigen Bedingungen durchgeführt werden kann, da jegliche Verwendung von toxischen Chemika­ lien und Lösungsmitteln dabei ausgeschlossen ist.

Obgleich die Kristallwasser enthaltende Substanz, wie oben erwähnt, eine der drei Reaktionskomponenten sein kann, ist es im Rahmen der Erfindung bevorzugt, die Kristallwasser enthaltende Substanz als Wasserquelle in Form einer zu­ sätzlichen Substanz in das Reaktionssystem einzubringen, vorteilhaft in Form einer basischen Substanz mit Gehalt an Kristallwasser, da die proteolytischen Enzyme in Gegenwart einer basischen Substanz eine höhere katalytische Aktivi­ tät besitzen, wobei die basische Substanz zugleich auf­ grund ihres Kristallwassergehalts als Wasserquelle für das Enzym dienen kann.

Geeignete Kristallwasser enthaltende Substanzen, die dem Reaktionsgemisch zugesetzt werden können, sind organische oder anorganische Verbindungen, bevorzugt basische Verbin­ dungen, die Kristallwasser enthalten.

Geeignete Substanzen sind beispielweise Na₂CO₃·10H₂O, Na₂CO₃·7H₂O, Na₂CO₃·H₂O, Na₂HPO₄·12H₂O, NaHCO₃, Na₂CO₃·2H₂O (Natriumsesquicarbonat) sowie etwa CH₃COONa·3H₂O. Natriumhydrogencarbonat, NaHCO₃, kann dabei ohne Kristallwassergehalt als Wasserquelle dienen, da aus dieser Verbindung Wasser abspaltbar ist.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Verwendung von Na₂CO₃·10H₂O als Kristallwasser enthaltende Substanz, da diese Verbindung einen relativ hohen Kristallwassergehalt mit einer für die proteolytischen Enzyme geeigneten Basi­ zität verbindet.

Die Aminokomponente des Reaktionssystems wird vorteilhaft in Form einer Carboxy-geschützten Aminosäure bzw. eines Carboxy-geschützten Peptids eingesetzt. Dabei ist es er­ findungsgemaß gleichermaßen günstig, wenn die Aminokompo­ nente in Form eines Amids oder in Form eines Esters einge­ setzt wird. Besonders geeignet ist der t-Butylester.

Günstige Ergebnisse werden beim erfindungsgemäßen Verfah­ ren erzielt, wenn die Aminokomponente in Form eines Addi­ tionssalzes, vorzugsweise des Hydrochlorids oder Hydro­ bromids, eingesetzt wird, da sich in Gegenwart einer ba­ sischen, Kristallwasser enthaltenden Substanz daraus die freie Base bildet. Hierdurch kann eine höhere Reaktionsge­ schwindigkeit als bei Einsatz der freien Basen als Reak­ tionskomponenten erzielt werden.

Die Acylierungskomponente, die vorzugsweise Amino-ge­ schützt ist, wird günstigerweise nicht in Form der freien Säure, sondern in Form eines Esters eingesetzt, wofür die Methyl-, Ethyl- oder Propylester gut geeignet sind. Die Peptidsynthese durch das proteolytische Enzym verläuft bei Verwendung derartiger Ester günstiger, wobei die Reaktion dann prinzipiell von einer als Nebenreaktion auftretenden Esterhydrolyse der Acylierungskomponente begleitet ist. Im Rahmen der Erfindung hat sich aber, was ebenfalls überra­ schend ist, gezeigt, daß diese Nebenreaktion gegenüber der Hauptreaktion der Peptidbildung durch geeignete Wahl der Molverhältnisse der beiden Reaktanten so stark zurückge­ drängt werden kann, daß die Peptidsynthesereaktion fast quantitativ abläuft.

Für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Enzyme sind im Prinzip sämtliche proteolytischen Enzyme. Als günstig geeignet erwiesen sich α-Chymotrypsin, Trypsin, Pepsin, Papain, Bromelain, Proteinase K, Subtilisin, Thermolysin sowie etwa Elastase. Diese Aufzählung ist jedoch keines­ wegs erschöpfend, da die erfindungsgemäße Grundreaktion der Peptidsynthese durch Proteasen auch mit anderen pro­ teolytischen Enzymen durchführbar ist.

Das Molverhältnis der Acylierungskomponente ist im Prinzip frei wählbar, liegt jedoch vorteilhaft im Bereich von etwa 1 : 2 bis 2 : 1 und vorzugsweise bei 1 : 2.

Das Molverhältnis der Kristallwasser enthaltenden Substanz zur Acylierungskomponente liegt vorteilhaft im Bereich von etwa 0,5 : 1 bis 2 : 1 und beträgt vorzugsweise etwa 1 : 1.

Die Menge des erfindungsgemäß eingesetzten proteolytischen Enzyms hängt neben der Aktivität des Enzyms und damit der Art des Enzyms auch von der Stabilität unter den gewählten Reaktionsbedingungen und seiner Spezifität ab. Sie kann in einfacher Weise experimentell bestimmt werden und liegt üblicherweise im Bereich von 0,5 bis 80 mg Enzym pro mMol der Acylkomponente und beträgt vorzugsweise etwa 20 mg Enzym pro mmol der Acylkomponente.

Die zur Erzielung einer günstigen Ausbeute erforderliche Reaktionsdauer läßt sich in einfacher Weise ermitteln. Sie liegt üblicherweise im Bereich von etwa 1 bis 24 h und vorzugsweise im Bereich von etwa 2 bis 4 h.

Die erfindungsgemäße Peptidsynthese wird üblicherweise bei Raumtemperatur durchgeführt. Nachdem es für die verschie­ denen in Frage kommenden proteolytischen Enzyme auch im lösungsmittelfreien System Temperaturoptima gibt, kann die Peptidsynthese gemäß der Erfindung auch bei von Raumtempe­ ratur nach oben wie auch nach unten abweichenden Tempera­ turen durchgeführt werden, wobei etwas über Raumtemperatur liegende Temperaturen im Bereich zwischen 30 und 38°C bei manchen Enzymen günstig sein können.

Ein wesentlicher Aspekt der Erfindungskonzeption ist der mechanochemische bzw. tribochemische Aspekt: Die mechani­ sche Beanspruchung der Reaktanten im Reaktionsgemisch kann im Prinzip durch beliebige mechanische Zufuhr von Energie zum Reaktionssystem erfolgen und geschieht vorteilhaft durch Verreiben der Gemischkomponenten oder durch Zerklei­ nern oder Druck- und Scherbeanspruchung.

Es ist im Rahmen der Erfindung als weiterer Überraschungs­ effekt zu betrachten, daß durch die mechanochemische bzw. tribochemische Einwirkung auf das Reaktionssystem kein Bindungsbruch und damit kein molekularer Abbau, sondern eine Synthesereaktion erfolgt, wobei die mögliche Neben­ reaktion der Esterhydrolyse durch das proteolytische Enzym, wenn die Acylierungskomponente in Esterform einge­ setzt wird, nicht tribochemisch bedingt ist.

Eine günstige weitere Möglichkeit der mechanischen Bean­ spruchung des Reaktionssystems liegt in der Beschallung mit Ultraschall, da hierdurch keinerlei Zerkleinerungswir­ kung der eingesetzten trockenen, pulverförmigen Substanzen erzeugt wird, wobei zugleich die auf das Reaktionssystem angewandte Energie stufenlos und exakt dosierbar bzw. ein­ stellbar ist.

Gemäß einer einfachen, jedoch sehr geeigneten Ausführungs­ form wird die Reaktion unter Homogenisierung des Gemischs in einem üblichen Homogenisator vorgenommen, vorzugsweise einem rotierenden Homogenisator. Entsprechende Vorrichtun­ gen sind handelsüblich; sie weisen einen sehr kleinen In­ nendurchmesser von wenigen Millimetern auf und werden bei Drehzahlen von 20 bis 100 min^-1 betrieben.

Ein besonderer Aspekt der Erfindungskonzeption liegt darin, daß als proteolytische Enzyme auch chemisch modifi­ zierte Enzyme verwendet werden können, sofern sie zur gleichen Reaktionsweise wie unmodifizierte proteolytische Enzyme in der Lage sind.

Ein Spezialfall derart modifizierter proteolytischer Enzyme sind trägergebundene, immobilisierte Enzyme, die vorteilhaft in partikelförmiger Form eingesetzt werden. Hierdurch ergibt sich eine leichte Abtrennbarkeit des Enzyms vom übrigen Reaktionssystem, dessen Endprodukt ja das zu gewinnende Produkt darstellt, das vom Katalysator getrennt werden muß.

Es hat sich ferner erfindungsgemäß als vorteilhaft erwie­ sen, nach Ablauf eines Teils der Gesamtreaktionsdauer eine weitere Menge an proteolytischem Enzym zu dem Reaktions­ system zuzugeben. Hierdurch können Verluste an Enzym bzw. enzymatische Aktivitätsverluste ausgeglichen und damit die Umsätze an Peptid erhöht werden. Es ist dabei günstig, die weitere Menge an Enzym erst nach Erreichung eines relevan­ ten Erstumsatzes zuzugeben, der mindestens 50% beträgt. Die Zusatzmengen an Enzym liegen dabei in der Größenord­ nung der eingesetzten Anfangsmengen.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich ferner auch zum Aufbau von Oligo- und Polypeptiden verwenden, wobei meh­ rere Peptiderzeugungsreaktionen sequentiell, entsprechend der angestrebten Sequenz, durchgeführt werden. Dabei kön­ nen neben einzelnen Aminosäurenkomponenten auch vorgefer­ tigte Peptide bzw. Peptidsequenzen eingesetzt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist ferner mit dem großen Vorteil verbunden, daß keine Probleme der Racemisierung bei der Peptidbildung auftreten, die andererseits bei lö­ sungsmittelgebundenen Verfahren in vielen Fällen kritisch sind.

Die Schutzgruppen, die zum Schutz der Aminogruppen bzw. der Carboxylgruppen der erfindungsgemäß eingesetzten Reak­ tanten verwendet werden können, sind die üblichen Schutz­ gruppen, die in der Peptidchemie geläufig sind, so daß eine Erläuterung hier nicht erforderlich ist.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbei­ spielen näher erläutert, die nicht einschränkend sind.

Bei den nachstehenden Versuchen wurden die Reaktionskom­ ponenten in einem gläsernen Homogenisator mit einem Innen­ durchmesser von 9 mm während der angegebenen Reaktions­ dauer durch Verreiben mechanisch beansprucht.

Die erhaltenen Reaktionsprodukte wurden jeweils durch prä­ parative Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) iso­ liert und charakterisiert. Sämtliche auf diese Weise synthetisierten Peptide hatten die entsprechende Aminosäu­ rezusammensetzung, wobei auch das Massenspektrum und die Ergebnisse der dünnschichtchromatographischen Analyse mit dem Ergebnis der HPLC-Analyse in Einklang waren.

Beispiel 1

Dieses Beispiel bezieht sich auf die Direktumsetzung der beiden Peptidbildungskomponenten in Gegenwart eines pro­ teolytischen Enzyms ohne zusätzliche basische, Kristall­ wasser enthaltende Substanz, wobei eine der Reaktions­ komponenten das zur Enzymreaktion erforderliche Kri­ stallwasser enthält.

Als Acylierungskomponente wurde Ac-Tyr-OEt·H₂O (0,1 mmol) eingesetzt; die Aminokomponente war Phe-NH₂ (0,2 mmol).

Bei Einsatz von α-Chymotrypsin in einer Menge von 2 mg und einer Reaktionsdauer von 4 h wurde ein Peptidsynthese­ umsatz von 40% festgestellt.

Die Nebenreaktion der Esterhydrolyse betrug nur 3%.

Damit ist nachgewiesen, daß die Wasserquelle für das pro­ teolytische Enzym auch von den Reaktionskomponenten selbst stammen kann.

Beispiel 2

Das Beispiel bezieht sich auf die Untersuchung der Abhän­ gigkeit der Peptidausbeute von den Reaktionsbedingungen und insbesondere dem Molverhältnis der eingesetzten Peptidbildungskomponenten.

Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 zusam­ mengefaßt.

Tabelle 1

Umsetzung von Ac-Tyr-OEt mit Leu-NH₂ · HCl mit α-Chymotrypsin in lösungsmittelfreiem System in verschiedenen Molverhältnissen

Die Ergebnisse der Tabelle 1 zeigen anhand der gewählten Modellreaktion, daß die Umsetzung in allen erfindungsgemä­ ßen Fällen in zufriedenstellender Weise abläuft, wobei günstigere Ergebnisse bei einem Molverhältnis von Acylie­ rungskomponente zu Aminokomponente von 1 : 2 erzielt werden.

Beispiel 3

Das Beispiel bezieht sich auf die Synthese von Peptiden im lösungsmittelfreien System unter Katalyse durch α-Chymo­ trypsin.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.

Tabelle 2

Peptidsynthese im lösungsmittelfreien System unter Katalysator mit α-Chymotrypsin

Die Ergebnisse zeigen, daß das erfindungsgemäße Verfahren der lösungsmittelfreien Peptidsynthese zu durchwegs gün­ stigen Peptidausbeuten führt, wobei die Nebenreaktion der Esterhydrolyse praktisch irrelevant ist. Außerdem sind die durch Esterhydrolyse entstehenden Nebenprodukte leicht vom Hauptprodukt abtrennbar.

Beispiel 4

Das Beispiel bezieht sich auf die Peptidsynthese im lö­ sungsmittelfreien System unter Katalyse mit Papain.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabel­ le 3 zusammengefaßt.

Tabelle 3

Die Ergebnisse der Tabelle 3 zeigen, daß auch Papain in vorteilhafter Weise beim erfindungsgemäßen Verfahren ver­ wendbar ist.

Der erste in Tabelle 3 aufgeführte Versuch mit Z-Glu-OH als Acylierungskomponente zeigt ferner, daß die Veresterung der Acylierungskomponente nicht zwingend erforderlich ist.

Beispiel 5

Das Beispiel bezieht sich auf die erfindungsgemäße Peptidsynthese, wobei als proteolytische Enzyme Trypsin, Proteinase K, Subtilisin bzw. Elastase verwendet sind.

Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 4 zusammengefaßt.

Tabelle 4

Peptidsynthese im lösungsmittelfreien System unter Katalyse mit Trypsin, Proteinase K, Subtilisin und Elastase

Es wurde festgestellt, daß die Verlängerung der Reak­ tionsdauer keinen Einfluß auf die Peptidsyntheseausbeute hatte. Daraus kann gefolgert werden, daß eine Enzyminak­ tivierung eingetreten war.

Durch die erfindungsgemäße nachträgliche Zugabe einer zweiten Enzymmenge im Verlauf der Peptidsynthese kann diese Enzymaktivierung kompensiert werden.

Die Ergebnisse der Tabelle 4 zeigen ferner, daß die Peptidausbeute im wesentlichen von der Struktur der Reak­ tionskomponenten und der Spezifität der Enzyme abhängig ist.

Im Rahmen der Erfindung wurde ferner festgestellt, daß keine sekundäre Peptidhydrolyse als Neben- bzw. Konkurrenz­ reaktion zur Peptidsynthesereaktion auftritt; auch dieser Befund ist überraschend.

Zusammenfassend bietet das erfindungsgemäße Verfahren eine völlig neuartige Alternative zur Peptidsynthese in erstmals lösungsmittelfreien Systemen durch rein mechano­ chemisch bzw. tribochemisch initiierte Umsetzung.

Damit eröffnen sich völlig neuartige Reaktionswege zum Aufbau von Di-, Oligo- und Polypeptiden einschließlich biochemisch und biologisch interessierender Polypeptide.

Claims (27)

1. Verfahren zur Herstellung von Peptiden durch Umsetzung einer Amino-geschützten Aminosäure oder eines Amino-geschützten Peptids als Acylierungskompo­ nente mit einer Aminosäure oder einem Peptid als Ami­ nokomponente in Gegenwart eines proteolytischen Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß

• - ein Gemisch der Acylierungskomponente, der Aminokom­ ponente und des proteolytischen Enzyms in trockenem Zustand einer mechanischen Beanspruchung unterzogen wird und
• - das Gemisch eine Kristallwasser enthaltende Substanz enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kristallwasser enthaltende Substanz die Acy­ lierungskomponente, die Aminokomponente und/oder das proteolytische Enzym selbst ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kristallwasser enthaltende Sub­ stanz eine dem Reaktionsgemisch zugesetzte organische oder anorganische basische Verbindung ist, die Kri­ stallwasser enthält, vorzugsweise ein Salz.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Kristallwasser enthaltende Substanz Na₂CO₃·10H₂O, Na₂CO₃·7H₂O, Na₂CO₃·H₂O, Na₂HPO₄·12H₂O, NaHCO₃, Na₂CO₃·NaHCO₃·2H₂O oder CH₃COONa·3H₂O verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Kristallwasser enthaltende Substanz Na₂CO₃·10H₂O verwendet wird.

6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminokomponente in Form einer Carboxy-geschützten Aminosäure oder eines Carboxy-geschützten Peptids eingesetzt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminokomponente in Form eines Amids eingesetzt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminokomponente in Form eines Esters eingesetzt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminokomponente in Form des t-Butylesters einge­ setzt wird.

10. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminokomponente in Form eines Additionssalzes, vorzugsweise des Hydro­ chlorids oder des Hydrobromids, eingesetzt wird.

11. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylierungskompo­ nente in Form eines Esters eingesetzt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylierungskomponente in Form eines Methyl-, Ethyl- oder Propylesters eingesetzt wird.

13. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß als proteolytisches Enzym α-Chymotrypsin, Trypsin, Pepsin, Papain, Bromelain, Proteinase K, Subtilisin, Thermolysin oder Elastase verwendet wird.

14. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Molverhältnis von Acylierungskomponente zu Aminokomponente 1 : 2 bis 2 : 1 und vorzugsweise 1 : 2 beträgt.

15. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 3 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Molverhältnis von Kristallwasser enthaltender Substanz zu Acylierungs­ komponente 0,5 : 1 bis 2 : 1 und vorzugsweise 1 : 1 beträgt.

16. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym in einer Menge von 0,5 bis 80 mg pro mmol der Acylierungskompo­ nente und vorzugsweise in einer Menge von etwa 20 mg pro mmol der Acylierungskomponente eingesetzt wird.

17. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung während einer Reaktionsdauer von 1 bis 24 h und vorzugsweise von 2 bis 4 h durchgeführt wird.

18. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung bei Raumtemperatur durchgeführt wird.

19. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die mechanische Bean­ spruchung durch Verreiben der Gemischkomponenten vor­ genommen wird.

20. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die mechanische Bean­ spruchung durch Zerkleinern, Druck- und Scherbeanspru­ chung und/oder durch Beschallung mit Ultraschall vor­ genommen wird.

21. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die mechanische Bean­ spruchung durch Homogenisieren des Reaktionsgemischs in einem Homogenisator, vorzugsweise einem rotierenden Homogenisator, vorgenommen wird.

22. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß chemisch modifizierte proteolytische Enzyme verwendet werden.

23. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß an einem Träger immo­ bilisierte Enzyme verwendet werden, vorzugsweise an einem partikelförmigen Träger immobilisierte Enzyme.

24. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß nach einem Teil der Gesamtreaktionsdauer eine weitere Menge an proteolyti­ schem Enzym zugegeben wird.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß eine weitere Menge an proteolytischem Enzym zuge­ geben wird, die etwa der zuerst zugesetzten Menge ent­ spricht.

26. Verfahren nach Anspruch 24 und/oder 25, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die weitere Menge an proteolytischem Enzym zugegeben wird, wenn der Umsatz, bezogen auf das zu bildende Peptid, mindestens 50% beträgt.

27. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß zum Aufbau von Oligo- und Polypeptiden mehrere Peptiderzeugungsreaktionen nach einem der Ansprüche 1 bis 26 sequentiell entspre­ chend der angestrebten Sequenz durchgeführt werden.