DE4123714A1

DE4123714A1 - Verfahren zur gewinnung eines natuerlichen oligosaccharidproduktes mit stimulierender wirkung auf die geweberegenerierung

Info

Publication number: DE4123714A1
Application number: DE4123714A
Authority: DE
Inventors: Carlos-Roca Agustin Pons; Gomez-Pamo Antonio Guerrero; Ranieri Juan Pablo Pivel
Original assignee: Laboratorios Andromaco SA
Current assignee: Laboratorios Andromaco SA
Priority date: 1990-07-17
Filing date: 1991-07-17
Publication date: 1992-01-23
Anticipated expiration: 2011-07-18
Also published as: FR2665900A1; ES2020652A6; DE4123714C2; IT1251807B; ITMI911972A1; JPH05178750A; ITMI911972A0; FR2665900B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung natürlicher Oligo saccharide, die eine stimulierende Wirkung auf die Geweberegenerierung aufweisen und deshalb für die Herstellung topisch anwendbarer pharma zeutischer Zubereitungen geeignet sind, die in der Humanmedizin bei spielsweise bei Verbrennungen, Ulcus decubito, usw. angewendet werden können.

Der nächstliegende Stand der Technik ist ein pharmazeutisches Präparat, das aus einem wäßrigen Extrakt der Pflanze Triticum vulgare besteht, für das beispielsweise folgende pharmakologische Wirkungen beschrieben sind: vernarbende Wirkung, schwache mitogene Wirkung, stimulierende Wirkung bei der RNA-Synthese in murinen Fibroblasten und eine klinische Wirkung bei verschiedenen pathologischen Zuständen, die die Körper oberfläche betreffen.

Andere natürliche Extrakte für die Wundbehandlung sind: Extrakt der Aloe arborescens, Naturhonig, vegetabilische Mishushit-Salbe und die wäßrigen Extrakte von Centella asiatica.

Zu erwähnen sind gleichfalls die Verwendung von Polysacchariden ver schiedenen Ursprungs und verschiedener Eigenschaften als stimulierende Mittel für die verschiedenen Phasen der Geweberegeneration im beson deren bei der Aktivierung von Makrophagen, deren Rolle bei der Gewebe regeneration bekannt ist, und die Stimulation der Fibroblastenpro liferation. Beide Wirkungen sind für verschiedene Polysaccharide ge zeigt worden, beispielsweise für das aus der Zellwand von Saccharomyces cerevisiae isolierte Glukan, für verschiedene Dextrane, Chitin, Carra geenan, Hialuronsäure, Conduranginsulfat und andere sulfatierte Poly saccharide.

Einigen natürlichen Polysacchariden, beispielsweise dem Dextranomer (Polymer des Dextrans mit hohem Molekulargewicht) wird auch eine Wir kung bei der Forderung der Biosynthese chemotaktischer Agentien auf der Oberfläche von Wunden als wichtige Faktoren bei der Beschleunigung der Wundheilung zugeschrieben.

Schließlich ist auch auf die Beziehung zwischen der wundheilenden Wirkung und der schwachen mitogenen Wirkung sowie der Stimulation der RNA-Synthese in murinen Fibroblasten hinzuweisen, Wirkungen, die wie oben bereits erwähnt für den wäßrigen Extrakt von Samen aus Triticum vulgare gezeigt wurden.

Obige Angaben bilden den Stand der Technik zur vorliegenden Erfindung.

Eine Betrachtung dieses Standes der Technik zeigt die Vorteile der vor liegenden Erfindung. Im Hinblick auf die Gesamtextrakte zeigt die Er findung den Vorteil einer genauen Definition des aktiven Moleküls. Im Hinblick auf die Polysaccharide und verwandte Substanzen zeigt die Erfindung den Vorteil, daß es sich um ein Verfahren handelt, das es erlaubt, auf einfache Weise und in wenigen Verfahrensschritten unter milden physikalischchemischen Bedingungen ein Produkt mittleren Mole kulargewichts (etwa 5000 Dalton) zu erhalten.

Diese Eigenschaften haben zur Folge, daß die industriellen Entwick lungsmöglichkeiten des erfindungsgemäß erhaltenen Produkts besser sind als die der bekannten Produkte, im besonderen, wenn man die verschie denen galenischen Formen, ihre bessere Stabilität und das bessere Freisetzungsverhalten des Wirkstoffs berücksichtigt.

Das erfindungsgemäße Verfahren besteht in der Reinigung eines Oligosa ccharids mit wundheilender Wirkung, ausgehend von einem wäßrigen Extrakt der unreifen Pflanze. Diese erhält man durch Keimung von Samen bestimmter Gramineen und anschließendem Wachstum unter kontrollierten Bedingungen. Nachfolgend werden die Verfahrensschritte beschrieben:
In der ersten Verfahrensstufe wird der Samen mit entionisiertem Wasser gewaschen und auf einer vorher angefeuchteten Vermiculitschicht aufge bracht.

In der zweiten Verfahrensstufe läßt man die Samen unter kontrollierten Temperatur-, Feuchtigkeits- und Lichtbedingungen während eines Zeit raums zwischen 10 und 30 Tagen keimen, bis die Pflanzen eine Höhe zwischen 10 und 40 cm erreicht haben. Zu diesem Zeitpunkt werden die Pflanzen gesammelt, gekürzt und gewaschen.

In der dritten Verfahrensstufe werden die Pflanzen mit destilliertem Wasser und verschiedenen Verhältnissen Pflanze/Wasser (Gewicht/Gewicht) eingeweicht, zuerst bei einer Temperatur zwischen 2 und 20^oC und zwischen 14 und 24 Stunden, anschließend bei einer Temperatur zwischen 50 und 130^oC und einer Zeit zwischen 30 Minuten und 6 Stunden.

In der vierten Verfahrensstufe wird die vorher mit verdünnter Mineral säure bis zu einem Säuregrad zwischen 10 und 20 Milliäquivalenten (mäq) angesäuerte wäßrige Suspension bei einer Temperatur zwischen 0 und 10^oC während einer Zeit zwischen 6 und 48 Stunden inkubiert.

In der fünften Verfahrensstufe wird das Mazerisat filtriert, um die restlichen Feststoffe abzutrennen und man unterwirft das Filtrat einer sterilisierenden Filtration über ein Filter von 0,22 µm. Das Endfiltrat ist das biologisch aktive Ausgangsmaterial, der Rohextrakt für die Herstellung des pharmakologisch aktiven Produktes, das den Gegenstand der vorliegenden Erfindung bildet.

In der sechsten Verfahrensstufe wird der Rohextrakt aus der vorher gehenden Stufe durch Ultrafiltration über Membranen mit einem Mole kularschnitt zwischen 500 und 6000 Dalton bis auf 1/3 bis 1/20 des ursprünglichen Volumens eingeengt.

In der siebten Verfahrensstufe wird das auf diese Weise erhaltene Fil trat von Material mit hohem Molekulargewicht durch Ultrafiltration über Membranen mit einem Molekularschnitt zwischen 10 000 und 50 000 Dalton gereinigt. Nach der Ultrafiltration fügt man dem flüssigen Konzentrat entionisiertes Wasser bis zum Ursprungsvolumen zu und ultrafiltriert bis 1/5 bis 1/10 des ursprünglichen Volumens. Die Gesamtheit der Ultra filtrate konzentriert man auf die gleiche Weise wie in der sechsten Verfahrensstufe beschrieben.

In der achten Verfahrensstufe wird das Konzentrat der Ultrafiltrate, die in der vorhergehenden Verfahrensstufe erhalten wurden, von Material mit geringem Molekulargewicht gereinigt, durch Ultrafiltration über ei ne Membran mit einem Molekularschnitt zwischen 500 und 6000 Dalton bis 1/3 bis 1/10 des ursprünglichen Volumens und gibt dem so erhaltenen Konzentrat Wasser bis zum ursprünglichen Volumen zu, wobei man das Ver fahren zwischen 1-mal und 6-mal wiederholt. Schließlich wird auf 1/3 bis 1/10 des ursprünglichen Volumens eingeengt.

In der neunten Verfahrensstufe wird das aus der vorhergehenden Verfah rensstufe erhaltene Konzentrat, in dem sich als aktives Prinzip das Oligosaccharid löslich und gereinigt befindet, entweder durch Lyophili sation entwässert oder pulverisiert, wobei der Wirkstoff rein und in festem Zustand erhalten wird, mit dem man die pharmazeutischen Prä parate formuliert, die für die topische Anwendung in der Humanmedizin und/oder Veterinärmedizin in Form von Pomaden, Cremen, Gel oder als Flüssigkeiten geeignet sind.

Beispiel

In einer ersten Verfahrensstufe werden zwischen 5 und 7 g Samen von Triticum vulgare abgewogen, 1-mal bis 4-mal mit 5 Volumen Wasser ge waschen, im Verhältnis zwischen 3 mg und 5 mg Samen/cm² Vermiculit auf einer 2 cm hohen Vermiculitschicht abgeschieden, die vorher mit Lei tungswasser im Verhältnis 0,3 und 0,4 ml Wasser/cm³ Vermiculit ange feuchtet wurde.

In der zweiten Verfahrensstufe läßt man die Samen unter Beleuchtung mit Lampen zwischen 15 und 28 W keimen, wobei ein Zyklus zwischen 22 und 24 Stunden/Tag eingehalten wird; die Temperatur wird zwischen 18 und 22^oC und die Feuchtigkeit durch Zugabe von Wasser alle 22 bis 24 Stunden aufrecht erhalten. Man läßt die Reifung fortschreiten, bis die Pflanzen auf eine Höhe zwischen 22 und 27 cm gewachsen sind, wofür eine Zeit zwischen 13 und 16 Tagen erforderlich ist. Nach der Wachstumsphase wurden die ganzen Pflanzen gesammelt, mit Leitungswasser gewaschen, bis die Reste von Vermiculit eliminiert waren und dann mit entionisiertem Wasser gewaschen. Nach dem Waschen wird in Stücke von 0,5 bis 1 cm Länge aufgeteilt.

In der dritten Verfahrensstufe werden die in der vorhergehenden Stufe erhaltenen Bruchstücke mit destilliertem Wasser im Verhältnis 0,5 bis 11,5 g pro 10 ml Wasser vermischt und zuerst während 16 bis 20 Stunden bei einer Temperatur zwischen 2 und 14^oC und anschließend in einem ge eigneten Behältnis, z. B. einem Autoklaven, bei einer Temperatur zwi schen 90 und 120^oC während 45 bis 90 Minuten eingeweicht.

In der vierten Verfahrensstufe läßt man das Mazerisat auf Raumtempera tur abkühlen und säuert mit Schwefelsäure und Salzsäure an, wobei man zwischen 0,4 und 0,6 ml der ersteren und zwischen 0,1 und 0,3 ml der letzteren pro Liter Mazerisat zugibt. Es wird gut gerührt, wobei eine Temperatur zwischen 2 und 8^oC während 12 und 16 Stunden eingehalten wird.

In der fünften Verfahrensstufe filtriert man das Mazerisat über einen Büchner-Filter, um die restlichen Feststoffe abzuscheiden. Anschließend wird das Filtrat filtriert, wobei jeder Vorgang 1mal bis 5mal wieder holt wird, mit Hilfe von Filtern aus Cellulosederivaten von 8 µm, 1,2 µm und 0,45 µm Porenweite. Schließlich wird das gereinigte Filtrat einer sterilisierenden Filtration mit Filtern aus Cellulosederivat von 0,22 µm unterworfen.

In der sechsten Verfahrensstufe wird der sterilisierte Rohextrakt aus der vorhergehenden Verfahrensstufe durch Ultrafiltration über eine Mem bran mit einem Molekularschnitt zwischen 1000 und 5000 Dalton bis auf ein Volumen zwischen 1/8 und 1/12 des Ausgangsvolumens konzentriert.

In der siebten Verfahrensstufe wird das auf diese Weise erhaltene Fil trat von Material mit hohem Molekulargewicht durch Ultrafiltration über Membranen mit einem Molekularschnitt zwischen 10 000 und 20 000 Dalton gereinigt; die Ultrafiltration wird fortgesetzt, bis das Volumen des Ultrafiltrats zwischen 7/10 und 9/10 Teile des ursprünglichen beträgt. Anschließend gibt man dem Konzentrat von hohem Molekulargewicht destil liertes Wasser bis zum ursprünglichen Volumen zu und ultrafiltriert, wobei man das Ultrafiltrat über das vorherige gewinnt. Diese Arbeits weise wird fortgesetzt, bis das Volumen des Konzentrats etwa 1/10 des ursprünglichen beträgt. Das auf diese Weise erhaltene Ultrafiltrat wird durch Ultrafiltration über Membranen mit einem Molekularschnitt zwischen 1000 und 5000 Dalton konzentriert, bis das Konzentrat ein Volumen zwi schen 1/8 und 1/10 des ursprünglichen beträgt.

In der achten Verfahrensstufe wird das in der vorhergehenden Verfahrens stufe erhaltene Konzentrat der Ultrafiltrate, von Material mit geringem Molekulargewicht gereinigt, durch Waschen mittels Ultrafiltration über Membranen mit einem Molekularschnitt zwischen 1000 und 5000 Dalton bis zu 1/3 und 1/10 des ursprünglichen Volumens, dem auf diese Weise erhalte nen Filtrat wird Wasser bis zum ursprünglichen Volumen zugegeben und die Arbeitsweise zwischen 3-mal und 5-mal wiederholt. Schließlich wird bis zu einem Volumen zwischen 1/8 und 1/10 des ursprünglichen Volumens konzen triert.

In einer neunten Verfahrensstufe wird das in der vorhergehenden Stufe erhaltene Konzentrat, in dem sich löslich und gereinigt das aktive Oli gosaccharid befindet, durch Lyophilisation von Wasser befreit, pulveri siert und somit rein und in festem Zustand der Wirkstoff erhalten, mit dem man die pharmazeutischen Zubereitungen erhält, die für die topische Anwendung in der Humanmedizin und/oder Tiermedizin in Form von Pomaden, Cremes, Gel oder in flüssiger Form geeignet sind.

Das nach der neunten Verfahrensstufe des erfindungsgemäßen Verfahrens er haltene Produkt, das näher im Beispiel beschrieben ist, weist ein Moleku largewicht zwischen 5 und 10 Kilo-Daltons auf. Das natürliche Oligosaccha rid gibt sich durch eine positive Reaktion nach Dubois oder Phenolsulfat zu erkennen (M. Dubois, K. A. Gilles, J. K. Hamilton, P. A. Rebers und F. Smith (1956), Anal. Chem. 28: 350-356). Quantitativ wird durch dieses Verfahren ein Zuckergehalt von 95% (Gewicht/Gewicht) erhalten.

Das nach dem neunten Verfahrensstufe des erfindungsgemäßen Verfahrens er haltene Produkt zeigt folgende biologische Eigenschaften:

1) eine schwache mitogene Wirksamkeit gegen murine Monozyten;
2) stimulierende Wirksamkeit auf die Proliferation von Lymphoplasten.

Das erfindungsgemäß nach der neunten Verfahrensstufe erhaltene Produkt zeigt biologische Wirksamkeit bei der Stimulation der Geweberegeneration. Das Produkt ist auch wirksam bei der Vernarbung von Wunden, die durch vor hergehende Behandlung mit Cortikoiden provoziert wurden.

Diese gleichen Wirksamkeiten können auch erhalten werden mit dem Roh extrakt, der am Ende der fünften Verfahrensstufe erhalten wird, unter der Bedingung, daß man ausreichende Mengen verwendet, in Anbetracht der Verdünnung des Wirkstoffs und der Anwesenheit von Verunreinigungen.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung eines natürlichen Oligosaccharidproduktes mit stimulierender Wirksamkeit bei der Geweberegeneration, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) Samen von Gramineen, der vorher gewaschen wurde, unter künst lichen und temperatur-, licht- und feuchtigkeitskontrollierten Bedingungen solange keimen läßt, bis die Pflanze eine bestimmte Höhe erreicht hat;
b) die in der Stufe a) erhaltenen Pflanzen einweicht und wäßrig extrahiert, wobei ein pharmakologisch aktiver Rohextrakt erhalten wird und das Einweichen und die Extraktion darin besteht, daß man die Pflanzen drei aufeinanderfolgenden Behandlungen unterwirft, die erste in neutralem Medium und mäßiger Temperatur, die zweite bei hoher Temperatur, und die dritte in saurem Medium bei niedriger Temperatur, wobei die Behandlungen bei definierten Behandlungszeiten und definierten Pflanze/Extraktionsflüssigkeit-Verhältnissen durchgeführt werden;
c) die pharmakologisch aktive, natürliche Oligosaccharidsubstanz durch Filtrieren und Sterilisieren des Rohextraktes reinigt, diesen durch Ultrafiltration unter Verwendung geeigneter Membranen kon zentriert, Verunreinigungen mit hohem Molekulargewicht durch Waschen und Ultrafiltration unter Verwendung geeigneter Membranen elimi niert, die von Verunreinigungen mit hohem Molekulargewicht gerei nigten Ultrafiltrate durch Verwendung geeigneter Membranen konzen triert, Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht durch Ultra filtration mit geeigneten Membranen eliminiert und die von Verun reinigungen mit hohem und niedrigem Molekulargewicht befreite Lösung durch Ultrafiltration unter Verwendung geeigneter Membranen konzen triert;
d) das pharmakologisch aktive Oligosaccharid in fester Form durch Trocknungsverfahren wie Lyophilisation, Pulverierung/Atomisierung des Konzentrates gewinnt oder dieses als solches oder formuliert als geeignete galenische Präparate verwendet.

2. Verfahren zur Gewinnung eines natürlichen Oligosaccharidproduktes mit stimulierender Wirkung auf die Geweberegeneration gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete Graminee Triticum vulgare ist, das in einem Verhältnis zwischen 3 mg und 5 mg Samen pro cm³ des Pflanzbettes ausgesät wird, das aus einer Vermiculit schicht mit 1 bis 3 cm Höhe besteht und vorher mit Leitungswasser im Verhältnis zwischen 0,2 und 0,6 ml Wasser/cm³ des Pflanzbettes, vorzugsweise zwischen 0,2 und 0,4 ml, angefeuchtet wurde.

3. Verfahren zur Gewinnung eines natürlichen Oligosaccharidproduktes mit stimulierender Wirkung auf die Geweberegeneration gemäß An spruch 1, gekennzeichnet durch folgende konkrete Keimungsbedingun gen: Beleuchtung mit Lampen zwischen 15 und 24 Watt Stärke während 16 und 24 Stunden/Tag, vorzugsweise zwischen 22 und 24 Stunden/Tag, eine Temperatur zwischen 18 und 30^oC, vorzugsweise zwischen 18 und 22^oC, Feuchtigkeit des Pflanzbettes, aufrechterhalten durch Zugabe von Wasser in den Verhältnissen gemäß Anspruch 2, jede 16 bis 32 Stunden, vorzugsweise jede 22 bis 24 Stunden.

4. Verfahren zur Gewinnung eines natürlichen Oligosaccharidproduktes mit stimulierender Wirkung auf die Geweberegeneration gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die optimale Erntezeit der Pflanzen zwischen 10 und 20 Tagen, vorzugsweise zwischen 13 und 16 Tagen, liegt, daß während dieser Zeit die Pflanzen eine Höhe zwischen 20 und 30 cm erreichen, vorzugsweise geerntet werden, wenn die Höhe zwischen 22 und 27 cm beträgt.

5. Verfahren zur Gewinnung eines natürlichen Oligosaccharidproduktes mit stimulierender Wirkung auf die Geweberegeneration gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die geernteten Pflanzen während der im vorhergehenden Anspruch angegebenen Zeit einweicht und extrahiert, zuerst mit Leitungswasser bis zur Eliminierung der Vermiculitreste wäscht und die Pflanzenteile mit einer Größe zwischen 0,3 und 21 cm Länge, vorzugsweise zwischen 0,5 und 11 cm Länge, aufteilt.

6. Verfahren zur Gewinnung eines natürlichen Oligosaccharidproduktes mit stimulierender Wirkung auf die Geweberegeneration gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zerkleinerten Pflanzen in drei Stufen eingeweicht und extrahiert werden, bei denen man sie einer kombinier ten Behandlung von hohen und tiefen Temperaturen und einem pH-Wert- Wechsel unterwirft.

7. Verfahren zur Gewinnung eines natürlichen Oligosaccharidproduktes mit stimulierender Wirkung auf die Geweberegeneration gemäß Anspruch 1 und dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Einweichungs- und Extraktionsstufe in der Suspendierung der Pflanzen teile in destilliertem Wasser und in einem Verhältnis von 0,5 bis 5 g pro 10 ml Wasser, vorzugsweise zwischen 0,5 und 1,5 g, besteht und die Inkubation bei einer Temperatur zwischen 2 und 20^oC, vorzugsweise zwi schen 2 und 14^oC, während einer Zeit zwischen 14 und 24 Stunden, vor zugsweise zwischen 16 und 20 Stunden, durchgeführt wird.

8. Verfahren zur Gewinnung eines natürlichen Oligosaccharidproduktes mit stimulierender Wirkung auf die Geweberegeneration gemäß Anspruch 1 und Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Einweichungs- und Verfahrensstufe in der Inkubierung der gemäß dem vorhergehenden Anspruch erhaltenen Suspension bei einer Temperatur zwischen 50 und 130^oC, vorzugsweise zwischen 90 und 120^oC, während einer Zeit zwi schen 30 Minuten und 6 Stunden, vorzugsweise zwischen 45 und 90 Minu ten, durchgeführt wird.

9. Verfahren zur Gewinnung eines natürlichen Oligosaccharidproduktes mit stimulierender Wirkung auf die Geweberegeneration gemäß Anspruch 1 und Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man erstens bei der drit ten Einweichungs- und Extraktionsstufe die gemäß dem vorhergehenden Anspruch erhaltene Suspension durch Zugabe von Mineralsäuren bis zu einer Säurestärke zwischen 10 und 20 Milliäquialenten Säure ansäuert, daß die Mineralsäuren vorzugsweise Schwefel- und Salzsäure sind, deren jeweilige Beiträge zwischen 80 und 90% und 10 bis 20% der gesamten Äquivalente der jeweiligen Säurestärke betragen, daß man zweitens die Inkubierung der angesäuerten Suspension bei einer Temperatur zwischen 0 und 10^oC, vorzugsweise zwischen 2 und 8^oC, während einer Zeit zwi schen 6 und 48 Stunden, vorzugsweise zwischen 12 und 16 Stunden, durch führt.

10. Verfahren zur Gewinnung eines natürlichen Oligosaccharidproduktes mit stimulierender Wirkung auf die Geweberegeneration gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der gemäß den vorhergehenden Ansprüchen erhaltene, anschließend geklärte und durch sterilisierende Filtration sterilisierte Rohextrakt pharmakologisch aktiv ist.

11. Verfahren zur Gewinnung eines natürlichen Oligosaccharidproduktes mit stimulierender Wirkung auf die Geweberegeneration gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den gemäß den vorhergehenden Ansprü chen erhaltenen aktiven Rohextrakt durch Ultrafiltration reinigt und ein pharmakologisch aktives natürliches Oligosaccharidprodukt gemäß folgenden Verfahrensstufen gewinnt:

a) der sterile Rohextrakt, erhalten gemäß den vorhergehenden Ansprü chen, wird durch Ultrafiltration über Membranen mit einem Molekular schnitt zwischen 500 und 6000 Dalton, vorzugsweise zwischen 1000 und 5000 Dalton, bis auf ein Volumen zwischen 1/3 und 1/20, vorzugs weise 1/8 und 1/12, des ursprünglichen Volumens konzentriert;
b) das auf diese Weise erhaltene Konzentrat wird vom Material mit hohem Molekulargewicht durch Ultrafiltration über Membranen mit ei nem Molekularschnitt zwischen 10 000 und 50 000 Dalton, vorzugswei se zwischen 10 000 und 20 000 Dalton, gereinigt, daß man das Ultra filtrat einsammelt, bis sein Volumen zwischen 5/10 und 9/10, vorzugs weise zwischen 7/10 und 9/10, des ursprünglichen Volumens beträgt und das Verfahren unter den gleichen Bedingungen durch Zugabe von Wasser zum Konzentrat bis zum ursprünglichen Volumen wiederholt;
c) die während der vorhergehenden Verfahrensstufe erhaltenen Ultra filtrate werden vereinigt, über eine Membran mit einem Molekular schnitt zwischen 500 und 6000 Dalton, vorzugsweise zwischen 1000 und 5000 Dalton, werden konzentriert, bis das Volumen des Konzentra tes zwischen 1/3 und 1/10, vorzugsweise 1/8 und 1/10, des ursprüng lichen Volumens beträgt, die Moleküle mit niedrigem Molekulargewicht durch 1 bis 6 Zyklen, vorzugsweise 4 bis 5 Zyklen, durch Zugabe von Wasser zum Konzentrat bis zum ursprünglichen Volumen wäscht und Ultra filtration über die gleichen Membranen bis zu einem Volumen von 1/3 bis 1/10, vorzugsweise 1/8 bis 1/10, des ursprünglichen Volumens.

12. Verfahren zur Gewinnung eines natürlichen Oligosaccharidproduktes mit stimulierender Wirkung bei der Geweberegenerierung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich in dem gemäß dem vorhergehenden An spruch erhaltenen Konzentrat das pharmakologisch aktive Oligosaccha rid löslich und gereinigt befindet, das in fester Zustand durch Lyo philisation oder Pulverisierung/Atomisierung als solches löslich in geeignete galenische Zubereitungen inkorporiert.