DE3941324C2

DE3941324C2 -

Info

Publication number: DE3941324C2
Application number: DE3941324A
Authority: DE
Inventors: Shigemi Fujisaki; Takashi Fujisaki; Junichi Yoshida; Yasuhiro Nishinomiya Hyogo Jp Fujisaki
Original assignee: FUJISAKI SHIGEMI NISHINOMIYA HYOGO JP
Current assignee: FUJISAKI SHIGEMI NISHINOMIYA HYOGO JP
Priority date: 1989-05-08
Filing date: 1989-12-14
Publication date: 1992-06-25
Also published as: JPH02292226A; GB8928811D0; GB2231263A; FR2646605A1; DE3943649C2; FR2646605B1; JPH0577655B2; DE3941324A1

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines prophylaktischen und therapeutischen Mittels für Taubheit wie akuter perzeptiver Taubheit (Hörsturz), chronischer neurotischer Taubheit und neurotisches Ohren sausen, dessen Wirkung auf der Aktivierung von verletzten Neurozyten beruht.

Während Steroidhormone bei Hörsturz, Facialislähmung, usw. indiziert sind, haben diese Hormone ernsthafte Nebenwirkungen und können kaum für längere Behandlungsdauer oral verabreicht werden.

Andererseits gibt es kein wirksames Arzneimittel für neurotische Taubheit (einschließlich seniler Taubheit), neurotisches Ohrensausen, usw., noch sind unbedenkliche Behandlungsmodalitäten verfügbar. Die pharmazeutische Industrie war daher gezwungen, ein Arzneimittel zur Verfügung zu stellen, das keine Nebenwirkungen hat, für die Behandlung oder die Erleichterung bei diesen Krankheiten.

Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines prophylaktischen und therapeutischen Arzneimittels, das in der Lage ist, verletzte Neurozyten zu aktivieren, und das entweder eine neutrale Protease oder eine neutrale Protease plus einer geringeren Menge von einer oder mehreren anderen Proteasen oder Pronase enthält.

Die Erfindungsurheber nahmen Kenntnis von der Wirksamkeit neutraler Proteasen als prophylaktische therapeutische Mittel für hartnäckige chronische Krankheiten und fanden insbesondere, daß eine Metall-Neutralprotease, die im folgenden kurz als MNP₁ bezeichnet wird, nicht nur eine starke entzündungshemmende Wirkung, sondern auch eine Wirkung in Richtung der Aktivierung von verletzten Neurozyten hat.

Daher wurde gefunden, daß MNP₁ die Gehirnnerven, die aus stark differenzierten Neurozyten zusammengesetzt sind und die Geruchsnerven, Sehnerven, Facialisnerven, Hörnerven, Zungennerven und rückläufigen Kehlkopfnerven stimulieren und aktivieren, wobei eine hervorragende Wirksamkeit nicht nur gegen plötzliche Taubheit (Hörsturz), sondern auch gegen neurotische Taubheit, neurotisches Ohrensausen, usw. gezeigt wird, die selbst auf Steroidhormone nicht ansprechen. Die Erfinder haben das Enzym klinischen Versuchen unterworfen und deren hervorragende Wirksamkeit und vollständige Abwesenheit von nachteiligen Wirkungen bestätigt.

Die Proteasen, die als aktive Bestandteile gemäß der Erfindung verwendet werden können, umfassen unter anderem Trypsin, α-Chymotrypsin, Promelain, Papain, Serratiopeptidase, Peptidase, Cephaprose, Protease, Pronase, Prozyme, Urokinase, Pancreatin, Fibrinolysin, Esterase und Kollagenase, wobei diese Enzyme einzeln oder in Kombination verwendet werden können. Das erfindungsgemäß verwendete Proteasegemisch kann in verschiedene Dosierungseinheiten zur oralen Verabreichung formuliert werden, wie Tabletten, Kapseln, Pulvern, Granulaten usw., oder in verschiedene Dosierungsformen für die parenterale Verabreichung, wie Injektionen, Suppositorien, Salben usw. Während die Dosierung von der Art der Enzyme abhängt, sowie von der Kondition des Patienten, der Verabreichungsmethoden, der Dosierungsform usw., kann das gewünschte Ziel der Erfindung im allgemeinen durch Verabreichen von 1 bis 5000 mg je erwachsenen Menschen, beispielsweise auf oralem Wege erreicht werden.

MNP₁, ein aktives Mittel gemäß der Erfindung, ist eine neutrale Protease, die durch Mikroorganismen des Stammes Streptomyces hervorgebracht wird. Dieses Enzym kann aus einem Kulturmedium von Streptomyces griseus durch Chromatographie mit einem Ionenaustauscher, wie Carboxymethyl(CM)-cellulose, Diethylaminoethyl(DEAE)- cellulose usw., oder einem Affinitätsträger (z.B. Sepharose), der Carbobenzyloxyglycylleucin (Cbz-Gly-Leu), Leucinamid (Leu-NH₂), Phenylalanin (Phe) oder dergleichen als Ligand trägt, gereinigt werden. Dieses Enzym hat die folgenden chemischen Eigenschaften:

Neutrale Protease
Molekulargewicht:
42 000 ± 5000
SDS-Elektrophorese	(TSKG 3000 SW)
Gelfiltration	28 000 ± 7000

Isoelektrischer Punkt:
p1 = 4,76 ± 1,0

Substratspezifität:

Optimaler pH für die enzymatische Aktivität:
pH 5,5∼9,5 (6∼9)

Stabilität:
pH 4∼10 (7∼9)

Inhibitoren:
EDTA, Phosphoramidon, Leucin

Löslichkeit:
leicht löslich in Wasser und unlöslich in Aceton und Ethanol

Elektrophorese:
70% Polyacrylamidgel (pH 8,0) Rf = 0,09

Aminosäureanalyse

Die genannte MNP₁ kann durch biotechnologische Mittel ebenfalls gereinigt werden. Zum Beispiel kann nach der Bestimmung der Struktur des neutralen Proteasegens die entsprechende DNA in das Plasmid pIJ702 eingefügt werden, wonach das erhaltene Rekombinationsplasmid mit einem entsprechenden Enzym oder Enzymen gespalten wird und das relevante Fragment in Spreptomyces lividans als Gastsubstrat inkorporiert wird. Die neutrale Protease (MNP₁), die vom Wirt produziert wird, wird dann aus der Kultur gereinigt.

Die Erfindung wird durch folgende beigefügte Zeichnungen erläutert.

Fig. 1 (I) ist ein Audiogramm im klinischen Fall 1;

Fig. 1 (II) ist ein Audiogramm im klinischen Fall 2;

Fig. 1 (III) ist ein Audiogramm im klinischen Fall 3; und

Fig. 1 (IV) ist ein Audigramm im klinischen Fall 4;

Bei der praktischen Durchführung der Erfindung zeigte sich, daß Serratiopeptidase, die von Mikroorganismen des Stammes Serratia abgeleitet ist, und Thermolysin, das von Mikroorganismen des Stammes Bacillus abgeleitet ist, eine Substratspezifität aufweist, so daß diese als aktiver Bestandteil verwendet werden können.

Die erfindungsgemäß verwendeten prophylaktischen und therapeutischen, neutrale Protease(n) enthaltenden Mittel können in verschiedenen Dosierungsformen durch anerkannte pharmazeutische Verfahrensweisen für die orale Verabreichung formuliert werden. Weiterhin kann das Mittel in anderer Weise in solchen Dosierungsformen verabreicht werden, wie Injektionen, Suppositorien und Salben. Außerdem kann das Mittel in Kombination mit anderen Arzneimitteln, wie therapeutischen Arzneimitteln gegen Krankheiten von Niere und Leber, therapeutischen Arzneimitteln für Gelenkrheumatismus, Steroidhormone, Antibiotika, Immunpotentiatoren, Antitumormitteln usw. verwendet werden.

Es ist bekannt, daß adrenokortikotrope Hormone, auch Steroidhormone genannt, die bei der Behandlung von verschiedenen Entzündungskrankheiten verwendet werden, dramatische Wirkungen, aber ebenso auch ernsthafte Nebenwirkungen aufweisen. Es ist bemerkenswert festzustellen, daß die neutrale(n) Protease(n) als therapeutisches Mittel gemäß der Erfindung hervorragende Wirkungen zeigt, die denjenigen der Steroide bei allen auf Steroide ansprechenden chronischen Entzündungskrankheiten vergleichbar sind und trotzdem keine der ernsthaften Nebenwirkungen der Steroide aufweisen.

Die Dosierung kann mit der Art der neutralen Protease, der zu behandelnden Krankheit, der Verabreichungsmethode, der Dosierungsform usw. schwanken, jedoch kann für die orale Verabreichung die tägliche Dosis von 1 bis 5000 mg je erwachsenen Menschen reichen. Im Falle einer Protease, die gegen Magensäfte instabil ist, kann die gewünschte Wirkung dadurch erreicht werden, daß sie in eine enteral beschichtete Zubereitung formuliert wird.

Wenn die Dosierung in Wirkungseinheiten von jeder neutralen Protease ausgedrückt wird, wobei die enteral beschichtete Zubereitung als Beispiel genommen wird, kann das gewünschte Ziel durch orale Verabreichung von 2000 bis 4000 Einheiten bei der Serratiopeptidase, die von Mikroorganismen des Stammes Serratia abgeleitet ist, und mit 5000 bis 500 000 Tyrosineinheiten bei der neutralen Peptidase, die von Mikroorganismen des Stammes Streptomyces abgeleitet ist, erreicht werden. Es sollte jedoch dazu bemerkt werden, daß je nach der Art der neutralen Protease eine enteral beschichtete Zubereitung vorzugsweise verwendet wird.

Ein Kennzeichen der erfindungsgemäß verwendeten prophylaktischen und therapeutischen neutralen Protease(n) gegen akute und chronische neurotische Taubheit, Ohrensausen, usw. ist dasjenige, daß nur die neutrale Protease oder die neutrale Protease und die anderen Proteasen in den Nervenzellen transloziert werden, um die verletzten Zellen zu aktivieren und die Zellen zu verbessern und wiederherzustellen, insbesondere Neurozyten bis zum normalen Zustand, wie demonstriert wurde.

Beispiel 1

2 g Serratiopeptidase, aus Serratia marcescens, 190 g Lactose und 70 g Kartoffelstärke wurden gleichmäßig gemischt und mit einer 3%igen Lösung von Hydroxypropylcellulose geknetet. Das Gemisch wurde granuliert und die erhaltene Granulierung gemischt mit 0,3% Magnesiumstearat und dann zu Tabletten formgepreßt.

Beispiel 2

2 g einer neutralen Protease, abgeleitet von Streptomyces griseus, wurde mit 40 g Lactose vermischt und nach Zugabe von 1,0 g Hydroxypropylmethylcellulose das Gemisch granuliert. Das erhaltene Granulat wurde gleichmäßig mit Celluloseacetatphthalat beschichtet und ergab enteral beschichtete Körner.

Beispiel 3

Die enteral beschichteten Körner aus neutraler Protease, die gemäß Beispiel 2 hergestellt waren, wurden in Kapseln eingefüllt und ergaben Kapseln.

Beispiel 4

Es wurden 6157 mg Witepsol H-15 (Dynamit Nobel, ein Triglycerid einer höheren gesättigten Fettsäure) und 325 mg Polyoxyethylenlaurylether (Nikko Chemicals, BL-25) durch Erhitzen verschmolzen. Danach wurden 500 mg Pulver der neutralen Protease, die von Streptomyces griseus abgeleitet war, zu der Schmelze zugefügt und dispergiert, und die erhaltene Dispersion wurde in eine Form für Suppositorien von 130 mg eingegossen. Nach der Verfestigung war das erhaltene Suppositorium aus der Form gelöst.

Klinische Fälle

Die klinischen Fälle waren wie folgt:

I) Akute perzeptive Taubheit (links), Ohrensausen (links), klinischer Fall 1: S. S. Ein 50jähriger Mann.

Der Patient hatte plötzlich eine linksseitige Taubheit und Ohrensausen erlitten, die zehn Tage anhielten und hatte eine Klinik für innere Medizin aufgesucht, wo ein orales Vitaminpräparat verschrieben wurde. Es trat jedoch keine Verbesserung auf, daher besuchte der Patient das Krankenhaus der Anmelderin.

Ein Hörtest und ein Gleichgewichtstest führten zur Diagnose der akuten perzeptiven Taubheit (Hörsturz) (links) und Ohrensausen (links) (vgl. Fig. 1 (I)).

Die orale Verabreichung von MNP₁, 5 Tabletten/Tag (2 Tabletten am Morgen, 1 Tablette am Nachmittag und 2 Tabletten nach der Abendmahlzeit), ergab eine dramatische Wiederherstellung des Gehörs auf Normalwerte nach vier Wochen. Das Ohrensausen verschwand ebenfalls.

Klinischer Fall 2: H. S. Ein 59jähriger Mann.

Der Patient hatte bilaterale Taubheit und Ohrensausen fünf Tage lang und besuchte das Krankenhaus der Anmelderin. Nach dem Hörtest und dem Gleichgewichtstest wurde ein Hörsturz diagnostiziert. Obwohl ein Steroidhormon (Rinderon) verabreicht worden war, besserte sich die Taubheit nicht, sondern wurde sogar leicht verschlimmert.

Es wurde MNP₁, 3 Tabletten/Tag verabreicht, nach 28 Tagen Verabreichung von Rinderon und 47 Tagen der Behandlung verbesserte sich der akustische Akutzustand merklich und ging auf Normalwerte zurück, und auch das Ohrensausen verschwand (vgl. Fig. 1(II)).

Von 15 der Patienten mit Hörsturz zeigten neun von zehn mit MNP₁ behandelte ein hervorragendes Reagieren und zwei von fünf, die mit Empynase-PD behandelt waren, zeigten ein hervorragendes Reagieren.

II) Chronische perzeptive Taubheit Klinischer Fall 3: T. N. Eine 28jährige Frau.

Die Patientin besuchte einen bestimmten HNO-Arzt wegen einer Taubheit, die ein Jahr früher aufgetreten war und als perzeptive Taubheit diagnostiziert worden war. Obwohl die Patientin verschiedene Behandlungen erhielt, trat keine Besserung auf, und die Taubheit verschlimmerte sich fortschreitend und entwickelte ein Ohrensausen. Dementsprechend besuchte die Patientin das Krankenhaus der Anmelderin am 16. März 1989. Das Hören und die Gleichgewichtsversuche führten zur Diagnose einer chronischen perzeptiven Taubheit (links) und Ohrensausen (links). Es wurden oral MNP₁, 5 Tabletten/Tag (zwei Tabletten am Morgen, eine am Mittag, zwei am Abend) verabreicht, was eine dramatische Verbesserung und eine Rückkehr auf fast normales Hören nach 48 Tagen führte (vgl. Fig. 1(III)).

Klinischer Fall 4: A. Y. Eine 74jährige Frau.

Die Hörfähigkeit hatte allmählich seit Mai letzten Jahres abgenommen und wurde als chronische perzeptive Taubheit bei einem HNO-Arzt diagnostiziert. Trotz verschiedener Behandlungen nahm die Hörfähigkeit allmählich ab. Am 24. Dezember 1988 besuchte die Patientin das Krankenhaus der Anmelderin mit Beschwerden von Taubheit und Ohrensausen. Beim Hörtest und Gleichgewichtstest wurde eine Diagnose von chronischer neurotischer Taubheit (bilateral) und Ohrensausen (bilateral) festgestellt. Fünf MNP₁-Tabletten wurden oral verabreicht und 66 Tage später war die Hörfähigkeit merklich verbessert und das Ohrensausen war verschwunden (vgl. Fig. 1(IV)).

Unter 35 Patienten mit chronischer perzeptiver Taubheit wurden hervorragende Heilergebnisse bei 13 von 25 Patienten, denen MNP₁ verabreicht worden war und zwei von zehn, denen Empynase-PD verabreicht worden war.

Die prophylaktische und therapeutische Verwendung der neutralen Protease(n) gemäß der Erfindung für neurotische Taubheit, usw. zeigt eine Wirkung sowohl bei der Verwendung von MNP₁ allein als auch von MNP₁ und anderen Proteasen, die darin enthalten sind und die auf verletzte Neurozyten wirken, um die Zellen zu aktivieren und ihre Funktion zu verbessern mit größerer Wirkung als diejenige von Steroid-Arzneimitteln und ohne Nebenwirkungen.

Claims

1. Verwendung einer neutralen Protease oder eines Gemisches aus einer neutralen Protease und einer oder mehrerer Proteasen oder Pronase als Aktivator für verletzte Neurozyten zur Behandlung von Taubheit, insbesondere von akuter perzeptiver Taubheit, chronischer neurotischer Taubheit und von neurotischem Ohrensausen.

2. Verwendung einer neutralen Protease oder eines Gemisches aus einer neutralen Protease und einer oder mehrerer Proteasen oder Pronase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die neutrale Protease eine neutrale Protease ist, die durch Mikroorganismen des Stammes Streptomyces gebildet worden ist.

3. Verwendung einer neutralen Protease oder eines Gemisches aus einer neutralen Protease und einer oder mehrerer Proteasen oder Pronase nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die neutrale Protease die Metall-Neutralprotease MNP₁ von Streptomyces ist.

4. Verwendung einer neutralen Protease oder eines Gemisches aus einer neutralen Protease und einer oder mehrerer Proteasen oder Pronase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die neutrale Protease Serratiopeptidase ist, die durch Mikroorganismen des Stammes Serratia erzeugt worden ist.

5. Verwendung einer neutralen Protease oder eines Gemisches aus einer neutralen Protease und einer oder mehrerer Proteasen oder Pronase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die neutrale Protease Thermolysin ist, die durch Mikroorganismen des Stammes Bacillus gebildet worden ist.

6. Verwendung einer neutralen Protease oder eines Gemisches aus einer neutralen Protease und einer oder mehrerer Proteasen oder Pronase nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich zu der neutralen Protease eine oder mehrere Proteasen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trypsin, alpha-Chymotrypsin, Promelain, Papain, Serratiopeptidase, Peptidase, Cephaprose, Protease, Pronase, Prozyme, Urokinase, Pankreatin, Fibrinolysin, Elastase und Collagenase, verwendet werden.