DE3943649C2

DE3943649C2 -

Info

Publication number: DE3943649C2
Application number: DE3943649A
Authority: DE
Inventors: Shigemi Fujisaki; Takashi Fujisaki; Junichi Yoshida; Yasuhiro Nishinomiya Hyogo Jp Fujisaki
Original assignee: FUJISAKI SHIGEMI NISHINOMIYA HYOGO JP
Current assignee: FUJISAKI SHIGEMI NISHINOMIYA HYOGO JP
Priority date: 1989-05-08
Filing date: 1989-12-14
Publication date: 1992-10-29
Anticipated expiration: 2009-12-15
Also published as: JPH0577655B2; DE3941324C2; FR2646605A1; JPH02292226A; FR2646605B1; GB2231263A; DE3941324A1; GB8928811D0

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines prophylaktischen und therapeutischen Mittels für Lähmungen, insbesondere von Facialislähmung und Lähmung des rückläufigen Kehlkopfnervs, dessen Wirkung auf der Aktivierung von verletzten Neurozyten beruht.

Während Steroidhormone bei Hörsturz, Facialislähmung, usw. indiziert sind, haben diese Hormone ernsthafte Nebenwirkungen und können kaum für längere Behandlungsdauer oral verabreicht werden.

Andererseits gibt es kein wirksames Arzneimittel für eine Lähmung des rückläufigen Kehlkopfnervs, usw., noch sind unbedenkliche Behandlungsmodalitäten verfügbar. Die pharmazeutische Industrie war daher gezwungen, ein Arzneimittel zur Verfügung zu stellen, das keine Nebenwirkungen hat, für die Behandlung oder die Erleichterung bei diesen Krankheiten.

Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines prophylaktischen und therapeutischen Arzneimittels, das in der Lage ist, verletzte Neurozyten zu aktivieren, und das entweder eine neutrale Protease oder eine neutrale Protease plus einer geringeren Menge von einer oder mehreren anderen Proteasen oder Pronase enthält.

Die Erfindungsurheber nahmen Kenntnis von der Wirksamkeit neutraler Proteasen als prophylaktische therapeutische Mittel für hartnäckige chronische Krankheiten und fanden insbesondere, daß eine Metall-Neutralprotease, die im folgenden kurz als MNP₁ bezeichnet wird, nicht nur eine starke entzündungshemmende Wirkung, sondern auch eine Wirkung in Richtung der Aktivierung von verletzten Neurozyten hat.

Daher wurde gefunden, daß MNP₁ die Gehirnnerven, die aus stark differenzierten Neurozyten zusammengesetzt sind und die Geruchsnerven, Sehnerven, Facialisnerven, Hörnerven, Zungennerven und rückläufigen Kehlkopfnerven stimulieren und aktivieren, wobei eine hervorragende Wirksamkeit nicht nur gegen Facialislähmung sondern auch gegen Paralyse des rückläufigen Kehlkopfnervs usw. gezeigt wird, die selbst auf Steroidhormone nicht ansprechen. Die Erfinder haben das Enzym klinischen Versuchen unterworfen und deren hervorragende Wirksamkeit und vollständige Abwesenheit von nachteiligen Wirkungen bestätigt.

Die Proteasen, die als aktive Bestandteile gemäß der Erfindung verwendet werden können, umfassen unter anderem Trypsin, α-Chymotrypsin, Promelain, Papain, Serratiopeptidase, Peptidase, Cephaprose, Protease, Pronase, Prozyme, Urokinase, Pancreatin, Fibrinolysin, Esterase und Kollagenase, wobei diese Enzyme einzeln oder in Kombination verwendet werden können. Das erfindungsgemäß verwendete Proteasegemisch kann in verschiedene Dosierungseinheiten zur oralen Verabreichung formuliert werden, wie Tabletten, Kapseln, Pulvern, Granulaten usw., oder in verschiedene Dosierungsformen für die parenterale Verabreichung, wie Injektionen, Suppositorien, Salben usw. Während die Dosierung von der Art der Enzyme abhängt, sowie von der Kondition des Patienten, der Verabreichungsmethoden, der Dosierungsform usw., kann das gewünschte Ziel der Erfindung im allgemeinen durch Verabreichen von 1 bis 5000 mg je erwachsenen Menschen, beispielsweise auf oralem Wege erreicht werden.

MNP₁, ein aktives Mittel gemäß der Erfindung, ist eine neutrale Protease, die durch Mikroorganismen des Stammes Streptomyces hervorgebracht wird. Dieses Enzym kann aus einem Kulturmedium von Streptomyces griseus durch Chromatographie mit einem Ionenaustauscher, wie Carboxymethyl(CM)-cellulose, Diethylaminoethyl(DEAE)cellulose usw., oder einem Affinitätsträger (z. B. Sepharose), der Carbobenzyloxyglycylleucin (Cbz-Gly-Leu), Leucinamid (Leu-NH₂), Phenylalanin (Phe) oder dergleichen als Ligand trägt, gereinigt werden. Dieses Enzym hat die folgenden chemischen Eigenschaften:

Neutrale Protease:
Molekulargewicht: 42 000±5000
SDS-Elektrophorese (TSKG 3000 SW)
Gelfiltration 28 000±7000

Isoelektrischer Punkt: p1=4,76±1,0

Substratspezifität:

Optimaler pH für die enzymatische Aktivität: pH 5,5-9,5 (6∼9)

Stabilität: pH 4-10 (7∼9)

Inhibitoren: EDTA, Phosphoramidon, Leucin

Löslichkeit: leicht löslich in Wasser und unlöslich in Aceton und Ethanol.

Elektrophorese: 70% Polyacrylamidgel (pH 8,0) Rf=0,09

Aminosäureanalyse

Die genannte MNP₁ kann durch biotechologische Mittel ebenfalls gereinigt werden. Zum Beispiel kann nach der Bestimmung der Struktur des neutralen Proteasegens die entsprechende DNA in das Plasmid pIJ702 eingefügt werden, wonach das erhaltene Rekombinationsplasmid mit einem entsprechenden Enzym oder Enzymen gespalten wird und das relevante Fragment in Spreptomyces lividans als Gastsubstrat inkorporiert wird. Die neutrale Protease (MNP₁), die vom Wirt produziert wird, wird dann aus der Kultur gereinigt.

Die Erfindung wird durch folgende beigefügte Zeichnungen erläutert.

Fig. 1 ist ein schematisches Diagramm, das die Stimmbänder im klinischen Fall 3 zeigt; (a) stellt die Vokalisierungsstellung und (b) die Inhalierungsstellung dar;

Fig. 2 ist ein schematisches Diagramm, das die Stimmbänder im klinischen Fall 4 wiedergibt; (a) stellt die Vokalisierungsstellung und (b) stellt die Inhalierungsstellung dar.

Bei der praktischen Durchführung der Erfindung zeigte sich, daß Serratiopeptidase, die von Mikroorganismen des Stammes Serratia abgeleitet ist, und Thermolysin, das von Mikroorganismen des Stammes Bacillus abgeleitet ist, eine Substratspezifität aufweist, so daß diese als aktiver Bestandteil verwendet werden können.

Die erfindungsgemäß verwendeten prophylaktischen und therapeutischen, neutrale Protease(n) enthaltenden Mittel können in verschiedenen Dosierungsformen durch anerkannte pharmazeutische Verfahrensweisen für die orale Verabreichung formuliert werden. Weiterhin kann das Mittel in anderer Weise in solchen Dosierungsformen verabreicht werden, wie Injektionen, Suppositorien und Salben. Außerdem kann das Mittel in Kombination mit anderen Arzneimitteln, wie therapeutischen Arzneimitteln gegen Krankheiten von Niere und Leber, therapeutischen Arzneimitteln für Gelenkrheumatismus, Steroidhormone, Antibiotika, Immunpotentiatoren, Antitumormitteln usw. verwendet werden.

Es ist bekannt, daß adrenokortikotrope Hormone, auch Steroidhormone genannt, die bei der Behandlung von verschiedenen Entzündungskrankheiten verwendet werden, dramatische Wirkungen, aber ebenso auch ernsthafte Nebenwirkungen aufweisen. Es ist bemerkenswert, festzustellen, daß die neutrale(n) Protease(n) als therapeutisches Mittel gemäß der Erfindung hervorragende Wirkungen zeigt, die denjenigen der Steroide bei allen auf Steroide ansprechenden chronischen Entzündungskrankheiten vergleichbar sind und trotzdem keine der ernsthaften Nebenwirkungen der Steroide aufweisen.

Die Dosierung kann mit der Art der neutralen Protease, der zu behandelnden Krankheit, der Verabreichungsmethode, der Dosierungsform usw. schwanken, jedoch kann für die orale Verabreichung die tägliche Dosis von 1 bis 5000 mg je erwachsenen Menschen reichen. Im Falle einer Protease, die gegen Magensäfte instabil ist, kann die gewünschte Wirkung dadurch erreicht werden, daß sie in eine enteral beschichtete Zubereitung formuliert wird.

Wenn die Dosierung in Wirkungseinheiten von jeder neutralen Protease ausgedrückt wird, wobei die enteral beschichtete Zubereitung als Beispiel genommen wird, kann das gewünschte Ziel durch orale Verabreichung von 2000 bis 4000 Einheiten bei der Serratiopeptidase, die von Mikroorganismen des Stammes Serratia abgeleitet ist, und mit 5000 bis 500 000 Tyrosineinheiten bei der neutralen Peptidase, die von Mikroorganismen des Stammes Streptomyces abgeleitet ist, erreicht werden. Es sollte jedoch dazu bemerkt werden, daß je nach der Art der neutralen Protease eine enteral beschichtete Zubereitung vorzugsweise verwendet wird.

Ein Kennzeichen der erfindungsgemäß verwendeten prophylaktischen und therapeutischen neutralen Protease(n) gegen Facialislähmung, Lähmung des rückführenden Kehlkopfnervs, usw. ist dasjenige, daß nur die neutrale Protease oder die neutrale Protease und die anderen Proteasen in den Nervenzellen transloziert werden, um die verletzten Zellen zu aktivieren und die Zellen zu verbessern und wiederherzustellen, insbesondere Neurozyten bis zum normalen Zustand, wie demonstriert wurde.

Beispiel 1

2 g Serratiopeptidase, aus Serratia marcescens, 190 g Lactose und 70 g Kartoffelstärke wurden gleichmäßig gemischt und mit einer 3%igen Lösung von Hydroxypropylcellulose geknetet. Das Gemisch wurde granuliert und die erhaltene Granulierung gemischt mit 0,3% Magnesiumstearat und dann zu Tabletten formgepreßt.

Beispiel 2

2 g einer neutralen Protease, abgeleitet von Streptomyces griseus, wurde mit 40 g Lactose vermischt und nach Zugabe von 1,0 g Hydroxypropylmethylcellulose das Gemisch granuliert. Das erhaltene Granulat wurde gleichmäßig mit Celluloseacetatphthalat beschichtet und ergab enteral beschichtete Körner.

Beispiel 3

Die enteral beschichteten Körner aus neutraler Protease, die gemäß Beispiel 2 hergestellt waren, wurden in Kapseln eingefüllt und ergaben Kapseln.

Beispiel 4

Es wurden 6157 mg Witepsol H-15 (Dynamit Nobel, ein Triglycerid einer höheren gesättigten Fettsäure) und 325 mg Polyoxyethylenlaurylether (Nikko Chemicals, BL-25) durch Erhitzen verschmolzen. Danach wurden 500 mg Pulver der neutralen Protease, die von Streptomyces griseus abgeleitet war, zu der Schmelze zugefügt und dispergiert, und die erhaltene Dispersion wurde in eine Form für Suppositorien von 130 mg eingegossen. Nach der Verfestigung war das erhaltene Suppositorium aus der Form gelöst.

Klinische Fälle

Die klinischen Fälle waren wie folgt:

I) Facialislähmung Klinischer Fall 1: Y. I. Ein 71jähriger Mann.

Der Patient besuchte das Krankenhaus der Anmelderin, weil er zehn Tage vorher bemerkt hatte, daß die Stirn nicht mehr Runzeln bildete, die Augen nicht mehr schließbar waren und die Augenbrauen nicht mehr beweglich waren, wobei Speichel aus dem Mund lief und Suppe aus dem Mund tropfte. Bei der Prüfung wurde bei dem Patienten eine Lähmung des ersten, zweiten und dritten Zweigs des linken Facialisnervs diagnostiziert, und es wurde ihm verschrieben, fünf Tabletten MNP₁ jeden Tag oral zu nehmen, was innerhalb eines Monats eine vollständige Heilung verursachte.

Klinischer Fall 2:

Das Patient besuchte das Krankenhaus der Anmelderin, da er sieben Tage vorher bemerkte, daß die rechte Augenbraue nicht mehr beweglich war und die Augen nicht schließbar und der Mund nicht bewegbar waren. Bei der Prüfung wurde beim Patienten eine Lähmung des ersten, zweiten und dritten Zweigs des rechten Facialisnervs diagnostiziert, und der Patient wurde instruiert, fünf Tabletten MNP₁ oral jeden Tag zu nehmen, was innerhalb 24 Tagen eine vollständige Heilung verursachte.

II) Lähmung des rückläufigen Kehlkopfnervs (a) Internuslähmung Klinischer Fall 3: S. K. Ein 62jähriger Mann.

Der Patient besuchte das Krankenhaus der Anmelderin mit Heiserkeitsbeschwerden, die vier Wochen anhielten. Der Patient war auf eine Schilddrüsenkrankheit während der letzten zwei bis drei Jahre behandelt worden und war heiser, wenn er keine Medizin genommen hatte. Es wurde jedoch unmittelbar nach der Behandlung mit einem Schilddrüsen-Arzneimittel besser. Diesmal trat die Heiserkeit vier Wochen vorher auf und verbesserte sich nicht trotz oraler Verabreichung eines Schilddrüsen-Arzneimittels. Danach wurde der Patient in dem Krankenhaus der Anmelderin von behandelnden Arzt überwiesen.

Bei der Prüfung wurden in den Stimmbändern kein Tumor oder eine andere bösartige Krankheit gefunden, und die Diagnose einer bilateralen Lähmung des inneren Muskels wurde gestellt, wobei der Muskel, der die Stimmbänder schießt, gemeint ist, und der zentrale Teil der Stimmbänder nicht geschlossen werden konnte, wenn beide Stimmbänder sich schlossen (vgl. Fig. 1), was eine Heiserkeit beim Sprechen ergab. Der Patient wurde instruiert, fünf Tabletten MNP₁ jeden Tag oral einzunehmen, was eine vollständige Heilung in zwei Wochen zur Folge hatte.

(b) Posticuslähmung Klinischer Fall 4: M. A. Ein 56jähriger Mann.

Der Patient besuchte das Krankenhaus der Anmelderin mit Dyspneoe und Tonbildungsversagen. Bei der Prüfung wurde gefunden, daß beide Stimmbänder in der Mitte fixiert waren und sich nicht öffneten. Die Diagnose der Lähmung des dilatorischen Muskels der Stimmbänder, d. h. der bilateralen Posticuslähmung, wurde erstellt und eine Notbehandlung wurde verabreicht, was sein Leben rettete. Die Stimmbänder bewegten sich jedoch immer noch nicht. Die Operation wurde verschoben, und es wurden fünf Tabletten jeden Tag MNP₁ oral verabreicht, und 30 Tage später waren die Stimmbänder wieder in der Lage, sich um etwa die Hälfte eines normalen Stimmbands zu dehnen. Diese Krankheit wird im wesentlichen nicht vollständig durch chirurgische Eingriffe geheilt und durch Arzneimitteltherapie kaum verbessert. Obwohl dieser Patient eine Fixierung der Stimmbänder in Mittelposition hatte und an Atembeschwerden litt, erlaubte die orale Verabreichung dieses Arzneimittels eine Atmung und die normale Tonbildung (vgl. Fig. 2).

Die prophylaktische und therapeutische Verwendung der neutralen Protease(n) gemäß der Erfindung für Facialislähmung, Lähmung des rücklaufenden Kehlkopfnervs, usw. zeigt eine Wirkung sowohl bei der Verwendung von MNP₁ allein als auch von MNP₁ und anderen Proteasen, die darin enthalten sind und die auf verletzte Neurozyten wirken, um die Zellen zu aktivieren und ihre Funktion zu verbessern mit größerer Wirkung als diejenige von Steroid-Arzneimitteln und ohne Nebenwirkungen.

Claims

1. Verwendung einer neutralen Protease oder eines Gemisches aus einer neutralen Protease und einer oder mehrerer Proteasen oder Pronase als Aktivator für verletzte Neurozyten zur Behandlung von Lähmungen, insbesondere von Facialislähmung, Lähmung des rückläufigen Kehlkopfnervs, von Internus- und von Posticuslähmung.

2. Verwendung einer neutralen Protease oder eines Gemisches aus einer neutralen Protease und einer oder mehrerer Proteasen oder Pronase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die neutrale Protease eine neutrale Protease Ist, die durch Mikroorganismen des Stammes Streptomyces gebildet worden ist.

3. Verwendung einer neutralen Protease oder eines Gemisches aus einer neutralen Protease und einer oder mehrerer Proteasen oder Pronase nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die neutrale Protease die Metall-Neutralprotease MNP₁ von Streptomyces ist.

4. Verwendung einer neutralen Protease oder eines Gemisches aus einer neutralen Protease und einer oder mehrerer Proteasen oder Pronase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die neutrale Protease Serratiopeptidase ist, die durch Mikroorganismen des Stammes Serratia erzeugt worden ist.

5. Verwendung einer neutralen Protease oder eines Gemisches aus einer neutralen Protease und einer oder mehrerer Proteasen oder Pronase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die neutrale Protease Thermolysin ist, die durch Mikroorganismen des Stammes Bacillus gebildet worden ist.

6. Verwendung einer neutralen Protease oder eines Gemisches aus einer neutralen Protease und einer oder mehrerer Proteasen oder Pronase nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich zu der neutralen Protease eine oder mehrere Proteasen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trypsin, alpha-Chymotrypsin, Promelain, Papain, Serratiopeptidase, Peptidase, Cephaprose, Protease, Pronase, Prozyme, Urokinase, Pankreatin, Fibrinolysin, Elastase und Collagenase, verwendet werden.