DE3888355T2

DE3888355T2 - Lagerung von entomopathogenen nematoden.

Info

Publication number: DE3888355T2
Application number: DE3888355T
Authority: DE
Inventors: Robin Bedding
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 1987-05-05
Filing date: 1988-05-05
Publication date: 1994-07-07
Anticipated expiration: 2008-05-06
Also published as: AU608852B2; DE3888355D1; WO1988008668A1; AU1722488A; EP0359764A1; US5042427A; JPH02503913A; EP0359764B1; EP0359764A4; JP2568119B2

Description

TECHNISCHES GEBIET

Diese Erfindung betrifft die Lagerung entomopathogener Nematoden. Insbesondere betrifft sie die Lagerung und den Transport infektiöser Nematoden-Jugendformen der dritten Stufe.

HINTERGRUND

Es wird immer deutlicher, daß entomopathogene Nematoden in den Familien Steinernematidae und Heterorhabditidae ein beträchtliches Potential zur Bekämpfung der verschiedensten Schadinsekten aufweisen. Infektiöse Jugendformen (J3) dieser Nematoden (die in der Umgebung ohne Nahrungsaufnahme mehrere Monate überleben können) besitzen die Fähigkeit zum Aufspüren von Insekten, zum Eindringen in ein Insektenhämocoel und zur dortigen Freisetzung spezieller symbiotischer Bakterien (der Xenorhabdus-Art). Diese Bakterien töten die Insekten innerhalb von ein bis zwei Tag(en) ab und schaffen geeignete Bedingungen für eine Nematodenreproduktion. R.A. Bedding hat akzeptable Verfahren zur großtechnischen in-vitro-Zucht dieser Nematoden entwickelt. Seine Techniken sind beispielsweise in den US-PS 4 178 366 und 4 334 498, in der AU-PS 509879 und in seinen Veröffentlichungen in "Nematologica", Band 27, Seiten 109 bis 114 (1981) (mit dem Titel "Low cost in vitro mass production of Neoaplectana and Heterorhabditis species (Nematoda) for field control of insect pests") und in Anals of Applied Biology", Band 104, Seiten 117 bis 120 (1984) (mit dem Titel "Large scale production, storage and transport of the insect-parasitic nematodes Neoaplectana spp. and Heterorhabditis spp.") beschrieben. Ungelöst bleiben jedoch eine massenhafte, hochdichte Lagerung und ein eben solcher Transport von Nematoden.
In der zuvorgenannten Veröffentlichung in "Annals of Applied Biology" beschreibt Bedding den Einsatz eines zerbröselten Polyetherpolyurethanschaums als Träger für gelagerte Nematoden in Polyethylenbeuteln. Unglücklicherweise erforderten derart gelagerte Nematoden eine konstante Zwangsbelüftung, dauerte eine Extraktion der Nematoden aus dem Schaumstoff 1 bis 2 h und war das Verfahren zur Lagerung der Heterorhabditis-Art ungeeignet. T. Yukawa und J.M. Pitt haben in der Beschreibung der Internationalen Patentanmeldung PCT/AU85/00020 verschiedene Verfahren zur Lagerung von Nematoden beschrieben. Eine bestimmte Menge der in dieser Beschreibung enthaltenen Information basiert auf zuvor veröffentlichten Arbeiten, einige Ergebnisse sind nicht wiederholbar. Eine in dieser Beschreibung erläuterte Technik ist jedoch sicherlich originell und funktioniert mit einer Nematoden-Art gut. Diese Technik besteht in der Lagerung infektiöser Nematoden-Jugendformen mit pulverisierter Aktivkohle. Auf diese Weise können die Nematoden in hoher Dichte unter anaeroben oder praktisch anaeroben Bedingungen eine erhebliche Zeit lang überleben. Dieses Verfahren ist jedoch mit einer Reihe ernsthafter Nachteile behaftet. Diese sind:
a) Es funktioniert lediglich mit der Art Steinernema feltiae zufriedenstellend.
b) Aktivkohle ist extrem unangenehm zu handhaben und muß in einem Dunstschrank verpackt werden. Käufer von derart verpackten Nematoden finden die Handhabung der Holzkohle ebenfalls unangenehm.
c) Aktivkohle ist teuer.
d) Die Nematoden gehen innerhalb weniger Tage ein, wenn Packungen Temperaturen über etwa 15ºC ausgesetzt werden (vermutlich als Ergebnis einer erhöhten, sauerstoffverbrauchenden Nematodenaktivität).
e) Es treten Schwierigkeiten auf, wenn die Packungen mehr als etwa 60 Millionen Nematoden enthalten.
f) Es gibt Beschränkungen bezüglich der Dicke der Packungen, und zwar hauptsächlich, weil Nematoden in Mischung mit Holzkohle lediglich dann gut überleben, wenn eine zentrale Nematodenmasse von einer äußeren Holzkohleschicht umgeben ist. Dies ist in dicken Packungen nicht gewährleistet.

BESCHREIBUNG DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines zuvor benutzten oder vorgeschlagenen Verfahren zum Lagern und Transportieren entomopathogener Nematoden für gewerbliche Zwecke überlegenen (einschlägigen) Verfahrens.
Diese Aufgabe läßt sich bei Verwendung von Ton lösen. Der Ton wird benutzt (a) zur Bildung eines homogenen Gemischs aus Nematoden und Ton (erste Ausführungsform der Erfindung); b) zur Bildung eines Sandwich aus zwei Tonschichten mit einer dazwischenliegenden Schicht aus einer Nematodencreme (zweite Ausführungsform der vorliegenden Erfindung) oder c) zum langsamen Austrocknen der Nematodencreme (dritte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung).
Die Vorteile der Verwendung von Ton als Matrix- oder Substratmaterial zur Lagerung von Nematoden sind vermutlich dreifach. Zunächst dürften die infektiösen Jugendformen (J3) der Nematoden-Arten Steinernema und Heterorhabditis länger überleben, wenn sie derart gelagert sind, daß ihre Bewegung mehr oder weniger gehemmt ist und sie folglich kaum soviel Energie verbrauchen wie im Falle, daß sie sich bewegen. Auf diese Weise konservieren sie Depotnahrungsreserven. Eine solche Hemmwirkung erreicht man mit Ton. Zweitens dürften die von den Nematoden als solchen produzierten Ausscheidungsprodukte für die Nematoden toxisch sein, diese Produkte werden aber wahrscheinlich im Ton absorbiert. Drittens sprechen die Nematoden (allgemein), wenn sie relativen Feuchtigkeiten von weniger als 100% ausgesetzt sind, physiologisch derart an, daß beispielsweise Trehalose und Inosit gebildet werden (von diesen Zuckern ist bekannt, daß sie etwas Schutz gegen ein weiteres Austrocknen bilden) und die Nematoden in eine oftmals von einem Einrollen des Körpers und einer Beschränkung der Bewegung begleitete Ruhephase eintreten. Eine Nutzung eines Tonsubstrats zur Nematodenlagerung führt diese Wirkung herbei.
Bei der dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bedient man sich des entwässernden Effekts von trockenem Ton zum langsamen Trocknen der Nematoden im Anschluß an die zuvor geschilderte Stufe, so daß sie einen Großteil ihres inneren Wassers verlieren, später jedoch rehydratisiert werden können, um ohne merkliche Sterblichkeit wieder aktiv zu werden. Dieses Verfahren besitzt den Vorteil, die Atmung der Nematoden (und selbstverständlich ihre Bewegung) zu stoppen und in hohem Maße die gesamte enzymatische Aktivität zu vermindern. Darüber hinaus wird bei niedriger Wasseraktivität jegliches Wachstum von verunreinigenden Organismen verhindert. Diese Anwendungsform der vorliegenden Erfindung ermöglicht somit eine lang dauernde, vielleicht mehrjährige Lagerung von J3-Nematoden. Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß eine Langzeitlagerung noch nicht getestet wurde.
In Ton gelagerte Nematoden (entweder in homogener Kombination oder als Sandwich) lassen sich durch Dispergieren der Nematoden und des Tons in Wasser reaktivieren. Wenn die Nematoden durch den Ton langsam ausgetrocknet wurden, werden sie am wirksamsten dadurch reaktiviert, daß zunächst die Nematoden/Ton-Kombination in einer Atmosphäre einer relativen Feuchtigkeit von 100%, jedoch in Abwesenheit von freiem Wasser, gelagert und dann die Nematoden in Wasser dispergiert werden.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Lagerung infektiöser Jugendformen der dritten Stufe (J3) entomopathogener Nematoden durch Ausbilden eines homogenen Gemischs eines wäßrigen Konzentrats (d. h. einer Creme) sauberer entomopathogener J3-Nematoden mit, bezogen auf das Gemisch, 33 Gew.-% bis 67 Gew.-% Ton.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Lagerung infektiöser Jugendformen der dritten Stufe (J3) entomopathogener Nematoden durch Auftragen einer dünnen Schicht einer wäßrigen Creme sauberer J3 entomopathogener Nematoden auf eine erste Tonschicht und anschließendes Bedecken der Nematodenschicht mit einer zweiten Tonschicht.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Lagerung entomopathogener Nematoden (durch langsames Austrocknen einer Creme sauberer J3-Nematoden), umfassend die folgenden Stufen:
(a) Ausbreiten einer Schicht einer wäßrigen Creme sauberer J3 entomopathogener Nematoden auf einer absorbierenden Unterlage;
(b) Aufbringen der absorbierenden Unterlage auf eine Schicht oder ein Bett aus trockenem Ton (d. h., der Ton wurde bei Umgebungsfeuchtigkeit gelagert);
(c) Aufbewahren der Kombination aus Nematodencreme, Unterlage und Ton in einer Umgebung einer relativen Feuchtigkeit von etwa 95% für mindestens drei Tage und
(d) anschließendes Reduzieren der relativen Feuchtigkeit der Umgebung, in der die Kombination über einige Wochen hinweg gelagert wird, bis zum Erreichen eines relativen Feuchtigkeitswerts von etwa 60%.
Nematoden/Ton-Kombinationen lagern die Nematoden unabhängig davon, ob die Kombination danach in einer anaeroben Umgebung oder in einer Umgebung, die einen merklichen Prozentanteil an Sauerstoff enthält (z. B. Luft), gehalten wird. In der Tat werden vollständig anaerobe Lagerungsbedingungen nicht bevorzugt, es hat sich nämlich gezeigt, daß sich die Lebensfähigkeit der gelagerten Nematoden in Abwesenheit von Sauerstoff insbesondere bei Temperaturen weit oberhalb 10ºC weit rascher verschlechtert. Sauerstoffanteile von über etwa 2% in der Lagerungsumgebung sind erwünscht, Sauerstoffmengen weit unterhalb des Sauerstoffgehalts von Luft sind für das Überleben der Nematoden sicherlich nicht schädlich.
Es hat sich gezeigt, daß bei Kombination bestimmter Tone mit J3 entomopathogener Nematoden und Entfernen des Hauptteils des Oberflächenwassers von der Kombination eine deutlich verbesserte Langlebigkeit nach Lagerung der Nematoden innerhalb eines breiten Temperaturbereichs auftritt. Weiterhin lassen sich die Nematoden nach einer solchen Lagerung ohne weiteres in Wasser durch bloßes Vermischen der Kombination mit Wasser suspendieren. Danach kann die Suspension zur Insektenbekämpfung direkt auf den Boden oder Pflanzen appliziert werden. Von den verschiedensten Tonen, die sich als Lagerungsverbesserer für diese Nematoden als geeignet erwiesen haben, sorgen die zur als "Attapulgit-Tone" bekannten Gruppe gehörenden Tone für deutlich bessere Lagerungsbedingungen als andere getestete Tone. Die Diatomeentone und Kieselgur gehören zu den Materialien, die bei erfindungsgemäßer Verwendung gegenüber bekannten Verfahren eine deutlich bessere Lagerung ermöglichen.
Das erfindungsgemäße Lagerungsverfahren wurde mit den meisten der bekannten Arten entomopathogener Nematoden erfolgreich getestet. Zu diesen Nematoden-Arten gehören Steinernema feltiae (zuvor als Neoaplectana carpocapsae bekannt; für die vorliegende Beschreibung ist jeglicher Hinweis auf Steinernema als Synonym zu Neoaplectana zu verstehen), Steinernema bibionis, Steinernema glaseri, Steinernema affinis, Steinernema anomali, Heterorhabditis heliothidis, Heterorhabditis bacteriophora, Heterorhabditis megidis und sechs weitere noch unbeschriebene neue Arten von Steinernema aus Australien, China und den Vereinigten Staaten, zwei neue Arten der neuen Gattung Steinernematid aus Australien und vier noch unbeschriebene neue Arten von Heterorhabditis aus Australien, China, Kuba und Europa. Sämtliche getesteten Arten entomopathogener Nematoden erwiesen sich als einer derartigen Lagerung zugänglich. Da diese Arten zwei unterschiedlichen Nematodenfamilien (Steinernematidae und Heterorhabditidae) angehören und nahezu sämtliche darin gefundenen Arten umfassen, dürften sich sämtliche derartigen Nematoden auf diese Weise lagern lassen.
Es folgen nun eine detaillierte Beschreibung der Art und Weise, auf die Nematoden zur Lagerung in einer Nematoden/ Ton-Kombination vorbereitet werden, und Beispiele für Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.

VORBEREITUNG DER NEMATODEN VOR DER LAGERUNG

Die Art und Weise, auf die die Nematoden vor ihrer Kombination mit Tonen bearbeitet werden, besitzt einen wesentlichen Einfluß auf deren weitere Langlebigkeit. Wenn Nematoden ungünstigen Bedingungen, z. B. hoher Temperatur, Anoxie-, Pathogenen oder Bakterientoxinen ausgesetzt oder mechanisch oder chemisch geschädigt werden, kann offensichtlich ihre Langlebigkeit verkürzt werden. Ungeachtet dieser Faktoren sollte eine Ausnutzung der Nahrungsreservedepots durch die Nematoden vor ihrer Lagerung auf ein Minimum reduziert werden. Es ist auch wichtig, daß die Nematoden bei Zugabe zu den Tonen so sauber wie möglich sind, so daß eine mikrobielle Degeneration des Gesamtgemischs nicht gefördert wird.
Sämtliche bei den zur Bestätigung der Wirksamkeit der vorliegenden Erfindung durchgeführten Versuchen eingesetzten Nematoden wurden nach den den beiden zuvorgenannten Veröffentlichungen von R.A. Bedding oder Modifikationen dieser Verfahren gezüchtet. Die Nematoden lassen sich jedoch auch auf Insekten in vivo oder in flüssiger Kultur züchten, sofern die Nematoden keine merklichen Mengen an restlichem Fremdmaterial aus dem Kulturmedium enthalten und von anderen Nematodenstufen als J3 relativ frei sind (vorzugsweise sollten keine erwachsenen Nematoden vorhanden sein, mit Bestimmtheit dürfen nicht mehr als 2% der Nematoden ausgewachsen sein). Eine Extraktion der Nematoden aus einem festen Kulturmedium wurde in der zuvorgenannten Veröffentlichung von R.A. Bedding im Jahre 1984 beschrieben. Sie konnte auch nach einer modifizierten Form dieser Technik erfolgen. Das Waschen erfolgte durch Sedimentieren in Tanks und anschließendes Abdekantieren des Wassers. Die Nematoden wurden nach einer Vorwäsche zwei Tage lang in den Tanks aufbewahrt, um einen bakteriellen Abbau kleiner, durch die vorausgehende Sedimentation nicht entfernter Mediumteilchen zu ermöglichen. Während dieser Zeit wurden jedoch die Nematoden in wäßriger Suspension unter Verwendung eines Kompressors belüftet. Diese Belüftungszeit trägt auch zu einer Verminderung der Populationen an ausgewachsenen und sonstigen Nicht- J3-Stufen bei und beeinträchtigt die Lagerfähigkeit nicht.
Nach weiterem Waschen wurden die Nematoden sedimentiert. Das überschüssige Wasser wurde abgelassen. Danach wurde das Nematodensediment aus den Tanks in mit Tuch ausgekleidete Siebe gepumpt. Letztere ließen das Wasser, jedoch nicht die Nematoden durch. Auf diese Weise konnte das Wasser abfließen. Bei einigen Versuchen wurde weiteres Wasser entfernt, wurden die Tuchenden vereinigt, um die Nematodenmasse vor dem Abquetschen einer weiteren Charge des Restwassers einzuschließen. Das erhaltene Nematodenkonzentrat (Creme) enthielt 0,5 bis 3 Millionen J3-Nematoden pro Gramm je nach der benutzten Art und der Menge des zwischen den Nematoden befindlichen Restwassers.
Diese Maßnahmen wurden bei den meisten der durchgeführten Versuche angewandt. In einigen Fällen wurde allerdings dem Nematodenkonzentrat vor dem Filtrieren durch das Tuch 0,1% Formaldehyd zugesetzt, um durch Vernetzung irgendwelche restlichen Teile des Kulturmediums, die sonst das Wachstum verunreinigender Mikroorganismen begünstigen könnten, zu stabilisieren.

KOMBINIEREN VON NEMATODEN MIT DEM TONSUBSTRAT

Im allgemeinen wurde zum Dispergieren der Nematodencreme in der Tonmatrix bzw. in dem Tonsubstrat die Nematodencreme abgewogen. Etwa die Hälfte bis zur doppelten Menge dieses Gewichts an Tonsubstrat wurde gründlich in die Creme eingemischt, um ein homogenes Gemisch herzustellen. Das Mischen ließ sich in höchst zufriedenstellender Weise durch sorgfältiges Verkneten des Tons und der Nematodencreme von Hand und kontinuierliches Zerkleinern irgendwelcher Klumpen von Nematoden oder Ton im Verfahren bewerkstelligen. Üblicherweise wird zunächst etwas Ton nicht mit der Nematodencreme gemischt, da die Wasseraktivität des erhaltenen Gemischs von Bedeutung ist. Die Wasseraktivität des anfänglichen Gemischs wird soweit wie möglich 0,99 angenähert, bevor der Ton zugegeben wird (wenn eine geringere Wasseraktivität erforderlich war). Während des Mischvorgangs wird die Wasseraktivität unter Verwendung einer elektronischen Sonde kontinuierlich überwacht. Wenn der Ton in Schnipselform vorliegt, werden nach Zubereiten des anfänglichen Gemischs 2 bis 4 h verstreichen gelassen, bevor die Wasseraktivität durch Zugabe von mehr Ton eingestellt wird. Dies deshalb, weil eine Wassergehaltgleichgewichtseinstellung zwischen dem Inneren und dem Äußeren der Schnipsel nicht augenblicklich erfolgt. Bei vermahlenen oder pulverförmigen Attapulgit-Tonen braucht man zur Gleichgewichtseinstellung nicht mehr als einige Minuten verstreichen zu lassen. Da das Bedienungspersonal beim Vermischen der Nematodencreme mit Ton Erfahrung sammelte, gab es nur ein minimales Erfordernis für eine wiederholte Benutzung der Sonde.
Nach dem Vermischen der Nematodencremes mit Tonen wurden die erhaltenen Kombinationen 4 h bei 15ºC liegen gelassen (die anfängliche Nematodenaktivität und die Absorptionswärme führen zu einem Temperaturanstieg) und dann in den verschiedensten Behältern, nämlich Polyethylenbeuteln, Glasgefäßen, Phiolen oder Röhrchen, Nahrungsmittelbehältern oder sonstigen Behältern aus Kunststoff, gewachsten Pappekartons oder Aluminiumkästen, gelagert. In einigen Fällen wurden die Nematoden/Ton-Kombinationen in Aluminiumfolie oder eine Kunststoffhülle für Nahrungsmittel (aus Polyethylen oder Polypropylen) eingepackt. Wenn eine Packung einer Nematoden/ Ton-Kombination nicht unter Kühlung gelagert werden sollte, wurden gewisse Vorkehrungen für einen Gasaustausch zwischen dem Packungsinneren und -äußeren (unter Minimierung eines Wasserverlusts) getroffen, so daß sich in den Behältern keine anaeroben Bedingungen entwickelten.
Nachdem die zur Ausführung der vorliegenden Erfindung benutzten Techniken allgemein beschrieben wurden, sollen die folgenden speziellen Beispiele die Erfindung näher veranschaulichen.

BEISPIEL 1

A. 3,2 kg einer in der geschilderten Weise, jedoch ohne aktives Ausquetschen von Wasser zubereiteten Creme mit etwa 6000 Millionen J3 eines Steinernema feltiae A11- Stamms wurden in einen Kunststoffbehälter (Fischkorb) gefüllt. 3,2 kg calcinierter Schnipsel von Attapulgit-Ton wurden sorgfältig von Hand eingemischt, um ein möglichst nahezu homogenes Gemisch herzustellen. Das Gemisch, das in dem Kunststoffbehälter eine Tiefe von einigen 10 cm einnahm, wurde zur Verminderung eines Austrocknens mit einer Aluminiumfolie abgedeckt und 4 h lang bei 15ºC stehengelassen. Nach 2 h wurde es erneut durchgemischt. Danach wurde das Nematoden/Ton-Gemisch in zwanzig 200 g Loten und vierundzwanzig 100 g Loten in runden 500 ml bzw. 250 ml fassenden Nahrungsmittelbehältern aus Kunststoff verpackt. Jeder Behälter war zu etwa 9/10 voll und besaß folglich am oberen Ende noch einen kleinen Luftraum. Die Wand jeden Behälters wurde mit 10 Löchern von etwa 2 mm Durchmesser perforiert. Die Löcher waren gleichmäßig rund um den Behälter nahe seines oberen Rands verteilt. Diese Perforationen bildeten Verbindungen zwischen der Außenumgebung und dem Luftraum am oberen Ende des Behälters. Acht Stück jeder Behältergröße wurden bei 4ºC, vier Stück jeder Behältergröße bei 15ºC, 23ºC bzw. 28ºC aufbewahrt. Zwei 100 g Lote wurden jeweils bei -8ºC bzw. -18ºC aufbewahrt. Alle zwei Wochen (mit Ausnahme der bei 4ºC gelagerten Behälter (vgl. Tabelle 1)) wurde der Gesamtinhalt eines Behälters aus jeder Temperatur in Wasser eingetragen, 5 min lang darin belassen und danach gerührt, so daß sämtliche Nematoden aus dem Behälter in Wasser suspendiert wurden. Die Nematoden und kleinere Attapulgit-Tonteilchen wurden dann abdekantiert (wobei die größeren Teilchen als Sediment zurückblieben) und nach Verdünnung der Probe gezählt. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle 1.
B. 2 kg einer Creme mit etwa 3800 Millionen Steinernema bibionis wurden, wie bei A. beschrieben, getestet, die gebildete Nematoden/Ton-Kombination wurde jedoch in Form von 100 g Loten in jeweils vierzig 250 ml fassenden Behältern verpackt. Danach wurden die Behälter bei denselben Temperaturen wie bei A. beschrieben gelagert und in entsprechender Weise geprüft. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 1 zusammengestellt.
C. 2 kg Heterorhabditis heliothidis, Stamm NZ wurden, wie in B. beschrieben, behandelt, wobei jedoch acht Packungen bei 15ºC und lediglich vier bei 4ºC aufbewahrt wurden (vorhergehende Versuche haben ein schlechtes überleben der bei 4ºC gelagerten Nematoden gezeigt). Die gelagerten Kombinationen wurden wiederum in Intervallen von zwei Wochen geprüft. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle 1. Tabelle 1 Prozentuales überleben von Steinernema und Heterorhabditis spp. nach einer Lagerung auf calcinierten Attapulgitschnipseln bei verschiedenen Temperaturen Nematoden-Arten Lagerungstemperatur Prozentuales Überleben nach einer Lagerungsdauer von
Geringere Mengen sämtlicher dieser Arten und eine Anzahl anderer Arten wurden in den verschiedensten Behälterarten getestet. Üblicherweise waren die Ergebnisse nicht signifikant verschieden von den in Tabelle 1 aufgeführten Ergebnissen. Steinernematiden, die bei Temperaturen oberhalb 15ºC in versiegelten Polyethylenbeuteln gelagert worden waren, zeigten jedoch im Vergleich zu in anderen Behältern gelagerten Steinernematiden eine ziemlich schlechte Überlebensrate.
Unter Benutzung der von R.A. Bedding, A.S. Molyneux und R.J. Akhurst beschriebenen Veröffentlichungen mit dem Titel "Heterorhabditis spp., Neoaplectana spp. and Steinernema kraussei: Interspecific and intraspecific differences in infectivity for insects" in "Experimental Parasitology", Band 55, Seiten 249 bis 255 (1982) wurde die Infektionskraft der in den am längsten gelagerten Proben lebensfähig gebliebenen Nematoden bei reifen Schmeißfliegenlarven (Lucilia cuprina) getestet. Die Infektionskraft hat sich als ähnlich stark wie diejenige frisch gesammelter Nematoden erwiesen.

BEISPIEL 2

A. 2 kg eines Steinernema feltiae All-Stamms mit etwa 4000 Millionen J3 Nematoden entsprechender Herkunft wie in Beispiel 1 wurden - ebenfalls entsprechend Beispiel 1 - in eine Creme überführt und danach mit 1,5 kg gemahlenen calcinierten Attapulgit-Tons, der durch ein 40 mesh (BSS)-Sieb gesiebt worden war, gemischt. Der Pf-Wert des erhaltenen Gemischs wurde mit 4,7 bestimmt. Fünfunddreißig Lote von jeweils 100 g der erhaltenen Kombination wurden jeweils in gewachsten Pappkartons, die entsprechend Beispiel 1 perforiert worden waren, bei 28ºC, 23ºC, 15ºC bzw. 4ºC gelagert und in wöchentlichen Intervallen untersucht.
B. 1 kg Steinernema glaseri NC 34-Stamm mit etwa 1200 Millionen J3 Nematoden wurde - wie bei A. beschrieben - mit 0,75 kg des gemahlenen und gesiebten Attapulgit-Tons gemischt. Acht Lote von jeweils 200 g der Kombination wurden in jeweils 500 ml fassenden Kunststoffbehältern gelagert. Vier dieser Behälter wurden bei 28ºC, vier bei 23ºC gehalten. Proben wurden in Intervallen von einer Woche getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt.
C. 1 kg Heterorhabditis heliothidis C1-Stamm mit einigen 1500 Millionen J3 Nematoden wurde mit 0,75 kg gemahlenen und gesiebten Attapulgit-Ton gemischt. Acht Lote von jeweils 200 g der Kombination wurden in jeweils 500 ml fassenden Kunststoffbehältern gelagert. Vier dieser Behälter wurden bei 23ºC, vier bei 15ºC gehalten. Die gelagerten Proben wurden entsprechend Beispiel 1 von Zeit zu Zeit untersucht. Die prozentualen Überlebensdaten für die J3 Nematoden sind in Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2 Prozentuale Überlebensrate von entomopathogenen Nematoden nach einer Lagerung in gemahlenem Attapulgit bei verschiedenen Temperaturen Nematoden-Arten Lagerungstemperatur Prozentuales Überleben nach einer Lagerungsdauer von

BEISPIEL 3

1 kg Steinernema feltiae (mexikanischer Stamm) J3 Nematoden, die auf einem Tuchfilter konzentriert und danach durch Abquetschen von überschüssigem Wasser befreit worden waren, wurde auf einer glatten Oberfläche bis zu einer Höhe von 2 cm ausgestrichen und danach in Blöcke von jeweils 100 g zerschnitten. Diese Blöcke wurden jeweils innerhalb eines 500 ml fassenden Kunststoffbehälters auf ein 2 cm tiefes Bett aus gemahlenem und calciniertem Attapulgit-Ton gelegt und derart mit Attapulgit-Ton bedeckt, daß sich in jedem Behälter insgesamt 50 g Attapulgit-Ton befanden. In der Wand des Behälters nahe seinem Rand wurde eine Reihe von Löchern eines Durchmessers von 2 mm vorgesehen. Diese Nematoden wurden bei 23ºC bzw. 28ºC aufbewahrt. Sie zeigten nach einem Monat eine geringere Sterblichkeit als die in Beispiel 2 in der Nematoden/Ton-Kombination gelagerten Nematoden.

BEISPIEL 4

1 kg einer wäßrigen Creme von Steinernema feltiae A11-Stamm J3 Nematoden wurde in einer Höhe von etwa 2 cm auf einem Filterpapier verteilt. Letzteres lag auf einem Bett aus gemahlenem Attapulgit-Ton. Die Nematodencreme wurde auf dem Filterpapier belassen, bis das gesamte sichtbare interstitielle Wasser entfernt und die Nematodenmasse recht hart geworden war. Danach wurde die Nematodenschicht auf dem Filterpapier auf ein anderes 2 cm tiefes Bett aus gemahlenem Attapulgit-Ton am Boden eines versiegelbaren Polystyrolkastens einer Wandstärke von 2,5 cm Dicke plaziert. Anschließend wurde der Kasten derart versiegelt, daß sich im Kasten eine relative Feuchtigkeit von etwa 95% entwickelte und die Nematoden über einen Zeitraum von einigen Tagen langsam Wasser verloren. In dem Polystyrolkasten konnten zahlreiche Schichten untergebracht werden, um gleichzeitig größere Mengen an Nematoden und Ton behandeln zu können. Während des Trocknens der Nematoden verringerte sich die Menge an sie verlassendem Wasserdampf. Gleichzeitig sank die relative Feuchtigkeit im Kasten schrittweise. Nach zwei Wochen betrug die relative Feuchtigkeit im Kasten etwa 60%, d. h. die Wasseraktivität der Nematoden betrug folglich 0,6. Bei einer derart niedrigen Wasseraktivität erfolgte kein Mikrobenwachstum. Sämtliche Nematodenbewegung hatte (unter Energieeinsparung) aufgehört. Die Nematoden brauchten während der Lagerung keine Sauerstoffzufuhr. In dieser Stufe konnten die Nematoden ohne weiteres durch Einbringen der getrockneten Nematodenmasse in Wasser wieder zum Leben erweckt werden. Proben der Nematoden/Ton-(schichtartig) -Kombination wurden dann in versiegelten Behältern gelagert. Jeder Behälter enthielt ein Bett aus Attapulgit-Ton einer Wasseraktivität von 0,6 (es wurde der Attapulgit aus dem Trocknungsbett verwendet), das mit Filterpapier und danach mit einer Schicht der eine dazwischenliegende Feuchtigkeit aufweisenden Nematoden bedeckt war. Zwei Monate nach der Lagerung bei 23ºC wurden etwa 90% der Nematoden wieder zum Leben erweckt, nachdem sie zunächst in einer Umgebung einer nahezu 100%igen relativen Feuchtigkeit (ohne freies Wasser) 24 h lang gelagert worden waren.
Der Erfinder der vorliegenden Erfindung hat zur Verwendung in diesem Beispiel der vorliegenden Erfindung einen Lagerungsbehälter entwickelt. Der Behälter besitzt einen Deckel, durch den ein auf seiner Oberseite offenes und an seiner Unterseite geschlossenes poröses Rohr hindurchragt. Das poröse Rohr ist mit einem zentralen Docht umwickelt. Dieser ragt vom Deckel (aus) in den Behälter, jedoch nicht in den Behälterinhalt, hinein. Die Oberseite des porösen Rohrs wird bis zu einem Tag, bevor die Nematoden zum Gebrauch benötigt werden, versiegelt. Danach wird das Siegel entfernt und das poröse Rohr mit Wasser gefüllt. Das Rohr besitzt solche Abmessungen, daß der Docht vollständig gesättigt wird, ohne daß irgendwelches freies Wasser auf die Nematoden heraustropft. Bei gesättigtem Docht steigt die relative Feuchtigkeit im Behälter auf 100% an, wobei die Nematoden sehr langsam hydratisiert werden (dies ist eine Voraussetzung für eine maximale Rückkehr zur Aktivität). Danach können die Nematoden in Wasser eingetropft werden, wobei sie dann innerhalb von Minuten wieder zum Leben erwachen und zur Applikation bereit sind.

Claims

1. Verfahren zur Lagerung infektiöser Jugendformen der dritten Stufe (J3) entomopathogener Nematoden durch Ausbilden eines homogenen Gemischs einer wäßrigen Creme oder Paste sauberer J3 entomopathogener Nematoden mit, bezogen auf das Gemisch, 33 bis 67 Gew.-% Ton.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Mischen durch Verkneten der wäßrigen Nematodencreme mit Tonschnipseln und anschließendes Einstellen der Wasseraktivität des erhaltenen Gemischs bewerkstelligt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, einschließlich einer Stufe, in der die Wasseraktivität des Gemischs während des Vermischens von Ton und Nematodencreme überwacht wird.

4. Verfahren zum Lagern infektiöser Jugendformen der dritten Stufe (J3) entomopathogener Nematoden in folgenden Stufen:

(a) Aufbringen einer dünnen Schicht einer wäßrigen Creme sauberer J3 entomopathogener Nematoden auf eine erste Tonschicht und

(b) anschließendes Bedecken der Nematodenschicht mit einer zweiten Tonschicht.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die erste Tonschicht und die Cremeschicht jeweils eine Dicke von etwa 2 cm aufweisen.

6. Verfahren zur Lagerung infektiöser Jugendformen der dritten Stufe (J3) entomopathogener Nematoden in folgenden Stufen:

(a) Ausbreiten einer Schicht einer wäßrigen Creme sauberer J3 entomopathogener Nematoden auf einer absorbierenden Unterlage;

(b) Aufbringen der absorbierenden Unterlage auf eine Schicht oder ein Bett aus trockenem Ton;

(c) Aufbewahren der Kombination aus Nematodencreme, Unterlage und Ton in einer Umgebung einer relativen Feuchtigkeit von etwa 95% für mindestens drei Tage und

(d) anschließendes Reduzieren der relativen Feuchtigkeit der Umgebung, in der die Kombination über einige Wochen hinweg gelagert wird, bis zum Erreichen eines relativen Feuchtigkeitswerts von etwa 60%.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das absorbierende Substrat aus einer Filterpapierschicht besteht.

8. Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei der Ton vor seinem Einsatz im Rahmen des Verfahrens gemahlen und gesiebt wird.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Ton aus der Gruppe Attapulgit-Tone, Diatomeentone und Kieselgur ausgewählt ist.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei anschließend das Verfahrensprodukt in einem (einer) luft- und wasserundurchlässigen Behälter oder Umhüllung bei einer Temperatur im Bereich von 4ºC bis 28ºC aufbewahrt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Behälter oder die Umhüllung im Falle, daß das Verfahrensprodukt nach einem der Ansprüche 1 bis 9 nicht unter Kühlen gelagert wird, perforiert ist.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nematoden aus der Gruppe entomopathogene Nematoden aus den Familien Steinernematidae und Heterorhabditidae ausgewählt sind.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die maximale Konzentration an ausgewachsenen Nematoden in der wäßrigen Creme von J3 Nematoden 2% beträgt.

14. Behälter zum Lagern von Nematoden, die nach dem Verfahren gemäß Anspruch 6 oder Anspruch 7 oder gemäß Anspruch 8 oder Anspruch 9 in Abhängigkeit von Anspruch 6 oder Anspruch 7 behandelt wurden, umfassend

(a) einen Behälter aus einem im wesentlichen steifen, luft- und wasserundurchlässigen Material mit einem Deckel;

(b) ein sich durch den Deckel und in den Behälter, jedoch nicht in den Behälterbereich, in dem die Nematoden gelagert werden sollen, erstreckendes poröses Rohr mit offenem Ende auf der Behälteraußenseite und geschlossenem Ende im Behälterinneren und

(c) einen den sich im Behälter befindenden Teil des porösen Rohrs umgebenden Docht;

wobei zur Rehydratisierung von im Behälter gelagerten getrockneten Nematoden Wasser in das poröse Rohr gefüllt wird, um den Docht zu sättigen, jedoch nicht auf die Nematoden zu tropfen.

15. Verfahren zum Lagern infektiöser Jugendformen der dritten Stufe (J3) entomopathogener Nematoden durch Zubereiten einer wäßrigen Creme von J3 Nematoden und Inberührungbringen der Creme mit Attapulgit-Ton unter solchen Bedingungen, daß eine schrittweise Absorption von Wasser aus der Creme und den Nematoden stattfindet, um die Nematoden derart auszutrocknen, daß ihre Bewegung ohne wesentliche Sterblichkeit der Nematoden verhindert wird.