CN1088046A - 昆虫致病性线虫的储存方法 - Google Patents
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Abstract
通过将一种线虫水膏和一种高度吸水性材料颗
粒一起混合来有效地长期储存属于斯氏线虫种或异
杆线虫种的感染性三期线虫幼虫。混合物中所含水
分要达到使混合物平衡后具有0.80至0.995(优选
0.95至0.99)范围的水活性。优选的吸收性材料是
颗粒形的平均重量为0.01gm的无水聚丙烯酰胺凝
胶。为了获得线虫的最佳存活率，平衡后的混合物应
当存放于1℃至30℃的温度范围内，在一种保持混合
物水活性在0.8至0.995范围内的空气环境中存
放。
Description
本发明涉及线虫的储存以便于运输或将来的使用。更具体地说涉及到使用具有特定水活性的高度吸收性物质如聚丙烯酰胺凝胶储存和运输属于斯氏线虫（同名：Neoaplectana）和异杆线虫（同名：Chromonema）种的第三期感染性线虫幼虫。
公知斯氏线虫科（Steinernematidae）和异杆线虫科（Heterorhabditide）的昆虫致病性线虫在生物控制许多昆虫害虫方面有相当大的潜能。这些线虫的感染性三期幼虫（J 3）（它们能够在不喂养的情况下于环境中存活许多周）能够寻找到昆虫，穿入昆虫的血腔，并在血腔中释放特定的共生细菌（Xenor habdus种）。这些细菌能在一天左右杀死昆虫，并为线虫的繁殖提供合适的条件。
将饲养有这些线虫的大量体外物质进行固体培养的方法已由RA Bedding在其专利中进行了描述，例如，见美国专利Nos.4178366和4334498的说明书，澳大利亚专利NO.5091879的说明书以及他的论文Nematologioa，Volume 27，109-114页，1981（题目是“low cost in-vitro mass production of Neoaplectana and Heterorhabditis Species（Nematodes）for field control of insect pests”）以及见Annals of Applied Biology Volume 104，117至120页，1984（题目为“Large seale production，storage and transport of the insect-parasitic nematodes Neoaplectana spp andHeterorhabditis spp.”）。对此方法的进一步改进的描述见国际专利申请No.PCT/AU 91/00136，WIPO公开号与为No.Wo 91/15569。线虫也可以是在液体培养中大量产生的物质，如G W Pace等人所述（见WIPO公开号No.86/01074），和M J Friedman，SL Langston and S Pollitt所述（见国际专利申请No.PCT/US 88/04124，其WIPO公开号是No.89/04602）。因此，可以通过几种不同方法产生大量的线虫，为了在商业上使用这些线虫，必须具备有效的方法以储存和运输它们到最终使用者。
R A Bedding在前述的Annals of Applied Biology中的文章中描述了使用聚醚聚氨基甲酸（乙）酯泡沫碎屑作为载体在聚乙烯袋子中储存线虫。尽管这是一种有效的低温储存方式，但是它的缺点是为了长时间的存放线虫，必须给载体强行通气。另外，从泡沫中提出线虫需要1-2小时。
T Yukawa和J M Pitt在国际专利申请No.PCT/AU 85/00020的说明书中描述了一种存放线虫的方法，该方法是将感染性线虫幼虫的膏状物与活性碳粉混合。这样只要在低温下高密度的线虫在厌氧或基本厌氧条件下能存活很长一段时间。Yukawa和Pitt特别强调了活性碳的高度吸附（不同于一般吸收）特性的重要性。但是，他们的方法具有许多不足之处，如下：
（a）这种方法只对Steinernema Carpocapsae种才得到满意结果。
（b）活性碳在操作中极不方便;
（c）活性碳价格昂贵;
（d）如果存放线虫的包装暴露于15℃以上时线虫会在几天内死亡;和
（e）对于存放线虫包装的最大体积和包装中存放线虫的数量有一定的限制。
I popiel，K D Holtemann，I Glazer和C Womersley在国际专利申请No.PCT/US 87/02043（它的WIPO公开号是WO 88/01134）说明书中描述了一种存放方法，该方法利用了一种以前的与许多其它种线虫相关的现象。该现象是当线虫暴露于超过97%的相对湿度几天后，它们的生化组成明显变化，进入一个休眠状态，通常称之为隐生现象（当线虫的表面水份去除后有时不太严格地称之为蛰前脱水）。当线虫处于这种状态时，它们比其它状态下更缓慢地利用它们的食物储存，因此它们可以存活更长的一段时间。Popiel等人发现昆虫致病性线虫和许多其它线虫一样，如果将其保持于大约97%的相对湿度下它们可以滞留于“明显的蛰前脱水状态”。实际上W R Simons和G O Poinar（在一篇论文中，标题是“The Ability of Neoaplectana Carpocapsae（Steinernematidae Nematodea）to Survive Extended Periods of Desiccation”公开于Jounal of Invertebrate Pathology，22卷，228-230页，1973）早已知道如果将感染性 Steinernema Carpocapsae（一种昆虫致病性线虫）的幼虫保持于96%湿度12小时，然后再在94%下保持12小时，它们可以在低湿度下比未经这种方式“处理”的线虫存活的更好。
在前述的WIPO公开号No.Wo 88/01134中，I Popiel等人描述了一种方法，该方法是使一种感染性昆虫致病性线虫幼虫的水悬浮液处于蛰前脱水状态，它有两步，分别是：
（1）通过真空过滤只有1-4mm厚的线虫高密度层除去悬浮液中的大部分表面水份，然后使线虫保持于大约97%的相对湿度下蒸发掉剩余的表面水分;蒸发的效果要达到线虫形成一个特征性网状结构或泡沫，或者使一定数量的微生物达到预定的重量（此重量因所处理的昆虫致病性线虫种类而不同）;和
（2）将线虫暴露于97%±2%的相对湿度下至少两天诱导隐生现象（将线虫网状结构置于一个由硫酸/水混合液控制相对湿度的干燥器中或者使用一种有预定相对湿度的空气循环的环境室中来达到此相对湿度范围）。
在诱导出隐生现象之后，Popiel等人将其线虫存放于相对湿度为50-94%或95-99%的范围中，同时供给足够的氧。对这种湿度的保持（Ⅰ）使用一种已由硫酸钾饱和溶液浸透的纤维基质或水凝胶（它可以保持97%的相对湿度），（Ⅱ）使用一种硝酸钾饱和溶液（它具有94%的相对湿度）或（Ⅲ）使用一种硫酸溶液。优选的方法涉及将所干燥的线虫存放于一个容器中，在该容器中也有一个由疏水性、蒸气可通透性膜（如GORETEX（商标）材料）包装的饱和盐溶液。或者将隐生的线虫存放于不透气和隔湿的容器中，并且有足够的空间以满足存放感染性幼虫的需要。Popiel等人报道说，使用这种方法，Steinernema Carpocapsae，Steinernema feltiae（同名：bibionis）和Heterorhabditis bacteriophora（同名：heliothidis）种的线虫可以存活几个月而不减其感染活性。
Popiel等人的上述方法也具有许多缺点，如下，
1.为了去除多余的水份，需要将一薄层线虫进行真空过滤，然后空气干燥。这需要大的空间和时间。另外，有可能会使线虫过度干燥，尤其是在商业生产条件下。
2.只有薄层的线虫才能暴露于大约97%的相对湿度下。因此同时处理几百公斤线虫的水混悬液是不实际的或需要付出巨大的劳动。为了以这种方式处理大量的线虫，必须使用昂贵的环境室。
3.使用所述的实验室技术保持非常准确的相对湿度，变化小于2%，在商业上是不容易的。
4.在诱导出隐生现象之后，必须从处理位置去除薄层线虫，并存放于容器中储存，且具备精确的储存条件使相对湿度保持接近于，但低于，100%。
5.该方法对于Heterorhabditis种的线虫不适用。
在至少95%的相对湿度下存放昆虫致病性J 3线虫也是昆虫捕获的一个特征（为捕获蟑螂而设计），这在美国专利No.5172514（申请人T Weber，R Georgis，P Pruitt and J Wren;转让给Biosys Corporation）的说明书中有描述。在这些蟑螂捕获方案中，在一种由多糖[如琼脂、糖、角叉菜胶（carragreenan）或西黄蓍胶]制备的水凝胶结构或一种多孔海绵基质、聚氨基甲酸乙酯泡沫或聚醚泡沫中含有线虫，而蟑螂则在含线虫基质表面的相对干燥表面上“眨眼”或“站立并扭动”。通过用一定量的“释放水份凝胶如膨胀的聚丙烯酰胺”包裹基质来保持含线虫基质周围空气的相对湿度值至少为95%。美国专利No.5172514的说明书没有记载有效的捕获期，并且即使暗示了有效捕获期明显地大于7天，但捕获器中的诱铒也不是真正的“储存”线虫的例子，因为线虫仍处于其活动状态能够寄生于蟑螂（相对于为将来使用而储存线虫所需而诱导出的代谢降低的状态而言）。
在美国专利No.5042427（其相应的国际申请号为No.PCT/AU 88/00127）的说明书中，R A Bedding介绍了如何使用粘土（特别是纤维状活性白土）储存昆虫致病性线虫，方法可以是将线虫与粘土（它不是一种高度吸性收材料）形成一种均匀混合物，或者制成在两层粘土中间夹一层线虫膏状物的三明治形状。这种方法（目前商业正在使用）的成功归功于三方面的主要因素，它们是（Ⅰ）限制线虫的活动（因此可以节省食物储存），（Ⅱ）或者，粘土有可能吸收毒性线虫的排泄产物，和（Ⅲ）通过使线虫暴露于低于100%的湿度下，优选是接近于0.97的水活性下，可以将其诱导出隐生状态。用这种方法使用锻烧的纤维状活性白土碎片或粗粉碎的煅烧纤维状活性白土可以储存一定范围的昆虫致病性线虫种类。
尽管它已获得商业的成功，这种方法仍具有某些不足，它们是：
1.在23℃-28℃的温度范围条件下存放2个月之后所有线虫种类的存活率显著降低。
2.当在存放之后将线虫悬浮于水中，以便制备成喷雾播散的剂型时，很难从混悬液中去掉所有的较大粘土颗粒。这些颗粒则会阻塞喷雾。并且较小的粘土颗粒会引起线虫混悬液出现泥水外观。
3.储存线虫产物的一半多重量是粘土;如果使用空运将增加运费。
4.如果“储存”非常大量的线虫，则对储存线虫产品的可通透性厚度有一定的限度，因为尽管线虫大部分已处于隐生状态，并且代谢显著地降低，但在储存产品中仍需要一部分氧气的存在。
本发明目的则是提供一种储存昆虫致病性线虫的方法以便于运输或将来的使用，本方法避免了前面所述方法或为此目的而建议方法的上述主要缺陷，并且这种方法既适用于小量的线虫也适用于为商业目的而制备大量的线虫。
实现本发明目的的方法是，使用高度吸收性（但不是必需是吸收性的）的凝胶，或其它高度吸收性物质，吸收线虫水膏状物中的表面水份，并且完成这过程后，要准确地提供一窄范围的水活性，以适用于诱导线虫的隐生现象且不会影响它们的存活率。
“水活性”定义为RH/100比率，其中RH应当是密封系统中周围空气的相对湿度。
该术语“高度吸收性物质”应当被在吸收材料领域中工作的人员所理解，且要熟悉其分类。在不限制对术语“高度吸收性”的一般理解情况下，本发明的优选高度水吸收性物质是可以吸收至少其本身重重75%的水份的物质，可以获得0.80-0.995范围的水活性。
当实施本发明方法时，将无水或几乎无水的吸附性颗粒优选与一种线虫膏以预定的组成比混合，这样可以实现对表面（游离）水份的吸收，并获得所需的水活性，而不需进一步调整所产生的混合物（例如，加入额外的水）。在一起混合线虫膏和吸收剂之前，可以将杀真菌剂和/或抗生素与线虫膏或与吸收剂混合。
使用高度吸收性物质确信有5方面的优越性。第一，它们可以很快地去除表面水份以使线虫在几分钟内形成“泡沫”。如果使用遇水即膨胀的吸收剂颗粒（如聚丙烯酰胺凝胶），在膨胀颗粒之间会形成大的间隙。这种间隙为线虫形成泡沫和更好的气体分散提供了空间。因此会很快产生一种透气的基质，使得线虫只经历很短一段时间的厌氧状态作用。第二，由于这些吸收剂可从基质的三维方向去除水份，因此可以同时处理大量的线虫，而不需要在过滤圆盘或类似物上制备薄层线虫。第三，通过以适当的配比混合线虫和吸收剂，可以很容易地获得所需的水活性。这就意味着可以很快地开始诱导隐生现象，并通过使线虫的生化组成发生改变而完成，例如，以便使线虫中的甘油和茧蜜糖含量升高和（尤其是对于Heterorhabditis种来说）出现卷曲。第四，该混合物不仅可以诱导线虫的隐生现象，而且它还可以在诱导之后保持水活性处于一个适合于线虫继续储存的数值。第五，使用的吸收剂重量可以显著地少于线虫膏的重量。
用使用高度吸收性物质这种方法储存的线虫可通过将线虫和吸收剂分散于水中使其再复活。但是，使它们最有效地复活的方法是向线虫/吸收剂组合物中加入水使水活性超过0.995但保持低于1.00;然后使线虫/吸收剂组合物放置2-4小时，最后再将线虫和吸收剂分散于另外加入的水中。如果吸收剂颗粒遇水后膨胀（例如，当聚丙烯酰胺凝胶时），那么筛滤掉这些颗粒得到一种感染性线虫幼虫的澄清混悬液是一件简单的事。
因此，根据本发明，一种储存昆虫致病性线虫的三期感染性幼虫（J 3）的方法包括形成一种澄清J 3线虫水浓缩物（膏）和高度吸水性（定义如上）颗粒的混合物，水浓缩物和吸水性材料的配比应当是在平衡之后该混合物的水活性在0.92-0.995范围之内。
优选的混合物水活性是0.92-0.995，最优选是在0.95和0.99之间。该混合物的水活性最终值需要24-72小时建立。
依据特定的吸附剂不同，所产生的混合物可以含有大约15%-75%的吸收剂。在使用特定品种的吸收剂之前，要进行试验以确定它与线虫膏的不同组合而产生的水活性。关于这一点，首先必须标准化线虫膏水含量，这可以通过使每克的清洁感染性线虫幼虫数目对于任何特定线虫种类都是恒定的或使所用线虫膏的粘度标准化而达到此目的。线虫膏的粘性越大，为达到最终吸收剂/线虫混合物的一特定水活性所需的吸收剂用量就越低。用获得最佳诱导隐生现象所需的实际水活性在昆虫致病性线虫种类之间的变化很小。在诱导一段时间之后（通常2-3天），可将线虫与已达到水活性的混合物一起储存，或者通过在最终组合物中进一步加入吸收剂降低该水活性。
已经发现如果用某种特定的吸收剂与J 3昆虫致病性线虫一结合结合，可以获得水活性在0.92和0.995之间，该线虫在较宽范围温度下储存之后其生存期有很大的延长。这种混合物可以存放于温度为1℃的冰箱中或存放于高达30℃的温度之下。而且，在存放之后，线虫可以很容易地被悬浮于水中，简单的方法是将吸收剂/线虫组合物与水混合然后筛滤掉吸收剂。如此获得的线虫混悬剂可以直接应用于土壤或植物，可用喷雾或其它方法，以控制昆虫害虫。
在本发明所测试的各种高度吸附性材料中，可以获得满意结果的是甲基纤维素粉末，聚丙烯酸酯淀粉胶粉末，和无水聚丙烯酰胺凝胶和淀粉的混合物。尽管如此，尤其发现无水聚丙烯酰胺凝胶（PAGS）可获得特别好的结果。优选具有0.005gm至0.02gm单一干颗粒重量的PAG，因为膨胀后的这种颗粒可以提供足够的间隙空间以便于线虫形成泡沫和气体分散。
下面对把线虫如何制备成储存用的线虫和吸收剂组合物的方法以及本发明的实施例作详细的描述。下面的叙述是对附图的解释。
图1是表示聚丙烯酰胺凝胶和水的各种混合物的水活性的图表。
图2是代表Steinernema Carpocapsae种线虫的各种吸收剂/线虫组合物死亡数据的坐标图。
图3是代表不同存放时间后存放样本中线虫（S.Carpocapsae）平均干重的坐标图。
在将与吸收剂组合前对线虫的饲养和处理方式对于它们将来的寿命有重要的影响。产生线虫的优选方法描述于前述的1984 Annals of Applied Biology论文中，作者R A Bedding，并按前述的国际专利申请PCT/AU 91/00136说明书中所述修改。显然，如果线虫经历过不利因素如高温、缺氧、暴露于致病因素或细菌毒素，或机械或化学损伤，它们的寿命会减少。另外，饲养线虫的培养基质量以及饲养方式都会到它们以后的寿命。例如，在液体培养基中饲养的昆虫致病性J 3线虫与在固体培养基中饲养的这种线虫相比经常是液体培养储存效果差（对于Heterorhabditis种尤其是如此）。除了这些因素之外，在存放之前线虫对其内部食物储存的利用应当降至最小，而且很重要的是在加入到吸收剂中时还要使线虫尽可能的清洁，以便（Ⅰ）不激发整个混合物的微生物降解和（Ⅱ）更准确地进一步有效评价线虫膏中的表面水份量（可通过计算每单位重量线虫膏中线虫的数目或测定线虫膏的粘度来评价）。
为了达到本发明的效果，在本发明人所进行的一系列试验中所使用的全部线虫应按R A Bedding，M S Stanfield和G W Crompton在国际专利申请No.PCT/AU 91/00136（WIPO公开号No.WO 91/15569）的说明书中所述方法饲养和提取。但是，该线虫可以在昆虫体内饲养或在液体培养基中饲养，条件是该线虫不带有显著量的培养基残留的外源物质和相对不含有除J 3外的其它期线虫（优选不存在有成熟线虫并且一定不能有超过2%的线虫是成熟的）。
如同在国际专利申请No.PCT/AU 88/00127的说明书所述的，本发明人所饲养的用于试验的昆虫致病性线虫在洗涤之后使之沉淀，并吸去多余的水。然后从沉淀罐中抽吸出沉淀的线虫，使之通过带有布的筛子，此筛子只允许水通过而不允许线虫通过。通过这种方法滤掉水份，并且在排水过程中通过搅拌线虫膏而进一步除去水份。在某些实验中，将布边缘收起并包裹住线虫团块，然后挤压出某些剩余的水份以进一步脱水。依据所采用的线虫种类和线虫内剩余水份含量的不同，所得到的线虫膏每克含有0.5-3.5百万个J 3线虫。对于某些实验，还可以在线虫储存于罐中的时候加入一种或几种不同的抗真菌剂和抗生素并与沉淀的线虫一起混合。因此，在去除掉大部分表面水份之后（并且大部分的抗生素和/或抗真菌剂也被去掉），一部分的抗生素和/或抗真菌剂仍保留下来被储存过程中的吸收剂所吸收。本发明人所使用的抗真菌剂是腐植酸、褐煤屑（含有大约50%腐植酸）、硫黄粉末、硫酸，和硫酸与硫黄粉末的混合物。
通常用于结合线虫和吸收性材料的方法如下：称取吸收剂颗粒并加入到含适当量的线虫中。（通过预先试验确定合适的用量以确定哪种结合配比落入所需的水活性范围内）。然后立即搅拌吸收剂和线虫使之一起混合以致于使吸收剂颗粒均匀地分散于混合物中。
线虫与高度水吸收性颗粒混合物的水活性必须是在0.80至0.995范围之内。如上所述，水活性范围优选是0.92至0.995，最优选的范围是0.95至0.99。如上所述，聚丙烯酰胺凝胶是优选的吸收剂，并且图1表示了为获得该混合物水活性范围在0.95至0.995所需的水与聚丙烯酰胺凝胶的比率。
所需的混合物水活性不是马上获得的。吸收剂颗粒很快地吸收线虫膏游离表面水份，然后再吸收由线虫内释放出的水份。因此，当游离表面水分被首先吸收后，该吸收性材料的水活性比其最终值要低，该最终值要在24至72小时之后获得。在线虫膏和聚丙烯酰胺凝胶颗粒的一种典型混合物中，混合开始后第一个四小时的凝胶颗粒水活性是0.92。然后在混合后8小时水活性增加至0.94，但是直到线虫膏和吸收剂颗粒混合后24小时才获得（所需）的值0.97。
在将线虫膏和一定量的无水聚丙酰胺凝胶颗粒一起混合之后，本发明采取的一般步骤是将混合物在15℃至23℃的温度范围放置过夜，并且放置时应允许通气但要降低蒸发。有时将混合物放入容器中并用铝箔或“Gladwrap”（商标）覆盖可达到这一目的。这种过夜存放一段时间后，将吸收剂颗粒（现在已遇水膨胀）和线虫混合物的样本置于各种不同存放容器中，每个容器的条件应当是允许容器的内外部进行气体交换（同时要使水份损失降低到最小），以至于在容器内不产生厌氧条件。
在一系列实验中可以使用各种不同容器。某些具有阳性通风设施（例如，在容器上有一系列孔）。但是，大部分容器带有一种可通气材料的膜，或包括一个由该材料制成的阻板。
在某些实验中，该容器装入线虫和吸收剂材料的混合物样本之后立即存放于较宽的实验存放温度范围下。而在另一些实验中，先将容器存放于15℃三天，然后再存放于较宽的存放温度范围下。在所有的实验中，较宽的储存温度范围要达到这样效果，使吸收剂/线虫组合物的水活性值保持在0.80至0.99范围内。
前面已广义地描述用于实施本发明的技术，下面将以说明的方式进一步描述本发明人进行试验的特定实施例。
实施例1
将从六个培养容器室（如前述WIPO公开号No.WO 91/15569所述类型）中产生的并按上述处理的含4千克线虫膏（其中线虫膏包含大约6436百万个J 3 Steinernema carpocapsac Agriotos株的线虫，1.609百万/克）的样本尽可能挤除掉所含水份。挤过的线虫膏应当具有一定的粘度以致于当将其置于一个4cm不封底的试管中直立时，在两分钟之内它不会滴出该试管。（向这种线虫膏中加入甚至小量的水份都可以降低其粘度以致于线虫会在几秒内容易地流出试管），使用挤过的线虫膏可以测定用过筛的聚丙烯酰胺凝胶结晶（该结晶平均大小为0.01gm）和这种线虫的不同组合物可获得多大的水活性，以及如果将这种组合物存放于23℃这种水活性会如何影响线虫的死亡率。
根据前面的预试验，将线虫膏分成7批，并以下述的重量比与PAGs组合：
批号 线虫膏 PAG结晶
比例 比例
1 3 1
2 3.5 1
3 4 1
4 4.5 1
5 5 1
6 5.5 1
7 6 1
然后将每种凝胶结晶与线虫膏组合物的样本加入250ml塑料食品容器中，在容器上边缘穿5个孔，每个孔的直径大约2mm。容器上面盖上盖子。对每个容器中的混合物重量要进行选择使每个容器中储存的样本含有大约110百万个线虫。并且还要将吸收剂颗粒和线虫混合物的较小样本存放于更多数量的小聚丙烯容器中，每个容器直径40mm，高20mm，并有可滑动的盖子以允许在盖和容器边缘之间通入部分气体。然后将较大和较小容器都存放于23℃。
在间隔一周后，将含每种线虫/凝胶组合物的三个小容器的全部内容物洗出。另外，从较大容器中称取样本。计算每个小容器和大容器样本中活线虫和死线虫的总数目。这种观察的结果表示于图2的图表中。
如从图2中可以看出的，线虫：凝胶的配比为3∶1，3.5∶1和4∶1时，6周后的死亡率显著低于20%，而线虫和凝胶颗粒的其它配比时线虫死亡率迅速升高。
在允许活线虫通过组织移动以后以及，使用提取的线虫样本建立储存后的活线虫平均干重。在这种实验中测量得到的各种储存线虫样本中活线虫平均干重的结果记录于图3。应当指出的是2周之后线虫的平均重量明显增加。这可能是因为首先死亡的线虫是最小的线虫。但是，在线虫膏：凝胶比为3∶1，3.5∶1和4∶1存放时这些线虫的干重降低不大，这表明，在这些配比下存放的线虫内食物储存剩余更多。
实施例2
在进行预试验确定最适合于存放Heterorhabditis bacteriophora（同名heliothidis）的水活性范围之后，用一定范围的防腐剂、抗真菌和抗生素测试不同批的这种线虫。在一系列这种实验中，对不含防腐剂的对照样进行测试，使用的方法描述如下。
按照实施例1制备和处理线虫，但不同的是在饲养培养基中增加10%脂肪。将几批200gm至500gm的线虫水膏样本与过筛的PAG颗粒（平均颗粒重量0.01gm）相结合。线虫膏中的表面水份不象实施例1中容易标准化，因为Heterorhabditis bacteriophora膏比Steinernema carpocapsae更容易损失水份。因此，对H.bacteriophora线虫标准化的方法是制备一层厚线虫膏，然后将其溶于水中，使得每克含有大约2.5百万个感染性三期线虫幼虫。按照实施例1将这种稀释的线虫膏与聚丙烯酰胺凝胶颗粒结合。
然后将全部的线虫和凝胶组合物存放于与实施例1中所用较小容器相同尺寸的容器中，每个容器含有大约8gm的组合物样本。然后将该容器置于拉链封口的聚乙烯袋中，袋中含有几克水和聚丙烯酰胺凝胶的混合物（100∶1）。这样可在每个袋子中有一部分游离水，使得每个袋子中的空气相对湿度可能达到100%。发明人强调不管袋子中的可能相对湿度是100%，聚丙烯酰胺凝胶和线虫组合物的水活性能保持在大约0.97。这说明组合物中的凝胶颗粒充当线虫和外部空气之间的一种缓冲剂。
然后聚乙烯袋子保持在23℃。每周对储存容器检查，只要它们相关的处理能提供有用的信息即可。（由于螨虫感染导致某些实施被放弃，尽管感染样本中的线虫仍然处于良好状态也不能进行）。这一系列实施的结果概括于下面的表1中。
＊正在进行的实验。
在这些实施例和发明人进行的其它实验工作中，用本发明的储存方法已成功地测试了有代表性的两种昆虫致病性线虫Steinernema（同名Neoaplectana）和Heterorhabditis（同名Chromonema）。所测试的所有种类的昆虫致病性线虫证示均可以进行这种方式的储存。因此，由于这些种属于两个不同的线虫科（Steinernematidae和Heterorhabditidae）并且包括这里发现的所有种，似乎可以合理地认为所有这些线虫都可以根据本发明进行储存。
显然本发明的方法非常适用于商业上大批量生产昆虫致病性线虫。
Claims (21)
1、一种储存昆虫致病性线虫的三期感染性幼虫(J3)的方法包括使一种清洁J3昆虫致病性线虫的水浓缩物，和一种高度吸水性物质形成一种混合物，水浓缩物和吸水性物质的比例应当能使该混合物平衡后具有0.88至0.995范围的水活性。
2、权利要求1定义的一种方法，其中该混合物的水活性是在0.92至0.995范围内。
3、权利要求1定义的一种方法，其中该混合物的水活性是在0.95至0.99范围内。
4、权利要求1、2或3定义的一种方法，其中所说的高度吸水性物质是一种能吸收至少其本身重量之75%的水分并具有0.80至0.995范围水活性的物质。
5、一种如权利要求1、2或3所定义的方法，其中高度吸水性物质是无水聚丙烯酰胺凝胶。
6、一种如权利要求5所定义的方法，其中的聚丙烯酰胺凝胶颗粒具有大约0.01gm的平均重量。
7、一种如权利要求1、2或3所定义的方法，其中高度吸水性物质选自下列一组成份：无水聚丙烯酰胺凝胶，甲基纤维素粉末，聚丙烯酸酯淀粉胶颗粒，和无水聚丙烯酰胺凝胶与淀粉的混合物。
8、一种如前面任何权利要求所定义的方法，包括加入一种抗真菌剂。
9、一种如权利要求8所定义的方法，其中的抗真菌剂选自下列一组成份：
（a）腐植酸;
（b）褐煤屑;
（c）硫黄粉末;
（d）硫酸;和
（e）硫酸和硫黄粉末的混合物。
10、一种如前面任何权利要求所定义的方法，包括向混合物中加入一种抗生素。
11、一种如前面任何权利要求所定义的方法，包括将混合物置于容器中的步骤，所说的容器具备通风设施，允许在容器的内外部之间有空气流通。
12、一种如权利要求11定义的方法，其中的通风设施包括在所说容器中穿孔。
13、一种如权利要求11定义的方法，其中的通风设施包括一种透气性材料的膜或隔板。
14、一种如前面任何权利要求所定义的方法，进一步包括保持所说混合物水活性值在0.80至0.99范围内的步骤。
15、一种如权利要求14定义的方法，其中的步骤中所说混合物的水活性值是保持在0.90至0.99范围内。
16、一种如权利要求11、12或13所定义的方法，其中所说吸收性材料是聚丙烯酰胺凝胶，包括将所说容器置于一种与游离水接触的空气中。
17、一种如权利要求16定义的方法，其中所说的与游离水接触空气是在第二容器的内部，在第二个容器中还包括一定量的聚丙烯酰胺凝胶和水的混合物，这种混合物具有1.00的基本水活性。
18、一种如权利要求11至17中的任何之一所定义的方法，其中所说的混合物存放在1℃至30℃范围内的温度下。
19、一种如权利要求18所定义的方法，其中所说的存放温度是20℃至28℃的温度范围。
20、一种如前面任何权利要求所定义的方法，其中的昆虫致病性线虫是斯氏线虫（Steinernema）种，异杆线虫（Heterorhabditis）种，或属于斯氏线虫科和异杆线虫科的其它线虫。
21、一种如权利要求1所定义的方法，基本上如以前所描述。
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