CN113080186B - 一种扩散型3龄松材线虫的低温保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及线虫保存技术领域，具体涉及一种扩散型3龄松材线虫的低温保存方法。本发明提供的扩散型3龄松材线虫的低温保存方法包括采用氯化钾溶液处理扩散型3龄松材线虫，再进行低温保存的步骤。本发明针对扩散型3龄松材线虫提供适宜的低温保存方法，该方法先对扩散型3龄松材线虫进行渗透脱水处理，再进行低温保存，显著提高了扩散型3龄松材线虫在低温保存过程中的存活率；经低温保存的扩散型3龄松材线虫只需经过复水处理即可复活，经过常规培养后即可转化为繁殖型松材线虫。该保存方法不需要使用冷冻保护剂，不依赖复杂的程序性降温方法，具有操作简单、成本低廉的优势，适于推广应用。

Description

一种扩散型3龄松材线虫的低温保存方法
技术领域
本发明涉及线虫保存技术领域，具体涉及一种扩散型3龄松材线虫的低温保存方法。
背景技术
松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)属于线虫动物门、线虫纲、滑刃目、滑刃科、伞滑刃属，可引起松树枯萎病(Pine Wilt Disease)。松树枯萎病是最具危险性的森林病害之一。随着气温降低，松树体内温度随之降低，新陈代谢速率开始减慢，同时体内的松材线虫由繁殖型幼虫向扩散型3龄幼虫转化。扩散型3龄松材线虫是松材线虫抵抗不利环境形成的虫态，也是松材线虫生活史的幼虫阶段之一。
线虫在极端环境条件下可进行休眠，线虫休眠的意义是抵抗低温等极端环境，延长生命周期。多种线虫在渗透压胁迫条件下可进入脱水休眠状态，有线虫休眠超过3万年的记录。脱水休眠过程是指线虫通过逐渐脱水进入隐生状态，此状态运动停止，新陈代谢降低，生命周期处于暂停阶段。在适宜条件下脱水休眠的线虫可通过复水重新恢复活力。
目前报道的松材线虫的保存方法均需使用冷冻保护剂，且多针对繁殖型松材线虫。繁殖型松材线虫是松材线虫在正常环境中的幼虫形态，与扩散型3龄松材线虫存在较大差异。专利申请CN 102428909 A公开了一种松材线虫的冷冻保存及解冻方法，该方法先对松材线虫悬液进行预处理在将处理后的松材线虫悬液中加入冷冻保护剂，进行平衡处理，然后将平衡处理后的松材线虫悬液进行程序化降温后冷冻保存。
发明内容
本发明的目的是提供一种扩散型3龄松材线虫的低温保存方法，利用该方法进行扩散型3龄松材线虫的低温保存能够显著提高扩散型3龄松材线虫的存活率。
本发明以扩散型3龄松材线虫为研究对象，通过对含有扩散型3龄松材线虫的油松木段进行分析，发现在寄主体内的扩散型3龄松材线虫能够长期在-20℃低温条件下保证较高的存活率。然而，扩散型3龄松材线虫离开寄主后，其在低温条件下的存活率明显降低。本发明发现利用渗透调节可以使得扩散型3龄松材线虫进入隐生状态，进一步根据冬季松树体内温度、水分和无机盐离子的变化规律设计低温胁迫实验，发现人工渗透调节使得扩散型3龄松材线虫进入隐生状态后，可在-20℃环境中显著提高其存活率，基于此，本申请开发了能够显著提高扩散型3龄松材线虫的存活率的脱水休眠低温保存方法。
具体地，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种扩散型3龄松材线虫的低温保存方法，该方法包括采用氯化钾溶液处理扩散型3龄松材线虫，再进行低温保存的步骤。
本发明对渗透调节物质进行了大量的筛选，意外地发现，与其他溶液相比，利用氯化钾溶液处理扩散型3龄松材线虫，能够显著提高扩散型3龄松材线虫的低温保存存活率。
本发明对氯化钾溶液的浓度进行了筛选，发现采用特定浓度的氯化钾溶液更有利于提高扩散型3龄松材线虫的低温保存存活率。
优选地，所述氯化钾溶液的浓度≤8％。
进一步优选地，所述氯化钾溶液的浓度为3-8％。更优选的氯化钾浓度为6-8％。
作为本发明的最优选实施方式，所述氯化钾溶液的浓度为8％。
具体地，所述处理为将所述扩散型3龄松材线虫置于所述氯化钾溶液中浸泡4-6h。本发明发现，过长或过短的氯化钾溶液处理时间都会对扩散型3龄松材线虫的低温保存存活率产生不利影响，将处理时间控制在上述范围内能够显著提高低温保存的存活率。
优选地，所述浸泡为在18-25℃条件下进行。
优选地，所述处理为将所述扩散型3龄松材线虫置于所述氯化钾溶液中浸泡4.5-5.5h。
经上述浸泡处理的扩散型3龄松材线虫可直接置于低温进行保存。
经上述渗透脱水处理的扩散型3龄松材线虫优选的保存温度为-10℃至-30℃。
进一步优选地，所述低温保存的保存温度为-18℃至-20℃。
作为本发明的最优选实施方式，所述低温保存的温度为-20℃。以上所述的方法中，在氯化钾溶液处理前，优选先将扩散型3龄松材线虫置于水中。
本发明所述的扩散型3龄松材线虫的低温保存方法还包括将低温保存的扩散型3龄松材线虫置于水中复活的步骤。本发明发现，利用本发明所述的低温保存方法进行低温保存的扩散型3龄松材线虫只需经过复水处理即可复活重新恢复活力，经过常规培养后即可转化为繁殖型松材线虫。
本发明的有益效果在于：本发明发现了扩散型3龄松材线虫能够在不利环境中进行脱水休眠进入隐生状态并在环境好转后通过复水重新恢复活力。本发明针对扩散型3龄松材线虫提供适宜的低温保存方法，该方法先对扩散型3龄松材线虫进行渗透脱水处理，再进行低温保存，显著提高了扩散型3龄松材线虫在低温保存过程中的存活率；经低温保存的扩散型3龄松材线虫只需经过复水处理即可复活，经过常规培养后即可转化为繁殖型松材线虫。该保存方法不需要使用冷冻保护剂，不依赖复杂的程序性降温方法，具有操作简单、成本低廉的优势，适于推广应用。
附图说明
图1为本发明实验例1中低温条件下油松木段中保存的扩散型3龄松材线虫的存活率分析。
图2为本发明实验例2中各实施例和对比例的低温保存方法的扩散型3龄松材线虫的存活率分析，其中，15％KCl、KCl、甘油、海藻糖、蔗糖分别代表对比例4、实施例1、对比例1、对比例2和对比例3的方法。
图3为本发明实验例3中扩散型3龄松材线虫的脱水过程分析，其中，A、B、C、D、E和F分别为脱水过程不同阶段的扩散型3龄松材线虫显微镜观察图片。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1扩散型3龄松材线虫的低温保存方法(1)
本实施例提供一种扩散型3龄松材线虫的低温保存方法，具体如下：取500μl的8％KCl溶液滴在凹形载玻片中，挑取300头扩散型3龄松材线虫从蒸馏水中转移到凹形载玻片的溶液中，处理5h。随着水分的蒸发，溶液中渗透压逐渐增大，扩散型3龄松材线虫逐渐失水，直到停止活动。将失水后的扩散型3龄松材线虫放入-20℃恒温环境中保存，在室温环境下向凹形载玻片中滴入500μl蒸馏水进行复水。
实施例2扩散型3龄松材线虫的低温保存方法(2)
本实施例提供一种扩散型3龄松材线虫的低温保存方法，具体如下：取500μl的6％KCl溶液滴在凹形载玻片中，挑取300头扩散型3龄松材线虫从蒸馏水中转移到凹形载玻片的溶液中，处理5h。随着水分的蒸发，溶液中渗透压逐渐增大，扩散型3龄松材线虫逐渐失水，直到停止活动。将失水后的扩散型3龄松材线虫放入-20℃恒温环境中保存，在室温环境下向凹形载玻片中滴入500μl蒸馏水进行复水。
对比例1
本对比例提供一种扩散型3龄松材线虫的低温保存方法，该方法与实施例2的方法的区别仅在于：将8％KCl溶液替换为8％甘油溶液。
对比例2
本对比例提供一种扩散型3龄松材线虫的低温保存方法，该方法与实施例2的方法的区别仅在于：将8％KCl溶液替换为8％海藻糖溶液。
对比例3
本对比例提供一种扩散型3龄松材线虫的低温保存方法，该方法与实施例2的方法的区别仅在于：将8％KCl溶液替换为8％蔗糖溶液。
对比例4
本对比例提供一种扩散型3龄松材线虫的低温保存方法，该方法与实施例2的方法的区别仅在于：将8％KCl溶液替换为15％KCl溶液。
实验例1低温条件下油松木段中保存的扩散型3龄松材线虫的存活率分析
选取1个油松疫木圆盘，采用贝尔曼漏斗法对疫木圆盘内的松材线虫进行分离，确定松材线虫在木段内的初始密度。将该圆盘分为5块，以报纸包裹上述疫木圆盘放入不同温度的冰箱内(-20℃、-30℃、-40℃、-70℃、-80℃)进行低温处理，分别于30d、60d、90d后对不同温度处理下的疫木木块进行松材线虫分离，确定低温处理后木块中松材线虫的密度，用低温处理后的松材线虫密度除以初始密度，计算松材线虫的存活率。本实验重复5次。
结果如图1所示。在对油松木段进行处理前，确定疫木圆盘中扩散型3龄松材线虫的密度为641头/g。将含松材线虫的疫木进行不同温度(-20℃、-30℃、-40℃、-70℃、-80℃)处理30、60、90天后，进行线虫分离后发现，30d后油松内松材线虫在不同温度处理下的密度为527±53.8、257.6±32.6、163.46±46.7、12.3±6.8、11.08±3.6头/g。60d后油松内松材线虫的密度为252±36.8、43.7±23.6、27.4±12.7、4.47±2.6、22.57±7.8头/g。90d后油松内松材线虫的密度为56±7.6、12.4±5.6、3.2±1.2、2.4±1.5、1.3±0.8头/g。统计松材线虫在不同温度处理下的存活率。在-20℃处理30d后，松材线虫的存活率为82.2％。随着处理温度的降低和处理时间的延长，松材线虫的存活率逐渐下降。在-80℃，依然会有线虫存活，30d后存活率为1.7％。以上实验结果表明，在寄主体内的扩散型3龄松材线虫可长期抵抗-20℃低温，少数松材线虫可在-80℃条件下存活。
实验例2各低温保存方法的扩散型3龄松材线虫存活率分析
分别利用实施例1、2和对比例1-4的方法对扩散型3龄松材线虫进行低温保存，分析经低温保存后的扩散型3龄松材线虫的的存活率，具体如下：将在-20℃恒温环境中保存24h的扩散型3龄松材线虫取出，在室温环境下向凹形载玻片中滴入500μl蒸馏水并密封在直径为12cm的培养皿中，24h后统计扩散型3龄松材线虫的存活率。本实验重复5次。以不添加任何渗透调节物质、仅添加蒸馏水的处理组作为对照。
实施例1和对比例1-4的实验结果如图2所示，结果表明，仅添加蒸馏水的处理组经低温保存后，扩散型3龄松材线虫的存活率为0；不同渗透调节物质的溶液浸泡扩散型3龄松材线虫后经低温保存，在浓度为8％的KCl溶液(实施例1)、15％KCl溶液(对比例4)和8％甘油溶液(对比例1)中，随着水分蒸发可使扩散型3龄松材线虫失水，失水后的扩散型3龄松材线虫存活率显著提高，其中利用8％的KCl溶液处理扩散型3龄松材线虫的实施例1的方法的存活率显著高于各对比例，其存活率平均统计结果为92.1％。以上结果说明实施例1的方法能够使松材线虫脱水并显著提高其在低温条件下的存活率。实施例2的实验结果与实施例1相当。
本发明还进行了-20℃恒温环境中保存更长时间的试验，结果表明，按照实施例1和2的方法处理扩散型3龄松材线虫，可在-20℃短期保存(小于3个月)过程中保证较高的存活率，表明该方法适于扩散型3龄松材线虫的短期低温保存。
实验例3扩散型3龄松材线虫脱水休眠过程分析
配制浓度为8％的KCl溶液，用移液枪吸取500μl上述溶液滴在凹形载玻片中，挑取约300头扩散型3龄松材线虫从蒸馏水中转移到凹形载玻片的溶液中。随着水分的蒸发，溶液中渗透压逐渐增大并有晶体稀出，扩散型3龄松材线虫逐渐失水并停止活动，此过程约5h。利用显微镜观察松材线虫失水过程并拍照记录。在室温环境下向凹形载玻片中滴入500μl蒸馏水，利用显微镜观察松材线虫复水过程并拍照记录。
结果如图3所示，随着水分的蒸发，首先可以观察到松材线虫具有明显的“卷曲”现象(图3的B、C)，同时可以自由活动；待全部水分蒸发结束，可观察到KCl晶体稀出，扩散型3龄松材线虫表现为运动停止，群体聚集(图3的D)，进一步观察会发现其身体萎缩，体表凹陷，脂肪粒聚集(图3的E、F)；在此状态下将扩散型3龄松材线虫进行低温处理后，在其周围环境中增加蒸馏水，可观察到复水现象，并重新恢复活力(图3的A)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (3)

1.一种扩散型3龄松材线虫的低温保存方法，其特征在于，包括采用氯化钾溶液处理扩散型3龄松材线虫，再进行低温保存的步骤；将低温保存的扩散型3龄松材线虫置于水中复活；
所述氯化钾溶液的浓度为6-8％；
所述处理为将所述扩散型3龄松材线虫置于所述氯化钾溶液中在18-25℃条件下浸泡4-6h；
所述低温保存的保存温度为-18℃至-20℃。
2.根据权利要求1所述的扩散型3龄松材线虫的低温保存方法，其特征在于，所述处理为将所述扩散型3龄松材线虫置于所述氯化钾溶液中浸泡4.5-5.5h。
3.根据权利要求1或2所述的扩散型3龄松材线虫的低温保存方法，其特征在于，在氯化钾溶液处理前，先将扩散型3龄松材线虫置于水中。
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