DE3872561T2

DE3872561T2 - Stabilisierung von beta-galactosidase peptide-fragmente.

Info

Publication number: DE3872561T2
Application number: DE8888303042T
Authority: DE
Inventors: Robert Dworschack; Pyare L Khanna; Phillip Ruprecht
Original assignee: Microgenics Corp
Current assignee: Roche Diagnostics Corp
Priority date: 1987-04-06
Filing date: 1988-04-06
Publication date: 1992-12-24
Anticipated expiration: 2008-04-07
Also published as: JPH069510B2; GR3005798T3; JPS6485081A; AU1417488A; ATE78061T1; EP0286367B1; DE3872561D1; US4956274A; EP0286367A2; EP0286367A3; AU609112B2; CA1307220C; ES2051838T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Techniken und Zusammensetzungen, die zum Stabilisieren von Reagenzien nützlich sind, welche bei spezifischen Bindungsassays wie Immunassays eingesetzt werden, die Enzymkomplementierung verwenden, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen.
In letzter Zeit sind eine Anzahl von Immunassays und anderer Bindungsassays beschrieben worden, welche die Reassoziierung von Polypeptidfragmenten zur Bildung aktiver Enzyme als einen Schritt zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals einsetzen, das eingesetzt wird, um die Menge an in einer Assaymischung vorhandenem Analyt festzustellen. Mehrere dieser Assays schlagen die Verwendung des Enzyms β-Galactosidase als das Enzym vor, das durch Komplementierung gebildet wird.
Jedoch ist entdeckt worden, daß die Stabilität von Reagenzien, die auf Fragmenten von β-Galactosidase basieren, nicht dem erwünschten Ausmaß entspricht. Es gibt mit zunehmender Lagerungszeit der Fragmente einen allmählichen aber beständigen und bedeutsamen Aktivitätsverlust des neugebildeten Enzyms.
Demgemäß bleibt eine Notwendigkeit zur Stabilisierung von Reagenzien, die zu Enzymkomplementierungsassays auf der Basis des Enzyms β-Galactosidase eingesetzt werden.
Ein Immunassaysystem auf der Basis der Reassoziierung von Polypeptidfragmenten wird von Farina und Golkey, US-PS 4378428 vom 20. März 1983 und von Gonelli et al., Biochem.and Biophys.Res.Commun. (1981) 102:917-923 beschrieben. Die molekulare Natur von β-Galactosidase- α-Komplementierung wird in einer Dissertation dieses Titels von Langley, UCLA, 1975 beschrieben. Ein Assaysystem auf der Basis van natürlichen und modifizierten β-Galactosidasepolypeptiden in einem Komplementierungsassay wird in der PCT-Anmeldung Nr. PCT/US85/02095 mit dem internationalen Veröffentlichungsdatum 9. Mai 1986 beschrieben.
Die GB-2081295 diskutiert den Einsatz nichtionischer und anionischer Tenside in Präparaten mit wässeriger Protease und Amylaseenzym, um das funktionelle Enzym zu stabilisieren. Diese Tenside sind nützlich bei der Reinigung von Zusammensetzungen, welche diese Enzyme enthalten.
Die vorliegende Erfindung schafft Techniken und Zusammensetzungen zum Stabilisieren von Peptidfragmenten aus β-Galactosidase, die zur Verwendung in einem α-Komplementierungsassay hergestellt ist. Das Peptidfragment wird in einer Lösung stabilisiert, die ein ionisches Tensid oder ein vom einem Zuckerrest abgeleitetes Tensid enthält. Da die Gegenwart von Tensid im allgemeinen mit der Komplementierung des Enzymemakzeptors und Enzymdonors nicht kompatibel ist, muß überschüssiges Tensid neutralisiert bzw. unwirksam gemacht oder entfernt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden ausgewählte Tenside mit einem Cyclodextrin neutralisiert.
Die vorliegende Erfindung schafft Zusammensetzungen, in denen β-Galactosidasepeptidfragmente, besonders aus dem α-Bereich des Enzyms, gegen Aktivitätsverlust während lagerungsbedingtem Abbau stabilisiert werden. Es ist entdeckt worden, daß die Verwendung eines ionischen Tensids im Fragment-Lagerungsmedium den Abbau verringert, der normalerweise während der Lagerung auftritt. Wenn ein Cyclodextrin dem Lagerungs- oder Assaymedium nach der Lagerung, aber vor der Durchführung des Komplementierungsassays hinzugefügt wird, werden schädliche Wirkungen des Tensids auf das Neubilden des aktiven Enzyms vermieden. Ähnliche verbesserte Ergebnisse können durch die Durchführung des Komplementierungsassays in der Gegenwart einer relativ hohen Serumskonzentration erreicht werden, wobei die Serumproteine die gewünschte Neutralisierung des Detergens bieten.
Die vorliegende Erfindung entstand aus Untersuchungen mit Komplementierungsassays unter Verwendung von β-Galactosidase. Es wurde entdeckt, daß die Lagerung von im Komplementierungsassay eingesetzten Peptidfragmenten zu einem Aktivitätsverlust des neugebildeten Enzyms mit einer Rate von 6-10% pro Tag führte. Durch Hinzufügen von, zum Beispiel einem ionischen Tensid zum Lagerungsmedium wurden die täglichen Aktivitätsverluste auf weniger als 1%, oft weniger als 0,5% verringert. Obwohl der Einsatz eines Tensids die Neubildung des aktiven Enzyms in einem gewissen Maß störte, konnte den nachteiligen Auswirkungen des Tensids durch Einbeziehen einer relativ hohen Serumskonzentration, vorzugsweise zumindest 10%, in der Komplementierungsreaktionslösung oder durch Einbeziehen eines Cyclodextrins zum Einschließen und dadurch Entfernen des Tensids entgegengewirkt werden.
Bei mehreren Klassen von ionischen Tensiden und aus Zuckerresten abgeleiteten Tensiden ist herausgefunden worden, daß sie höhere Lagerungsstabilität bieten. Diese umfassen Fettsulfonate, Fettsäureamide von Aminosäuren, Fettsäureester von Zuckern oder Zuckersäureamiden, und sulfonathältige Derivate von Cholsäureamiden. Der fettige (d.h. Kohlenwasserstoff-) Anteil dieser Moleküle ist vorzugsweise von einer gesättigten Fettsäure abgeleitet, die zumindest 10, aber nicht mehr als 22 Kohlenstoffatome aufweist, mehr vorzuziehen im Bereich von 12-18 Kohlenstoffatomen. Der Aminosäureanteil ist vorzugsweise eine nicht-polare, genetisch kodierte Aminosäure, mit der der Fettsäureanteil über eine Amidbindung zwischen der funktionellen Carboxylsäuregruppe der Fettsäure und der funktionellen Aminogruppe der Aminosäure verbunden ist. Der resultierende Amidstickstoff kann wahlweise alkyliert sein, vorzugsweise mit einer Methylgruppe. Ein besonders nützliches Fettsäureamid einer Aminosäure ist N-Lauroylsarcosin(N-dodecanoyl-N-methylglycin).
Wenn eine Fettsäure einen Ester mit einem Zucker oder Zuckersäureamid bildet, werden die gleichen Fettsäuren bevorzugt, wie für Fettsäureamide von Aminosäuren. Der Zuckeranteil ist vorzugsweise von einer Aldose oder einem Aldonsäureamid abgeleitet, wobei er in beiden Fällen vorzugsweise von Glukose, Mannose, Galactose oder den entsprechenden Aldonsäuren abgeleitet ist. Spezifische Beispiele umfassen Decanoyl-N-methylgluconamid.
Sulfonathältige Derivate von Cholsäureamiden weisen vorzugsweise eine Sulfonatgruppe auf, die durch eine verbindende organische Gruppe entweder mit dem Amidstickstoff eines Cholsäureamids oder der 3-α-Hydroxy-Position einer Cholsäureverbindung verbunden ist. Bevorzugt werden C2-C5 N-Sulfonalkyl-Derivate von Cholamid und N-Sulfonalkyl-Derivate von Aminoalkyläthern, die mit dem 3-α-Hydroxy von Cholamid verbunden sind. In beiden Fällen können die Amid- oder Aminostickstoffe durch Nieder-Alkylgruppen alkyliert sein. Im Fall der sulfonalkylierten Amine kann die Aminogruppe quarternär sein, um ein zwitterionisches Tensid zu bilden. Spezifische Beispiele umfassen 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat,3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propansulfonat und Taurodeoxycholsäure. Die ersten beiden dieser Cholsäurederivate sind unter den Bezeichnungen CHAPS und CHAPSO im Handel erhältlich. Taurodeoxycholsäure ist oft unter der Abkürzung TDA bekannt.
Es ist festgestellt worden, daß Tenside die Stabilität von β-Galactosidasepeptidfragmenten und ihren Konjugaten, insbesondere das Spenderfragment aus dem in Komplementierungsassays eingesetzten -Bereich, im Verhältnis zu ihrer relativen Konzentration erhöhen. Selbst äußerst geringe Mengen an Tensiden führen zu einer kleinen Zunahme der Lagerungsstabilität. Da die Stabilisierungswirkung mit verschiedenen Tensiden etwas variiert, kann die Menge die notwendig ist, um die Stabilität auf ein annehmbares Maß zu erhöhen, ganz leicht durch einen einfachen Versuch bestimmt werden, bei dem verschiedene Mengen an Tensid einer Peptidfragmentlösung hinzugefügt werden. Aliquote werden in zeitlichen Abständen entfernt, das Enzym wird rekonstituiert, und die Aktivität des entstehenden rekonstituierten Enzyms wird mit dem Anfangswert einer Kontrollprobe verglichen, die eingesetzt wird, um den Wert für 100 % Enzymaktivität zu bestimmen.
Da Tenside die Abbauprozesse verlangsamen, aber nicht notwendigerweise alle Abbauprozesse stoppen, geht weiterhin einige Enzymaktivität verloren, auch wenn ein Tensid eingesetzt wird, um die Peptidfragmentlösungen zu stabilisieren. Jedoch ist es im allgemeinen möglich, ausreichende Stabilisierung zu erreichen, um ein rekonstituiertes Enzym mit 90% der ursprünglichen Aktivität nach sechswöchiger Lagerung unter Einsatz irgendeines der bevorzugten oben besprochenen Tensidtypen zu schaffen. Ohne Tenside bieten β-Galactosidasepeptidfragmente aus dem α-Bereich, die sechs Wochen gelagert und rekonstituiert wurden, um ein aktives Enzym zu bilden, nur etwa 25-35% der Aktivität von rekonstituiertem Enzym, das ohne Lagerung erzeugt wurde.
Beim Einsatz eines Fettsäureamids einer Aminosäure können Tensidkonzentrationen von 0,03 bis 0,4%, vorzugsweise von 0,06 bis 0,18% als Anfangskonzentrationen eingesetzt und nach oben oder unten angeglichen werden, sollte eine derartige Angleichung unter der Gesamtheit der Umstände notwendig sein. Diese und alle anderen prozentuellen Konzentrationen sind, wenn nicht anders angegeben, hierin in Gewicht/Volumen (g/v) ausgedrückt. Bei Verwendung eines Fettsäureesters eines Zuckers oder Zuckersäureamids liegen die entsprechenden Konzentrationen von 0,15 bis 1,5%, vorzugweise von 1,0 bis 1,5%. Für ein sulfonathältiges Derivat eines Cholsäureamids liegen die entsprechenden Konzentrationen von 0,06 bis 0,48%, vorzugsweise von 0,12 bis 0,24% für nicht-zwitterionische Formen, und von 0,2 bis 1,8%, vorzugsweise von 0,9 bis 1,8% für zwitterionische Formen. Für Fettsulfonate von 0,006 bis 0,12%, vorzugsweise von 0,03 bis 0,12%.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann durchgeführt werden, um Fragmente vom Aminoterminus von β-Galactosidaseenzymen zu stabilisieren. β-Galactosidase ist ein tetrameres Protein mit einem Molekulargewicht gleich 540 000 Dalton. Die vier identischen Monomere bestehen aus 1021 Aminosäuren, jeweils mit einem Molekulargewicht von 116 000 Dalton. Das monomere Protein ist in drei Bereiche aufgeteilt: (1) das N-terminale Proximalsegment (derα-Bereich); (2) ein Mittelbereich; und (3) ein C-terminales Distalsegment (der ω-Bereich). Komplementierungsassays werden im allgemeinen durch Einsatz von zwei Peptidfragmenten aus β-Galactosidase, ein Fragment aus dem α-Bereich, typischerweise als der Enzymdonor bezeichnet, und ein größeres Fragment durchgeführt, dem Peptide aus dem α-Bereich fehlen, typischerweise als ein Enzymakzeptor bekannt. Die Fähigkeit von Peptidfragmenten, sich in ein aktives Enzym umzubilden, ist als Komplementierung bekannt, speziell α-Komplementierung, wenn eine Löschung im α-Bereich in einem Peptid durch ein kleineres Peptid komplementiert wird, das Aminosäuren aus dem -Bereich enthält. Ein Beispiel für α-Komplementierung stellt das M15/CNBr2-Komplementierungssystem dar. Dem M15-Mutantenpolypeptid fehlen die Aminosäuren 11-41 von β-Galactosidase und existiert in Lösung als ein enzymatisch inaktives Dimer. Ein aus β-Galactosidase durch Zyanogenbromid (CNBr)Spaltung abgeleitetes Polypeptid, das CNBr2-Peptid, besteht aus den Aminosäuren 3-92 aus β-Galactosidase. Das CNBr2-Peptid fördert, wenn es mit Dimer M15 gemischt ist, die spontane Rekonstituierung des β-Galactosidasetetramers mit voller enzymatischer Aktivität (Langley und Zabin, Biochemistry (1976) 15: 4866). Das M15-Peptid ist als ein α-Akzeptor bekannt und das CNBr2-Peptid als ein α-Donor. Das CNBr2Peptid kann auch als ein α-Donor für das M112-Dimer dienen, eine Löschungsmutation, der die Aminosäuren 23-31 innerhalb von β-Galactosidase fehlen (Lin et al., Biochem.Biophys.Res.Comm. (1970) 40: 249; Celeda und Zabin, Biochemistry (1979) 18:404; Welphy et al., J.Biol.Chem. (1981) 256:6804; Langley et al., PNAS USA (1975) 72; 1254). Eine große Anzahl von α-Bereich-Fragmenten von β-Galactosidase, die bei Komplementierungsassays nützlich sind, wird in der PCT-Anmeldung Nr. PCT/US85/02095 mit dem internationalen Veröffentlichungsdatum 9. Mai 1986 beschrieben. Diese Mutantenfragmente umfassen zwei Bereiche, einen α-Donor-Bereich, der eine Proteinsequenz enthält, die fähig ist, sich mit einem Enzymemakzeptanten zu kombinieren, um ein aktives β-Galactosidaseenzym zu bilden, sowie einen Analytbereich, der fähig ist, mit einem analytbindenden Protein in Wechselwirkung zu treten, um Hilfsmittel zum Konjugieren eines Analyten an den Enzymdonor zu schaffen. Diese Enzymdonorfragmente sind in Kombination mit Enzymakzeptorfragmenten (die, wie oben beschrieben, aus Proteinen bestehen, die aus Mutantengenen mit Löschungsmutationen innerhalb des α-Bereichs hergestellt wurden, oder anders hergestellt wurden, um Löschungen in den Aminosäuren des α-Bereichs zu schaffen) fähig, sich zu rekonstituieren, um aktives β-Galactosidaseenzym zu bilden.
Weitere Stabilisierung von Reagenzien, die bei β-Galactosidase-Komplementierungsassays eingesetzt werden, kann durch Hinzufügen eines Chelatbildners zum Lagermedium, das die Enzymakzeptorreagenzien enthält, erreicht werden. Diese Fragmente, die aus einen Polypeptid bestehen, das den kompletten Mittelbereich und C-terminalen Bereich eines β-Galactosidaseenzyms enthält, weisen typischerweise eine Anzahl von Zystinresten auf und sind stabilisiert, wenn sie gegen metallkatalysierte Oxidation geschützt sind. Das Hinzufügen eines Chelatbildners für Metallionen wie EDTA oder EGTA erhöht die Stabilität von Peptidfragmenten aus diesen Anteilen des β-Galactosidaseenzyms.
Das Lagermedium, in dem Peptidfragmente gelagert sind, kann zusätzlich zu den Tensiden wie oben beschrieben andere Bestandteile enthalten, die für eine Vielfalt von Zwecken nützlich sind. Zum Beispiel kann ein Puffer in den Lagermedien vorhanden sein, sodaß einfaches Mischen der Lagermedien und einer Probe ein Medium schafft, das den für die optimale Aktivität des rekonstituierten β-Galactosidaseenzyms wünschenswerten pH-Wert aufweist. Ein Bakteriozid wie Natriumazid kann vorhanden sein, um Bakterienwachstum zu verhindern. Andere Bestandteile, die vorhanden sein können, umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf Magnesiumionen oder andere Ionen, die zur Enzymaktivität notwendig sind, Reagenzien mit dem Zweck, den Abbau von Zystinresten zu verhindern, wie Dithiothreitol (DTT), Solubilisierungsmittel wie Lösungsmittel (z.B. Äthylenglycol), und nicht-ionische Tenside (z.B. Fettsäurester von Kondensationsprodukten von Sorbit und Äthylenoxid, wie Tween 20). Das Lagermedium ist typischerweise wässerig, wobei ein β-Galactosidasepeptidfragment in Konzentrationen von etwa 5-100nM, vorzugsweise von etwa 10-50 nM vorhanden ist.
0bwohl Tenside zur Stabilität des Enzymfragments während der Lagerung beitragen, stören sie das Komplementierungsassay, weil Tenside auf Proteine eine denaturierende Wirkung ausüben und die Proteine sich wieder zu ihrer richtigen Konformation falten müssen, um ein aktives Enzym zu bilden. Da das Reaktionsmedium für ein Komplementierungsassay andere Bestandteile als das Enzymdonorlagermedium enthält, trägt die entstehende Verdünnung etwas zur Verminderung der Wirkung der zum Enzymdonorlagermedium hinzugefügten Tenside bei. Zum Beispiel ermöglichte eine dreißigfache Verdünnung eines Lagermediums, das etwa 0,06% Natriumdodecylsulfat enthielt, die Komplementierung. Jedoch ist Verdünnung und die resultierende Verringerung der Konzentration von Reagenzien weniger wünschenswert als eine Technik, welche das Auftreten der Reaktion in unverdünntem Zustand ermöglichen würde. Zu diesem Zweck wurden Techniken zum Entfernen von Tensiden aus dem Komplementierungsassaymedium untersucht. Es ist festgestellt worden, daß das Hinzufügen von Cyclodextrin zum Assaymedium der Wirkung des Tensids entgegenwirkt und eine Durchführung des Komplementierungsassays ohne Verdünnung ermöglicht.
Cyclodextrine sind zyklische Amylosen. α-Cyclodextrin ist Cyclohexaamylose, β-Cyclodextrin ist Cycloheptaamylose und γ-Cyclodextrin ist Cyclooctaamylose. Diese zyklischen Amylosen bilden Einschlußverbindungen (Clathrate) und sind fähig, eine Anzahl verschiedener organischer Moleküle einzuschließen. Jedoch war ihre Brauchbarkeit zum Einschließen von Tensiden und dadurch das Entfernen von Tensiden von Peptidoberflächen nicht bekannt, bevor dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung entdeckt wurde.
Obwohl alle drei Cyclodextrine wirksam beim Entfernen eines jeden der zum Stabilisieren von Fragmenten von β-Galactosidase eingesetzten Tensids sind, werden Vorteile erreicht, indem man die Größe des Tensids auf die Größe des Innenraums des Cyclodextrins abstimmt. Aus Cholsäurederivaten abgeleitete Tenside werden daher sehr leicht unter Verwendung von γ-cyclodextrin, das den größten Innenraum aufweist, entfernt. Kleinere Tenside wie Fettsäureamide von Aminosäuren und Fettsulfonate werden sehr leicht mit α-Cyclodextrin entfernt, das den kleinsten Innenraum der drei Cyclodextrine aufweist.
Der Einsatz einer beliebigen Menge an Cyclodextrin vermindert das Ausmaß, bis zu dem eine Verdünnung des Assaymediums notwendig ist, und daher fällt jeder Einsatz von Cyclodextrin zum Entfernen von Tensid aus einem Komplementierungsassaymedium in den Schutzbereich des breitesten Aspekts der vorliegenden Erfindung. Jedoch wird es vorgezogen. ein Molverhältnis von Cyclodextrin zu Tensid von zumindest 1:1, vorzugsweise zumindest 2:1, zu schaffen. Da Cyclodextrine selbst eine gewisse nachteilige Wirkung auf das Komplementierungsassay ausüben, wird es vorgezogen, nicht mehr als einen geringen Überschuß an Cyclodextrin gegenüber der zum Neutralisieren der Wirkung des Tensids notwendigen Menge einzusetzen. Diese Menge kann leicht durch einfaches Experimentieren unter Verwendung verschiedener Verdünnungen von Cyclodextrin für jede gegebene Konzentration an Tensid festgestellt werden. Es wird bevorzugt, die obere Grenze des Molverhältnisses von Cyclodextrin zu Tensid unter 8:1, vorzugsweise unter 4:1 zu halten. Diese Grenzen können wie gewünscht je nach der Gesamtheit der Umstände angepaßt werden.
Es ist festgestellt worden, daß Serum auch wirksam ist, um die Wirkung von Tensiden zu neutralisieren. Auch in Abwesenheit von Cyclodextrinen ermöglichen Reaktionen, die in relativ hohen Konzentrationen von Serum durchgeführt werden, ein leichteres Auftreten von Komplementierung als in niedrigen Serumkonzentrationen durchgeführte Reaktionen. Serumkonzentrationen von zumindest 5%, vorzugsweise zumindest 10% des gesammten Assayvolumens, das im Komplementierungsschritt der Bestimmung eingesetzt wird, reichen aus, damit Komplementierung in einem meßbaren Ausmaß stattfindet.
Nachdem die Erfindung jetzt allgemein beschrieben wurde, soll unter Bezugnahme auf die folgenden, zur Veranschaulichung dienenden Beispiele ein besseres Verständnis ermöglicht werden.

BEISPIELE

Die folgenden Abkürzungen und Markennamen werden in den folgenden Beispielen für spezifische Tenside verwendet: LS = N-Lauroylsarcosin (auch als N-Dodecanoyl-n-methylglycin bekannt); CHAPS = 3-[(3-Cholamido-propyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat; CHAPSO = 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propansulfonat; TDA = Taurodesoxycholsäure (auch als 3α,12α-Dihydroxy-5β-cholan-24-säure-N-[2-sulfoäthyl]amid bekannt); Mega 10 = N-Decanoyl-N-methylglucamid; Brij 99 = ein Markenname für einen 0leyläther von Polyoxyäthylen, der durchschnittlich 20 Oxyäthyleneinheiten enthält; Triton X67 = ein Markenname für einen Festflocken-Polyoxyäthylenfettsäureäther (nichtionisch) mit nicht spezifizierter Struktur; Brij 96 = ein Markenname für einen 0leyläther von Polyoxyäthylen, der durchschnittlich 10 0xyäthyleneinheiten enthält; Lubrol PX = ein Markenname für Äthylenoxidkondensate von Fettalkoholen (wobei die genaue Struktur nicht spezifiziert ist); Nonidet P-40 = ein Markenname für ein Octalphenol- Äthylenoxidkondensat, das durchschnittlich 9 Mol Äthylenoxid pro Mol Phenol enthält; und Tween 20 = ein Markenname, der das Kondensationsprodukt eines Äthers von Polyoxyäthylen und Sorbit mit Laurinsäure und anderen Fettsäuren bezeichnet.

Beispiel 1

Veränderung der Stabilität von Enzymdonoren mit variierender Menge an vorhandenem Natriumdodecylsulfat

Vier Assaysets wurden durchgeführt, wobei ein Enzymdonormolekül mit drei verschiedenen Antigenen oder ohne jeglichem Antigen eingesetzt wurde. Der Grundenzymdonor, als ED4 bezeichnet, besteht aus den Nterminalen Resten 6-51 mit bestimmten Restriktionsstellenpeptiden, die mit den Amino- und Carboxyl-Enden verbunden sind. Die drei mit dem Grundenzymdonor verbundenen Antigene waren T4, Digoxin und Theophyllin. Die Verbindung erfolgte durch Maleimidbindung zwischen dem Antigen und einem Zysteinrest in Position 46 des Polypeptids. Die Anfangs-Enzymdonorkonzentrationen waren 25nM ED4, 20nM ED4-T4, 20 nM ED4-Dig, 40nM ED4-Theo.
Ein Lagerungspuffer bestand aus 150 mM KPO&sub4;, 100 mM NaPO&sub4; ("KPO&sub4;" und "NaPO&sub4;" sind Bezeichnungen für Mischungen aus K&sub2;HPO&sub4; und KH&sub2;PO&sub4; (oder die entsprechenden Natriumsalze), abgestimmt, um einen pH-Wert von 7,0, zu ergeben 10nM EGTA (Äthylenglycol-bis-(β-aminoäthyläther)-N,N,N',N'-tetraessigsäure), 2mM Mg(OAc)&sub2;, 0,05% Tween 20, 0,05mM DTT (Dithiothreitol), 20mM NaN&sub3;, 2,4% Äthylenglycol, pH 7,0. Der Lagerbehälter war ein mit Parafilm abgedichtetes Reagensröhrchen aus klarem Glas.
Die Enzymdonorstabilität wurde durch Durchführung eines Komplementierungsassays unter Verwendung von 100 uL 800 nM Enzymemakzeptor, 10 uL 20nM Enzymdonor, 190 uL 0,6mg/ml CPRG (Cholorphenolrot-β-D-Galactopyranosid, ein β-Gaiactosidasesubstrat) bestimmt; das Enzym wurde bei dieser Bestimmung 30-fach verdünnt. Enzymaktivitäten wurden vor der Lagerung (Tag 0) und nach der Lagerung der Bestandteile bei 30ºC für 1, 5, 8, 15, 21 und 41 Tage gemessen.
Alle vier ED4-X-Reagenzien (drei Konjugate und die Kontrolle, ein nicht modifizierter Enzymdonor) zeigten einen Verlust an Enzymaktivität nach der Komplementierung im Laufe der Zeit. Bei 41 Tagen lagen alle Enzymaktivitätswerte im Bereich von 30-40% der ursprünglichen Aktivität in Abwesenheit von Stabilisatoren.
Zusätzliche Versuche wurden dann durchgeführt, um festzustellen, ob hinzugefügtes Natriumdodecylsulfat (SDS) die Aktivität des durch Komplementierung gebildeten rekonstituierten Enzyms aufrechterhalten würde. Obwohl bei geringeren Konzentrationen von hinzugefügtem SDS in manchen Fällen anomale Ergebnisse festgestellt wurden, die auf Versuchsfehler zurückzuführen sind, gab es eine allgemeine Tendenz zu erhöhter Lagerungsstabilität mit zunehmender Menge an SDS. Konzentrationen von 0,06%, 0,015%. 0,03% und 0,015% waren für ED4-T4, ED4-Dig, ED4-Theo bzw. ED4 notwendig, um Enzymaktivität bei 41 Tagen auf dem Niveau von 90% oder mehr der ursprünglichen Aktivität zu halten.
Es gibt eine augenscheinliche Aktivierung von ED4 in Gegenwart von SDS. Die durch das Tensid verursachte Denaturierung kann es ermöglichen, daß sich eine stabilere, weniger aktive Form von ED4 (die in Abwesenheit von Tensid vorhanden ist) zu einer aktiveren Konfiguration auf die Verdünnung während des Komplementierungsassay hin faltet. Die ED4-Konjugate zeigen dieses offenbar anomale Verhalten nicht, möglicherweise, weil sie als Ergebnis der Bindung des Antigens zur Bildung des Konjugats in den Konfigurationen, in denen sie existieren können, eingeschränkter sind. Diese Theorie ist nicht bewiesen, kann aber zum Verstehen der in diesen Versuchen angegebenen Ergebnisse hilfreich sein.

Beispiel 2

Wirkungen verschiedener Tenside auf ED4-T4-Stabilität

Eine Anzahl verschiedener Tenside wurde auf ihre Wirkung auf die Lagerstabilität von ED4-T4 getestet, wobei der gleiche Lagerpuffer, Lagerbehälter, und die gleiche Lagertemperatur wie in Beispiel 1 angegeben eingesetzt wurden. Die ED4-T4-Konzentration betrug 20nM und die Lagerzeit war auf 8 Tage begrenzt. Die Enzymaktivität wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 unten dargestellt. Tabelle 1 Additiv Konz.in Reagens Konz.während Bestimmung %-Aktivität nach 8 Tagen N-Lauroylsarcosin CHAPS Taurodesoxycholsäure Mega 10 NaSCN CHAPSO Octyl-β-Glucosid Desoxycholsäure Brij Triton X67 Kontrolle Tween 20 Lubrol Px Nonidet P-40
Die beste Stabilität wurde mit N-Lauroylsarcosin, CHAPS, Taurodesoxycholsäure und Mega 10 bei den angegebenen Konzentrationen erreicht. Eine Anzahl nicht-ionischer Tenside, wie in der Tabelle angegeben, zeigte entweder keine nennenswerte Wirkung oder schädliche Wirkungen.

Beispiel 3

Wirkung von Tensiden auf ED4-Stabilität

Die Wirkung verschiedener Tenside auf ED4-Stabilität wurde unter Verwendung der gleichen Reaktionsbedingungen wie in Beispiel 2 angegeben bestimmt. Eine ED4-Konzentration von 25nM wurde verwendet. Die Ergebnisse sind aus Tabelle 2 ersichtlich. Tabelle 2 Additiv Konz.in Reagens Konz.während Bestimmung %-Aktivität nach 8 Tagen N-Lauroylsarcosin CHAPS Taurodesoxycholsäure Mega 10 NaSCN CHAPSO Octyl-β-Glucosid Desoxycholsäure Brij Triton X67 Kontrolle Tween 20 Lubrol Px Nonidet P-40
Die beste Stabilität wurde mit N-Lauroylsarcosin, CHAPS, Taurodesoxycholsäure und Natriumthiocyanat bei den angegebenen Konzentrationen erreicht. Eine gewisse Aktivierung (ähnlich der bei SDS in Beispiel 1 beobachteten) war bei N-Laurosylsarcosin zu sehen.

Beispiel 4

Wirkung verschiedener Tenside und chaotroper Bedingungen auf ED4-T4- Stabilität

Die Wirkung verschiedener Tenside und chaotroper Bedingungen auf ED4- T4-Stabilität wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 2 angegeben festgestellt. Die ED4-T4-Konzentration betrug 20nM. Enzymaktivität wurde an den Tagen 0, 1, 5, 8, 14 und 34 gemessen.
N-Lauroylsarcosin, Taurodesoxycholat, CHAPS und NaSCN wurden bei verschiedenen Konzentrationen getestet. Enzymaktivitäten von zumindest 90% der ursprünglichen Aktivität wurden mit minimalen Konzentrationen von 0,06% N-Lauroylsarcosin, 0,24% Taurodesoxycholsäure und 1 Mol Natriumthiocyanat erzielt. Bei 34 Tagen unterstützte CHAPS die Stabilität von 90% nicht. Die Abwesenheit von Stabilisator verursachte in allen Fällen ein Abfallen der Enzymaktivität in den Bereich von 22-34% der ursprünglichen Aktivität. In allen Fällen gab es einen allgemeinen Trend zur Erhöhung der Stabilität mit höheren Mengen des angegebenen Tensids oder der angegebenen chaotropen Bedingung (Natriumthiocyanat).

Beispiel 5

Wirkung verschiedener Tenside oder chaotroper Bedingungen auf ED4-Stabilität

Die Wirkung verschiedener Tenside oder Natriumthiocyanats auf ED4-Stabilität wurde in einem Versuch gemessen, der dem in Beispiel 4 berichteten entsprach. Die ED-Konzentration betrug 25 nM. Die Meßzeiten und Tenside sind die gleichen wie die in Beispiel 4 berichteten.
Die gleichen allgemeinen Trends waren zu sehen. Beibehaltung von zumindest 90% oder mehr der ursprünglichen Enzymaktivität wurde mit minimalen Konzentrationen von 0,03% N-Lauroylsarcosin, 0,24% Taurodesoxycholsäure, 1,8% CHAPS und 1M Natriumthiocyanat erzielt. Die Stabilität lag in Abwesenheit eines Stabilisators im Bereich von 47- 57%.

Beispiel 6

Wirkung verschiedener Substanzen auf ED4-T4-Stabilität

Die Wirkung einer Anzahl verschiedener Denaturierungs- und Lösungsmittel auf die ED4-T4-Stabilität wurde in einer Bestimmung entsprechend der in Beispiel 4 beschriebenen festgestellt. Die ED4-T4-Konzentration betrug 20 nM, und die Lagerstabilität wurde für 14 Tage gemessen. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 3 und 4 angegeben. Tabelle 3 Additiv Konz.in Lagerung Konz.während Bestimmung %-Aktivität nach 14 Tagen SDS Propylenglycol Methanol Carbitol Harnstoff DMSO Äthylenglycol Kontrolle Guanidin-HCl Acetonitril Sulfolan DMF Tabelle 4 Additiv Konz.in Lagerung Konz.während Bestimmung %Aktivität nach 14 Tagen SDS Methanol Acetonitril Propylenglycol Äthylenglycol Guanidin-HCl Sulfolan Harnstoff DMSO DMF Carbitol Kontrolle
Die beste Stabilität wurde mit SDS, Methanol, Acetonitril, Propylenglycol und Äthylenglycol bei den angegebenen Konzentrationen erreicht.

Beispiel 7

Neutralisation von Tensid durch Cyclodextrine

Die Fähigkeit von α-, β- und γ-Cyclodextrin, Lauroylsarcosin auf ED4- T4 und ED4-Dig-Komplementierungsassays zu neutralisieren, wurde bestimmt. Der Lagerungspuffer war der gleiche wie in Beispiel 1 beschrieben. Assays wurden sofort (d.h. ohne Lagerung) durchgeführt. Das Komplementierungsassay wurde unter Verwendung von 100uL 800nM Enzymakzeptor, 100 uL 2nM Enzymsdonor und 100 uL 1,1mg/ml CPRG durchgeführt. Keine Verdünnung war notwendig.Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt.
Das linke Feld von Fig. 1 zeigt die Wirkung von α-, β- und γ-Cyclodextrin auf ein Komplementierungsassay unter Verwendung von ED4T4 als der Enzymdonor. Die Prozent Cyclodextrin sind bezogen auf Komplementierungsaktivität (in mA/sec ausgedrückt) aufgetragen. Wenn die Cyclodextrine in Abwesenheit eines Stabilisierungsagens hinzugefügt wurden, war mit zunehmender Konzentration eines jeden Cyclodextrins eine leichte Abnahme der Komplementierungsaktivität zu sehen. In ähnlicher Weise störte die Gegenwart von Lauroylsarcosin als ein Stabilisierungsagens im Reagens während der Lagerung die Komplementierung wie durch die Aktivitäten bei der 0% Cyclodextrinachse angegeben. Zunehmende Mengen aller Typen von Cyclodextrinen waren beim Neutralisieren bzw. Unwirksammachen der Störung von Lauroylsarcosin mit dem Komplementierungsassay wirksam. α-Cyclodextrin war am wirksamsten, während γ-Cyclodextrin am wenigsten wirksam war. Ähnliche Ergebnisse werden im rechten Feld gezeigt, das die Wirkungen von Cyclodextrinen auf ein Komplementierungsassay unter Verwendung von ED4-Dig in Abwesenheit oder Gegenwart von Lauroylsarcosin im Reagens zeigt.

Beispiel 8

Neutralisierung von LIDS und Lauroylsarcosin durch Serum

Zu Beginn durchgeführte Untersuchungen zeigten, daß Serum möglicherweise nützlich zum Neutralisieren bzw. Unwirksammachen von Tensiden in einem Komplementierungsassay war. Dieses Potential wurde in einem Versuch nachgewiesen, bei dem der gleiche Lagerungspuffer wie in den vorhergehenden Versuchen eingesetzt wurde. Da jedoch die Lagerstabilität nicht getestet wurde, wurde das Assay sofort durchgeführt. Zwei Assayreihen wurden durchgeführt, wobei entweder ED4-T4 oder ED4-Dig in Lagerpuffer mit einer Konzentration von 2,0nM eingesetzt wurde. Die Assaymischung enthielt 100 uL des Enzymdonors in Lagerpuffer, 100 uL 720nM Enzymakzeptors (EA 1150), 100 uL 0,6mg/mL CPRG und 33 uL Serum in verschiedenen Verdünnungen. Konzentrationen von Serum in der entstehenden Assaylösung variierten von 0-10%, wobei LIDS und Lauroylsarcosinkonzentrationen von 0-0,048 bzw. 0-0,24% variierten.
Die Ergebnisse werden in Fig. 2 gezeigt. Diese Figur zeigt, daß Serum die Hemmung der Komplementierung von ED4-T4- und ED4-Dig-Konjugaten, die sowohl durch LIDS als auch Lauroylsarcosin verursacht wurde, neutralisierte bzw. unwirksam machte. Der Neutralisierungsgrad hing von der Menge an Denaturierungsmittel und Serum im Assay ab. Das 10%-Serum-Assay für Digoxin wurde unter diesen Bedingungen vollständig neutralisiert; das 3,3%-Serumassay für ED4-T4 zeigte variable Neutralisierung. Zusätzliche Neutralisierung war für Assays bei geringerem Serumgehalt notwendig.

Beispiel 9

Neutralisierung von Lauroylsarcosin durch α-Cyclodextrin und Komplementierungsassays

Die vorhergehenden Beispiele der Neutralisierung von Tensiden wurden in relativ einfachen Komplementierungspuffern durchgeführt. Wenn diese Assays in komplexeren Pufferlösungen wiederholt wurden, die zum Beispiel (für ED4-T4) 80 mM KPO&sub4;, Saccharose, ANS (8-Anilinonaphthalinsulfonsäure, ein Thyropin-freisetzendes Agens), Methionin, GARS (Ziegen-anti-Kaninchen-Antiserum), anti-T4-Antikörper mit Kaninchenursprung und CPRG, pH 7,0, enthielten, wurden ähnliche Ergebnisse erzielt. Es wurde gezeigt, daß α-Cyclodextrin die Hemmung der Komplementierung durch Lauroylsarcosin vollständig unwirksam machte. Die minimale, zur vollständigen Neutralisierung des Tensids notwendige Konzentration von α-Cyclodextrin variierte etwas mit der Gegenwart anderer Assaybestandteile. Zum Beispiel verringerte die Gegenwart von Serum die zur vollständigen Neutralisation notwendige Menge an α-Cyclodextrin. Das bestätigt die oben in Beispiel 8 dargelegten Ergebnisse. Die zum Neutralisieren der maximalen getesteten Konzentration von Lauroylsarcosin (0,18%) notwendigen minimalen Mengen an α-Cyclodextrin variierten von 0,6% für ein ED4-Dig-Assay, das kein Serum enthielt, bis 0,1% für ein ED4-Dig-Assay, das 10% Serum enthielt. Ähnliche Ergebnisse waren für ED4-T4-Assays zu sehen; eine α-Cyclodextrinkonzentration von 0,2% war ausreichend, um 0,18% Lauroylsarcosin in einem Assaymedium, das 3,3% Serum enthielt, vollständig zu neutralisieren, während in der Abwesenheit von Serum eine α-Cyclodextrinkonzentration von mehr als 0,3% notwendig war.

Beispiel 10

Neutralisierung von Lauroylsarcosin durch β-Cyclodextrin in Komplementierungsassays

Die Fähigkeit von β-Cyclodextrin, Lauroylsarcosin zu neutralisieren, wurde in einem vollständigen Assaymedium nachgewiesen, das 80mM KPO&sub4;, 10 mM EGTA, 2mM Magnesiumacetat, 20 mM Natriumazid, 0,05% Tween 20, 0,05mM DTT, pH 7,0, enthielt. Die obigen Ingredienzien waren sowohl in Enzymdonor- als auch in Enzymakzeptorlagerungslösungen vorhanden. Die Enzymdonor(ED4-T4)-Lösung enthielt auch 1,4 mg/ml CPRG und 1:52 GARS. Die Enzymakzeptorlösung enthielt auch 5mM Saccharose, 10mM Methionin, 0,3mM ANS und eine 1:350-Verdünnung von anti-T4-Antikörper. Die Assayvolumina waren 125 uL Enzymakzeptor, der variable Mengen an β-Cyclodextrin enthielt, 65 uL Enzymdonor, der variable Mengen an Lauroylsarcosin enthielt, 51,6 uL Wasser und 8,3 uL Probe. Die variablen Konzentrationen von Lauroylsarcosin und β-Cyclodextrin werden in Fig. 3 gezeigt, die auch die Ergebnisse des Assays zeigt.
β-Cyclodextrin neutralisierte n-Lauroylsarcosin in der Gegenwart von 3,3% Serum und den verbleibenden Assaybestandteilen. Diese Ergebnisse sind den in Beispiel 9 für α-Cyclodextrine gezeigten ähnlich. Obwohl β-Cyclodextrin die Antikörperbindung im ED4-T4-Assay nicht störte, war in einem Digoxin-Assay eine Spaltung der Antikörperbindung zu sehen.

Beispiel 11

Neutralisierung von Taurodesoxycholsäure durch β-Cyclodextrin in Komplementierungsassays

Die fähigkeit von β-Cyclodextrin, Taurodesoxycholsäure (TDA) zu neutralisieren, wurde unter Anwendung der gleichen Assaybedingungen wie in Beispiel 10 beschrieben bestimmt. β-Cyclodextrinkonzentrationen reichten von 0-0,8%, Taurodesoxycholsäurekonzentrationen reichten von 0-0,48% und Serumkonzentrationen reichten von 0-10%. Die Ergebnisse waren denen für Lauroylsarcosin ähnlich, aber β-Cyclodextrin war in jeder gegebenen Konzentration weniger wirksam. Die höheren Konzentrationen von Taurodesoxycholsäure konnten innerhalb des Löslichkeitsbereichs von β-Cyclodextrin nicht wirksam neutralisiert werden. Jedoch konnten geringere Konzentrationen wirksam neutralisiert werden. TDA bei 0,12% wurde bei 0,4% β-Cyclodextrin wirksam neutralisiert; TDA bei 0,24% wurde bei 0,8% β-Cyclodextrin neutralisiert.
In einem ähnlichen Versuch, bei dem in der Bemühung, Taurodesoxycholsäure zu neutralisieren, α-Cyclodextrin eingesetzt wurde, konnte keine Neutralisierungswirkung von α-Cyclodextrin nachgewiesen werden. Andererseits war γ-Cyclodextrin beim Neutralisieren von TDA wirksamer als β-Cyclodextrin. Auf der Basis der anderen hier gezeigten Ergebnisse scheint dieses Ergebnis durch die Größe der Öffnung in den Cyclodextrinen erklärbar, wobei das γ-Cyclodextrin den größten Zentral-Raum und daher den meisten Platz für den Steroidring von Taurodeoxycholsäure verfügbar hat.

Claims

1. Verfahren zum Stabilisieren von β-Galactosidasepeptidfragmenten gegen Verlust von Komplementierungsaktivität bei Lagerung, das umfaßt:

Lagerung eines β-Galactosidasepeptidfragments in einem Lagerungsmedium, das ein ionisches Tensid oder ein von einem Zuckerrest abgeleitetes Tensid enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das genannte Tensid ein Fettsulfonat, ein Fettsäureamid einer Aminosäure, ein Fettsäureester eines Zuckers oder Zuckersäureamids oder ein sulfonathältiges Derivat eines Cholsäureamids ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin das genannte Tensid ein Salz von Dodecylsulfat, N-Lauroylsarcosin, 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]- 1-propansulfonat, 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1- propansulfonat, Taurodesoxycholsäure oder Decanoyl-N-Methylgluconamid ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 und 3, worin das genannte Tensid in einer Konzentration von 0,006 bis 1,8% vorhanden ist.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das genannte Peptidfragment ein β-Galactosidase-α-Bereich-Fragment ist.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das weiterhin das Hinzufügen eines Cyclodextrins zum genannten Lagermedium nach der genannten Lagerung aber vor der Verwendung des genannten Fragments in einem Komplementierungsassay umfaßt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das genannte Cyclodextrin α- oder β-Cyclodextrin und das genannte Tensid N-Lauroylsarcosin ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6, worin das genannte Cyclodextrin γ-Cyclodextrin ist und das genannte Tensid ein sulfonathältiges Derivat eines Cholsäureamids ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, worin das Molverhältnis von Cyclodextrin zu Tensid zumindest 1:1 beträgt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das genannte Fragment β-Galactosidasereste 6-51 umfaßt.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches weiterhin das Hinzufügen von Serum bis zu einer Konzentration von 3,3% zum genannten Lagermedium nach der genannten Lagerung, aber vor Verwendung des genannten Fragments in einem Komplementierungsassay umfaßt.

12. β-Galactosidasepeptidfragment enthaltende Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein ionisches Tensid oder ein von einem Zuckerrest abgeleitetes Tensid enthält, um das Fragment gegen Verlust von Komplementierungsaktivität bei Lagerung zu stabilisieren.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 12, worin das genannte Tensid ein Fettsulfonat, ein Fettsäureamid einer Aminosäure, ein Fettsäureester eines Zuckers oder Zuckersäureamids oder ein sulfonathältiges Derivat eines Cholsäureamids ist.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 13., worin das genannte Tensid ein Salz oder Dodecylsulfat, N-Lauroylsarcosin, 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat, 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propansulfonat, Taurodesoxycholsäure oder Decanoyl-N-methylgluconamid ist.

15. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 12 bis 14, worin das genannte Tensid in einer Konzentration von 0,006 bis 1,8% vorhanden ist.

16. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 12 bis 15, worin das genannte Peptidfragment ein β-Galactosidase-α-Bereich-Fragment ist.

17. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 12 bis 15, worin das genannte Fragment β-Galactosidasereste 6-51 umfaßt.