JPH069510B2 - 酵素−供与体及び受容体アッセイにおける試薬安定化 - Google Patents
酵素−供与体及び受容体アッセイにおける試薬安定化Info
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- JPH069510B2 JPH069510B2 JP63082375A JP8237588A JPH069510B2 JP H069510 B2 JPH069510 B2 JP H069510B2 JP 63082375 A JP63082375 A JP 63082375A JP 8237588 A JP8237588 A JP 8237588A JP H069510 B2 JPH069510 B2 JP H069510B2
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- cyclodextrin
- enzyme
- surfactant
- galactosidase
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
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- Y10S435/81—Packaged device or kit
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- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/963—Methods of stopping an enzyme reaction or stabilizing the test materials
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、検出可能なシグナルを生成するために酵素の
相補性を利用する特定の結合アッセイ、たとえばイムノ
アッセイに使用される試薬を安定化するために有用な技
法及び組成物に関する。
相補性を利用する特定の結合アッセイ、たとえばイムノ
アッセイに使用される試薬を安定化するために有用な技
法及び組成物に関する。
アッセイ混合物中に存在する分析物の量を決定するため
に使用される検出可能なシグナルを生成する段階として
活性酵素を形成するために、ポリペプチドフラグメント
の再結合を利用する多くのイムノアッセイ及び他の結合
アッセイが最近、記載されている。これらのアッセイの
いくつかは、相補性により形成される酵素として酵素β
−ガラクトシダーゼを使用することを示唆する。
に使用される検出可能なシグナルを生成する段階として
活性酵素を形成するために、ポリペプチドフラグメント
の再結合を利用する多くのイムノアッセイ及び他の結合
アッセイが最近、記載されている。これらのアッセイの
いくつかは、相補性により形成される酵素として酵素β
−ガラクトシダーゼを使用することを示唆する。
しかしながら、β−ガラクトシダーゼのフラグメントを
基材とする試薬の安定性は、所望よりも低いことが発見
された。フラグメントの貯蔵時間が長くなるにつれて、
改質された酵素の活性が、徐々ではあるが連続的に且つ
有意に損失する。
基材とする試薬の安定性は、所望よりも低いことが発見
された。フラグメントの貯蔵時間が長くなるにつれて、
改質された酵素の活性が、徐々ではあるが連続的に且つ
有意に損失する。
従って、酵素β−ガラクトシダーゼを基材とする酵素相
補性アッセイに使用される試薬の安定化の必要性が存在
する。
補性アッセイに使用される試薬の安定化の必要性が存在
する。
ポリペプチドフラグメント再結合に基づくイムノアッセ
イシステムは、Farina及びGolkey、アメリカ特許第4,37
8,428号（1983年３月２０日に発行された）、及びGonal
liなど.,Biochem.and Biophys.Res.Commun.(1981)102:9
17〜923により記載されている。β−ガラクトシダーゼ
α−相補性の分子性質は、Langley(UCLA,1975)によるこ
の表題のPh.D.論文に記載されている。相補性アッセイ
における天然の及び変性されたβ−ガラクトシダーゼポ
リペプチドに基ずくアッセイシステムは、ＰＣＴ出願PC
T／US85／02095(1986年５月９日の国際出願日）に記載
されている。
イシステムは、Farina及びGolkey、アメリカ特許第4,37
8,428号（1983年３月２０日に発行された）、及びGonal
liなど.,Biochem.and Biophys.Res.Commun.(1981)102:9
17〜923により記載されている。β−ガラクトシダーゼ
α−相補性の分子性質は、Langley(UCLA,1975)によるこ
の表題のPh.D.論文に記載されている。相補性アッセイ
における天然の及び変性されたβ−ガラクトシダーゼポ
リペプチドに基ずくアッセイシステムは、ＰＣＴ出願PC
T／US85／02095(1986年５月９日の国際出願日）に記載
されている。
本発明は、α−相補性アッセイに使用するために調製さ
れたβ−ガラクトシダーゼからのペプチドフラグメント
を安定化するための技法を提供する。このペプチドフラ
グメントは、イオン性界面活性剤又は糖残基に由来する
界面活性剤を含む溶液中で安定化される。界面活性剤の
存在は一般的に、酵素受容体及び酵素供与体の相補性と
適合しないので、過剰の界面活性剤が中和又は除去され
るべきである。本発明の好ましい態様においては、選択
された界面活性剤がシクロデキストリンにより中和され
る。
れたβ−ガラクトシダーゼからのペプチドフラグメント
を安定化するための技法を提供する。このペプチドフラ
グメントは、イオン性界面活性剤又は糖残基に由来する
界面活性剤を含む溶液中で安定化される。界面活性剤の
存在は一般的に、酵素受容体及び酵素供与体の相補性と
適合しないので、過剰の界面活性剤が中和又は除去され
るべきである。本発明の好ましい態様においては、選択
された界面活性剤がシクロデキストリンにより中和され
る。
本発明は、酵素のα−領域からのβ−ガラクトシダーゼ
ペプチドフラグメントが貯蔵劣化の間の活性の損失に対
して安定化される組成物を提供する。フラグメント−貯
蔵媒体にイオン性界面活性剤を使用して、貯蔵の間、通
常生じる劣化を減じることが発見された。シクロデキス
トリンが貯蔵の後、但し、相補性アッセイを行なう前
に、貯蔵媒体又はアッセイ媒体に添加される場合、活性
酵素の改質に対する界面活性剤の有害な効果が回避され
る。類似する改良された結果が、比較的高い濃度の血清
の存在下で相補性アッセイ（ここで該血清タンパク質
は、界面活性剤の所望の中和をもたらす）を行なうこと
によって達成され得る。
ペプチドフラグメントが貯蔵劣化の間の活性の損失に対
して安定化される組成物を提供する。フラグメント−貯
蔵媒体にイオン性界面活性剤を使用して、貯蔵の間、通
常生じる劣化を減じることが発見された。シクロデキス
トリンが貯蔵の後、但し、相補性アッセイを行なう前
に、貯蔵媒体又はアッセイ媒体に添加される場合、活性
酵素の改質に対する界面活性剤の有害な効果が回避され
る。類似する改良された結果が、比較的高い濃度の血清
の存在下で相補性アッセイ（ここで該血清タンパク質
は、界面活性剤の所望の中和をもたらす）を行なうこと
によって達成され得る。
本発明は、β−ガラクトシダーゼを使用する相補性アッ
セイに関与する研究から始まった。相補性アッセイに使
用されるペプチドフラグメントの貯蔵は、１日当り６〜
１０％の割合で改質された酵素の活性の損失をもたらす
ことが発見された。たとえば、貯蔵媒体にイオン性界面
活性剤を添加することによって、活性の毎日の損失は１
％以下、しばしば０．５％以下に減じられた。界面活性
剤の使用は、活性酵素の改質をいく分妨げるが、界面活
性剤の悪影響は、相補性反応溶液中に比較的高い濃度、
好ましくは少なくとも１０％の血清を含むことによっ
て、又は包接体としてシクロデキストリン（これによっ
て、界面活性剤を除去する）を含むことによって、妨げ
られ得る。
セイに関与する研究から始まった。相補性アッセイに使
用されるペプチドフラグメントの貯蔵は、１日当り６〜
１０％の割合で改質された酵素の活性の損失をもたらす
ことが発見された。たとえば、貯蔵媒体にイオン性界面
活性剤を添加することによって、活性の毎日の損失は１
％以下、しばしば０．５％以下に減じられた。界面活性
剤の使用は、活性酵素の改質をいく分妨げるが、界面活
性剤の悪影響は、相補性反応溶液中に比較的高い濃度、
好ましくは少なくとも１０％の血清を含むことによっ
て、又は包接体としてシクロデキストリン（これによっ
て、界面活性剤を除去する）を含むことによって、妨げ
られ得る。
イオン性界面活性剤及び糖残基に由来する界面活性剤の
いくつかのクラスが、卓越した貯蔵安定性を提供するも
のとして同定されて来た。これらは、脂肪スルホネー
ト、アミノ酸の脂肪酸アミド、糖及び糖酸アミドの脂肪
酸エステル、及びコール酸アミドのスルホネート含有誘
導体である。これらの分子の脂肪（すなわち、炭化水
素）部分は、好ましくは少なくとも１０個、但し２２個
よりも多くない、より好ましくは12〜18個の範囲の炭素
原子を有する飽和脂肪酸に由来する。アミノ酸部分は好
ましくは、非極性で、一般的にコードされたアミノ酸で
あり、そして脂肪酸部分が、脂肪酸のカルボン酸官能基
とアミノ酸のアミノ官能基との間にアミド結合によって
結合される。場合によっては、その得られたアミドの窒
素は、好ましくはメチル基によりアルキル化され得る。
特に有用なアミノ酸の脂肪酸アミドは、Ｎ−ラウロイル
サルコシン（Ｎ−ドデカノイル−Ｎ−メチルグリシン）
である。
いくつかのクラスが、卓越した貯蔵安定性を提供するも
のとして同定されて来た。これらは、脂肪スルホネー
ト、アミノ酸の脂肪酸アミド、糖及び糖酸アミドの脂肪
酸エステル、及びコール酸アミドのスルホネート含有誘
導体である。これらの分子の脂肪（すなわち、炭化水
素）部分は、好ましくは少なくとも１０個、但し２２個
よりも多くない、より好ましくは12〜18個の範囲の炭素
原子を有する飽和脂肪酸に由来する。アミノ酸部分は好
ましくは、非極性で、一般的にコードされたアミノ酸で
あり、そして脂肪酸部分が、脂肪酸のカルボン酸官能基
とアミノ酸のアミノ官能基との間にアミド結合によって
結合される。場合によっては、その得られたアミドの窒
素は、好ましくはメチル基によりアルキル化され得る。
特に有用なアミノ酸の脂肪酸アミドは、Ｎ−ラウロイル
サルコシン（Ｎ−ドデカノイル−Ｎ−メチルグリシン）
である。
脂肪酸が糖又は糖酸アミドとエステルを形成する場合、
その同じ脂肪酸は、アミノ酸の脂肪酸アミドのために好
ましい。糖部分は、好ましくはアルドース又はアルドン
酸アミドに由来し、そして両者の場合、好ましくはグル
コース、マノース（単糖類）又はその対応するアルドン
酸に由来する。特定の例としてデカノイル−Ｎ−メチル
グルコンアミドを挙げることができる。
その同じ脂肪酸は、アミノ酸の脂肪酸アミドのために好
ましい。糖部分は、好ましくはアルドース又はアルドン
酸アミドに由来し、そして両者の場合、好ましくはグル
コース、マノース（単糖類）又はその対応するアルドン
酸に由来する。特定の例としてデカノイル−Ｎ−メチル
グルコンアミドを挙げることができる。
コール酸アミドのスルホネート含有誘導体は、好ましく
はコール酸アミドのアミド窒素又はコール酸化合物の３
α−ヒドロキシ位置のいずれかに結合有機基を通して結
合されるスルホネート基を有する。コールアミドのＣ２
〜Ｃ５Ｎ−スルホノアルキル誘導体及びコールアミドの
３−α−ヒドロキシに結合されたアミノアルキルエーテ
ルのＮ−スルホノアルキル誘導体が好ましい。両者の場
合、アミド又はアミノ窒素は、低級アルキル基によりア
ルキル化され得る。スルホノアルキル化されたアミンの
場合、そのアミノ基は、双性イオン性界面活性剤を付与
するために四次構造を有することができる。特定の例と
して、３−〔（３−コールアミドプロピル）ジメチル−
アンモニオ〕−１−プロパンスルホネート、３−〔（３
−コールアミド−プロピル）ジメチルアンモニオ〕−２
−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート、及びタウロ
デオキシコール酸を挙げることができる。これらのコー
ル酸誘導体の初めの２種は、CHAPS及びCHAPSOとして市
販されている。タウロデオキシコール酸は、しばしばＴ
ＤＡとして知られている。
はコール酸アミドのアミド窒素又はコール酸化合物の３
α−ヒドロキシ位置のいずれかに結合有機基を通して結
合されるスルホネート基を有する。コールアミドのＣ２
〜Ｃ５Ｎ−スルホノアルキル誘導体及びコールアミドの
３−α−ヒドロキシに結合されたアミノアルキルエーテ
ルのＮ−スルホノアルキル誘導体が好ましい。両者の場
合、アミド又はアミノ窒素は、低級アルキル基によりア
ルキル化され得る。スルホノアルキル化されたアミンの
場合、そのアミノ基は、双性イオン性界面活性剤を付与
するために四次構造を有することができる。特定の例と
して、３−〔（３−コールアミドプロピル）ジメチル−
アンモニオ〕−１−プロパンスルホネート、３−〔（３
−コールアミド−プロピル）ジメチルアンモニオ〕−２
−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート、及びタウロ
デオキシコール酸を挙げることができる。これらのコー
ル酸誘導体の初めの２種は、CHAPS及びCHAPSOとして市
販されている。タウロデオキシコール酸は、しばしばＴ
ＤＡとして知られている。
界面活性剤は、相補性アッセイに使用されるβ−ガラク
トシダーゼペプチドフラグメント及びそれらの接合体、
特にα−領域からの供与体フラグメントの安定性を、そ
れらの比較濃度に比例して高めるであろうことが見出さ
れた。ひじょうに少量の界面活性剤でも、貯蔵安定性の
少々の増強をもたらすであろう。安定効果は、種々の界
面活性剤によりいく分異なるので、許容レベルに安定性
を高めるために必要な量は、単純な実験（ここで異なっ
た量の界面活性剤がペプチドフラグメント溶液に添加さ
れる）によって容易に決定され得る。時間間隔でアリコ
ートが除去され、酵素が再構成され、そしてその得られ
た再構成酵素の活性が、100％酵素活性レベルにするた
めに使用され得る対照サンプルの初期値に比較される。
トシダーゼペプチドフラグメント及びそれらの接合体、
特にα−領域からの供与体フラグメントの安定性を、そ
れらの比較濃度に比例して高めるであろうことが見出さ
れた。ひじょうに少量の界面活性剤でも、貯蔵安定性の
少々の増強をもたらすであろう。安定効果は、種々の界
面活性剤によりいく分異なるので、許容レベルに安定性
を高めるために必要な量は、単純な実験（ここで異なっ
た量の界面活性剤がペプチドフラグメント溶液に添加さ
れる）によって容易に決定され得る。時間間隔でアリコ
ートが除去され、酵素が再構成され、そしてその得られ
た再構成酵素の活性が、100％酵素活性レベルにするた
めに使用され得る対照サンプルの初期値に比較される。
界面活性剤は劣化過程を遅らせるが、但しすべての劣化
過程を必ずしも停止するものではないので、ある酵素活
性は、界面活性剤がペプチドフラグメント溶液を安定化
するために使用される場合でされ、失なわれ続ける。し
かしながら、上記の好ましいタイプの界面活性剤のいず
れかを使用しての６週間の貯蔵の後、再構成酵素を元の
活性の９０％にするのに十分な安定化を達成することが
一般的に可能である。界面活性剤なしに６週間貯蔵さ
れ、そして活性酵素を形成するために再構成された、α
−領域からのβ−ガラクトシダーゼペプチドフラグメン
トは、貯蔵しないで調製された再構成酵素の活性のたっ
た25〜35％を示す。
過程を必ずしも停止するものではないので、ある酵素活
性は、界面活性剤がペプチドフラグメント溶液を安定化
するために使用される場合でされ、失なわれ続ける。し
かしながら、上記の好ましいタイプの界面活性剤のいず
れかを使用しての６週間の貯蔵の後、再構成酵素を元の
活性の９０％にするのに十分な安定化を達成することが
一般的に可能である。界面活性剤なしに６週間貯蔵さ
れ、そして活性酵素を形成するために再構成された、α
−領域からのβ−ガラクトシダーゼペプチドフラグメン
トは、貯蔵しないで調製された再構成酵素の活性のたっ
た25〜35％を示す。
アミノ酸の脂肪酸アミドを用いる場合、0.03〜０．４
％、好ましくは0.06〜0.18％の界面活性剤濃度が初期濃
度として使用され、そして上下に調整され得、そしてそ
のような調整は、完全に状況に応じて行なわれるべきで
ある。本明細書に示されているすべての％濃度は、特に
ことわらないかぎり重量／体積（ｗ／ｖ）である。糖又
は糖酸アミドの脂肪酸エステルを用いる場合、その対応
する濃度は、0.15〜１．５％、好ましくは１．０〜１．
５％である。コール酸アミドのスルホネート含有誘導体
に関しては、その対応する濃度は、非双性イオン形のた
めには0.06〜0.48％、好ましくは0.12〜0.24％であり、
そして双性イオン形のためには０．２〜１．８％、好ま
しくは０．９〜１．８％である。脂肪スルホネートに関
しては、その濃度は 0.006〜0.12％、好ましくは0.03〜
0.12％である。
％、好ましくは0.06〜0.18％の界面活性剤濃度が初期濃
度として使用され、そして上下に調整され得、そしてそ
のような調整は、完全に状況に応じて行なわれるべきで
ある。本明細書に示されているすべての％濃度は、特に
ことわらないかぎり重量／体積（ｗ／ｖ）である。糖又
は糖酸アミドの脂肪酸エステルを用いる場合、その対応
する濃度は、0.15〜１．５％、好ましくは１．０〜１．
５％である。コール酸アミドのスルホネート含有誘導体
に関しては、その対応する濃度は、非双性イオン形のた
めには0.06〜0.48％、好ましくは0.12〜0.24％であり、
そして双性イオン形のためには０．２〜１．８％、好ま
しくは０．９〜１．８％である。脂肪スルホネートに関
しては、その濃度は 0.006〜0.12％、好ましくは0.03〜
0.12％である。
本発明の方法は、β−ガラクトシダーゼ酵素のアミノ末
端からのフラグメントを安定化するために行なわれ得
る。β−ガラクトシダーゼは、540,000ドルトンに等し
い分子量を有する四量体タンパク質である。４個の同一
のモノマーは、それぞれ1021個のアミノ酸から成り、そ
してそれぞれのモノマーは、116,000ドルトンの分子量
を有する。単量体タンパク質は３種の領域に分けられ
る：(1)Ｎ−末端に近いセグメント（α−領域）；(2)中
間領域；及び(3)Ｃ−末端に遠いセグメント（ω−領
域）。相補性アッセイは、一般的にβ−ガラクトシダー
ゼからの２種のペプチドフラグメント、典型的には酵素
供与体として言及されている、α−領域からのフラグメ
ント及び、典型的には酵素受容体として言及されてい
る、α−領域からのミッシングペプチドである大フラグ
メントを用いることによって行なわれる。活性酵素に改
質するペプチドフラグメントの能力は、相補性、特に１
つのペプチド中のα−領域の欠失がα−領域からのアミ
ノ酸を含む小ペプチドにより相補される場合、α−相補
性として知られる。α−相補性の例は、Ｍ15／CNBr2相
補性システムにより提供される。Ｍ15突然変異体ポリペ
プチドは、β−ガラクトシダーゼのアミノ酸11〜41を欠
失し、そして酵素的に不活性の二量体として溶液中に存
在する。臭化シアン(CNBr)分解によりβ−ガラクトシダ
ーゼに由来するポリペプチド、すなわちCNBr2ペプチド
は、β−ガラクトシダーゼからのアミノ酸３〜３９から
成る。二量体Ｍ15と共に混合される場合、CNBr2ペプチ
ドは、十分な酵素活性を有するβ−ガラクトシダーゼ四
量体の自発的な再構成を促進せしめる〔Langley及びZeb
in,Biochemistry(1976)15:4866〕。Ｍ15ペプチドはα−
受容体として知られ、そしてCNBr2ペプチドはα−供与
体として知られる。CNBr2ペプチドはまた、Ｍ112二量
体、すなわちβ−ガラクトシダーゼ内のアミノ酸23〜31
をミッシングする欠失突然変異体のためのα−供与体と
して役立つこともできる〔Lin、など.,Biochem.Biophy
s.Res.Comm.(1970)40:249;Celeda及びZabin,Biochemist
ry(1979)18:404;Welphyなど.,J.Biol.Chem.(1981)256:6
804;Langleyなど.,PNAS USA(1975)72;1254〕。相補性ア
ッセイに有用なβ−ガラクトシダーゼのα−領域フラグ
メントの多くは、1986年５月９日の国際出願日を有する
ＰＣＴ出願PCT／US85／02095に記載される。これらの突
然変異フラグメントは、２個のドメイン、すなわち活性
β−ガラクトシダーゼ酵素を形成するために酵素−受容
体と結合することができるタンパク質配列を含むα−供
与体ドメイン及び酵素供与体に分析体を接合するための
手段を付与するために分析体−結合タンパク質と相互作
用することができる分析体ドメインを含む。これらの酵
素−供与体フラグメント及び酵素−受容体フラグメント
（上記のように、α−領域内で欠失突然変異を有する突
然変異遺伝子から調製され、又はさもなければα−領域
のアミノ酸に欠失を生ぜしめるために調製されたタンパ
ク質から成る）は、活性β−ガラクトシダーゼ酵素を形
成するために再構成することができる。
端からのフラグメントを安定化するために行なわれ得
る。β−ガラクトシダーゼは、540,000ドルトンに等し
い分子量を有する四量体タンパク質である。４個の同一
のモノマーは、それぞれ1021個のアミノ酸から成り、そ
してそれぞれのモノマーは、116,000ドルトンの分子量
を有する。単量体タンパク質は３種の領域に分けられ
る：(1)Ｎ−末端に近いセグメント（α−領域）；(2)中
間領域；及び(3)Ｃ−末端に遠いセグメント（ω−領
域）。相補性アッセイは、一般的にβ−ガラクトシダー
ゼからの２種のペプチドフラグメント、典型的には酵素
供与体として言及されている、α−領域からのフラグメ
ント及び、典型的には酵素受容体として言及されてい
る、α−領域からのミッシングペプチドである大フラグ
メントを用いることによって行なわれる。活性酵素に改
質するペプチドフラグメントの能力は、相補性、特に１
つのペプチド中のα−領域の欠失がα−領域からのアミ
ノ酸を含む小ペプチドにより相補される場合、α−相補
性として知られる。α−相補性の例は、Ｍ15／CNBr2相
補性システムにより提供される。Ｍ15突然変異体ポリペ
プチドは、β−ガラクトシダーゼのアミノ酸11〜41を欠
失し、そして酵素的に不活性の二量体として溶液中に存
在する。臭化シアン(CNBr)分解によりβ−ガラクトシダ
ーゼに由来するポリペプチド、すなわちCNBr2ペプチド
は、β−ガラクトシダーゼからのアミノ酸３〜３９から
成る。二量体Ｍ15と共に混合される場合、CNBr2ペプチ
ドは、十分な酵素活性を有するβ−ガラクトシダーゼ四
量体の自発的な再構成を促進せしめる〔Langley及びZeb
in,Biochemistry(1976)15:4866〕。Ｍ15ペプチドはα−
受容体として知られ、そしてCNBr2ペプチドはα−供与
体として知られる。CNBr2ペプチドはまた、Ｍ112二量
体、すなわちβ−ガラクトシダーゼ内のアミノ酸23〜31
をミッシングする欠失突然変異体のためのα−供与体と
して役立つこともできる〔Lin、など.,Biochem.Biophy
s.Res.Comm.(1970)40:249;Celeda及びZabin,Biochemist
ry(1979)18:404;Welphyなど.,J.Biol.Chem.(1981)256:6
804;Langleyなど.,PNAS USA(1975)72;1254〕。相補性ア
ッセイに有用なβ−ガラクトシダーゼのα−領域フラグ
メントの多くは、1986年５月９日の国際出願日を有する
ＰＣＴ出願PCT／US85／02095に記載される。これらの突
然変異フラグメントは、２個のドメイン、すなわち活性
β−ガラクトシダーゼ酵素を形成するために酵素−受容
体と結合することができるタンパク質配列を含むα−供
与体ドメイン及び酵素供与体に分析体を接合するための
手段を付与するために分析体−結合タンパク質と相互作
用することができる分析体ドメインを含む。これらの酵
素−供与体フラグメント及び酵素−受容体フラグメント
（上記のように、α−領域内で欠失突然変異を有する突
然変異遺伝子から調製され、又はさもなければα−領域
のアミノ酸に欠失を生ぜしめるために調製されたタンパ
ク質から成る）は、活性β−ガラクトシダーゼ酵素を形
成するために再構成することができる。
さらに、β−ガラクトシダーゼ相補性アッセイに使用さ
れる試薬の安定化は、酵素−受容体試薬を含む貯蔵媒体
にキレート剤を添加することによって達成され得る。β
−ガラクトシダーゼ酵素の完全な中央領域及びＣ−末端
領域を含むポリペプチドから成るこれらのフラグメント
は、典型的には、多くのシスチン残基を有し、そして金
属−触媒酸化に対して保護される場合、安定化される。
金属イオンに対するキレート剤、たとえばEDTA又はEGTA
の添加は、β−ガラクトシダーゼ酵素のこれらの部分か
らのペプチドフラグメントの安定性を高める。
れる試薬の安定化は、酵素−受容体試薬を含む貯蔵媒体
にキレート剤を添加することによって達成され得る。β
−ガラクトシダーゼ酵素の完全な中央領域及びＣ−末端
領域を含むポリペプチドから成るこれらのフラグメント
は、典型的には、多くのシスチン残基を有し、そして金
属−触媒酸化に対して保護される場合、安定化される。
金属イオンに対するキレート剤、たとえばEDTA又はEGTA
の添加は、β−ガラクトシダーゼ酵素のこれらの部分か
らのペプチドフラグメントの安定性を高める。
ペプチドフラグメントが貯蔵される貯蔵媒体は、前記界
面活性剤の他に、種々の目的のために有用な他の成分を
含むことができる。たとえば、緩衝液は貯蔵媒体中に存
在することができ、その結果、貯蔵媒体とサンプルとの
単純な混合が、再構成されたβ−ガラクトシダーゼ酵素
の最適活性のために所望されるpHを有する媒体を提供す
るであろう。殺菌剤、たとえばアジ化ナトリウムは、細
菌の増殖を妨げるために存在することができる。存在す
ることができる他の成分として、酵素活性のために必要
なマグネシウムイオン又は他のイオン、シスチン残基の
分解を阻止するように向けられた試薬、たとえばジチオ
トレイトール（ＤＴＴ）、可溶化剤、たとえば溶媒（た
とえば、エチレングリコール）及び非イオン性界面活性
剤（たとえば、ソルビトール及びエチレンオキシドの縮
合生成物の脂肪酸エステル、たとえばTween 20）を挙げ
ることができるが、但しこれだけに限定されない。貯蔵
媒体は、典型的には、約５〜100nM、好ましくは約10〜5
0nMの濃度で存在するβ−ガラクトシダーゼペプチドフ
ラグメントを含む水性溶液である。
面活性剤の他に、種々の目的のために有用な他の成分を
含むことができる。たとえば、緩衝液は貯蔵媒体中に存
在することができ、その結果、貯蔵媒体とサンプルとの
単純な混合が、再構成されたβ−ガラクトシダーゼ酵素
の最適活性のために所望されるpHを有する媒体を提供す
るであろう。殺菌剤、たとえばアジ化ナトリウムは、細
菌の増殖を妨げるために存在することができる。存在す
ることができる他の成分として、酵素活性のために必要
なマグネシウムイオン又は他のイオン、シスチン残基の
分解を阻止するように向けられた試薬、たとえばジチオ
トレイトール（ＤＴＴ）、可溶化剤、たとえば溶媒（た
とえば、エチレングリコール）及び非イオン性界面活性
剤（たとえば、ソルビトール及びエチレンオキシドの縮
合生成物の脂肪酸エステル、たとえばTween 20）を挙げ
ることができるが、但しこれだけに限定されない。貯蔵
媒体は、典型的には、約５〜100nM、好ましくは約10〜5
0nMの濃度で存在するβ−ガラクトシダーゼペプチドフ
ラグメントを含む水性溶液である。
界面活性剤は、貯蔵の間、酵素フラグメントの安定性を
助けるが、それらは相補性アッセイを妨害する。なぜな
らば、界面活性剤はタンパク質を変性するために作用
し、そしてそれらのタンパク質は活性酵素を形成するた
めにそれらの正しい配置に再生すべきであるからであ
る。相補性アッセイのための反応媒体は、酵素供与体貯
蔵媒体以外の成分を含むので、その得られた希釈は、酵
素供与体貯蔵媒体に添加される界面活性剤の効果をいく
分低下せしめる。たとえば、約0.06％のドデシル硫酸ナ
トリウムを含む貯蔵媒体の３０倍希釈は、相補性を可能
にした。しかしながら、希釈及びその得られる試薬の濃
度の低下は、反応が非希釈状態で起こることを可能にす
る技法よりも所望されない。このために、相補性アッセ
イ媒体から界面活性剤を除くための技法が研究された。
アッセイ媒体へのシクロデキストリンの添加は、界面活
性剤の効果に対して反作用し、そして相補性アッセイが
希釈しないで進行することを可能にすることが見出され
た。
助けるが、それらは相補性アッセイを妨害する。なぜな
らば、界面活性剤はタンパク質を変性するために作用
し、そしてそれらのタンパク質は活性酵素を形成するた
めにそれらの正しい配置に再生すべきであるからであ
る。相補性アッセイのための反応媒体は、酵素供与体貯
蔵媒体以外の成分を含むので、その得られた希釈は、酵
素供与体貯蔵媒体に添加される界面活性剤の効果をいく
分低下せしめる。たとえば、約0.06％のドデシル硫酸ナ
トリウムを含む貯蔵媒体の３０倍希釈は、相補性を可能
にした。しかしながら、希釈及びその得られる試薬の濃
度の低下は、反応が非希釈状態で起こることを可能にす
る技法よりも所望されない。このために、相補性アッセ
イ媒体から界面活性剤を除くための技法が研究された。
アッセイ媒体へのシクロデキストリンの添加は、界面活
性剤の効果に対して反作用し、そして相補性アッセイが
希釈しないで進行することを可能にすることが見出され
た。
シクロデキストリンは、環状アミロースである。α−シ
クロデキストリンはシクロヘキサアミロースであり、β
−シクロデキストリンはシクロヘプタアミロースであ
り、そしてγ−シクロデキストリンはシクロオクタアミ
ロースである。これらの環状アミロースは封入化合物
（包接体）を形成し、そして多くの異なった有機分子を
取り込むことができる。しかしながら、界面活性剤を取
り込むためのそれらの使用及びそれによるペプチド表面
から界面活性剤の除去は、本発明のこの観点が発見され
るまで知られていなかった。
クロデキストリンはシクロヘキサアミロースであり、β
−シクロデキストリンはシクロヘプタアミロースであ
り、そしてγ−シクロデキストリンはシクロオクタアミ
ロースである。これらの環状アミロースは封入化合物
（包接体）を形成し、そして多くの異なった有機分子を
取り込むことができる。しかしながら、界面活性剤を取
り込むためのそれらの使用及びそれによるペプチド表面
から界面活性剤の除去は、本発明のこの観点が発見され
るまで知られていなかった。
これら３種のすべてのシクロデキストリンは、β−ガラ
クトシダーゼのフラグメントを安定化するために使用さ
れる界面活性剤を除去することにおいて効果的である
が、利点は、シクロデキストリンの内部空間の大きさと
界面活性剤の大きさとを調和せしめることによって達成
される。従って、クロール酸誘導体に由来する界面活性
剤は、γ−シクロデキストリン（これは最大の内部空間
を有する）を用いて最っとも容易に除去される。小さな
界面活性剤、たとえばアミノ酸の脂肪酸アミド及び脂肪
スルホネートは、α−シクロデキストリン（これは３種
のシクロデキストリンの中で最小の内部空間を有する）
により最っとも容易に除去される。
クトシダーゼのフラグメントを安定化するために使用さ
れる界面活性剤を除去することにおいて効果的である
が、利点は、シクロデキストリンの内部空間の大きさと
界面活性剤の大きさとを調和せしめることによって達成
される。従って、クロール酸誘導体に由来する界面活性
剤は、γ−シクロデキストリン（これは最大の内部空間
を有する）を用いて最っとも容易に除去される。小さな
界面活性剤、たとえばアミノ酸の脂肪酸アミド及び脂肪
スルホネートは、α−シクロデキストリン（これは３種
のシクロデキストリンの中で最小の内部空間を有する）
により最っとも容易に除去される。
シクロデキストリンの使用は、アッセイ媒体の希釈が必
要とされる程度を減じ、そして従って、相補性アッセイ
媒体から界面活性剤を除去するためのシクロデキストリ
ンの使用は、本発明の最っとも広い観点の範囲内に存在
する。しかしながら、シクロデキストリン：界面活性剤
のモル比は、少なくとも１：１、好ましくは少なくとも
２：１であることが好ましい。シクロデキストリン自体
は相補性アッセイに何らかの悪影響を有するので、界面
活性剤の効果を中和するのに必要とされる量よりもわず
かに過剰量のシクロデキストリンを使用することが好ま
しい。この量は、界面活性剤の与えられた濃度に対する
シクロデキストリンの種々の希釈度を用いての単純な実
験により容易に決定され得る。８：１以下、好ましくは
４：１以下（シクロデキストリン：界面活性剤）のモル
比の上限を維持することが好ましい。これらの限度は、
状況に依存して、所望により調整され得る。
要とされる程度を減じ、そして従って、相補性アッセイ
媒体から界面活性剤を除去するためのシクロデキストリ
ンの使用は、本発明の最っとも広い観点の範囲内に存在
する。しかしながら、シクロデキストリン：界面活性剤
のモル比は、少なくとも１：１、好ましくは少なくとも
２：１であることが好ましい。シクロデキストリン自体
は相補性アッセイに何らかの悪影響を有するので、界面
活性剤の効果を中和するのに必要とされる量よりもわず
かに過剰量のシクロデキストリンを使用することが好ま
しい。この量は、界面活性剤の与えられた濃度に対する
シクロデキストリンの種々の希釈度を用いての単純な実
験により容易に決定され得る。８：１以下、好ましくは
４：１以下（シクロデキストリン：界面活性剤）のモル
比の上限を維持することが好ましい。これらの限度は、
状況に依存して、所望により調整され得る。
血清もまた、界面活性剤の効果を中和するために作用す
ることが見出された。シクロデキストリンの不在下でさ
え、比較的高い濃度の血清で行なわれる反応は、低血清
濃度で行なわれる反応よりもより容易に相補性を可能に
する。アッセイの相補的段階に使用される合計アッセイ
体積の少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％の
血清濃度は、相補性が測定可能な程度に進行することを
可能にするのに十分である。
ることが見出された。シクロデキストリンの不在下でさ
え、比較的高い濃度の血清で行なわれる反応は、低血清
濃度で行なわれる反応よりもより容易に相補性を可能に
する。アッセイの相補的段階に使用される合計アッセイ
体積の少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％の
血清濃度は、相補性が測定可能な程度に進行することを
可能にするのに十分である。
本発明は、一般的に記載されてきたが、次の例は本発明
を例示するものであって、限定するものではない。
を例示するものであって、限定するものではない。
次の略語及び商標は、特定の界面活性剤を示すために次
の例で使用される： ＬＳ＝Ｎ−ラウロイルサルコシン（また、Ｎ−ドデカノ
イル−Ｎ−メチルグリシンとして知られる）；CHAPS＝
３−〔（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニ
オ〕−１−プロパンスルホネート；CHAPSO＝３−〔（３
−コールアミド−プロピル）ジメチルアンモニオ〕−２
−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート；ＴＤＡ＝タ
ウロドオキシコール酸（また、３α，12α−ジヒドロキ
シ−５β−コラン−２４−オイック酸Ｎ−〔２−スルホ
エチル〕アミドとして知られている）；Mega 10＝Ｎ−
デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド；Brij 99＝平均２
０のオキシエチレン単位を含むポリオキシエチレンのオ
レイルエーテルの商標；Triton X67＝不特定構造の固体
フレークのポリオキシエチン脂肪酸エーテル（非イオン
性）のための商標；Brij 96＝平均１０のオキシエチレ
ン単位を含むポリエチレンのオレイルエーテルの商標；
Lubrol PX＝脂肪アルコールのエチレンオキシド縮合体
（正確な構造は不特定である）の商標；Nonidet P-40＝
フェノール１モル当りエチレンオキシド平均９モルを含
むオクタルフェノール−エチレンオキシド縮合体のため
の商標；及びTween 20＝ポリオキシエチレン及びソルビ
トールのエーテルとドデカン酸及び他の脂肪酸との縮合
生成物のための商標名。
の例で使用される： ＬＳ＝Ｎ−ラウロイルサルコシン（また、Ｎ−ドデカノ
イル−Ｎ−メチルグリシンとして知られる）；CHAPS＝
３−〔（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニ
オ〕−１−プロパンスルホネート；CHAPSO＝３−〔（３
−コールアミド−プロピル）ジメチルアンモニオ〕−２
−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート；ＴＤＡ＝タ
ウロドオキシコール酸（また、３α，12α−ジヒドロキ
シ−５β−コラン−２４−オイック酸Ｎ−〔２−スルホ
エチル〕アミドとして知られている）；Mega 10＝Ｎ−
デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド；Brij 99＝平均２
０のオキシエチレン単位を含むポリオキシエチレンのオ
レイルエーテルの商標；Triton X67＝不特定構造の固体
フレークのポリオキシエチン脂肪酸エーテル（非イオン
性）のための商標；Brij 96＝平均１０のオキシエチレ
ン単位を含むポリエチレンのオレイルエーテルの商標；
Lubrol PX＝脂肪アルコールのエチレンオキシド縮合体
（正確な構造は不特定である）の商標；Nonidet P-40＝
フェノール１モル当りエチレンオキシド平均９モルを含
むオクタルフェノール−エチレンオキシド縮合体のため
の商標；及びTween 20＝ポリオキシエチレン及びソルビ
トールのエーテルとドデカン酸及び他の脂肪酸との縮合
生成物のための商標名。
例１ 種々の量の存在するドデシル硫酸ナトリウムによる酵素
供与体の安定性の変化 ４セットのアッセイが、３種の異なった抗原を有する又
はいづれの抗原も持たない酵素供与体分子を用いて行な
われた。ＥＤ４として同定される基本酵素供与体は、ア
ミノ末端基及びカルボキシル末端基に結合された制限部
位ペプチドを有するＮ−末端残基６〜５１から成る。基
本酵素供与体に結合された３種の抗原は、Ｔ４、ジゴキ
シン及びテオフィリンであった。結合は、抗原とポリペ
プチドの位置４６でのシスチン残基との間でマレイミド
結合によってであった。初期の酵素供与体濃度は、ＥＤ
４で２５nM、ED4-T4で２０nM、ED4-Digで２０nM、及びE
D4-Theoで４０nMであった。
供与体の安定性の変化 ４セットのアッセイが、３種の異なった抗原を有する又
はいづれの抗原も持たない酵素供与体分子を用いて行な
われた。ＥＤ４として同定される基本酵素供与体は、ア
ミノ末端基及びカルボキシル末端基に結合された制限部
位ペプチドを有するＮ−末端残基６〜５１から成る。基
本酵素供与体に結合された３種の抗原は、Ｔ４、ジゴキ
シン及びテオフィリンであった。結合は、抗原とポリペ
プチドの位置４６でのシスチン残基との間でマレイミド
結合によってであった。初期の酵素供与体濃度は、ＥＤ
４で２５nM、ED4-T4で２０nM、ED4-Digで２０nM、及びE
D4-Theoで４０nMであった。
貯蔵緩衝液は、150mMのKPO4、100mMのNaPO4〔“KPO4”
及び“NaPO4”は、７．０のpHを提供するために平衡化
されたK2HPO4及びKH2PO4（又はその対応するナトリウム
塩）の混合物のための名称である〕、１０nMのEGTA〔エ
チレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテ
ル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ酢酸〕、２mMのMg(O
Ac)2、0.05％Tween 20、0.05mMのＤＴＴ（ジチオトレイ
トール）２０mMのNaN3、２．４％エチレングリコール
（pH７．０）から成る。貯蔵容器は、パラフィンにより
密封された透明なガラス試験管であった。
及び“NaPO4”は、７．０のpHを提供するために平衡化
されたK2HPO4及びKH2PO4（又はその対応するナトリウム
塩）の混合物のための名称である〕、１０nMのEGTA〔エ
チレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテ
ル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ酢酸〕、２mMのMg(O
Ac)2、0.05％Tween 20、0.05mMのＤＴＴ（ジチオトレイ
トール）２０mMのNaN3、２．４％エチレングリコール
（pH７．０）から成る。貯蔵容器は、パラフィンにより
密封された透明なガラス試験管であった。
酵素供与体安定性を、800nMの酵素受容体100μ、20nM
の酵素供与体１０μ、０．６mg／mlのCPRG（クロロフ
ェノールレッドβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、β−ガラ
クトシダーゼ基質）190μを用いて相補性アッセイを
行なうことによって決定し；その酵素をこのアッセイで
３０倍に希釈した。酵素活性が、成分の貯蔵の前（日
０）及び貯蔵の後１，５，８，15，21及び４１日で測定
された（３０℃）。
の酵素供与体１０μ、０．６mg／mlのCPRG（クロロフ
ェノールレッドβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、β−ガラ
クトシダーゼ基質）190μを用いて相補性アッセイを
行なうことによって決定し；その酵素をこのアッセイで
３０倍に希釈した。酵素活性が、成分の貯蔵の前（日
０）及び貯蔵の後１，５，８，15，21及び４１日で測定
された（３０℃）。
すべての４種のED4-Ｘ試薬（３種の接合体及び対照、非
変性酵素供与体）は、時間と共に相補性に基づく酵素活
性の損失を示した。４１日で、すべての酵素の活性レベ
ルは、安定剤の不在下で元の活性の30〜40％の範囲内に
あった。
変性酵素供与体）は、時間と共に相補性に基づく酵素活
性の損失を示した。４１日で、すべての酵素の活性レベ
ルは、安定剤の不在下で元の活性の30〜40％の範囲内に
あった。
次に、添加されたドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
が、相補性により形成された再構成酵素の活性を維持す
るかどうかを決定するために、追加の実験を行なった。
実験的誤差のせいである異例の結果が、多くの場合、添
加されたＳＤＳの低濃度で示されたけれども、ＳＤＳの
量を高めるにつれて貯蔵安定性が高まる一般的傾向が存
在した。0.06％，0.015％，0.03％及び0.015％の濃度
が、それぞれED4-T4-ED4-Dig，ED4-Theo及びＥＤ４に関
して４１日で、元の活性の９０％又はそれ以上のレベル
で酵素活性を維持するために必要とされた。
が、相補性により形成された再構成酵素の活性を維持す
るかどうかを決定するために、追加の実験を行なった。
実験的誤差のせいである異例の結果が、多くの場合、添
加されたＳＤＳの低濃度で示されたけれども、ＳＤＳの
量を高めるにつれて貯蔵安定性が高まる一般的傾向が存
在した。0.06％，0.015％，0.03％及び0.015％の濃度
が、それぞれED4-T4-ED4-Dig，ED4-Theo及びＥＤ４に関
して４１日で、元の活性の９０％又はそれ以上のレベル
で酵素活性を維持するために必要とされた。
ＳＤＳの存在下でＥＤ４の明白な活性化が存在する。界
面活性剤により引き起こされた変性は、より安定した、
活性が低い形のＥＤ４（界面活性剤の不在下で存在す
る）が相補性アッセイの間、希釈に基ずいてより活性的
な配置に再生することを可能にすることができる。ＥＤ
４接合体は、この明白に異例な挙動を示さない。なぜな
らば、たぶん、それらは、それらが接合体を形成するた
めに抗原の結合の結果として存在することができる配置
においてより制限されるからである。この理論は証明さ
れていないが、但し、これらの実験に示された結果を理
解することにおいて助けとなるであろう。
面活性剤により引き起こされた変性は、より安定した、
活性が低い形のＥＤ４（界面活性剤の不在下で存在す
る）が相補性アッセイの間、希釈に基ずいてより活性的
な配置に再生することを可能にすることができる。ＥＤ
４接合体は、この明白に異例な挙動を示さない。なぜな
らば、たぶん、それらは、それらが接合体を形成するた
めに抗原の結合の結果として存在することができる配置
においてより制限されるからである。この理論は証明さ
れていないが、但し、これらの実験に示された結果を理
解することにおいて助けとなるであろう。
例２ ED4-T4の安定性に対する種々の界面活性剤の効果 多くの異なった界面活性剤が、例１に示されているのと
同じ貯蔵緩衝液、貯蔵容器及び貯蔵温度を用いて、ED4-
T4の貯蔵安定性に対するそれらの効果について試験され
た。ED4-T4の濃度は２０nMであり、そして貯蔵時間は８
日に制限された。酵素活性は、例１と同じ方法でアッセ
イされた。
同じ貯蔵緩衝液、貯蔵容器及び貯蔵温度を用いて、ED4-
T4の貯蔵安定性に対するそれらの効果について試験され
た。ED4-T4の濃度は２０nMであり、そして貯蔵時間は８
日に制限された。酵素活性は、例１と同じ方法でアッセ
イされた。
結果は下の第１表に示される。
最良の安定性は、示された濃度でのＮ−ラウロイルサル
コシン、CHAPS、タウロデオキシコール酸、及びMega 10
により達成された。表に示されたような多くの非イオン
性界面活性剤は、適切でない効果又は不利益な効果を示
した。
コシン、CHAPS、タウロデオキシコール酸、及びMega 10
により達成された。表に示されたような多くの非イオン
性界面活性剤は、適切でない効果又は不利益な効果を示
した。
例３ ＥＤ４安定性に対する界面活性剤の効果 ＥＤ４の安定性に対する種々の界面活性剤の効果が、例
２に示された同じ反応条件を用いて決定された。２５nM
の濃度のＥＤ４が使用された。結果は第２表に示され
る。
２に示された同じ反応条件を用いて決定された。２５nM
の濃度のＥＤ４が使用された。結果は第２表に示され
る。
最良の安定性は、示された濃度でのＮ−ラウロイサルコ
シン、CHAPS、タウロデオキシコール酸及びナトリウム
チオシアネートにより達成された。ある活性化（例１の
ＳＤＳにより見られる活性に類似する）が、Ｎ−ラウロ
シルサルコシンに関して見られた。
シン、CHAPS、タウロデオキシコール酸及びナトリウム
チオシアネートにより達成された。ある活性化（例１の
ＳＤＳにより見られる活性に類似する）が、Ｎ−ラウロ
シルサルコシンに関して見られた。
例４ ED4-T4の安定性に対する種々の界面活性剤及びカオトロ
ピック条件の効果 ED4-T4の安定性に対する種々の界面活性剤及びカオトロ
ピック条件の効果が、例２に示された同じ条件下で決定
された。ED4-T4の濃度は２０nMであった。酵素活性は、
０，１，５，８，14及び３４日で測定された。
ピック条件の効果 ED4-T4の安定性に対する種々の界面活性剤及びカオトロ
ピック条件の効果が、例２に示された同じ条件下で決定
された。ED4-T4の濃度は２０nMであった。酵素活性は、
０，１，５，８，14及び３４日で測定された。
Ｎ−ラウロイルサルコシン、タウロデオキシコーレー
ト、CHAPS及びNaSCNが種々の濃度で試験された。元の活
性の少なくとも９０％の酵素活性が、最少濃度の0.06％
Ｎ−ラウロイルサルコシン、0.24％タウロデオキシコー
ル酸及び１Ｍナトリウムチオシアネートにより得られ
た。３４日で、CHAPSは９０％以上の安定性を維持しな
かった。安定剤の不在は、すべての場合において酵素活
性が元の活性の22〜34％の範囲に低下することを引き起
こした。示された界面活性剤又はカオトロピック条件
（ナトリウムチオシアネート）の量が多くなるほど、安
定性が高まる一般的な傾向がすべての場合において存在
した。
ト、CHAPS及びNaSCNが種々の濃度で試験された。元の活
性の少なくとも９０％の酵素活性が、最少濃度の0.06％
Ｎ−ラウロイルサルコシン、0.24％タウロデオキシコー
ル酸及び１Ｍナトリウムチオシアネートにより得られ
た。３４日で、CHAPSは９０％以上の安定性を維持しな
かった。安定剤の不在は、すべての場合において酵素活
性が元の活性の22〜34％の範囲に低下することを引き起
こした。示された界面活性剤又はカオトロピック条件
（ナトリウムチオシアネート）の量が多くなるほど、安
定性が高まる一般的な傾向がすべての場合において存在
した。
例５ ＥＤ４の安定性に対する種々の界面活性剤及びカオトロ
ピック条件の効果 ＥＤ４の安定性に対する種々の界面活性剤及びナトリウ
ムチオシアネートの効果が、例４に報告されたのと類似
する実験で測定された。ＥＤ濃度は２５nMであった。測
定時間及び界面活性剤は、例４に報告されたのと同じで
ある。
ピック条件の効果 ＥＤ４の安定性に対する種々の界面活性剤及びナトリウ
ムチオシアネートの効果が、例４に報告されたのと類似
する実験で測定された。ＥＤ濃度は２５nMであった。測
定時間及び界面活性剤は、例４に報告されたのと同じで
ある。
同じ一般的傾向が見られた。少なくとも９０％又はそれ
以上の元の酵素活性の保持が、最少濃度の0.03％Ｎ−ラ
ウロイルサルコシン、0.24％タウロデオキシコール酸、
１．８％CHAPS及び１Ｍナトリウムチオシアネートによ
り得られた。安定剤の不在下での安定性は、47〜57％の
範囲であった。
以上の元の酵素活性の保持が、最少濃度の0.03％Ｎ−ラ
ウロイルサルコシン、0.24％タウロデオキシコール酸、
１．８％CHAPS及び１Ｍナトリウムチオシアネートによ
り得られた。安定剤の不在下での安定性は、47〜57％の
範囲であった。
例６ ED4-T4安定性に対する種々の物質の効果 ED4-T4安定性に対する多くの異なった変性剤及び溶媒の
効果が、例４に記載のアッセイに類似するアッセイで決
定された。ED4-T4の濃度は２０nMであり、そして貯蔵安
定性は１４日間測定された。その結果は第３及び４表に
示される。
効果が、例４に記載のアッセイに類似するアッセイで決
定された。ED4-T4の濃度は２０nMであり、そして貯蔵安
定性は１４日間測定された。その結果は第３及び４表に
示される。
最良の安定性は、示された濃度でＳＤＳ、メタノール、
アセトニトリル、プロピレングリコール及びエチレング
リコールにより達成された。
アセトニトリル、プロピレングリコール及びエチレング
リコールにより達成された。
例７ シクロデキストリンによる界面活性剤の中和 ED4-T4及びED4-Dig相補性アッセイに基ずいてラウロイ
ルサルコシンを中和するα−，β−、及びγ−シクロデ
キストリンの能力を決定した。貯蔵緩衝液は、例１に記
載のものと同じであった。アッセイは直ちに行なわれた
（すなわち、貯蔵しないで）。その相補性アッセイは、
800nM酵素受容体100μ、２nM酵素供与体100μ及び
１．１mg／ml CPRG100μを用いて行なわれた。希釈は
必要でなかった。結果は第１表に示される。
ルサルコシンを中和するα−，β−、及びγ−シクロデ
キストリンの能力を決定した。貯蔵緩衝液は、例１に記
載のものと同じであった。アッセイは直ちに行なわれた
（すなわち、貯蔵しないで）。その相補性アッセイは、
800nM酵素受容体100μ、２nM酵素供与体100μ及び
１．１mg／ml CPRG100μを用いて行なわれた。希釈は
必要でなかった。結果は第１表に示される。
第１図の左のパネルは、酵素供与体としてED4-T4を用い
る相補性アッセイに基づいてα−，β−、及びγ−シク
ロデキストリンの効果を示す。％シクロデキストリンが
相補性活性（mA／秒で示される）に対して図示されるシ
クロデキストリンが安定剤の不在下で添加される場合、
相補性活性のわずかな減少が、それぞれのシクロデキス
トリンの濃度の低下に伴って見られた。同様に、貯蔵の
間、試薬中における安定剤としてラウロイルサルコシン
の存在は、０％シクロデキストリン軸での活性によって
示されるように相補性を妨害した。すべてのタイプのシ
クロデキストリンの量を高めることは、相補性アッセイ
に関するラウロイルサルコシンの妨害を中和することに
有効であった。α−シクロデキストリンは最っとも効果
的であり、そしてγ−シクロデキストリンは最少の有効
性を示した。類似する結果が、右のパネルにおいて示さ
れ、これは、試薬中におけるラウロイルサルコシンの不
在又は存在下でED4-Digを使用しての相補性アッセイに
基ずくシクロデキストリンの効果を示す。
る相補性アッセイに基づいてα−，β−、及びγ−シク
ロデキストリンの効果を示す。％シクロデキストリンが
相補性活性（mA／秒で示される）に対して図示されるシ
クロデキストリンが安定剤の不在下で添加される場合、
相補性活性のわずかな減少が、それぞれのシクロデキス
トリンの濃度の低下に伴って見られた。同様に、貯蔵の
間、試薬中における安定剤としてラウロイルサルコシン
の存在は、０％シクロデキストリン軸での活性によって
示されるように相補性を妨害した。すべてのタイプのシ
クロデキストリンの量を高めることは、相補性アッセイ
に関するラウロイルサルコシンの妨害を中和することに
有効であった。α−シクロデキストリンは最っとも効果
的であり、そしてγ−シクロデキストリンは最少の有効
性を示した。類似する結果が、右のパネルにおいて示さ
れ、これは、試薬中におけるラウロイルサルコシンの不
在又は存在下でED4-Digを使用しての相補性アッセイに
基ずくシクロデキストリンの効果を示す。
例８ 血清によるLIDS及びラウロイルサルコシンの中和 初期研究は、血清が相補性アッセイにおいて界面活性剤
の中和のためにたぶん有用であることを示した。この可
能性は、前の実験におけるのと同じ貯蔵緩衝液を使用す
る実験で確められた。しかしながら、貯蔵安定性は試験
されなかったので、そのアッセイは直ちに行なわれた。
２種の一連のアッセイが、貯蔵緩衝液中に２．０nMの濃
度でのED4-T4又はED4-Digのいずれかを用いて行なわれ
た。アッセイ混合物は、貯蔵緩衝液中に酵素供与体100
μ，720nMの酵素受容体(EA1150)１００μ，０．６m
g／mlのCPRG 100μ及び種々の希釈度での血清３３μ
を含んだ。得られたアッセイ溶液中の血清の濃度は、
０〜１０％であり、そしてLIDS及びラウロイルサルコシ
ンの濃度はそれぞれ０〜0.048及び０〜0.24％であっ
た。
の中和のためにたぶん有用であることを示した。この可
能性は、前の実験におけるのと同じ貯蔵緩衝液を使用す
る実験で確められた。しかしながら、貯蔵安定性は試験
されなかったので、そのアッセイは直ちに行なわれた。
２種の一連のアッセイが、貯蔵緩衝液中に２．０nMの濃
度でのED4-T4又はED4-Digのいずれかを用いて行なわれ
た。アッセイ混合物は、貯蔵緩衝液中に酵素供与体100
μ，720nMの酵素受容体(EA1150)１００μ，０．６m
g／mlのCPRG 100μ及び種々の希釈度での血清３３μ
を含んだ。得られたアッセイ溶液中の血清の濃度は、
０〜１０％であり、そしてLIDS及びラウロイルサルコシ
ンの濃度はそれぞれ０〜0.048及び０〜0.24％であっ
た。
結果は第２図に示される。この図は、血清がLIDS及びラ
ウロイルサルコシンの両者によって引き起こされるED4-
T4及びED4-Dig接合体の相補性の阻害を中和することを
示す。中和の程度は、アッセイ中の変性剤及び血清の量
に依存した。ジゴキシンのための１０％血清アッセイ
は、これらの条件下で完全に中和され；ED4-T4のための
３．３％血清アッセイは種々の中和化を示した。追加の
中和が、低血清含有率アッセイのために必要とされた。
ウロイルサルコシンの両者によって引き起こされるED4-
T4及びED4-Dig接合体の相補性の阻害を中和することを
示す。中和の程度は、アッセイ中の変性剤及び血清の量
に依存した。ジゴキシンのための１０％血清アッセイ
は、これらの条件下で完全に中和され；ED4-T4のための
３．３％血清アッセイは種々の中和化を示した。追加の
中和が、低血清含有率アッセイのために必要とされた。
例９ 相補性アッセイにおけるα−シクロデキストリンによる
ラウロイルサルコシンの中和 前の例の界面活性剤の中和が、比較的単純な相補性緩衝
液中で行なわれた。これらのアッセイが、たとえば（ED
4-T4のために）、８０mMのKPO4、スクロース、ＡＮＳ
（８−アニリノナフタレンスルホン酸、チロピン開放
剤）、メチオニン、GARS（ヤギ抗−ウサギ抗血清）、ウ
サギ起源の抗−Ｔ４抗体及びCPRGを含むより複雑な緩衝
溶液（pH７．０）中でくり返される場合、類似する結果
が得られた。α−シクロデキストリンは、ラウロイルサ
ルコシンによる相補性の阻害を完全に中和することが示
された。界面活性剤の完全な中和のために必要なα−シ
クロデキストリンの最少濃度は、他のアッセイ成分の存
在によりいく分変わった。たとえば、血清の存在は、完
全な中和のために必要なα−シクロデキストリンの量を
減じた。これは、例８において示された結果を再び肯定
する。試験されるラウロイルサルコシン（0.18％）の最
大濃度を中和するために必要とされるα−シクロデキス
トリンの最少量は、血清を含まないED4-Digアッセイの
ためには０．６％〜１０％血清を含むED4-Digアッセイ
のためには０．１％であった。類似する結果がED4-T4ア
ッセイに関して見られ；０．２％の濃度のα−シクロデ
キストリンは、３．３％血清を含むアッセイ媒体中、0.
18％ラウロイルサルコシンを完全に中和するために十分
であり、ところが０．３％以上の濃度のα−シクロデキ
ストリンが、血清の不在下で必要とされた。
ラウロイルサルコシンの中和 前の例の界面活性剤の中和が、比較的単純な相補性緩衝
液中で行なわれた。これらのアッセイが、たとえば（ED
4-T4のために）、８０mMのKPO4、スクロース、ＡＮＳ
（８−アニリノナフタレンスルホン酸、チロピン開放
剤）、メチオニン、GARS（ヤギ抗−ウサギ抗血清）、ウ
サギ起源の抗−Ｔ４抗体及びCPRGを含むより複雑な緩衝
溶液（pH７．０）中でくり返される場合、類似する結果
が得られた。α−シクロデキストリンは、ラウロイルサ
ルコシンによる相補性の阻害を完全に中和することが示
された。界面活性剤の完全な中和のために必要なα−シ
クロデキストリンの最少濃度は、他のアッセイ成分の存
在によりいく分変わった。たとえば、血清の存在は、完
全な中和のために必要なα−シクロデキストリンの量を
減じた。これは、例８において示された結果を再び肯定
する。試験されるラウロイルサルコシン（0.18％）の最
大濃度を中和するために必要とされるα−シクロデキス
トリンの最少量は、血清を含まないED4-Digアッセイの
ためには０．６％〜１０％血清を含むED4-Digアッセイ
のためには０．１％であった。類似する結果がED4-T4ア
ッセイに関して見られ；０．２％の濃度のα−シクロデ
キストリンは、３．３％血清を含むアッセイ媒体中、0.
18％ラウロイルサルコシンを完全に中和するために十分
であり、ところが０．３％以上の濃度のα−シクロデキ
ストリンが、血清の不在下で必要とされた。
例１０ 相補性アッセイにおけるβ−シクロデキストリンによる
ラウロイルサルコシンの中和 ラウロイルサルコシンを中和するためのβ−シクロデキ
ストリンの能力を、８０mMのKPO4、１０mMのEGTA、２mM
の酢酸マグネシウム、２０mMのアジ化ナトリウム、0.05
％のTween 20、0.05mMのＤＴＴを含む完全アッセイ媒体
（pH７．０）中で示した。上記成分は、酵素供与体及び
酵素受容体貯蔵溶液の両者に存在した。酵素供与体（ED
4-T4）溶液はまた、１．４mg／mlのCPRG及び１：52GARS
も含んだ。酵素受容体溶液はまた、５mMサクロース、１
０mMのメチオニン、０．３mMのＡＮＳ、及び抗−Ｔ４抗
体の１：350希釈溶液も含んだ。アッセイの体積は、種
々の量のβ−シクロデキストリンを含む酵素受容体125
μ、種々の量のラウロイルサルコシンを含む酵素供与
体６５μ、水51.6μ及びサンプル８．３μであっ
た。種々の濃度のラウロイルサルコシン及びβ−シクロ
デキストリンが第３図に示され、そしてこれはまた、ア
ッセイの結果も示す。
ラウロイルサルコシンの中和 ラウロイルサルコシンを中和するためのβ−シクロデキ
ストリンの能力を、８０mMのKPO4、１０mMのEGTA、２mM
の酢酸マグネシウム、２０mMのアジ化ナトリウム、0.05
％のTween 20、0.05mMのＤＴＴを含む完全アッセイ媒体
（pH７．０）中で示した。上記成分は、酵素供与体及び
酵素受容体貯蔵溶液の両者に存在した。酵素供与体（ED
4-T4）溶液はまた、１．４mg／mlのCPRG及び１：52GARS
も含んだ。酵素受容体溶液はまた、５mMサクロース、１
０mMのメチオニン、０．３mMのＡＮＳ、及び抗−Ｔ４抗
体の１：350希釈溶液も含んだ。アッセイの体積は、種
々の量のβ−シクロデキストリンを含む酵素受容体125
μ、種々の量のラウロイルサルコシンを含む酵素供与
体６５μ、水51.6μ及びサンプル８．３μであっ
た。種々の濃度のラウロイルサルコシン及びβ−シクロ
デキストリンが第３図に示され、そしてこれはまた、ア
ッセイの結果も示す。
β−シクロデキストリンは、３．３％血清及び残りのア
ッセイ成分の存在下でｎ−ラウロイルサルコシンを中和
した。これらの結果は、α−シクロデキストリンに関し
て例９で示された結果に類似する。β−シクロデキスト
リンは、ED4-T4アッセイにおいて抗体結合を妨害しない
けれども、抗体結合の破壊がジゴキシンアッセイで見ら
れた。
ッセイ成分の存在下でｎ−ラウロイルサルコシンを中和
した。これらの結果は、α−シクロデキストリンに関し
て例９で示された結果に類似する。β−シクロデキスト
リンは、ED4-T4アッセイにおいて抗体結合を妨害しない
けれども、抗体結合の破壊がジゴキシンアッセイで見ら
れた。
例１１ 相補性アッセイにおけるβ−シクロデキストリンによる
タウロデオキシコール酸の中和 タウロデオキシコール酸（ＴＤＡ）を中和するためのβ
−シクロデキストリンの能力が、例１０に記載された同
じアッセイ条件を用いて決定された。β−シクロデキス
トリンの濃度は０〜０．８％の範囲であり、タウロデオ
キシコール酸の濃度は０〜0.48％であり、そして血清濃
度は０〜１０％である。その結果はラウロイルサクロシ
ンについての結果に類似するが、しかしβ−シクロデキ
ストリンは、与えられた濃度で効果が少なかった。高濃
度のタウロデオキシコール酸は、β−シクロデキストリ
ンの可溶性範囲で効果的に中和され得なかった。しかし
ながら、低濃度のものは、効果的に中和され得た。0.12
％でのＴＤＡは、０．４％β−シクロデキストリンで効
果的に中和され；0.24％でのＴＤＡは、０．８％β−シ
クロデキストリンで中和された。
タウロデオキシコール酸の中和 タウロデオキシコール酸（ＴＤＡ）を中和するためのβ
−シクロデキストリンの能力が、例１０に記載された同
じアッセイ条件を用いて決定された。β−シクロデキス
トリンの濃度は０〜０．８％の範囲であり、タウロデオ
キシコール酸の濃度は０〜0.48％であり、そして血清濃
度は０〜１０％である。その結果はラウロイルサクロシ
ンについての結果に類似するが、しかしβ−シクロデキ
ストリンは、与えられた濃度で効果が少なかった。高濃
度のタウロデオキシコール酸は、β−シクロデキストリ
ンの可溶性範囲で効果的に中和され得なかった。しかし
ながら、低濃度のものは、効果的に中和され得た。0.12
％でのＴＤＡは、０．４％β−シクロデキストリンで効
果的に中和され；0.24％でのＴＤＡは、０．８％β−シ
クロデキストリンで中和された。
タウロデオキシコール酸を中和する試みにおけるα−シ
クロデキストリンを使用しての類似する実験において、
α−シクロデキストリンの中和効果は示され得なかっ
た。他方、γ−シクロデキストリンは、ＴＤＡを中和す
ることにおいて、β−シクロデキストリンよりもより効
果的であった。ここで示される他の結果に基ずけば、こ
の結果は、シクロデキストリンの初めの大きさによって
説明できるように思われる。すなわちγ−シクロデキス
トリンは、最っとも大きな中央空間を有し、そして従っ
て、タウロデオキシコール酸のステロイド環のために利
用できる最大のルームを有する。
クロデキストリンを使用しての類似する実験において、
α−シクロデキストリンの中和効果は示され得なかっ
た。他方、γ−シクロデキストリンは、ＴＤＡを中和す
ることにおいて、β−シクロデキストリンよりもより効
果的であった。ここで示される他の結果に基ずけば、こ
の結果は、シクロデキストリンの初めの大きさによって
説明できるように思われる。すなわちγ−シクロデキス
トリンは、最っとも大きな中央空間を有し、そして従っ
て、タウロデオキシコール酸のステロイド環のために利
用できる最大のルームを有する。
この明細書に記載されたすべての出版物及び特許出願
は、本発明が関与する当業者の熟練のレベルのしるしで
ある。すべての出版物及び特許出願は、引用により本明
細書に組み込まれる。
は、本発明が関与する当業者の熟練のレベルのしるしで
ある。すべての出版物及び特許出願は、引用により本明
細書に組み込まれる。
本発明は十分に記載されたが、多くの変性及び修飾が特
許請求の範囲内で行なわれ得ることは、当業者にとって
明らかであろう。
許請求の範囲内で行なわれ得ることは、当業者にとって
明らかであろう。
第１図は、酸素供与体としてED4-T4を用いての相補性ア
ッセイに基ずくα−，β−、及びγ−シクロデキストリ
ンの効果を示し； 第２図は、血清がLIDS及びラウロイルサルコシンの両者
によって引き起こされるED4-T4及びED4-Dig接合体の相
補性の阻害を中和することを示し；そして 第３図は、β−シクロデキストリンによるラウロイルサ
ルコシンの中和を示す。
ッセイに基ずくα−，β−、及びγ−シクロデキストリ
ンの効果を示し； 第２図は、血清がLIDS及びラウロイルサルコシンの両者
によって引き起こされるED4-T4及びED4-Dig接合体の相
補性の阻害を中和することを示し；そして 第３図は、β−シクロデキストリンによるラウロイルサ
ルコシンの中和を示す。
Claims (11)
- 【請求項１】相補性活性のβ−ガラクトシダーゼペプチ
ドフラグメントの貯蔵損失に対する安定化の方法であっ
て： イオン性界面活性剤又は糖残基に由来する界面活性剤を
含む貯蔵媒体中にβ−ガラクトシダーゼペプチドフラグ
メントを貯蔵することを含んで成る方法。 - 【請求項２】前記界面活性剤が脂肪スルホネート、アミ
ノ酸の脂肪酸アミド、糖又は糖酸アミドの脂肪酸エステ
ル、又はコール酸アミドのスルホネート含有誘導体であ
る請求項１記載の方法。 - 【請求項３】前記界面活性剤が、ドデシルスルフェート
の塩、Ｎ−ラウロイルサルコシン、３−〔（３−コラミ
ド−プロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパンス
ルホネート、３−〔（３−コラミドプロピル）ジメチル
アンモニオ〕−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネ
ート、タウロデオキシコール酸、又はデカノイル−Ｎ−
メチルグルコンアミドである請求項２記載の方法。 - 【請求項４】前記界面活性剤が0.006〜１．８％の濃度
で存在する請求項１記載の方法。 - 【請求項５】前記ペプチドフラグメントがβ−ガラクト
シダーゼのα−領域フラグメントである請求項１記載の
方法。 - 【請求項６】相補性アッセイにおいて前記貯蔵の後、但
し前記フラグメントを用いる前、前記貯蔵媒体にシクロ
デキストリンを添加することをさらに含んで成る請求項
１記載の方法。 - 【請求項７】前記シクロデキストリンがα−及びβ−シ
クロデキストリンであり、そして前記界面活性剤がＮ−
ラウロイルサルコシンである請求項６記載の方法。 - 【請求項８】前記シクロデキストリンがγ−シクロデキ
ストリンであり、そして前記界面活性剤がコール酸アミ
ドのスルホネート含有誘導体である請求項６記載の方
法。 - 【請求項９】前記シクロデキストリン：界面活性剤のモ
ル比が少なくとも１：１である請求項６記載の方法。 - 【請求項１０】前記酵素フラグメントがβ−ガラクトシ
ダーゼの残基６〜５１を含んで成る請求項１記載の方
法。 - 【請求項１１】前記相補性アッセイが、前記界面活性剤
及び少なくとも３．３％の血清を含む溶液中で行なわれ
る請求項１記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US34757 | 1987-04-06 | ||
| US07/034,757 US4956274A (en) | 1987-04-06 | 1987-04-06 | Reagent stabilization in enzyme-donor and acceptor assay |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6485081A JPS6485081A (en) | 1989-03-30 |
| JPH069510B2 true JPH069510B2 (ja) | 1994-02-09 |
Family
ID=21878404
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63082375A Expired - Fee Related JPH069510B2 (ja) | 1987-04-06 | 1988-04-05 | 酵素−供与体及び受容体アッセイにおける試薬安定化 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4956274A (ja) |
| EP (1) | EP0286367B1 (ja) |
| JP (1) | JPH069510B2 (ja) |
| AT (1) | ATE78061T1 (ja) |
| AU (1) | AU609112B2 (ja) |
| CA (1) | CA1307220C (ja) |
| DE (1) | DE3872561T2 (ja) |
| ES (1) | ES2051838T3 (ja) |
| GR (1) | GR3005798T3 (ja) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| KR910008736B1 (ko) * | 1989-06-13 | 1991-10-19 | 태평양화학주식회사 | 4급암모니움-치환된 사포닌 에테르 유도체 및 그 제조방법 |
| US5212081A (en) * | 1990-04-03 | 1993-05-18 | Microgenics Corporation | Stabilization of polypeptide fragments against proteolytic degradation |
| US5633144A (en) * | 1990-05-03 | 1997-05-27 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Assay pad and method for determination of the presence of total coliforms |
| US5223393A (en) * | 1990-06-12 | 1993-06-29 | Microgenics Corporation | Detection of analytes having binding sites for at least two binding moieties |
| GB9100551D0 (en) * | 1991-01-10 | 1991-02-20 | Amersham Int Plc | Method and reagent for eliminating analytical interference in enzymatic analysis from substances used for extraction of intracellular metabolites |
| JP2562085B2 (ja) * | 1991-02-21 | 1996-12-11 | 天野製薬株式会社 | 酵素の安定化方法 |
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| US5541116A (en) * | 1991-09-30 | 1996-07-30 | B.R.A.H.M.S. Diagnostica Gmbh | Method for the stabilization of endogenous, physiologically active peptides |
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| US5427912A (en) * | 1993-08-27 | 1995-06-27 | Boehringer Mannheim Corporation | Electrochemical enzymatic complementation immunoassay |
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| EP0863402B1 (en) | 1997-03-03 | 2005-09-14 | Amersham Biosciences UK Limited | In-situ cell extraction and assay method |
| EP1057021B1 (en) * | 1998-02-16 | 2007-04-18 | GE Healthcare UK Limited | Method for measurement of total analyte |
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| EP1305634A2 (en) * | 2000-04-03 | 2003-05-02 | Bristol-Myers Squibb Company | Fluorescence assay for gamma-secretase activity and inhibitors |
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| JP2006503582A (ja) * | 2002-10-21 | 2006-02-02 | ディスカヴァーエックス インコーポレイテッド | Ｉｐ３タンパク質結合測定法 |
| EP1682569A4 (en) * | 2003-11-06 | 2010-01-13 | Discoverx Corp | CELL MEMBRANE PROTEIN ASSAY |
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