JP2501571B2 - 分析試薬に係る改善 - Google Patents

分析試薬に係る改善

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は改善された分析試薬、特に改善されたペルオ
キシダーゼ含有試薬、改善されたペルオキシダーゼ基質
試薬およびこのような試薬の一方または両方を含有する
分析試薬キツトに関する。
背景技術 ペルオキシダーゼは、過酸化物により、特異的基質の
酸化を触媒する一群の酵素である。或る種の基質はこの
方法で酸化されると、強発色性になり強い色を発色す
る。ペルオキシダーゼは分析用途における標識体とし
て、通常特異的に結合する分析成分と組合せて広く使用
されている。このような標識化された成分の存在は、特
異的基質および過酸化物を含む基質溶液を加えることに
より容易に検出できる。このような組合せを使用する分
析の例には、酵素標識免疫吸着分析法（ELISA）があ
り、この方法では抗体に結合されたペルオキシダーゼが
使用される。
ペルオキシダーゼ試薬を含む分析用キツトの調整の際
の重大な問題は、特に分析に常用される稀釈溶液中での
ペルオキシダーゼの長期間安定性にある。安定性は血清
タンパク質を含有させることにより増大させうるが、ペ
ルオキシダーゼ試薬を凍結乾燥させた形であるいは濃縮
溶液として提供する場合に、通常この問題が生じる。こ
のような形でペルオキシダーゼ試薬を使用する場合には
特定の分析を行なうためのプロトコールに安定化のため
の追加の操作工程を加えることが必要となる。血清タン
パク質および４−アミノアンチピリン（米国特許第4448
882号明細書参照）または８−アニリノ−１−ナフタレ
ン スルホン酸（英国特許第2066823号明細書参照）の
どちらかを使用して、ペルオキシダーゼ含有試薬を安定
化することも知られている。
極めて広く使用されているペルオキシダーゼの一種
は、ホースラデイツシユ ペルオキシダーゼ（以後、HR
Pと称する）であり、このペルオキシダーゼの特異的基
質はテトラメチルベンジジン（以下、TMBと称する）で
ある。TMBは過酸化物およびHRPの存在下に強着色酸化生
成物を生成する危険のない無色の基質である。しかしな
がら、水性溶液中に僅かに溶解するだけで、室温におい
て、分析に適する濃度で溶液から晶出する傾向を有す
る。これは過酸化物との反応に対するTMBの有用性を減
じ、他方で分析の感度を減じる。HRP用の基質としてTMB
を使用する既知の分析用キツトは、使用の短時間前に混
合しなければならない成分を含有せしめる必要のある多
成分基質試薬パツクである。いづれの試薬も使用後に貯
蔵することはできない。
前記したように、ペルオキシダーゼの触媒的作用は特
異的基質および過酸化物の存在を必要とする。我々は稀
ペルオキシダーゼ含有溶液の安定性が過酸化物の不存在
下においてペルオキシダーゼに対する特異的基質の添加
により極めて増大されることを発見した。
発明の開示 本発明の第一の態様に従い我々は、ペルオキシダーゼ
またはペルオキシダーゼ複合体とペルオキシダーゼに対
する特異的基質とを含有する緩衝化されている水性溶液
よりなり、過酸化物が存在しないペルオキシダーゼ含有
試薬を提供する。
ペルオキシダーゼは遊離のペルオキシダーゼであつて
もよいが、分析目的には好ましくは、分析に使用する特
異的結合性成分に結合させてペルオキシダーゼ複合体を
生成させたペルオキシダーゼである。ペルオキシダーゼ
複合体は好ましくは、ペルオキシダーゼと抗原または抗
体との複合体、最も好ましくは抗体との複合体である。
ペルオキシダーゼはホースラデイツシユペルオキシダー
ゼが好ましい。
ペルオキシダーゼ複合体は、たとえばスルホヒドリル
−マレイミドカツプリング［Ishikawa,E.,（1980年），
（Immunoassay suppl.,１、１〜16頁;Duncan,R.J.S.
ら、Anal.Biochem.,132、68〜73頁］、ジスルフイド−
チオール交換体［Carlsson,J.ら、（1978年）,Biochem.
J.,173、723〜737頁］、過ヨウ素酸塩酸化［Nakane,P.
K.ら、（1974年）、J.Histochem.Cytochem.,22、1084〜
1091頁］またはグルタルアルデヒド カツプリング［Au
rameas.S.（1969年）、Immunochem.,６、43〜72頁;Aura
meas.S.ら、（1971年）、Immunochem.,８、1175〜1179
頁］を用いて製造できる。
過酸化物はいずれの過酸化物（たとえば有機過酸化
物）であつてよいが、好ましくは過酸化水素である。
安定化効果は稀溶液で特に顕著である。好ましくはペ
ルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ複合体の濃度
は、10-6〜10-9M、最も好ましくは約10-9Mである（これ
らの濃度はペルオキシダーゼにもとづく）。
特異的基質はペルオキシダーゼまたはペルオキシダー
ゼ複合体を安定化するに効果的な量で用いる。たとえ
ば、ペルオキシダーゼがホースラデイツシユペルオキシ
ダーゼ（遊離のまたは複合体として）であり、そして特
異的基質がTMBである場合に、TMBの量は好ましくは0.01
〜0.1mg/mlの範囲である。
溶液はペルオキシダーゼに適合するpHに緩衝化する。
好ましくは、溶液をpH4〜pH8、さらに好ましくはpH5〜p
H7、最も好ましくは約pH6に緩衝化する。適当な緩衝剤
はpH6でクエン酸と組合せた0.1M酢酸ナトリウムであ
る。
溶液は、好ましくは血清タンパク質を0.1〜５％（重
量／容量）、最も好ましくは約0.2％（重量／容量）の
量で含有する。血清タンパク質はペルオキシダーゼの溶
解を助け、および／または、溶液が免疫分析用途に用い
られる場合に非特異的結合を減少せしめる効果を有す
る。
非特異的結合を減少せしめるもう一つの手段として、
溶液に界面活性剤を含有せしめる。適当には、0.01〜0.
1％（容量／容量）、好ましくは約0.02％（容量／容
量）の界面活性剤を加える。一例として、溶液中にツイ
ーン（Tween＝商品名）0.02％（容量／容量）を含有さ
せることができる。
本発明の第二の態様に従い我々は、ペルオキシダーゼ
またはペルオキシダーゼ複合体を含有する緩衝化されて
いる水溶液のペルオキシダーゼ活性を安定化する方法を
提供し、この方法は過酸化物の不存在下に、ペルオキシ
ダーゼに対する特異的基質を、溶液のペルオキシダーゼ
活性を安定化するに有効な量で、溶液に加えることを包
含する。
研究中に、我々は水性媒質中におけるTMBの溶解度が
シクロデキストリンとして知られている一群の環状オリ
ゴサツカライドの添加により有利に増大できることを発
見した。
本発明の第三の態様に従い我々は、TMBおよびβ−シ
クロデキストリンを溶液中に含有する水溶液よりなるTM
Bペルオキシダーゼ−基質試薬を提供する。
β−シクロデキストリンは、僅かに可溶性であるTMB
を溶解させる作用を有し、これは環状オリゴサツカライ
ドの中心に形成される空洞部中に分子が取り込まれるこ
とによるものと考えられる。
TMBは好ましくは、たとえば本発明の第一の態様の目
的物質であるようなペルオキシダーゼ含有試薬に対する
基質として使用するのに適する濃度で存在せしめる。適
当には、TMBの濃度は0.02〜0.3mg/ml、さらに好ましく
は、0.02〜0.1mg/ml、最も好ましくは約0.1mg/mlであ
る。
β−シクロデキストリンは好ましくはTMBの溶解に効
果的な濃度で存在せしめる。適当には、β−シクロデキ
ストリンは、0.025〜0.25％（重量／容量）、最も好ま
しくは約0.25％（重量／容量）の濃度で存在せしめる。
好適には、TMBペルキオシダーゼ−基質試薬はさら
に、過酸化物、たとえば過酸化水素を含有する。過酸化
水素の濃度は好ましくは0.002〜0.02％（容量／容量）
最も好ましくは約0.005％（容量／容量）である。
TMBペルオキシダーゼ−基質試薬は分析試薬の混合中
におけるpH変動を回避するために緩衝化することができ
る。
本発明の第四の態様に従い我々は、本発明の第三の態
様のTMBペルオキシダーゼ−基質試薬の調整方法を提供
し、この方法はTMBおよびβ−シクロデキストリンを含
む水溶液を形成することを包含する。好ましくは、TMB
を先ず有機溶剤、たとえばジメチルスルホキシド（DMS
O）に溶解し、次いでβ−シクロデキストリンを含有す
る水溶液に加えることを包含する。
本発明の第一の態様および第三の態様の試薬の一方ま
たは両方は分析試薬キツトに含ませることができる。好
ましくは、分析試薬キツトは本発明の第一の態様のホー
スラデイツシユペルオキシダーゼ−抗体試薬および本発
明の第三の態様のTMBペルオキシダーゼ−基質試薬を含
むELISAキツトである。
本発明をここで次の例および比較列により説明する。
比較例Ａ HPR溶液の安定性を評価する実験を行なつた。
0.1M酢酸ナトリウム／クエン酸緩衝液（pH6）中にHRP
0.95μg/mlを牛血清アルブミン0.2％（容量／容量）お
よびツイーン（商品名）0.02％（容量／容量）とともに
含有するペルオキシダーゼ溶液を新しく調整した。酵素
活性はTMB0.1mg/mlおよび過酸化水素0.0044％（容量／
容量）を0.1M酢酸ナトリウム／クエン酸緩衝液（pH6）
中に含有する新しく調整した基質溶液1mlにこのペルオ
キシダーゼ溶液10μを加え、20秒後にOD650を測定す
ることにより測定した。この測定をペルオキシダーゼ溶
液を37℃で貯蔵した後に繰返した。結果を下記第１表に
示す。
実施例１ 比較例Ａに記載した実験をペルオキシダーゼ溶液に0.
1mg/mlTBMを添加して行なつた。結果を下記第１表に示
す。
これらの結果はHRPの酵素活性がTMBの存在下に貯蔵し
た場合に、TMBを含有しないで貯蔵された場合に15％の
活性保留を示すのに比較して58％活性保留を示すことを
示している。
比較例Ｂ 溶液中におけるHRP−抗体複合体の安定性を評価する
実験を行なつた。
HRPはモノクロナル抗体（この例では、エストン−３
−グルクロニドに対して特異性を有するマウスモノクロ
ナル抗体）に、Avrameasのグルタルアルデヒド方法（前
記文献参照）による吸着法を用いて結合させた。HRPは1
00mgを0.05重炭酸塩緩衝液（pH9.5）500μに溶解し、
ここに同一緩衝液中で調整した11％（重量／容量）グル
タルアルデヒド500μを加えた。反応は室温（20℃〜2
5℃）で攪拌しながら２時間行なつた。反応混合物を次
いで、予め0.05M重炭酸塩緩衝液（pH9.5）で平衡化した
PD10カラム（Pharmacia社製）に適用した。溶出は同一
緩衝液で行ない、活性化されたHRPを含有する留分を集
めた。0.05M重炭酸塩緩衝液（pH9.5）中の抗体（２〜3m
g/ml）を、活性化されたHRPに加えて、活性化HRP対抗体
の質量比率を6:1にした。反応は４℃で16〜21時間行な
い、その後抗体−HRP複合体を代表的なTSIC G3000SNカ
ラム（Toya Soda社製、日本国）上でゲル濾過により精
製した。
0.1M酢酸ナトリウム／クエン酸緩衝液（pH6）中に2nM
HPRでHRP−抗体複合体を、牛血清アルブミン0.2％
（容量／容量）およびツイーン（商品名）0.02％（容量
／容量）とともに含有するペルオキシダーゼ複合体溶液
を新しく調整した。酵素活性は比較例Ａに記載の組成の
ペルオキシダーゼ−複合体溶液20μを加え、次いで２
分後にOD650を測定することにより測定した。この測定
を37℃で貯蔵した後に繰返した。結果を下記第２表に示
す。
実施例２ 比較例Ｂに記載の実験を、ペルオキシダーゼ−複合体
溶液にTMB0.1mg/mlを加えて行なつた。結果を下記第２
表に示す。
これらの結果はHRP−抗体複合体の酵素活性が、TMB含
有緩衝液中において分析濃度で、16日間の貯蔵後に89％
保留されたことを示している。これに比較して、安定化
されていない溶液中では同一期間貯蔵して、酵素活性が
100％失なわれる。
比較例Ｃ TMB基質溶液の安定性を評価する実験を行なつた。
TMB基質溶液は、ジメチル スルホキシド（DMSO）中
のTMBの10mg/mlを用意し、これを0.1M酢酸ナトリウム／
クエン酸緩衝液（pH6）中で1:100に稀釈し、ここにH2O2
0.0044％（容量／容量）を加えた。この基質の試料を４
℃、20℃および50℃で貯蔵し、HRP−抗体複合体溶液
（ペルオキシダーゼにもとづいて2nM）と混合した後に
各試料の一定量のOD650を測定した。結果を下記第３表
に示し、対照（新しく調製された基質溶液）のパーセン
トとして表わす。
実施例３ 比較例Ｃに記載の実験をβ−シクロデキストリン0.25
％（重量／容量）を加えて行なつた。結果を下記第４表
に示す。
これらの結果は比較例Ｃについて示された結果に比較
して、β−シクロデキストリンを使用することにより、
貯蔵性が増大されることを示している。例３に記載の実
験において、TMBの晶出は見られなかつた。
本発明を実施例だけにより記述したが、詳細な変更を
本発明の範囲内で行なうことができることが理解される
であろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭58−23786（ＪＰ，Ａ)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】分析に使用する特異的結合性成分に結合し
    ているペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ複合
    体、およびペルオキシダーゼに対する特異的基質を含有
    する緩衝化されている水溶液よりなり、過酸化物が存在
    しないペルオキシダーゼ含有試薬であって、該特異的基
    質がテトラメチルベンジジンである該ペルオキシダーゼ
    含有分析用試薬。
  2. 【請求項２】ペルオキシダーゼがホースラディッシュ
    ペルオキシダーゼである請求の範囲第１項に記載のペル
    オキシダーゼ含有分析用試薬。
  3. 【請求項３】分析に使用する特異的結合性成分に結合し
    ているペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ複合
    体、ペルオキシダーゼに対する特異的基質、およびβ−
    シクロデキストリンを含有する緩衝化されている水溶液
    よりなり、過酸化物が存在しないペルオキシダーゼ含有
    試薬であって、該特異的基質がテトラメチルベンジジン
    である該ペルオキシダーゼ含有分析用試薬。
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