DE3818440A1 - Verfahren und vorrichtung zur in-vitro-kultivierung und in-vitro-vermehrung von pflanzen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur In-vitro- Kultivierung und In-vitro-Vermehrung von Pflanzen, bei dem die Pflanzen durch an eine Ver- und ggf. eine Entsorgungs­ einrichtung angeschlossene Kapillarmembranen mit Nährmedium ver- und ggf.von Stoffwechselprodukten entsorgt und auf einem Substrat kultiviert werden, sowie eine hierzu geeignete Vorrichtung.

Unter Pflanzen werden dabei im Rahmen dieser Anmeldung einzelne Zellen, vielzellige Kalli, Sprossen, Blätter bis hin zu bewurzelten Setzlingen oder beliebigen Zwischenformen hiervon verstanden.

Die In-vitro-Kultivierung und In-vitro-Vermehrung von Pflanzen im industriellen Maßstab erfolgt bislang überwie­ gend auf einem Substrat, das in geeignete Kulturgefäße, wie beispielsweise Weckgläser, eingebracht ist. Das Substrat besteht in der Regel aus Agar-Agar, der mit einem flüssigen Nährmedium versetzt ist und als Verfestiger dient. Die Zusammensetzung des Nährmediums hängt von einer Reihe von Faktoren ab, wie z.B. von der Art der Pflanze, deren Wachstumsstadium oder dem Entwicklungsziel der Kultur.

So kann es wünschenswert sein, während einer bestimmten Wachstumsphase die Zusammensetzung des Nährmediums konstant zu halten oder aber auf definierte Art und Weise während der Dauer der Kultivierung oder Vermehrung zu variieren, um ein hinsichtlich Quantität und Qualität optimales Ergebnis zu erzielen oder z.B. bei toxikologischen Testungen den Einfluß verschiedener Stoffe auf das Wachstumsverhalten von Pflanzen zu untersuchen.

Da die Kultivierung bzw. Vermehrung von Planzen im allge­ meinen Zeiträume von einigen Wochen bis zu mehreren Monaten erfordert, ist ein ein- oder mehrmaliges Umsetzen des Pflanzgutes auf frisches Substrat unumgänglich. Dies trifft nicht nur für die Fälle zu, bei denen während der Kultivierung oder Vermehrung die Zusammensetzung des Nähr­ mediums variiert werden soll, sondern auch für jene Fälle, bei denen die Zusammensetzung konstant gehalten werden soll. So ändert sich die Zusammensetzung des Nährmediums bereits dadurch, daß die Pflanze entsprechend ihres Bedarfs Nähr­ stoffe aufnimmt und Stoffwechselprodukte abgibt. Weiterhin wird dem Substrat laufend Wasser durch Verdunstung entzogen, so daß das Substrat allmählich austrocknet und damit aufkonzentriert wird.

Jedes Umsetzen des Pflanzgutes auf frisches bzw. hinsicht­ lich der Nährstoffzusammensetzung variiertes Substrat erhöht die Kosten des Endprodukts (z.B. des Setzlings), da hierfür personal- und materialintensive Maßnahmen nötig sind. So wird das Umsetzen des Pflanzgutes von Hand bewerkstelligt, eine Automatisierung erscheint wegen der Komplexität der einzelnen Arbeitsschritte sowie der Empfindlichkeit des Pflanzgutes hinsichtlich mechanischer Beschädigung mit ver­ tretbarem Aufwand nicht realisierbar.

Der zweite Kostenfaktor von Bedeutung ist der hohe Preis für Agar-Agar, der nach einmaliger Verwendung als Verfestiger verworfen wird und deshalb als nicht wiederverwendbares Abfallprodukt betrachtet werden muß.

Diese Faktoren fallen umso stärker ins Gewicht, je häufiger ein Umsetzen des Pflanzgutes während der Dauer der Kulti­ vierung oder Vermehrung vorgenommen werden muß.

Ein weiterer kostenintensiver Arbeitsschritt ist schließlich für solche Produkte erforderlich, die nach Beendigung der In-vitro-Kultivierung von der Substratschicht in Erde umgesetzt werden. Hierzu sind besondere Maßnahmen erfor­ derlich, um das Substrat vollständig von den Wurzeln ab­ zutrennen, ohne dabei das empfindliche Wurzelsystem zu schädigen.

Die DDR-Patentschrift DD-2 25 439 beschreibt einen Träger für Nährmedium in der pflanzlichen In-vitro-Kultur, der Agar- Agar als Verfestiger des Nährmediums substituieren soll.

Der Träger für Nährmedium besteht in einer bevorzugten Aus­ führungsform aus einem Viskoseschwamm, der mit Nährmedium getränkt in ein handelsübliches Kulturgefäß eingesetzt und mit einem Cellulosefilter abgedeckt ist. Der Cellulose­ filter, auf den der Callus bzw. eine Zellaggregate ent­ haltende Suspension aufgebracht ist, ermöglicht die kon­ tinuierliche Zuführung des Nährmediums, das entsprechend dem Verbrauch durch Zugabe von frischem Nährmedium in das Kulturgefäß ergänzt werden kann.

Für die Kultivierung und Vermehrung von Pflanzen, die eine Bewurzelung aufweisen, kann der Viskoseschwamm eine Ausnehmung zur Aufnahme der Pflanze aufweisen und ihr da­ durch Halt verleihen. Ein zusätzlicher, seitlich ange­ brachter Schlitz ermöglicht eine Entnahme des Endprodukts ohne Beschädigung des Wurzelsystems.

Auch mit diesem Träger für Nährmedium können die geschil­ derten Nachteile des agarenthaltenden Substrats nicht in befriedigendem Maße behoben werden.

So ist es zwar möglich, die Zusammensetzung des über den Cellulosefilter zugeführten Nährmediums während der Kultivierungs- bzw. Vermehrungsdauer durch Zugabe frischen Nährmediums entsprechend des Verbrauchs konstant zu halten, jedoch lediglich für den Fall, daß der Cellulosefilter einen Rückfluß der Stoffwechselprodukte und damit eine Vermengung mit dem frischen Nährmedium verhindert. Da jedoch kein Ab­ transport der Stoffwechselprodukte vorgesehen ist, lagern diese sich in unmittelbarer Umgebung ab und erschweren auf diese Weise eine weitere Nährstoffversorgung und damit weiteres Zellwachstum. Bei längerer Kultivierungsdauer kann dies sogar örtlich zu Konzentrationen von Stoffwechselpro­ dukten führen, die für die Zellen eine toxische Wirkung ha­ ben und in letzter Konsequenz zum Totalverlust der Kultur führen können.

Weiterhin ist es mit einer Konfiguration gemäß o.g. Patent­ schrift nicht möglich, eine definierte Variation der Zusam­ mensetzung des Nährmediums vorzunehmen, ohne dabei den Träger zusammen mit der Kultur aus dem Kulturgefäß zu ent­ nehmen. Dies erfordert somit ebenfalls einen zusätzlichen Arbeitsschritt, der sich kostenerhöhend auf das Endprodukt niederschlägt.

Die Vorrichtung gemäß obiger Patentschrift ist auch nicht für solche Kultivierungsverfahren geeignet, die eine Bewurzelung zum Ziel haben, da ein Eindringen von sich aus­ bildenden Wurzeln in den Träger durch den Cellulosefilter hindurch verhindert wird, wohingegen die Ausführungsform mit der Ausnehmung lediglich für Setzlinge mit bereits ausge­ prägten Wurzelansätzen geeignet ist. Deshalb muß auch hier mindestens ein zusätzlicher Arbeitsschritt vorgesehen wer­ den, der die Umsetzung auf jeweils geeignete Trägerkonfigu­ rationen beinhaltet.

Der Gegenstand der DDR-Patentschrift ermöglicht somit für bestimmte Anwendungsfälle eine Vereinfachung gegenüber der Kultivierung bzw. Vermehrung von Pflanzen mittels agarenthaltendem Substrat, ist jedoch für einen kostengün­ stigen, kontinuierlichen Betrieb nicht geeignet.

Aus der Deutschen Offenlegungsschrift 29 00 455 sind ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Züchtung von Mykorrhiza- Pilzen bekannt. Für diesen speziellen Anwendungsfall wird vorgeschlagen, die zu züchtenden Pilze beispielsweise auf Kapillarmembranen anzusiedeln, durch welche die Versorgung mit Nährstoffen und der Abtransport von Stoffwechselpro­ dukten erfolgt. Durch die Anordnung mehrerer Kapillarmem­ branen innerhalb einer Flanschanordnung mit Zu- und Abfluß in einem Kulturbehälter ist es möglich, das Nährstoffmedium über einen Vorratsbehälter im Kreislauf umzupumpen. Damit ist es möglich, die Zusammensetzung des Nährmediums zu kon­ trollieren, d.h. je nach Bedarf für die Zeit der Kultivierung konstant zu halten oder aber entsprechend der jeweiligen Wachstumsphase bedarfsgerecht zu variieren.

Das Kultivierungsgefäß kann mit einem Deckel verschlossen werden, um im Wachstumsraum oberhalb der Kapillaren die Gasatmosphäre zu konditionieren. Dies kann hinsichtlich der Temperatur und der Gaszusammensetzung erfolgen.

Schließlich kann gegebenenfalls der Zwischenraum zwischen den Kapillarmembranen mit einem synthetischen oder natür­ lichen Bodensubstrat gefüllt werden.

Somit ist es also möglich, eine kontinuierliche und hin­ sichtlich der Zusammensetzung des Nährmediums kontrollierte Kultivierung von Pilzen zu erzielen. Eine Übertragung auf die Kultivierung oder Vermehrung von Pflanzen allgemeiner Art führt jedoch noch nicht zum angestrebten Erfolg, da entsprechend des speziellen Zuschnitts auf die Kultivierung von Pilzen eine spätere Umsetzung des Kultivierungsgutes nicht vorgesehen ist. So steht am Ende der Kultivierungszeit das Endprodukt, d.h. in der Regel der fertige Speisepilz, zur Ernte an und wird zu diesem Zweck z.B. durch Abschneiden von seinem Wurzelwerk getrennt und aus dem Kulturgefäß entfernt. Das Wurzelwerk verbleibt im Substrat und wird Das Problem bei der Kultivierung oder Vermehrung von Pflan­ zen mittels agarenthaltendem Substrat besteht hingegen dar­ in, das Wurzelwerk möglichst ohne mechanische Beanspruchung oder Schädigung zusammen mit der Pflanze dem Kulturgefäß zu entnehmen und vom Substrat zu trennen, damit eine Umsetzung in Erde an den in der Regel endgültigen Standort erfolgen kann, wenn das gewünschte Wachstunmsstadium erreicht ist.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war nun, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur In-vitro-Kultivierung und In­ vitro-Vermehrung von pflanzlichen Zellen zur Verfügung zu stellen, das die geschilderten Nachteile des Standes der Technik nicht mehr aufweist. Insbesondere sollte während der gesamten Kultivierungs- oder Vermehrungsdauer bis zum Erreichen der für die Umpflanzung in Erde erforderlichen Größe ein ein- oder mehrmaliges Umsetzen auf frisches und/oder variiertes Substrat entfallen und eine Schädigung des Wurzelsystems bei der Vorbereitung zur Verpflanzung in Erde zuverlässig vermieden werden.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfah­ ren, bei dem einzelne Zellen bis hin zu Setzlingen von Pflanzen verwendet werden, bei dem Kapillarmembranen eng aneinanderliegend angeordnet und mit einer Substratschicht für die Pflanzen bedeckt verwendet werden, bei dem die Pflanzen bis zum Erreichen einer für die Umpflanzung erfor­ derlichen Größe kultiviert werden, bei dem die Kapil­ larmembranen und die Substratschicht danach um die Pflanzen herum zertrennt werden und danach die Pflanzen zusammen mit den zertrennten Kapillarmembranen und der zertrennten Sub­ stratschicht umgepflanzt werden.

Das Kultivierungs- oder Vermehrungsgut kann je nach Verfüg­ barkeit und Zweckmäßigkeit in verschiedenen Entwicklungs­ stadien eingesetzt werden. So können als Ausgangsmaterial isolierte Zellen, Zellaggregate, Kalli, Gewebe, Organe oder beliebige geeignete Bestandteile einer Pflanze zur Anwendung kommen. Beispiele derartiger Bestandteile sind u.a. Protoplasten (Zellen, deren Zellwand enzymatisch abgebaut wurde), intakte Einzelzellen bzw. Zellaggregate, Gonen (unreife Pollenvorstufen, die sich zu haploiden Pflanzen weiterkultivieren lassen) , Eizellen, Kalli, somatische Embryonen, Meristeme (Sproßspitzen), Sprosse, Blätter, Wurzeln, Rhizome und Samen.

Das Kultivierungs- oder Vermehrungsgut wird auf eine Sub­ stratschicht aufgebracht, die als Träger dient. Als Substrat kann beispielsweise mit Nährmedium versetzter Agar-Agar eingesetzt werden,jedoch führen auch andere Substrate zum gewünschten Erfolg. So können anstelle von Agar-Agar als synthetische Substratmaterialien beispielsweise Watte aus synthetischen Polymeren wie z.B. Polyester, Schwämme z.B. in Tuchform oder als Schüttung von Schnitzeln und Granulat oder Pulver aus Cellulose verwendet werden. Als besonders vorteilhaft hat sich eine Schüttung von Kapillar­ membran-Kurzschnitt erwiesen, wie er in der deutschen Pa­ tentanmeldung (Az. 38 18 441.9) (internes Aktenzeichen AGW2 227) offenbart ist. Hierbei handelt es sich in der bevorzugten Ausführungsform um ca. 0,5 bis 10 Millimeter lange Stücke einer Kapillarmembran aus Cellulose, regene­ rierter Cellulose oder Cellulosederivaten.

Die Substratschicht bedeckt die Kapillarmembranen, die eng aneinanderliegend angeordnet sind. Die Kapillarmembranen sind an eine Ver- und Entsorgungseinrichtung angeschlossen und übernehmen die Versorgung der Pflanzen mit Nährstoffen sowie gegebenenfalls deren Entsorgung von Stoffwechselpro­ dukten.

Die Ver- und ggf. Entsorgungseinrichtung besteht im ein­ fachsten Fall aus einem Vorratsgefäß für das Nährmedium und einer Pumpe, die das Nährmedium vom Vorratsgefäß durch die Kapillarmembranen hindurch zurück in das Vorratsgefäß im Kreislauf fördert. Damit ist eine kontinuierliche Versorgung mit Nährmedium möglich.

Für anspruchsvollere Anwendungsfälle kommen komplexere Ver- und Entsorgungseinrichtungen zur Anwendung, die durch Regel- und Dosiereinrichtungen in der Lage sind, eine gewünschte, für den betreffenden Anwendungsfall als optimal erachtete Zusammensetzung des Nährmediums zu kontrollieren. Dies kann einerseits ein Konstanthalten, andererseits aber auch eine Veränderung der Zusammensetzung während der Dauer der Kultivierung oder Vermehrung bedeuten. Die Veränderung der Zusammensetzung kann von Hand vorgenommen werden, bevorzugt wird jedoch eine automatische Betriebsweise, bei der eine derartige Veränderung beispielsweise zeitgesteuert vorge­ nommen wird.

Als Parameter für die Regelung der Zusammensetzung des Nährmediums können z.B. die Konzentrationen von Sauerstoff, Stickstoff, Wasserstoff oder dergleichen herangezogen wer­ den, für die entsprechende Sensoren vorzusehen sind. Ebenso ist eine Einbeziehung des Feuchtegehaltes der Substrat­ schicht in die Regelung der Ver- und Entsorgungseinrichtung möglich, um ein Austrocknen bzw. eine Überflutung des Kultivierungs- oder Vermehrungsgutes zu verhindern und eine für das Wachstum optimale Durchfeuchtung der Substratschicht zu erreichen. Dieser Regelkreis wirkt z.B. auf die Pumpe und damit auf die Durchflußmenge des Nährmediums durch die Ka­ pillarmembranen ein.

Mit Hilfe dieser Ver- und Entsorgungseinrichtung ist eine bedarfsgerechte Ver- und Entsorgung der Pflanzen während der gesamten Kultivierungs- oder Vermehrungszeit gewährleistet, d.h. es können sämtliche Wachstumsphasen ohne Umsetzung der Pflanzen bis zum Erreichen einer für die Umpflanzung erfor­ derlichen Größe durchlaufen werden. Die Pflanzen verbleiben während dieser Zeit an ein und demselben Ort. Die hierdurch entbehrlich gewordene ein- oder mehrmalige Umsetzung redu­ ziert nicht nur den Arbeits- und Kapitaleinsatz, sondern eliminiert vollständig die Gefahr einer Schädigung des emp­ findlichen Wurzelsystems.

Nach Erreichen der für die Umpflanzung erforderlichen Größe werden erfindungsgemäß die Kapillarmembranen und die Sub­ stratschicht um die Pflanzen herum zertrennt und die Pflan­ zen zusammen mit den zertrennten Kapillarmembranen und der zertrennten Substratschicht umgepflanzt. Dadurch erübrigt sich ein Abtrennen des Substrats vom Wurzelwerk mit der da­ mit verbundenen Gefahr einer Beschädigung der Wurzeln. Durch den Verbleib des Substrats und der Kapillarmembranabschnitte im Wurzelwerk wird die Wurzelkonfiguration mechanisch sta­ bilisiert und damit die Gefahr eines Pflanzschocks erheblich reduziert.

Das Zertrennen der Substratschicht und der Kapillarmembranen kann mittels einfacher Werkzeuge, wie z.B. Schere oder Mes­ ser erfolgen. Es ist auch möglich, das Zertrennen mit einer mechanischen Stanzvorrichtung durchzuführen, wobei eine In­ tegration in einen automatisierten Arbeitsablauf z.B. in der Form realisierbar ist, daß die ausgestanzten Abschnitte so­ gleich versandfertig verpackt werden.

Häufig werden derartig kultivierte Pflanzen ohne Zwischen­ schaltung weiterer Arbeitsschritte unmittelbar an ihren endgültigen Standort gepflanzt. Auch in diesem Fall werden die Pflanzen zusammen mit dem Substrat und den Kapillarmem­ branabschnitten umgesetzt.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens, die dadurch gekennzeichnet ist, daß die Kapillarmembranen als erste Schicht angeordnet sind, daß das Substrat als zweite Schicht über und/oder in der ersten Schicht angeordnet ist und daß ein Wachstumsraum über der zweiten Schicht angeordnet ist.

Als erste Schicht sind die Kapillarmembranen angeordnet, über die die Versorgung mit Nährstoffen und gegebenenfalls die Entsorgung von Stoffwechselprodukten bewerkstelligt wird.

Darüber- und/oder darinliegend angeordnet ist als zweite Schicht das Substrat, das das Kultivierungs- oder Vermehrungsgut trägt. Bei der Auswahl des Substrats ist darauf zu achten, daß es einerseits eine ausreichende Nachgiebigkeit besitzt, um empfindliches Kultivierungs- oder Vermehrungsgut , das in das Substrat eingebracht werden muß, nicht zu schädigen, andererseits ihm aber einen ausreichen­ den Halt beispielsweise gegen Umkippen zu geben.

Weiterhin soll die Substratschicht eine gute Stofftransport­ fähigkeit bezüglich der Nährstoffe und Wasser besitzen, um einen möglichst verzögerungsarmen Austausch von Nährstoffen und Stoffwechselprodukten zwischen dem Kultivierungs- oder Vermehrungsgut und den Kapillarmembranen zu ermöglichen. Dieser verzögerungsarme Austausch ist speziell bei Konfigu­ rationen mit einer geregelten Ver- und Entsorgungseinrich­ tung wünschenswert, um kurze Reglereingriffszeiten zu er­ reichen.

Über der zweiten Schicht ist ein Wachstumsraum angeordnet. Der Wachstumsraum kann im einfachsten Fall die lichte Höhe über der Substratschicht sein. In der Regel ist dieser Raum jedoch durch einen Deckel abgeschlossen, der zunächst als Schutz gegen mechanisches Beschädigen für das Kultur- oder Vermehrungsgut dient. Bei einem luftdichten Abschluß der gesamten Vorrichtung kann mittels einer zusätzlichen Be­ lüftungseinrichtung eine Komditionierung der Atmosphäre im Wachstumsraum vorgenommen werden. Die Belüftungseinrichtung kann beispielsweise in der Ver- und Entsorgungseinrichtung integriert sein, so daß neben der Zusammensetzung des Nähr­ mediums auch die Zusammensetzung der Atmosphäre im Wachs­ tumsraum geregelt, d.h. z.B. klimatisiert werden kann. Durch Einbringung von Sterilfiltern in die Zuluftführung kann bei empfindlichem Kultivierungs- oder Vermehrungsgut eine Konta­ mination verhindert und damit Sterilität erzielt werden.

Bei einer transparenten oder durchsichtigen Ausgestaltung des Deckels bzw. Teilen hiervon können wachstumsfördernde Bestrahlungen, beispielsweise mit Ultraviolett- oder Infra­ rotlicht erfolgen.

Die Einstellung der gewünschten Temperatur kann z.B. dadurch erfolgen, daß die Vorrichtung als Ganzes, gegebenfalls zu­ sammen mit der Ver- und Entsorgungseinrichtung, in einem temperierbaren Raum oder Schrank untergebracht ist. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, daß die Kreisläufe für das Nährmedium und für die Atmosphäre im Wachstumsraum eine eigene Thermostatisiereinrichtung, beispielsweise in Form von Heizwendeln, aufweisen.

Als Material für die Kapillarmembranen der erfindungsgemäßen Vorrichtung eignen sich alle gängigen Materialien, die für die Herstellung von Kapillarmembranen im allgemeinen Anwen­ dung finden. Bevorzugt werden Kapillarmembranen aus Cellulose, regenerierter Cellulose oder Cellulosederivaten, da diese biologisch abbaubar sind. Diese Eigenschaft ist besonders dann von Bedeutung, wenn die Pflanzen am Ende ih­ rer Kultivierung zusammen mit dem Substrat und den Kapil­ larmembranabschnitten an ihren endgültigen Standort ge­ pflanzt werden.

In diesem Fall ist auch ein Substratmaterial auszuwählen, das ebenfalls die Eigenschaft der biologischen Abbaubarkeit auf­ weist. Die Substratschicht kann deshalb vorteilhafterweise aus einer Schüttung von Kurzschnitt der im übrigen iden­ tischen Kapillarmembranen der ersten Schicht der Vorrich­ tung bestehen.

Vorteilhafterweise besteht die erste Schicht aus wenigstens einer Lage Kapillarmembranen, die im wesentlichen parallel zueinander angeordnet sein können. Für einen verbesserten Zusammenhalt und eine vereinfachte Handhabung beim Zusam­ menbau der Vorrichtung sowie beim Zertrennen der ersten und zweiten Schicht am Ende der Kultivierungszeit kann es von Vorteil sein, daß innerhalb einer Lage die Kapillarmembranen mit Kettfäden verbunden sind, wobei sich die Kapillarmem­ branen benachbarter Lagen überkreuzen können. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bestehen die Lagen Ka­ pillarmembranen aus Flächengebilden, wie z.B. Geweben, Ge­ wirken oder Gelegen.

Auf diese Weise wird eine eng aneinander anliegende Anord­ nung der Kapillarmembranen in der ersten Schicht erreicht. Diese Art der Anordnung ist für die Wurzelbildung besonders vorteilhaft, da sie überraschenderweise die mechanischen Eigenschaften sowie die Transportmechanismen für Nährstoffe und Stoffwechselprodukte in natürlicher Umgebung gut simu­ liert. Dies ist an der sehr kräftigen und stark verästelten Wurzelstruktur zu erkennen, wie sie sich mit bisherigen In­ vitro-Verfahren nicht erreichen läßt.

Die Kapillarmembranen münden an ihren Enden jeweils in eine gemeinsame Ein- und eine gemeinsame Auslaufkammer ein, die eine Vergleichmäßigung der Strömung des Nährmediums und da­ mit eine gleichmäßige Beschickung aller Kapillarmembranen ermöglicht.

Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Kapillarmembranen zu einem Prämodul zusammengefaßt sind. Unter Prämodul soll im Rahmen dieser Anmeldung eine Konfiguration verstanden wer­ den, die aus den die erste Schicht bildenden Kapillarmem­ branen besteht und mit je einem Anschlußstutzen ein- und auslaufseitig derart versehen ist, daß dieser Prämodul auf einfache Weise zwischen die Ein- und die Auslaufkammer flu­ iddicht in die Vorrichtung einsetzbar ist. Fluiddicht bedeutet in diesem Zusammenhang, daß der Nährmediumstrom im Bereich der Vorrichtung ohne Leckage ist.

Dieser Prämodul kann unabhängig von der Vorrichtung auf Vorrat kostengünstig gefertigt werden und ist selbständig als Einwegprodukt handelbar. Gerade im wirtschaftlich bedeutungsvollen Bereich der Massenkultivierung und -vermehrung ist die einfache Handhabbarkeit und Auswechsel­ barkeit des Membranteils von ausschlaggebender Bedeutung.

Ein weiterer Kostenvorteil gegenüber herkömmlichen Vorrich­ tungen und Verfahren ergibt sich, wenn als Substratschicht eine Schüttung eines Kapillarkurzschnitts verwendet wird. Ein derartiger Kurzschnitt ist auf einfache Weise und kostengünstig, z.B. durch Schneiden von Kapillarmembranab­ fall herzustellen, wobei die Länge der erhaltenen einzelnen Kapillarmembranstücke bevorzugt zwischen 0,5 und 10 Milli­ metern beträgt.

Weitere Einzelheiten der Erfindung werden aufgrund der Figur erläutert, die schematisch den Aufbau einer Konfiguration zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sowie die Vorrichtung selbst zeigen.

Die Kapillarmembranen enthaltende Schicht 1 als erste Schicht ist aus mehreren Lagen von Kapillarmembranen aufge­ baut. Darüber befindet sich die Substratschicht 2 als zweite Schicht. Dabei ist ohne weiteres ersichtlich, daß je nach Aufbau der Lagen Kapillarmembranen und der Konsistenz des verwendbaren Substrats ein Teil des Substrats in die Hohl­ räume zwischen den einzelnen Kapillarmembranen und damit in die erste Schicht eindringt. Dies hat jedoch keine nachtei­ ligen Folgen, sondern verbessert sogar den Nährstoff- und Stoffwechselprodukttransport zwischen dem Kultivierungs­ oder Vermehrungsgut und weiter entfernt liegenden Kapillar­ membranen.

Der Wachstumsraum 3 wird durch einen Deckel 4 abgeschlossen, der auf einem Kragen 5 ruht. Deckel 4 und Kragen 5 bestehen z.B. aus transparentem Polymer, so daß eine einfache Beob­ achtung des Wachstumsfortschritts und eine Bestrahlung mit natürlichem und/oder künstlichem Licht ermöglicht wird. Zwischen Kragen 5 und Deckel 4 ist eine Schlauchdichtung 6 angeordnet, die z.B. aus einem Silikonschlauch in Form einer Rundschnurdichtung ausgeführt ist. Deckel 4 und/oder Kragen 5 können Bohrungen oder ähnliche Öffnungen aufweisen, wenn eine natürliche Belüftung gewünscht wird.

Das Nährmedium wird mit der Pumpe 7 aus dem Vorratsgefäß 8 über die Einlaufkammer 9 durch die Kapillarmembranen der Kapillarmembranschicht 1 und die Auslaufkammer 10 zurück in das Vorratsgefäß 8 im Kreislauf umgepumpt. Die Ver- und Entsorgungseinrichtung besteht hier aus dem einfachen Vorratsgefäß 8 für das Nährmedium und der Pumpe 7.

Die Kapillarmembranschicht 1 wird ein- und auslaufseitig von Anschlußstutzen 11 gehalten, wobei die Kapillarmembranen fluiddicht mit Polyurethan in den Anschlußstutzen 11 vergossen sind. Die Kapillarmembranschicht 1 bildet zusammen mit den beiden Anschlußstutzen 11 den Prämodul. Zur Erhöhung der Stabilität bzw. zur Verbesserung der Handhabung beim Auswechseln des Prämoduls kann dieser mit der Trägerplatte 13 ausgerüstet sein, die sich zwischen den beiden Anschluß­ stutzen 11 unterhalb der Kapillarmembranschicht 1 befindet. Die Trägerplatte 13 kann auch seitlich bis zur Oberkante der Anschlußstutzen 11 herumgeführt sein, wodurch die Auf­ nahme 14 an der Ein- und Auslaufkammer 9 und 10 mit üblichen Befestigungsmitteln dicht befestigt sind, enthalten kann. Die Dichtung 12 ist z.B. als Hohlprofildichtung ausgeführt und befindet sich zwischen Ein- bzw. Auslaufkammer 9 bzw. 10 und den Anschlußstutzen 11.

Je nach Ausführungsform wird der Kragen 5 auf die Anschluß­ stutzen 11 des Prämoduls oder auf die Ein- und Auslaufkammer 9 und 10 sowie auf die jeweils zugehörigen seitlichen Be­ grenzungen aufgesetzt. Dabei kann der Kragen 5 mit üblichen,

Fixiermitteln, wie beispielsweise Anschraubwinkel, Nuten, Schrauben, Muttern und Klammern, befestigt und fixiert wer­ den. Gleiches gilt für alle übrigen nicht dargestellten Die Figur gibt nur beispielhaft eine Ausführungsform des Gegenstands der Erfindung wieder, wobei jederzeit andere Ausführungsformen je nach Anwendungsfall und Gerätekonfigu­ ration realisierbar sind, ohne den Rahmen der Erfindung zu Die Erfindung wird weiter anhand der nachstehenden Beispiele Die Versuche wurden mit einer Vorrichtung durchgeführt, die durch den Verguß der Kapillarmembranen in den Anschluß­ stutzen mittels Polyurethan mit Dampf sterilisierbar sind, d.h. auch nach der Sterilisierung fluiddicht bleiben.

Die Kapillarmembranschicht war aus mehreren Lagen aufgebaut, wobei die einzelnen Lagen als Matten ausgeführt waren, d.h. die im wesentlichen parallel liegenden Kapillarmembranen wurden mittels Kettfäden zu einem Flächengebilde verarbei­ tet.

Als Kapillarmembranen wurden Hohlfäden mit angenähert kreisförmigem Querschnitt auf cellulosischer Basis verwendet mit einem Außendurchmesser von ca. 222 µm und einer Wand­ dicke von ca. 11 µm. Derartige Kapillarmembranen werden beispielsweise aus aus Cuoxamlösungen regenerierter Cellulose als Hohlfäden hergestellt.

Als Substrat wurde mit Nährmedium versetzter Agar-Agar verwendet.

Die Vorrichtung wurde an ein Nährmedium enthaltendes Vor­ ratsgefäß mit Silikonschläuchen angeschlossen, als Pumpe wurde eine Schlauchpumpe verwendet.

Darüber hinaus wurde die Gesamtkonfiguration vor jedem Ver­ such zunächst mit Isopropanol und anschließend mit Die Vorrichtung wurde vor der Sterilisation auf Dichtigkeit der Kapillarmembranen geprüft. Zu diesem Zweck wird der intrakapilläre Raum zwei Minuten lang mit 500 mbar Überdruck beaufschlagt und danach der Druckabfall über einen Zeitraum von 10 Minuten verfolgt. Dichtigkeit ist dann gegeben, wenn nach dieser Zeit der Druckabfall weniger als 50 mbar beträgt.

Die Sterilisation erfolgte bei 121°C und dauerte 20 Minuten, wobei der intrakapilläre Raum einschließlich des Vorratsge­ fäßes und der Schläuche sowie der extrakapilläre Raum des Prämoduls mit bidestilliertem Wasser gefüllt waren. Nach der Sterilisation wurde das Wasser aus dem intra- und dem extrakapillären Raum steril entfernt. Anschließend wurde das sterilisierte Nährmedium in das Vorratsgefäß eingefüllt.

Als Nährmedien wurden bei allen Versuchen Basalmedien nach Murashige/Skoog (Murashige, T., Skoog, F., Physiol. Plant, 15, 473-497, 1962) eingesetzt, denen Wuchsstoffe im Bereich von 0 bis 3 mg/l Cytokinin (z.B. 6-Benzylaminopurin) und 0-1 mg/l Auxin (z.B. Indol-3-acetic acid) zugesetzt waren.

Als Substrat wurde mit Nährmedium vesetzter Agar-Agar verwendet. Der Nährmedium enthaltende sterile Agar-Agar wurde steril zugegeben, wobei die Höhe der Substratschicht 10 bis 15 mm betrug.

Während der Kultivierung wurden 500 ml flüssiges Nährmedium im Kreislauf durch die Vorrichtung gepumpt. Dieses Medium wurde wöchentlich erneuert. Die PumPgeschwindigkeit lag im Bereich von 2-10 ml/min.

Kontrollkulturen wurden in Weckgläsern auf Nährmedium-hal­ tigem Agar-Agar mitgeführt. Der Agar-Agar wurde während der Versuchszeit nicht erneuert.

A. Vermehrung von "Rose Vatertag"

Es wurden drei Versuche zur Beurteilung des Vermeh­ rungserfolgs durchgeführt.

• - Versuch V1: 2 Lagen Kapillarmembranen
• - Versuch V2: 4 Lagen Kapillarmembranen
• - Versuch V3: 8 Lagen Kapillarmembranen

Alle übrigen Parameter wurden für die Versuche V1 bis V3 konstant gehalten, wie nachfolgend beschrieben wird.

Als Substrat wurde Agar-Agar verwendet, der mit dem Nährmedium versetzt war.

Als Kultivierungsgut wurden jeweils 20 Pflanzen der Spezies "Rose Vatertag" eingesetzt und 43 Tage kultiviert, wobei das Nährmedium mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/min im Kreislauf gepumpt wurde.

Als Kontrollversuch A wurden 60 Pflanzen derselben Spe­ zies in handelsüblichen Weckgläsern auf demselben Sub­ strat kultiviert, das für den Kultivierungslauf gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Anwendung kam. Der Kontrollversuch wurde zeitgleich durchgeführt, so daß sich auch für den Kontrollversuch eine Kultivierungszeit von ebenfalls 43 Tagen ergab.

Als Beurteilungskriterium für die Auswertung wurde im Hinblick auf eine gewerbliche Anwendung der Vermeh­ rungsfaktor, d.h. die Zahl der gewonnenen Sprosse be­ zogen auf die Anzahl eingesetzter Sprosse, herangezogen.

In allen drei Versuchen ergab sich nach dem Ablauf der Kultivierungszeit eine signifikante Erhöhung des Ver­ mehrungsfaktors gegenüber dem Kontrollversuch, wie nachstehender Tabelle zu entnehmen ist.

Versuch
Vermehrungsfaktor
V1
4,85
V2	5,10
V3	5,65
Kontrolle A	3,62

B. Bewurzelung von "Rose Muttertag"

Es wurden zwei Versuche zur Beurteilung des Bewurzelungserfolgs durchgeführt:

• - Versuch V4: 2 Lagen Kapillarmembranen
• - Versuch V5: 4 Lagen Kapillarmembranen

Alle übrigen Parameter wurden für die Versuche V4 und V5 konstant gehalten, wie nachfolgend beschrieben wird.

Als Substrat wurde Agar-Agar verwendet, der mit dem Nährmedium versetzt war.

Als Kultivierungsgut wurden jeweils 24 Pflanzen der Spezies "Rose Muttertag" eingesetzt und 14 Tage kulti­ viert, wobei das Nährmedium mit einer Geschwindigkeit zwischen 5 bis 10 ml/min im Kreislauf umgepumpt wurde.

Als Kontrollversuch B wurden 24 Pflanzen derselben Spe­ zies in handelsüblichen Weckgläsern auf demselben Sub­ strat kultiviert, das für den Kultivierungslauf gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Anwendung kam. Der Kontrollversuch wurde zeitgleich durchgeführt, so daß sich auch für den Kontrollversuch eine Kultivierungszeit Als Beurteilungskriterium für die Auswertung wurde die Bewurzelungsrate herangezogen, die gebildet wird aus dem Verhältnis der Anzahl der bewurzelten Pflanzen zur Gesamtzahl der eingesetzten Pflanzen, ausgedrückt in Prozent.

In beiden Versuchen ergab sich nach dem Ablauf der Kultivierungszeit eine signifikante Erhöhung der Bewurzelungsrate gegenüber dem Kontrollversuch, wie nachstehender Tabelle zu entnehmen ist.

Versuch
Bewurzelungsrate
V4|96%
V5	96%
Kontrolle B	75%

C. Vermehrung von "Veilchen Saintpaulia"

Abschließend wurde noch ein Versuch V6 zur Beurteilung des Vermehrungserfolges durchgeführt, wobei 6 Lagen Ka­ pillarmembranen verwendet wurden.

Als Kultivierungsgut wurden 12 Pflanzen der Sorte Saintpaulia R2 eingesetzt und 70 Tage kultiviert, wobei das Nährmedium mit einer Geschwindigkeit von 2 bis 6 ml/min im Kreislauf gepumpt wurde.

Als Substrat wurde Agar-Agar verwendet, der mit Nährmedium versetzt war.

Als Kontrollversuch C wurden 10 Pflanzen derselben Spe­ zies in handelsüblichen Weckgläsern auf Agar-Agar kul­ tiviert. Der Kontrollversuch wurde zeitgleich durchge­ führt, so daß sich ebenfalls eine Kultivierungszeit von 70 Tagen ergab.

Als Beurteilungskriterium wurde analog zu dem Versuch V1 bis V3 der Vermehrungsfaktor benutzt. Wiederum ergab sich eine signifikante Erhöhung des Vermehrungsfaktors.

Versuch
Vermehrungsfaktor
V6
56,42
Kontrolle C	18,60

Die vorstehenden Beispiele besitzen lediglich exemplarischen Charakter und stellen keine Begrenzung der möglichen Einsatzgebiete dar. So ist neben dem Einsatzgebiet der Massenvermehrung in der dargestellten Art und Weise z.B. auch die Möglichkeit einer Versorgung von Mutterquartieren zur mehrfachen, wiederholten Sproßgewinnung gegeben. Darüber hinaus sind eine Reihe spezieller Anwendungsgebiete zu nennen, wie z. B. Untersuchungen zur Optimierung von Kulturmedien oder des Pflanzenwachstums, Langzeitversuche, kontrollierte Langzeitlagerung, Toxizitäts- und Resistenztests, sowie die Kultur von Pilzen jeglicher Art.

Claims (14)

1. Verfahren zur In-vitro-Kultivierung und In-vitro- Vermehrung von Pflanzen, bei dem die Pflanzen durch an eine Ver- und ggf. eine Entsorgungseinrichtung an­ geschlossene Kapillarmembranen mit Nährmedium ver- und ggf. von Stoffwechselprodukten entsorgt und auf einem Substrat kultiviert werden, dadurch gekennzeichnet, daß einzelne Zellen bis hin zu Setzlingen von Pflanzen verwendet werden, daß Kapillarmembranen eng aneinander­ liegend angeordnet und mit einer Substratschicht für die Pflanzen bedeckt verwendet werden, daß die Pflanzen bis zum Erreichen einer für die Umpflanzung erforderlichen Größe kultiviert werden, daß die Kapillarmembranen und die Substratschicht danach um die Pflanzen herum zer­ trennt werden und danach die Pflanzen zusammen mit den zertrennten Kapillarmembranen und der zertrennten Sub­ stratschicht umgepflanzt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanzen an ihren endgültigen Standort gepflanzt werden.

3. Vorrichtung, geeignet zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 oder 2, bestehend aus wenigstens einer Kapillarmembran und aus Substrat, dadurch gekennzeich­ net, daß die Kapillarmembranen als erste Schicht ange­ ordnet sind, daß das Substrat als zweite Schicht über und/oder in der ersten Schicht angeordnet ist und daß ein Wachstumsraum über der zweiten Schicht angeordnet ist.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Wachstumsraum klimatisierbar ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Kapillarmembranen und/oder das Sub­ strat aus biologisch abbaubarem Material bestehen.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapillarmembranen aus Cellulose, regenerierter Cellulose oder Cellulosederivaten beste­ hen.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Schicht aus wenigstens einer Lage Kapillarmembranen besteht.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapillarmembranen im wesent­ lichen parallel zueinander angeordnet sind.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß innerhalb der Lage die Kapillarmem­ branen mit Kettfäden verbunden sind.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Kapillarmembranen benach­ barter Lagen überkreuzen.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Lage Kapillarmembranen aus einem Gewebe, Gewirke oder Gelege besteht.

12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapillarmembranen an ihren Enden jeweils in eine gemeinsame Ein- und eine gemeinsame Auslaufkammer münden.

13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapillarmembranen zu einem Prä­ modul zusammengefaßt sind und der Prämodul auswechselbar ist.

14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Substratschicht aus einer Schüttung eines Kapillarmembrankurzschnitts besteht.