DE3741583A1 - Verfahren zur vernichtung von mikroben im betriebswasser von papierfabriken - Google Patents

Verfahren zur vernichtung von mikroben im betriebswasser von papierfabriken

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Description

Die Erfindung betrifft die Vernichtung Präzipitate verursachenden, schleimbildenden und/oder die Qualität von Lebensmittelpapier bzw. -karton mindernden Mikroben im Fabrikationswasser von Papierfabriken.
Die Fabrikationswässer der Papierindustrie bieten außerordentlich günstige Bedingungen für das Wachstum von Bakterien und Pilzen. Temperatur, pH-Wert und Nährstoffgehalt sind für mehrere Mikroben oftmals fast optimal. Als Folge davon können in den Papierfabriken zeitweise schleimbildende Betriebsstörungen auftreten, verursacht von Anhäufungen bildenden Mikroben. Oft ist damit eine starke Schleimbildung verbunden. Ein mikrobiologisches Problem eigener Art bilden die im Papier bzw. Karton für Lebensmittelzwecke verbleibenden Bakterien oder deren Sporen (z. B. Bacillus).
Im Rahmen ausgedehnter Untersuchungen in verschiedenen Papierfabriken, in denen Produktionsstörungen auftraten, konnte festgestellt werden, daß die schlimmsten Störungsverursacher im Betriebswasser die hyphenbildenden Mikroben sind. An den gebildeten Hyphen setzen sich schleimbildende Bakterien sowie chemischer Schleim an. Schädliche Mikroorganismen in diesem Sinne sind hauptsächlich die Schimmel- und Hefepilze sowie die kettenbildenden Bakterien wie die Bacillus-Spezies.
Schleimstörungen hat man traditionell durch Einsatz mikrobentötender Chemikalien bekämpft. Früher benutzte man dazu Quecksilberverbindungen, auf die man jedoch wegen ihrer Giftigkeit in der zweiten Hälfte der 1960er Jahre, schon bevor ihr Einsatz verboten wurde, verzichtete. Man ist weiterhin gezwungen, Biozide, zu den Giften zweiter Klasse zu rechnende organische Verbindungen, einzusetzen. Jede Schleimbekämpfungschemikalie hat im Betriebswasser eine spezifische biologische Halbwertszeit, die von einigen zehn Minuten bis zu mehreren Tagen reicht. Gewisse Zerfallsprodukte können auch bakteriostatischer Natur sein. Deshalb ist der Einsatz chemischer Bekämpfungsmittel auch in ökologischer Hinsicht eine unvorteilhafte Angelegenheit.
Als neue Möglichkeit zur Bekämpfung von Mikroben im Betriebswasser von Papierfabriken wurde nun ein natürliches mikrobiologisches Schleimbekämpfungsmittel entwickelt, das auf der Nutzung lytischer, die Mikrobenzellwände zerstörender Enzyme basiert. Dabei ist also die Bekämpfung auf den primären Störungsgrund, die Mikrobe gerichtet. Man hat jetzt lytische Enzyme gefunden, welche namentlich die betreffenden Mikroben bekämpfen. Bei den lytischen Enzymen handelt es sich um labile, im Betriebswasser schnell zerfallende Verbindungen, die nur für die Mikroben, ansonsten aber nicht gefährlich sind. Man hat also nun ein Mittel gefunden, mit dem sich die gegenwärtigen chemischen Bekämpfungsstoffe durch eine anwender- und umweltfreundliche Alternative ersetzen lassen.
Die lytischen Enzyme sollen in erster Linie zu dem Zweck eingesetzt werden, im Betriebswasser von Papierfabriken präzipitatsbildende Bakterien aufzulösen und die Qualität von Lebensmittelpapier bzw. -karton beeinträchtigende Bakterien abzutöten. Durch Einsatz lytischer Enzyme lassen sich auch schleimbedingte Störungen durch Spaltung der Wandstrukturen der Mikrobenzellen, so daß die Anhäufungen aufgelöst werden, beseitigen.
Der Vorteil der Enzyme gegenüber Chemikalien liegt u. a. in ihrer Ungiftigkeit für den Menschen und die Umwelt, in ihrer Spezifität und in ihrem geringen Platzbedarf. Durch Aufkonzentrieren des Enzympräparats erhält man wirksame Konzentrationen schon mit einigen ppm Enzympräparat im Fabrikationswasser.
Die Erfindung betrifft also ein Verfahren, bei dem die Präzipitate verursachenden und schleimbildenden und/oder die Qualität von Lebensmittelpapier bzw. -karton mindernden Mikroben in den Fabrikationswässern von Papierfabriken entweder a priori oder nachträglich durch Zusatz lytischer Enzyme in diese Wässer vernichtet werden.
Die lytischen Enzyme, die mit Hilfe von Mikroben erzeugt oder aus Hühnerei-Eiweiß isoliert werden, wirken hauptsächlich auf die 1,3-Bindungen im Glucan der Mikrobenzellwände, wobei die Zellwand dem in der Zelle herrschenden Druck nicht mehr standzuhalten vermag und reißt. Bisher kennt man den kommerziellen Einsatz solcher Enzyme lediglich zum Freisetzen an der Zellwand angelagerter Eiweißstoffe und in der Forschung zum Freisetzen zellinterner Teile.
Bekannt ist bereits die Zersetzung von Polysaccharidschleim mit herkömmlichen Enzymen in der Papierindustrie. Es gibt ein Handelspräparat, Levanhydrolase (US 37 73 623, US 38 24 184, SF 52 271), dessen Schwäche darin besteht, daß es nur auf Levanschleim wirkt, den nur wenige in der Papierindustrie vorkommende Bakterien erzeugen. In der Praxis ist es fast unmöglich, mit diesem Enzym allein eine ausreichende Wirkung zu erzielen, und es müssen weiterhin gleichzeitig giftige Mikroben, besonders Pilze abtötende Biozide zugesetzt werden. Auch zwei andere herkömmliche Enzyme zum Spalten von Schleimen in Fabrikationswässern der Papierindustrie wurden patentiert: Pentosanase-Hexosanase (US 40 55 467) und Dehydrogenase (US 43 70 199).
Der Einsatz herkömmlicher Enzyme zur Bekämpfung mikrobiologisch bedingter Störungen in der Papierindustrie hat einige recht erhebliche Schattenseiten. Erstens richtet sich die Bekämpfung auf die sekundäre Erscheinung: den Schleim, der von Mikrobe zu Mikrobe variiert. Da die Enzyme aber hochspezifischer Natur sind, bleibt Schleim übrig, den das Enzym nicht abzubauen vermag. Zweitens wird der Polysaccharidschleim in kleinere Komponenten gespaltet, welche die Mikroben als Nahrung zu nutzen vermögen. Es kann dann auch zu einer explosionsartigen Vermehrung und Zusammenballung von gefährlichen Pilzen kommen, was wiederum zu Betriebsstörungen führt.
Ins Betriebswasser der Papierfabrik werden an gewissen kritischen Punkten z. B. lytische Enzyme in wäßriger Lösung, gestützt auf Vorversuche im Labor z. B. jeweils zwei Stunden lang 10 ppm in Abständen von vier Stunden zugesetzt. Ziel ist es, die Mikrobendichte in bezug auf die störungsverursachenden Organismen unter einer bestimmten kritischen, die Störungsschwelle darstellenden Grenze zu halten.
Das lytische Enzympräparat kann gemäß gängiger Praxis in fester, wassermischbarer oder flüssiger Form in Wasser formuliert sein.
Im folgenden wird die Erfindung an Hand von Beispielen im einzelnen beschrieben.
Beispiel 1 Schimmelpilz: Aspergillus niger Verfahren
Als Nährmedium diente Pilznährlösung (S-S-Nährlösung): 0,4% Hefeextrakt, 1,0% Malzextrakt, 0,4% D-Glucan, pH 7,3. Das Inokulum wurde durch Homogenisieren von auf Pilznähragar (S-S-Agar) als Schrägröhrchenkultur gezüchtetem Aspergillus niger in steriles Wasser hergestellt. Nach erfolgter Beimpfung wurde der Pilz bei +30°C als Schüttelkultur kultiviert.
Von den lytischen Enzym Novozym 234 wurde eine einprozentige Lösung hergestellt und durch Filtrieren in einem Bakterienfilter (Porenweite 0,45 µm) sterilisiert.
Zum Testen der Hemmwirkung von Novozym 234 auf das Wachstum von Aspergillus niger wurde dem Kulturmedium im Zusammenhang mit der Beimpfung Enzym in folgenen Konzentrationen zugesetzt: 0 ppm (= Kontrolle), 1 ppm, 5 ppm, 10 ppm, 25 ppm, 50 ppm, 75 ppm bzw. 100 ppm. Das Wachstum von Aspergillus niger wurde durch Messen der Kulturmedium-Absorbanz bei 620 Nanometer mit einem Spektralphotometer unmittelbar nach der Beimpfung sowie 1 Stunde, 2 Stunden, 3 Stunden, 4,5 Stunden, 6,5 Stunden und 9 Stunden nach der Beimpfung verfolgt.
Ergebnisse
Das Wachstum von Aspergillus niger wurde spektrometrisch verfolgt (Wellenlänge 620 nm). Die gemessenen Absorbanzwerte sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Bei Novozym-234-Konzentrationen von 5 ppm ab aufwärts war eine deutliche Verlangsamung des Schimmelpilzwachstums zu beobachten. Bei den verwendeten Konzentrationen (100 ppm) wurde das Wachstum von Aspergillus niger zwar nicht völlig gehemmt, jedoch erheblich gebremst (Bild 1).
Tabelle 1
Die A₆₂₀-Werte der Novozym 234 in verschiedenen Konzentrationen enthaltenden Aspergillus-niger-Kulturen während der Kultivierung
Schlußfolgerungen
Aspergillus niger ist ein typischer in der Papierindustrie allgemein auftretender Schimmelpilz, dessen starke Hyphenbildung die Bildung von Präzipitaten bewirkt. Der Organismus ist unter sehr unterschiedlichen Bedingungen vegetationsfähig und deshalb besonders schwierig unter Kontrolle zu halten. Aus Tabelle 1 und Bild 1 geht hervor, wie bereits 5 ppm lytisches Enzym Novozym 234 das Wachstum des Schimmelpilzes Aspergillus niger verlangsamen; das Enzym könnte in der Papierfabrik periodisch mit einer Dosierpumpe zugesetzt werden. Eine Enzymmenge von 75 ppm bewirkt für fünf Stunden einen völligen Wachstumsstop. In dem Versuch wurden zur Veranschaulichung der Ergebnisse Zusatznährstoffe eingesetzt, so daß also in Wirklichkeit, d. h. unter echten Papierfabrik-Betriebswasser-Verhältnissen noch geringere Enzymmengen genügen würden.
Beispiel 2 Hefepilz: Hefe 1696, isoliert in einer Papierfabrik Verfahren
Als Nährmedium diente Pilznährlösung (S-S-Nährlösung): 0,4% Hefeextrakt, 1,0% Malzextrakt, 0,4% D-Glucose, pH 7,3. Aus der Hefe 1696 wurde Inokulum durch Homogenisieren von auf Pilznähragar (S-S-Agar) angesetzter Hefepilz-Schrägagarkultur in steriles Wasser hergestellt. Die Hefe 1696 wurde bei +30°C als Schüttelkultur kultiviert.
Aus lytischem Enzym Novozym 234 wurde eine einprozentige Lösung hergestellt und in einem Bakterienfilter (Filterporenweite 0,45 µm) sterilisiert.
Im Wachstumshemmversuch wurde dem Kulturmedium im Zusammenhang mit der Beimpfung mit Hefe 1696 das Enzym Novozym 234 in folgenden Konzentrationen zugesetzt: 0 ppm (= Kontrolle), 1 ppm, 5 ppm, 10 ppm, 25 ppm, 50 ppm, 75 ppm und 100 ppm. Das Wachstum der Hefe 1696 wurde durch Messen der Kultur-Absorbanz bei 620 Nanometer mit einem Spektralphotometer unmittelbar nach der Beimpfung sowie 1 Stunde, 2 Stunden, 3 Stunden, 4 Stunden, 5 Stunden, 6 Stunden und 7 Stunden nach der Beimpfung verfolgt.
Ergebnisse
Das Wachstum der in der Papierfabrik isolierten Hefe 1696 wurde spektrometrisch verfolgt; die A₆₂₀-Werte sind in Tabelle 2 zusammengestellt. Bei Novozym-234-Konzentrationen von 25 ppm aufwärts wurde das Wachstum der Hefe 1696 erheblich gebremst. Auch bei niedrigeren Konzentrationen des Novozym 234 wurde eine Verlangsamung des Hefewachstums beobachtet, jedoch blieb die Wirkung dann kürzer als bei den höheren Gehalten (Bild 2).
Tabelle 2
A₆₂₀-Werte der Novozym 234 in verschiedenen Konzentrationen enthaltenden Hefe-1696-Kulturen während der Züchtung
Schlußfolgerungen
Die Hefe 1696 verursachte in einer finnischen Papierfabrik durch Bildung von schleimartigen Präzipitaten Unterbrechungen in der Papierproduktion. Neben den Schimmelpilzen haben sich die Hefepilze infolge ihres Kettenbildungsvermögens und ihrer oft starken Schleimerzeugung als äußerst problematisch erwiesen. Aus Tabelle 2 und Bild 2 ist ersichtlich, wie schon 1 ppm lytisches Enzym Novozym 234 das Wachstum des in der Fabrik isolierten Hefestammes 1696 verzögerte. Bei höheren Enzymkonzentrationen erhöht sich die inhibitorische Wirkung, und berücksichtigt man, daß die verwendete Nährlösung beträchtlich größere Mengen gelöste Nährstoffe als das Betriebswasser der Papierfabrik enthält, so kann vorausgesetzt werden, daß in der Praxis ein periodisches zweistündiges, mit Dosierpumpe erfolgendes Einspeisen von einigen ppm im Abstand von jeweils vier Stunden genügen dürfte, um das Wachstum des Hefepilzes auf ausreichend niedrigem Niveau zu halten.
Beispiel 3 Bakterium: Bacillus subtilis, ATCC 23059 Verfahren
Als Nährmedium diente Trypton-Hefeextrakt-Lösung, die 0,5% Trypton, 0,25% Hefeextrakt und 0,5% Natriumchlorid enthielt, pH 9,2. Als Inokulum diente in entsprechendem Nährmedium kultivierte frische Bakterienkultur. Die Kultivierung im Versuch erfolgte als Schüttelkultur bei +37°C.
Als lytisches Enzym diente zentrifugiertes und filtriertes Cyto­ phaga-sp.-NCIB-9497-Kulturmedium. (Das Filter hatte eine Porenweite von 0,45 µm.) Als Nährlösung für den Enzymerzeuger diente Hefeextrakt-Brühe, welche 2,0% Hefeextrakt enthielt, pH 7,0. Die Bebrütung erfolgte bei +37°C und dauerte 16 Stunden.
Im Wachstumshemmversuch wurde dem Nährmedium des zu testenden Bakteriums in Verbindung mit der Beimpfung filtriertes Cytopha­ ga-sp.-NCIB-9497-Kulturmedium in einer Menge von 16 Volumenprozent zugesetzt. Der Kontrolle wurde eine entsprechende Menge Hefeextraktbrühe (2,0% Hefeextrakt) zugesetzt. Das Wachstum wurde durch Messen der Konzentration des sich in der Kultur zersetzenden Adenosintriphosphats (ATP) unmittelbar nach der Beimpfung sowie 2 Stunden, 4 Stunden und 23 Stunden nach der Beimpfung mit einer Biolumineszenzvorrichtung verfolgt. Die Menge des sich zersetzenden ATP ist direkt proportional zur Wachstumsintensität der Mikroben - je mehr zerfallendes ATP, um so mehr lebende, aktive Mikroben.
Ergebnisse
Das Wachstum von Bacillus subtilis ATCC 23059 wurde durch Messen der Veränderung des ATP-Gehaltes der Kultur verfolgt. Die gemessenen ATP-Konzentrationen sind in Tabelle 3 zusammengestellt. Die Zugabe von lytische Enzyme enthaltendem Cytophaga-sp.-NCIB- 9497-Kulturmedium in die Bacillus-subtilis-ATCC-23059-Kultur bewirkte eine beträchtliche Verlangsamung des Wachstums dieses Bakteriums und eine deutliche Verlängerung seiner Lag-Phase.
Tabelle 3
Einfluß des lytische Enzyme enthaltenden filtrierten Cytopha­ ga-sp.-NCIB-9497-Kulturmediums auf das Wachstum von Bacillus subtilis ATCC 23059. In der Tabelle sind die ATP-Konzentrationen in Nanogramm/100 µl angegeben.
Schlußfolgerungen
Die Bazillen haben sich in der Papierindustrie sowohl wegen ihres Kettenbildungsvermögens und damit als Ursache für Präzipitate als auch wegen ihrer Fähigkeit, widerstandsfähige Sporen zu bilden, die ins Endprodukt eingehen und besonders bei Lebensmittelpapier große Schwierigkeiten verursachen können, als problematisch erwiesen.
Das Wachstum des besagten Bacillus-subtilis-ATCC-23059-Stammes läßt sich mit der von Cytophaga sp. erzeugten Enzymlösung für eine Dauer von über vier Stunden völlig stoppen, was im Hinblick auf das Eintragen mit Dosierpumpe in der Praxis der Papierindustrie eine völlig ausreichende Inhibitionszeit ist.
Beispiel 4 Bakterium: Bacillus-sp.-Stamm aus einer finnischen Papierfabrik
Die Durchführung des Verfahrens erfolgte wie im Beispiel 3.
Ergebnisse
Das Wachstum des Bacillus sp. aus einer finnischen Papierfabrik wurde durch Messung der ATP-Gehalts-Änderung der Kultur verfolgt. Die gemessenen ATP-Konzentrationen sind in Tabelle 4 zusammengestellt. Durch Zugabe von Cytophaga-sp.-NCIB-9497-Kulturmedium in die Bacillus-sp.-Kultur wurde das Wachstum des Bakteriums durch deutliche Verlängerung seiner Lag-Phase verlangsamt.
Tabelle 4
Einfluß des lytische Enzyme enthaltenden filtrierten Cytopha­ ga-sp.-NCIB-9497-Kulturmediums auf das Wachstum eines aus einer finnischen Papierfabrik stammenden Bacillus-sp.-Stammes. Die ATP-Konzentrationen sind in der Tabelle in ng/100 µl angegeben.
Schlußfolgerungen
Mit diesem Versuch konnte die Wirksamkeit des von Cytophaga sp. erzeugten Enzyms auch auf einen "wilden" in einer finnischen Papierfabrik isolierten Bacillus-sp.-Stamm bestätigt werden. Auch in diesem Falle hielt die Wirkung in ausgezeichneter Weise mehr als vier Stunden an, was im Hinblick auf die Praxis genügt.
Beispiel 5 Bakterium: Bacillus-sp.-Stamm aus einer schwedischen Papierfabrik
Die Durchführung des Verfahrens erfolgte wie im Beispiel 3.
Ergebnisse
Das Wachstum des aus einer schwedischen Papierfabrik stammenden Bacillus sp. wurde durch Messung der ATP-Gehalts-Änderung der Kultur verfolgt. Die gemessenen ATP-Konzentrationen sind in Tabelle 5 zusammengestellt. Durch Zugabe filtrierten Cytopha­ ga-sp.-NCIB-9497-Kulturmediums in die Bacillus-sp.-Kultur wurde das Wachstum des Bakteriums deutliche verlangsamt und seine Lag-Phase verlängert.
Tabelle 5
Einfluß des lytische Enzyme enthaltenden filtrierten Cytopha­ ga-sp.-NCIB-9497-Kulturmediums auf das Wachstum eines aus einer schwedischen Papierfabrik stammenden Bacillus-sp.-Stammes. Die ATP-Konzentrationen sind in der Tabelle in ng/100 µl angegeben.
Schlußfolgerungen
Das von Cytophaga sp. erzeugte lytische Enzym ist ein Breitspektrumenzym, denn es hat auch in diesem Versuch seine Langzeitwirkung auf einen aus einer schwedischen Papierfabrik stammenden, Probleme verursachenden Bacillus-sp.-Stamm bewiesen. Die vollständige Inhibition hält mindestens vier Stunden lang an; in dieser Zeit hat sich die Kontrolle ohne Enzymzusatz in bezug auf ihre Wachstumsintensität mehr als verdreißigfacht.

Claims (3)

1. Verfahren zur Vernichtung Präzipitate verursachender, schleimbildender und/oder die Qualität von Lebensmittelpapier bzw. -karton beeinträchtigender Mikroben in den Fabrikationswässern von Papierfabriken, dadurch gekennzeichnet, daß dem Fabrikationswasser der Papierfabrik lytisches Enzym mit die Mikrobenzellwände zerstörender Glucanase- und Proteaseaktivität zugesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß dem Fabrikationswasser der Papierfabrik lytisches Enzym auf eine Konzentration von vorzugsweise wenigstens 1 ppm zugesetzt wird.
3. Einsatz von präzipitatverursachende, schleimbildende und/oder die Qualität von Lebensmittelpapier bzw. -karton mindernde Mikroben vernichtenden lytischen Enzymen in den Fabrikationswässern von Papierfabriken.
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