DE3686257T2

DE3686257T2 - Herstellung von polypeptiden.

Info

Publication number: DE3686257T2
Application number: DE8686905378T
Authority: DE
Inventors: Anthony Eaton; Keith Rhind; Charles Titmas
Original assignee: Celltech R&D Ltd
Current assignee: UCB Celltech Ltd
Priority date: 1985-09-19
Filing date: 1986-09-19
Publication date: 1993-03-04
Anticipated expiration: 2006-09-20
Also published as: DE3686257D1; AU6376186A; EP0236416A1; GB2188934B; GB8710516D0; GB8523156D0; WO1987001729A1; AU603553B2; ATE78872T1; DK250287A; JPS63501541A; DK250287D0; GB2188934A; EP0236416B1

Description

Sachgebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit einem C-terminalen Amid-Rest und einem oder mehreren Cystein- oder Cystin-Aminosäureresten, bei dem ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz des Polypeptids und einen C-terminalen Glyzin-Aminosäurerest umfaßt, mit einem Amidierungs-Enzym umgesetzt wird.

Hintergrund der Erfindung

Es wurde gezeigt, daß eine Anzahl physiologisch wirksamer Polypeptide, besonders Peptidhormone, eine C-terminale Amidgruppe benötigen, um volle Wirksamkeit zu zeigen. Zusätzlich wurde gezeigt, daß das C-terminale Amid die Halbwertszeit einiger Hormone im Kreislaufsystem, durch Verhinderung des Abbaus durch natürliche Proteasen am C-terminalen Ende, erhöht. Es ist nun durch Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie möglich, Polypeptide in industriellem Maßstab, mittels in vitro Kulturen, synthetisch herzustellen. Jedoch besitzen Polypetide, die unmittelbar auf diese Weise hergestellt werden, kein C-terminales Amid und können deshalb ihre volle physiologische Wirksamkeit und Stabilität im Kreislaufsystem nicht entfalten. Dieses Problem wurde gelöst, indem ein Amidierungs-Enzym verwendet wurde, das einen zusätzlichen C-terminalen Aminosäurerest in den nötigen Amid-Rest umwandelte (siehe zum Beispiel publizierte europäische Patentanmeldung EP-A1-0134631 und EP-A1-0133282). Das betreffende Amidierungs-Enzym wurde zum ersten Mal durch Bradbury et. al. beschrieben und charakterisiert (Bradbury, A. F. et. al. Nature (1982) 298, 686-688; Bradbury, A. F. et. al. Biochem. and Biophys. Comm. (1983) 1123(2), 372-377; Landymore-Lin, A. E. N. et. al. Biochem. and Biophys. Comm. (1983) 117(2), 289-293).
Wir haben nun festgestellt, daß solche Amidierungs-Enzyme gewisse Polypeptide nicht zufriedenstellend amidieren, besonders diejenigen Polypeptide, welche Cystein-Aminosäurereste oder Disulfidbrücken in ihrer Struktur enthalten. Unsere Untersuchungen zeigen, daß die mangelhaft zufriedenstellende Amidierung von der Ausfällung des Polypeptidsubstrats während der Behandlung mit Amidierungs-Enzym herrührt.
Unter Vorbehalt glauben wir, daß diese Ausfällung, zumindest teilweise, durch Kupfer, welches erwiesenermaßen in manchen Fällen die Aktivität des Amidierungs-Enzyms erhöht, hervorgerufen wird. Das Kupfer, welches in der Amidierungs-Enzym-Zubereitung vorliegt, könnte mit Schwefelresten des Cysteins oder Cystins wechselwirken, was Polymerisation des Polypeptids bewirkt und zu Dimerbildung und/oder Aggregation führt, was wiederum in Ausfällung des Polypeptids endet. Zusätzlich kann Ascorbinsäure (Vitamin C), welches als ein weiterer Cofaktor in der Amidierungszubereitung verwendet wird, für weitere Komplikationen sorgen. Zum Beispiel kann Ascorbinsäure auch in die Modifikation des Polypeptids, in Folge seiner Wechselwirkung mit Schwefelresten des Cysteins oder Cystins, verwickelt sein.
Es scheint, daß die Amidierungs-Wirksamkeit des Enzyms beträchtlich reduziert wird, wenn das Polypeptidsubstrat in der ausgefällten Form vorliegt.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß einer ersten Erscheinungsform der Erfindung wird ein Verfahren dargelegt, um ein erstes Polypeptid mit einem C-terminalen Amid-Rest und einem oder mehreren Cystein- oder Cystin Aminosäureresten herzustellen, bei dem ein zweites, die Aminosäuresequenz des ersten Polypeptids und einen C-terminalen Glycin-Aminosäurerest umfassendes Polypeptid mit einem Amidierungs-Enzym umgesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß der oder die Cystein- oder Cystin-Schwefelreste zumindest während des Amidierungsschrittes geschützt sind.
Der Begriff 'Amidierungs-Enzym' in diesem Text bezeichnet ein Enzym, welches fähig ist, den C-terminalen Glycin-Aminosäurerest in einen Amid-Rest umzuwandeln.
Das Amidierungs-Enzym kann aus Quellen wie z. B. Säugergewebe oder aus jeglicher anderer geeigneter Quelle gewonnen werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Amidierungs-Enzym welches im Verfahren der Erfindung verwendet wird, ein Amidierungs-Enzym wie z. B. das Amidierungs-Enzym, welches aus Schweinehypophysegewebe stammt, wie von Bradbury et al beschrieben und charakterisiert (J. loc. cit.).
Der Schutz des Cystein- oder Cystin-Schwefelrestes oder der -Schwefelreste während Behandlung mit der Amidierungs-Enzym-Zubereitung vermindert das bisher unvorhergesehene Problem der Ausfällung.
Wie hierin verwendet, bedeutet die Bezeichnung "Cysteinoder Cystin-Aminosäurerest" auch deren Derivate. Typischerweise sind Cystein- oder Cystinreste zu chemischer Modifikation entweder durch Derivatisierung oder Umsetzung mit einer Schutzgruppe, um einen geschützten Schwefel enthaltenden Rest zu ergeben, befähigt.
Der Schutz des Cystein- oder Cystin-Schwefelrestes, welcher während des Amidierungsschrittes angewendet wird, kann einen irreversibeln Schutz umfassen. Zum Beispiel kann ein Cysteinoder Cystin-Schwefelrest durch irreversible Derivatisierung, beispielsweise durch Behandlung mit Acrylnitril, Ethylenimin, Sulfenylhalogenid, oder durch Perameisensaureoxidation des Cystins zu Cysteinsäure geschützt werden. Vorzugsweise jedoch ist der Schutz reversibel und man kann jegliche Schutzgruppe, die fähig ist, reversibel an Cystein oder Cystin zu binden, verwenden. Typischerweise sind die Bedingungen, die für den Schutz des Cystein- oder Cystin-Schwefelrest, und im Falle von reversiblem Schutz, für die Entfernung der Schutzgruppe angewendet werden so, daß sie keinen schädlichen Einfluß auf die Struktur des Polypeptids haben, d. h. das Endprodukt wird vorteilhaft in der Form seiner nativen dreidimensionalen Struktur hergestellt.
Das Polypeptid kann ein jegliches Polypeptid mit einem oder mehreren Cystein- oder Cystin-Aminosäureresten sein, für welches ein C-terminaler Amid-Rest wünschenswert ist. Das Verfahren ist geeignet, um einen C-terminalen Glycin-Aminorest eines Polypeptids, welches durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt wurde, in einen C-terminalen Amid-Rest umzuwandeln. Beispiele solcher Polypeptide umfassen Calcitonine, wie z. B. Lachscalcitonin, menschliches Calcitonin und funktionell gleichwertige Derivate dieser Calcitonine; genverwandte Peptide des Calcitonins wie z. B. menschliches genverwandtes Peptid des Calcitonins, genverwandtes Peptid des Calcitonins aus Ratte und funktionell gleichwertige Derivate dieser genverwandten Peptide; Oxytocin und funktionell gleichwertige Derivate; und Vasopressin und funktionell gleichwertige Derivate.
Der Begriff 'Polypeptid' bezeichnet in diesem Text eine Verbindung, die aus zwei oder mehr Aminosäureresten besteht und beinhaltet Proteine mit Sekundärstruktur.
In manchen Fällen kann unter den Bedingungen, die für die Wirksamkeit des Amidierungs-Enzym optimal sind (zum Beispiel bei einem pH-Bereich 5 bis 8, vorzugsweise etwa 6,8 für das bevorzugte Amidierungs-Enzym), die Polypeptid-Glycinverbindung nahe, oder bei, ihrem isoelektrischen Punkt sein und dies kann Ausfällung bewirken, was auf eine andere Weise die Verfügbarkeit des Substrates für das Amidierungs-Enzym vermindert. Dieses Problem kann gelöst werden, indem Schutz verwendet wird, der entweder durch Derivatisierung oder durch Verwendung einer geladenen Schutzgruppe eine Nettoladung in das Polypeptid einführt. Das Einführen einer Nettoladung in das geschützte Polypeptid kann seinen isoelektrischen Punkt und seine Lösungseigenschaften verändern und dadurch die Ausfällung vermindern. Geeignete Schutzgruppen, welche an Cystein- und Cystin-Schwefelreste binden können, beinhalten SO und -SPO . Da menschliches Calcitonin-Glycin und menschliches genverwandtes Peptid-Glycin des Calcitonins beim bevorzugten Amidierungs-pH nahe bei ihrem isoelektrischen Punkt sind, bringt die Verwendung einer geladenen Schutzgruppe, die die Disulfidbrücken schützt und den isoelektrischen Punkt ändert, eine wesentliche Verbesserung in der Zubereitung korrekt C-terminal amidierter Polypeptide.
Gemäß einer zweiten Erscheinungsform der Erfindung wird ein Polypeptid mit einem oder mehreren Cystein- oder Cystin-Aminosäureresten und einem C-terminalen Glycin-Aminosäurerest dargelegt, dadurch gekennzeichnet, daß der oder jeder Cystein- oder Cystin-Schwefelrest geschützt ist.
Jeder Cystein- oder Cystin-Schwefelrest kann durch Derivatisierung oder durch Binden einer Schutzgruppe geschützt werden. Geeignete Schutzgruppen beinhalten alle Schutzgruppen, die fähig sind, reversibel an Cystein- oder Cystin-Schwefelatome zu binden, mit der Maßgabe, daß sie bei Bedingungen binden und entfernt werden können, die nicht schädlich sind für das Polypeptid. Vorzugsweise ist die Schutzgruppe geladen. Besonders bevorzugte Schutzgruppen sind -SO und -SPO .
Beispiele anderer geeigneter Cystein- oder Cystin-Schwefelschutzgruppen, welche verwendet werden können, beinhalten z. B. Benzylgruppen, welche mit einem oder mehreren Carboxy-, Sulfat-, Phosphat-, Alkyl-, Alkoxy-, Nitro- oder Halogensubstituenten substituiert sein können, z. B. eine Dinitrofluorobenzolgruppe; eine Diphenylmethylgruppe, welche mit einem oder mehreren Carboxy-, Sulfat- oder Phosphatsubstituenten substituiert sein kann; eine Triphenylmethylgruppe, welche mit einem oder mehreren Carboxy-, Sulfat- oder Phosphatsubstituenten substituiert sein kann; Alkylgruppen, z. B. eine t-Butylgruppe; eine Acylgruppe, z. B. eine Acetylgruppe; eine Acylgruppe, die beispielsweise mit einem Halogenatom substituiert ist, z. B. eine Jodacetatgruppe; eine Benzoylgruppe; eine Carbonatgruppe; eine Carbamoylgruppe, welche mit beispielsweise einer Alkyl-, einer Alkoxy- oder einer Alkoxyalkylgruppe substituiert sein kann; eine Benzhydrylgruppe; eine Mono- oder Diacetalgruppe, z. B. eine Tetrahydropyranylgruppe oder eine Benzylthiomethylgruppe; ein Metall z. B. Quecksilber; eine Quecksilbergruppe z. B. eine Quecksilberbenzoatgruppe; oder eine gemischte Disulfidgruppe z. B. eine S-Alkylmercapto- oder eine S-Alkylsulfenylcysteingruppe. Beispiele anderer Cystein- oder Cystin-Schwefelschutzgruppen und Verfahren zur Entfernung solcher Schutzgruppen können, falls gewünscht, zum Beispiel aus "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol. 2 Part A (eds. Gross and Meienhofer, Academic Press (1980)) und "Chemical Modification of Proteins" (eds. Means and Feeney, Holden-Day Inc. (1971)) entnommen werden.
Es wird anerkannt sein, daß eine Nettoladung, falls gewünscht, in die obigen Cystein- oder Cystin-Schwefelschutzgruppen oder jegliche andere geeignete Cystein- oder Cystin-Schwefelschutzgruppen, durch Substitution der Schutzgruppe mit einem passenden geladenen Substituenten beispielsweise durch Substitution mit einem oder mehreren Carboxy-, Sulfat- oder Phosphatsubstituenten eingeführt werden kann.
Wir haben auch festgestellt, daß wenn Kupfer, welches in der Amidierungs-Enzym-Zubereitung vorliegt, in einer Chelatform vorliegt, verbesserte Ausbeuten des amidierten Produktes erhalten werden können. Chelatbildung des Kupfer kann als Alternative oder vorzugsweise in Kombination mit dem Schutz der Cystein- oder Cystin-Schwefelreste verwendet werden. Es scheint, daß Chelatbildung des Kupfers die Ausfällung des Polypeptids vermindern kann und weitere Vorteile betreffend der Modulierung der Zuganglichkeit des Kupfers zum Enzym haben kann. Mit Bezug auf das Letztere haben wir weiter festgestellt, daß während in manchen Fällen Kupfer die Wirksamkeit des Amidierungs-Enzym verstärkt, kann ein Überschuß an Kupfer schädlich für die Enzymaktivität sein. Chelatbildung des Kupfers scheint diese Schwierigkeit zu beseitigen.
Gemäß einer dritten Erscheinungsform der Erfindung wird somit ein Verfahren zur Herstellung eines ersten Polypetids mit einem C-terminalen Amidrest dargelegt, bei dem ein zweites, die Aminosäuresequenz des ersten Polypeptids und einen C-terminalen Glycin-Aminosäurerest umfassendes Polypetid mit einem Amidierungs-Enzym umgesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Amidierungs-Enzym-Zubereitung eine Verbindung beinhaltet, welche fähig ist Kupferchelat zu bilden.
Geeignete chelatbildende Verbindungen beinhalten Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Penicillamin. Ein weiterer Chelatbildner, der verwendet werden kann, ist Bathocuproin, als ein Disulfonat, welches bevorzugt Kupfer(I)-Chelat bildet.
Wir haben festgestellt, daß die Zugabe von chelatbildendem Agens den Gehalt an freiem Kupfer vermindert, wodurch die schädlichen Effekte an sowohl dem Polypeptid als auch dem Amidierungs-Enzym vermindert werden, aber ein Kupfergehalt, in geeigneter Form, genügend um als Kofaktor für das Enzym zu wirken, erhalten bleibt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele mit Verweis auf die begleitenden Zeichnungen, welche "HPLC"- (high performance liquid chromatography) -Spuren sind, dargestellt.
Fig. 1: Spur 1 zeigt eine "HPLC"-Spur eines Aliquots einer Reaktionsmischung bei 0 min Inkubationszeit, welche hCT-Gly und Schweinehypophyse-Amidierungsenzym enthält.
Spur 2 zeigt eine "HPLC"-Spur eines Aliquots einer Reaktionsmischung nach 420 min Inkubationszeit, welche hCT-Gly und Schweinehypophyse-Amidierungsenzym enthält.
Fig. 2: Spur 1 zeigt eine "HPLC"-Spur eines Aliquots eines Pellets, welches nach Zentrifugation einer Reaktionsmischung, welche 540 min lang inkubiert wurde und hCT und Schweinehypophyse-Amidierungsenzym enthält, erhalten wurde.
Spur 2 zeigt eine "HPLC"-Spur eines Aliquots eines Überstands, welcher nach Zentrifugation einer Reaktionsmischung, welche 540 min lang inkubiert wurde und hCT und Schweinehypophyse-Amidierungsenzym enthält, erhalten wurde.
Fig. 3: Spur 1 zeigt eine "HPLC"-Spur einer Probe, die unmittelbar nach der Zubereitung einer Reaktionsmischung, die hCT-Gly, Cu/EDTA und Ascorbinsäure enthält, entnommen wurde.
Spur 2 zeigt eine "HPLC"-Spur einer Probe, die nach Übernachtinkubation einer Reaktionsmischung, die hCT-Gly in Abwesenheit von Ascorbinsäure und Cu/EDTA enthält, entnommen wurde.
Spur 3 zeigt eine "HPLC"-Spur einer Probe, die nach Übernachtinkubation einer Reaktionsmischung, die hCT-Gly, Cu/EDTA und Ascorbinsäure enthält, entnommen wurde.
Fig. 4: zeigt eine Spur, die bei erhöhter Empfindlichkeit der Spur 3, die in Fig. 3 gezeigt wird, laufen gelassen wurde.
Fig. 5: Spur 1 zeigt eine "HPLC"-Spur eines Aliquots, das nach 60 min Inkubation einer Reaktionsmischung, die hCT und Na&sub2;SO&sub3; enthält, entnommen wurde.
Spur 2 zeigt eine "HPLC"-Spur eines Aliquots, das nach 60 min Inkubation einer Reaktionsmischung, die hCT-Gly und Na&sub2;SO&sub3; enthält, entnommen wurde.
Fig. 6: Spur 1 zeigt eine "HPLC"-Spur eines Aliquots, das unmittelbar nach Zubereitung einer Reaktionsmischung, die S-sulfoniertes hCT-Gly und Schweinehypophyse-Amidierungsenzym- Zubereitung enthält, entnommen wurde.
Spur 2 zeigt eine "HPLC"-Spur eines Aliquots, das nach 4 Stunden Inkubation einer Reaktionsmischung, die S-sulfoniertes hCT-Gly und Schweinehypophyse-Amidierungsenzym-Zubereitung enthält, entnommen wurde.
Fig. 7: Spur 1 zeigt eine "HPLC"-Spur eines Aliquots, das nach 30 min Reaktionszeit einer Reaktionsmischung, die hCT-Gly, Cu/EDTA und Na&sub3;O&sub3;PS enthält, entnommen wurde.
Spur 2 zeigt eine "HPLC"-Spur eines Aliquots, das nach 90 min Reaktionszeit einer Reaktionsmischung, die hCT-Gly, Cu/EDTA und Na&sub3;O&sub3;PS enthält, entnommen wurde.
Spur 3 zeigt eine "HPLC"-Spur eines Aliquots, das nach 150 min Reaktionszeit einer Reaktionsmischung, die hCT-Gly, Cu/EDTA und Na&sub3;O&sub3;PS enthält, entnommen wurde.
Fig. 8: Spur 1 zeigt eine "HPLC"-Spur eines Aliquots, das unmittelbar nach Zubereitung einer Reaktionsmischung, die hCT-Gly und Na&sub3;O&sub3;PS enthält, entnommen wurde.
Spur 2 zeigt eine "HPLC"-Spur eines Aliquots, das nach 30 min Reaktionszeit einer Reaktionsmischung, die hCT-Gly und Na&sub3;O&sub3;PS enthält, entnommen wurde.
Spur 3 zeigt eine "HPLC"-Spur eines Aliquots, das nach 60 min Reaktionszeit einer Reaktionsmischung, die hCT-Gly und Na&sub3;O&sub3;PS enthält, entnommen wurde.
Spur 4 zeigt eine "HPLC"-Spur eines Aliquots einer Kontrollreaktionsmischung.
Fig. 9: Spur 1 zeigt eine "HPLC"-Spur eines Aliquots, das unmittelbar nach Zubereitung einer Reaktionsmischung, die hCT-Gly und Na&sub3;O&sub3;PS enthält, entnommen wurde.
Spur 2 zeigt eine "HPLC"-Spur eines Aliquots, das nach 30 min Reaktionszeit einer Reaktionsmischung, die hCT-Gly und Na&sub3;O&sub3;PS enthält, entnommen wurde.
Fig. 10: zeigt ein Massenspektrum einer Probe eines sulfonierten hCGRP.

Ausführliche Beschreibung der Ausführungsformen

Menschliches Calcitonin ist ein Peptidhormon mit möglicher klinischer Anwendung in der Behandlung von nach den Wechseljahren auftretender Osteoporose und anderen Calciumstoffwechselstörungen, z. B. Paget-Krankheit.
Als Vorläufer zu diesem wurde menschliches Calcitonyl-Glycin (hCT-Gly) in E. coli mit rekombinanter DNA-Technologie hergestellt (siehe z. B. publizierte europäische Patentanmeldung EP-A1-0131363). Der gereinigte Vorläufer kann unter selektiven Bedingungen mittels eines Amidierungs-Enzyms, wie in der obigen Einführung beschrieben, amidiert werden.

Vergleichsversuch A

Ein Experiment wurde durchgeführt, um den Verlust des menschlichen Amidierungs-Enzym während der Amidierungsreaktion aufzuzeigen.
Menschliches Calcitonyl-Glycin wurde bei 37ºC mit einem Amidierungs-Enzym inkubiert. Die Zusammensetzung der Reaktionsmischung (210 ul) war wie folgt:
25 mM PIPES-Puffer (pH 6,8) 300 mM NaCl
100 uM Cu/EDTA
1 mM Ascorbinsäure
2 mg/ml menschliches Calcitonyl-Glycin 1000 Einheiten/ml Catalase
200 ul Schweinehypophyse-Amidierungsenzym
(Das verwendete Schweinehypophyse-Amidierungsenzym war partiell gereinigt nach dem Verfahren von: Bradbury, A. F., and Smith, D.G. (1985) in "Biogenetics of Neurohormonal Peptides" pp 171-186).
5 ul Aliquote der Reaktionsmischung wurden nach 0 und 420 Minuten entnommen. Die Aliquote wurden unter Verwendung von "HPLC" analysiert. Fig. 1 zeigt die Ergebnisse dieses Experimentes und zeigt klar den Verlust von > 90% menschlichen Calcitonyl-Glycins aus der Lösungsphase der Reaktionsmischung über diese Zeitspanne an.

Vergleichsversuch B

Um zu beweisen, daß menschliches Calcitonyl-Glycin tatsächlich ausgefällt wurde, wurde das in Vergleichsversuch A beschriebene Experiment wiederholt, und am Ende der Reaktion (nach ungefähr 540 Minuten) wurde die ganze übriggebliebene Probe (43 ul) zentrifugiert (20'000 g·5 Minuten). Das daraus resultierende Pellet wurde in 50 ul Eisessig gelöst und ein 10 ul Aliquot davon wurde mit "HPLC" analysiert. Zusätzlich wurde ein 10 ul Aliquot des Überstandes nach Zentrifugation mit "HPLC" analysiert. Die Ergebnisse des Experimentes sind in Fig. 2 dargestellt, und zeigen an, daß die Mehrheit (71%) des menschlichen Calcitonyl-Glycins im Pellet vorlag, was auf eine beträchtliche Ausfällung des menschlichen Calcitonyl-Glycins hindeutet.

Vergleichsversuch C

Ein Experiment wurde durchgeführt, um die Ausfällung des menschlichen Calcitonyl-Glycins in Gegenwart und Abwesenheit eines Amidierungs-Cofaktors zu zeigen. Menschliches Calcitonyl-Glycin wurde bei 37ºC übernacht in einem Puffer aus 10 mM PIPES (pH 6,8) und 300 mM NaCl als Kontrolle und im gleichen Puffer mit zusätzlich 0,3 mM Cu/EDTA und 3 mM Ascorbinsäure, beide bei einem Gesamtvolumen von 26 ul, inkubiert. Aliquote wurden zentrifugiert (20'000 g·5 Minuten) und mit "HPLCß' analysiert. Die Ergebnisse dieses Experiments werden in Fig. 3 gezeigt, in der Spur 1 werden 2,8 ul der Reaktionsmischung unmittelbar nach Zubereitung gezeigt und eine große Spitze (peak) zeigt das Vorhandensein von menschlichem Calcitonyl-Glycin in der Lösungsphase der Mischung an. Spur 2 (7,5 ul) ist die Spur nach einer Übernachtinkubation in der Abwesenheit von Cu/EDTA und Ascorbinsäure und Spur 3 (7,5 ul) zeigt die Spur nochmals nach einer Übernachtinkubation in der Gegenwart von Cu/EDTA und Ascorbinsäure.
Fig. 4 zeigt eine Spur, die bei erhöhter Empfindlichkeit der Spur 3, die in Fig. 3 gezeigt wurde, laufen gelassen wurde. Die Spur zeigt klar die Gegenwart von komplexen, multiplen Spitzen (peaks) mit Retentionszeiten zwischen 2,5 und 3,0 Minuten. Man nimmt an, daß die komplexen multiplen Spitzen (peaks) Polymerisationsprodukte des menschlichen Calcitonyl-Glycins sind.

Beispiel 1

Ein Experiment wurde durchgeführt, um menschliches Calcitonyl-Glycin und menschliches Calcitonin zu S-sulfonieren.
50 ul 0,1 M NaHCO&sub3;(pH 9,3) wurde 100 ul 2,5 mg/ml menschliches Calcitonyl-Glycin in Wasser zugefügt. 1M Na&sub2;SO&sub3; (13 ul) und 0,01 M CuSO&sub4;(3 ul) wurden zugegeben und die Reaktionsmischung wurde für 60 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Man erachtete die Reaktion als abgeschlossen, wenn alles menschliche Calcitonyl-Glycin verschwunden war (Retentionszeit ungefähr 2,75 Minuten) und ein neues sulfoniertes Derivat auftrat (Retentionszeit ungefähr 1,8 Minuten). Die entsprechenden "HPLC"-Spuren sind in Fig. 5 gezeigt. Die obere Spur zeigt sulfoniertes menschliches Calcitonin, welches auf ähnliche Weise behandelt wurde.

Beispiel 2

Ein Experiment wurde durchgeführt, um die Stabilisierung des menschlichen Calcitonyl-Glycins durch S-Sulfonierung zu zeigen.
S-sufoniertes menschliches Calcitonyl-Glycin wurde bei 37ºC mit einer Amidierungsenzym-Zubereitumg aus Schwein, wie im Vergleichsversuch A beschrieben, inkubiert. Es wurden Aliquote der Reaktionsmischung entnommen, zentrifugiert (20'000 g·5 Minuten) und mit "HPLC" analysiert. Fig. 6 zeigt die resultierende Spur, welche eine neue Spitze (peak) (30% Ausbeute) enthält, die nach vier Stunden Behandlung mit der Amidierungs-Zubereitung mit dem S-sulfonierten menschlichen Calcitonin mitwandert (Retentionszeit ungefähr 2,5 Minuten). Nach Beurteilung des anfänglichen und des Spitzenbereichs (peak area) am Schluß zu schließen, gibt es keine Ausfällung des Substrates oder des Produktes.
Die spezifischen Einzelheiten der "HPLC"-Bestimmungen, die in den obigen Experimenten durchgeführt wurden sind wie folgt:
Säule: Hypersil ODS 10·0,2 cm
% A: 10 mM NH&sub4;HCO&sub3;
% B: CH&sub3;CN
Gradient: 15-50% B über 15 Minuten
Flußrate: 1 ml/Min.
Nachweis: Fig. 1 1,1 AUFS, A&sub2;&sub2;&sub5;
Fig. 2 1,5 AUFS, A&sub2;&sub2;&sub5;
Fig. 3 0,2 AUFS, A&sub2;&sub2;&sub5;
Fig. 4 0,025 AUFS, A&sub2;&sub2;&sub5;
Fig. 5 & 6 0,05 AUFS, A&sub2;&sub2;&sub5;

Beispiel 3

Ein Experiment wurde durchgeführt, um hCT-Gly zu thiophosphorylieren und die Wirkung von variierenden Versuchsbedingungen zu bestimmen.
40 ul 0,5M Na&sub3;O&sub3; PS und 10 ul 100 mM Cu/EDTA-Lösung wurden 100 ul einer 0,6 mg/ml Lösung von hCT-Gly, welches getrocknet wurde, zugegeben. Ein Endvolumen von 200 ul wurde erhalten, indem 150 ul 100 mM Tris-Puffer zugegeben wurde. Wie man aus der Spur [Fig. 7] ersehen kann, hat sich das Produkt nicht mit der Zeit in das Ausgangsmaterial zurückverwandelt, sondern ist stabil geblieben.
Die Reaktion wurde wiederholt, wobei 10 ul 10 mM Cu/EDTA-Lösung anstatt 10 ul 100 mM Cu/EDTA-Lösung verwendet wurde. Diese Verringerung des Cu/EDTA schien wenig Wirkung auf die Reaktion zu haben. Eine Kontrollreaktion wurde auch ausgeführt; d. h. Reaktionsmischung minus Na&sub3; O&sub3;PS und wie man aus der Spur ersehen kann [Fig. 8] war die Reaktion nach 100 Minuten beendet.
Im nächsten Experiment wurde die Menge an zugefügtem Na&sub3;O&sub3;PS verringert, d. h. 10 mM Na&sub3;O&sub3;PS Endkonzentration anstatt 100 mM Na&sub3;O&sub3;PS. Wie die Verringerung an Cu/EDTA scheint dies keine große Wirkung auf die Reaktion zu haben [Fig. 9]. Aus diesen zwei letzten Experimenten kann man sagen, daß man definitiv Kupfer(II)ionen braucht, damit die Reaktion stattfinden kann und daß variierende Mengen an Cu/EDTA und Na&sub3;O&sub3;PS wenig Wirkung auf die Reaktion hatten.
Das durch Thiophosphat geschützte hCT-Gly wird dann, im großen und ganzen wie in Beispiel 2 beschrieben, amidiert.
Die spezifischen Einzelheiten der "HPLC"-Bestimmungen sind wie oben in Beispiel 2 beschrieben.

Beispiel 4

SULFONIERUNG des hCGRP

Eine Reaktionsmischung die aus 14,4 mg PENINSULAR, CRUDE CGRP; Tris (200 mM, 10 ml); und Na&sub2;SO&sub3;(1M, 500 ul); Cu/EDTA (10 mM, 100 ul) besteht, wurde bei Raumtemperatur stehen gelassen und Aliquote wurden entnommen, um sie auf Synchropak CM 300 zu injizieren
A = "HPLC"-Wasser
B = 2M NaCl/20 mM (P) pH 6.00 (d. h. 116,88 g NaCl in 1 Liter "HPLC"-H&sub2;O + 2 ml H&sub3;PO&sub3;,
pH - 6,00 mit verdünnter NaOH) C = MeCN
T = 0 - 30%; %B = 1 - 20%; %C = 10 - 10
T = 30 - 50%; %B = 20 - 90%; %C = 10 - 10
Fluß = 3,0 ml min&supmin;¹; Wellenlänge = 230 nm
Die Reaktion war nach 330 Minuten beendet. Die Spitze (peak) bei der Retentionszeit 20,3 Minuten wurde gesammelt und gefriergetrocknet. Der Rückstand wurde in ca. 3 ml 0,1M HOAC gelöst und auf Sephadex G-10 zum Entsalzen geladen. Die Säule wurde eluiert. Die erste Spitze (peak) wurde gesammelt und gefriergetrocknet. Eine Probe des resultierenden Rückstandes wurde zur Massenspektrumanalyse geschickt.
Das Massenspektrum (gezeigt in Fig. 10) wurde bei saurem pH laufen gelassen und ergab ein sehr schwach protoniertes, molekulares Ion im Positiv-Ionen-Modus mit einem kleinen Fragment-Ion, das den Verlust einer Sulfatgruppe 80 amu tiefer zeigt.
Vorliegende Erfindung ist nur als Beispiel beschrieben worden und Änderungen von Einzelheiten können innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung gemacht werden.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines ersten Polypeptids mit einem C-terminalen Amid-Rest und ein oder mehr Cysteinoder Cystin-Aminosäureresten, bei dem ein zweites, die Aminosäuresequenz des ersten Polypeptids und einen C-terminalen Glycin-Aminosäurerest umfassendes Polypeptid mit einem Amidierungs-Enzym umgesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß der oder die Cystein- oder Cystin-Schwefelreste zumindest während des Amidierungsschrittes geschützt sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der oder die Cystein- oder Cystin-Schwefelreste des zweiten Polypeptids reversibel geschützt sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin der oder die Cystein- oder Cystin-Schwefelreste des zweiten Polypeptids durch einen Sulfit- oder Thiophosphat-Rest geschützt sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin der oder die Cystein- oder Cystin-Schwefelreste des zweiten Polypeptids durch eine geladene Schutzgruppe geschützt sind.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das erste Polypeptid humanes Calcitonin oder ein von humanem Calcitonin-Gen stammendes Peptid ist.

6. Polypeptid mit ein oder mehr Cystein- oder Cystin-Aminosäureresten und einem C-terminalen Glycin-Aminosäurerest in einem Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der oder alle Cystein- oder Cystin-Schwefelreste geschützt sind.

7. Polypeptid nach Anspruch 6, worin der oder alle Cysteinoder Cystin-Schwefelreste durch einen Sulfit- oder Thiophosphat-Rest geschützt sind.

8. Polypeptid nach Anspruch 6 oder 7, worin das Polypeptid humanes Calcitonin-Gly oder ein von humanem Calcitonin-Gen stammendes Peptid-Gly ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Amidierungs-Enzym- Preparation eine zur Kupferkomplexierung fähige Verbindung enthält.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin die zur Kupferkomplexierung fähige Verbindung Ethylendiamintetraessigsäure ist.