JPS63501541A - ポリペプチドの生産 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリペプチドの生産 発明の分野 本発明は、ポリペプチドが１または複数のシスティンまたはシスチンアミノ酸残 基を有する、Ｃ末端アミド基を有するポリペプチドを生産する方法であって、該 ポリペプチドの該アミノ酸配列およびＣ末端グリシンアミノ酸残基を有するポリ ペプチドをアミド化酵素（ａｍｉｒｄａｔｉ　−ｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ　）と反応 させる工程を含む方法に関する。

発明の背景 多くの生理学的に活性＆、Ｉ！リペプチド、特にペゾチドホルモンは、その完全 な活性化がＣ末端アミド基に依存することが示されている。また、Ｃ末端アミド は、循環系中のいくつかのホルモンが天然のプロテアーゼによってＣ末端側から 分解することを防止することによって、これらのホルモンの半減期を延長するこ とが示されている。現在では、組ｉえＤＮＡ技術を使用して、インビトロ培養に よシボリペプチドを工業的規模で合成することが可能である。けれども、この方 法で直接に生産されたポリペプチドはＣ末端アミドを持たず、したがって循環系 において完全な生理学的活性と安定性を示すことができない。この問題は、アミ ド化酵素を使用して付加的なＣ末端アミノ酸残基を必要なアミド基に変換するこ とによって克服された（たとえば公開ヨーロッパ特許出願ＥＰ−ＡＩ−０１３４ ６３１およびＥＰ−ＡＩ−０１３３２８２参照）。

、　関連するアミド化酵素はＢｒａｄｂｕｒｙ　ｅｔ　ａｌ　によってはじめて 記述され特徴ずけられた（　Ｂｒａｄｂｕｒｙ、　Ａ、　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、Ｎ ａｔｕｒｅ　（１９８２年）２９８号、６８６−６８８頁、Ｂｒａｄｂｕｒｙ、 　Ａ、　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　 Ｃｏｍｍ。

（１９８３年）１１２３（２）号、３７２−３７７頁、Ｌａｎｄｙｍｏｒｅ　− Ｌｉｎ、　Ａ、　Ｅ、　Ｎ、　ｅｔ　ａ１％Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ａｎｄ　Ｂｉｏ ｐｈｙｓ、　Ｃｏｍｍ。

（１９８３年）　１１７（２）号、２８９−２９３頁）。

本発明者らは、このようなアミド化酵素はある種のポリペプチド、特にシスティ ンアミノ酸残基またはジスルフィド架橋をその構造中に含むポリペプチドを充分 にアミド化しないことを発見した。本発明者らの研究は、この充分なアミド化の 欠除はアミド化酵素による処理中に生じるポリペプチド基質の沈殿によるもので あることを示す。

偏見抜きで考えて、この沈殿は、少くとも部分的には、ある場合にはアミド化活 性の活性を助長することが示されている銅によって生じうるものと考えられる。

アミド化酵素調製物中に存在する銅はシスティンまたはシスチンの硫黄基と相互 作用してポリペプチドの重合を生じさせることによシダイマーの形成ないし凝集 に導き、その結果ポリペプチドの沈殿を生じさせることが考えられる。

これに加えて、アミド化調製物の他の補因子として使用されるアスコルビン酸（ ビタミンＣ）が事態をさらに複雑化していることが考えられる。たとえば、アス コルビン酸もシスティンまたはシスチンの硫黄基との相互作用の結果ポリペプチ ドの修飾に関与しているのかもしれない。

該酵素のアミド化活性は、ポリペプチド基質が沈殿状態にある時相当に減少する ように見受けられる。

本発明の第１の観点によれば、第１のポリペプチドが１または複数のシスティン またはシスチンアミノ酸残基を有する場合にＣ末端アミド基を有する第１のポリ ペプチドを生産する方法であって、該第１のポリペプチドのアミノ酸配列および Ｃ末端グリシンアミノ酸残基を含む第２のポリペプチドをアミド化酵素と反応さ せる工程を含む方法において、システィンまたはシスチンの１または複数の硫黄 基が少くともアミド化工程中保護されることを特徴とする方法が提供される。

本明細書中で「アミド化酵素Ｊ　（ａｍｉｄａｔｉｎｇ　ｅｎｚｉｍｅ）という 用語は、Ｃ末端グリシンアミノ酸残基をアミド基に変換することができる酵素を 相称するために使用する。

アミド化酵素はたとえば哺乳動物組織その他適当な供給源から得ることができる 。

特に好ましい実施例において、本発明の方法において使用されるアミド化酵素は たとえばＢｒａｄｂｕｒｙ　ｅｔ　ａｌ　（上記文献）によって記述され特徴ず けられたブタ脳下垂体組織から得たαアミド化酵素のようなαアミド化酵素であ る。

アミド化酵素調製物による処理中システィンまたはシスチンの１または複数の硫 黄基を保護することは、従来予想されなかった沈殿という問題を減少させる。

本明細書中で使用する「システィンまたはシスチンアミノ酸残基」という用語は その誘導体も含む。典型的には、システィンまたはシスチン基は、誘導体化（ａ ｅローｖａｔｉｚａｔｉｏｎ）または保護基との反応のいずれかによって、保護 された硫黄含有基を生じるように化学修飾することができる。

アミド化工程中使用されるシスティンまたはシスチンの硫黄基の保護は不可逆的 保護を含むことができる。たとえば、システィンまたはシスチンの硫黄基は不可 逆的誘導体化、たとえばアクリロニトリル、エチレンイミン、ハロゲン化スルフ ェニルによる処理またはシスチンの過ギ酸による゛酸化によるシスティン酸への 変換等の不可逆誘導体化によってシスティンまたはシスチンの硫黄基を保護する ことができ、る。しかし、保護は可逆的であり、システィンまたはシスチンに可 逆的に結合しうる保護基を用いうろことが望ましい。典型的には、システィンま たはシスチン基の保護および可逆保護の場合には保護基の除去に用いられる諸条 件は、ポリペプチドの構造に阻害的効果を持たないようなものである。すなわち 、最終生産物はその自然の三次元構造の形で生産されることが有利である。

ポリペプチドは、Ｃ末端アミド基が望まれるようなｌまたは複数のシスティンま たはシスチンアミノ酸残基を含むポリペプチドであればどのようなものでもよい 。本方法は、組替えＤＮＡ技術によって生産されたポリペプチドのＣ末端グリシ ンアミノ酸残基のＣ末端アミド基への変換に適当である。このようなポリペプチ ドの例は、サケカルシトニン、ヒトカルシトニン等のカルシトニンおよびこれら のカルシトニンと機能的に等価の誘導体、ヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチド 、ラットカルシトニン遺伝子関連ペプチド等のカルシトニン遺伝子関連ペプチド およびこれら遺伝子関連ペプチドと機能的に等価の誘導体、オキ７ト＼ンおよび 機能的に等価の誘導体、バンプレツシンおよび機能的に等価の誘導体を含む。

本明細書において使用される「ポリペプチド」という用語は２以上のアミノ酸残 基を含む化合物を指称し、二次構造を有するタンノξり質を含む。

アミド化酵素の活性にとって最適の条件下（たとえばｐＨ５〜８の範囲、上記好 ましいアミド化酵素の場合好ましくは約６．８）において、ある場合にはポリペ プチド−グリシン化合物はその等電点近傍または等電点にあシ、このため沈殿が 生じてアミド化酵素にとって適当な基質を別な面で減少させることがあシうる。

この問題は、誘導体化または荷電した保護基の使用のいずれかによってポリペプ チド中に正味の電荷導入する保護を使用することによシ克服することができる。

保護されるポリペプチド中への正味の電荷の導入はその等電点および溶解度を修 正することにより沈殿を減少させることができる。システィンまたはシスチンの 硫黄原子へ結合しうる適当な保護基は−ＳＯ３−およびづＰＯ３を含む。ヒトカ ルシトニン−グリシンおよびヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチド−グリシンは 上記好ましいｐＨにおいて等電点に近いので、ジスルフィド架橋を保護しかつ等 電点を変更する荷電した保護基を使用することは、正確にＣ末端がアミド化され たポリペプチドを調製する上で著るしい改善をもたらすものである。

第２の観点において、本発明は、１または複数のシスティンまたはシスチンアミ ノ酸残基お工びＣ末端グリシンアミノ酸残基を有し、各システィンまたはシスチ ン硫黄基が保護されることを特徴とするポリペプチドを提供する。

各システィンまたはシスチン硫黄基は誘導体化または保護基の結合によって保護 することができる。適当な保護基は、ポリペプチドにとって阻害的でない条件下 で結合しかつ除去しうるものであれば、システィンまたはシスチンの硫黄原子に 可逆的に結合することができるいかなる保護基も含む。保護基は荷電しているこ とが好ましい。特に好ましい保護基は−ＳＯ３−および−Ｓ０３　である。

使用可能な他の適当なシスティンまたはシスチン硫黄保護基の例は、たとえば、 １または複数のカルヂキシル、硫酸塩、リン酸塩、アルキル、アルコキシ、ニト ロまたはハロゲン置換基たとえばジニトロフルオロベンゼン基によって置換可能 なベンジル基、１または複数のカルゼキシル、硫酸塩またはリン酸塩置換基によ って置換可能なジフェニルメチル基、１または複数のカルゼキシル、硫酸塩また はリン酸塩置換基によって置換可能なトリフェニルメチル基、アルキル基たとえ ばｔ−ブチル基、アシル基たとえばアセチル基、たとえばハロゲン原子によって 置換されたアシル基たとえばヨードアセテート基、ベンゾイル基、炭酸塩基、た とえばアルキル、アルコキシまたはアルコキシアルキル基によって置換可能なカ ルバモイル基、ベンズヒドリル基、モノアセタールまたはジアセタール基たとえ ばテトラヒドロピラニル基またはベンジルチオメチル基、金属たとえば水銀、水 銀基たとえば水銀ベンゾエート基、または混合ジスルフィド基たとえばＳ−アル キルメルカプト基またはＳ−アルキルスルフェニルシスティン基を含む。他のシ スティンまたはシスチン硫黄保護基およびこのような保護基を除去する方法の例 として、所望ならばたとえばｒ　Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ 、　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　Ｂｉｏｌｏｇｙ］　第　２　巻　ノ”　）　Ａ（Ｇ ｒｏｓｓおよびＭｅｉｅｎｈＯｆｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１ ９８０年））およびｒ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　 Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　１　（ＭｅａｎｓおよびＦｅｅｎｅＹ編、Ｈｏ１ｄｅｎ　− Ｄａｙ　Ｉｎｃ、　（１９７１年））を参照されたい。

所望により、保護基を適当に荷電した置換基たとえば１または複数のカルゼキシ ル、硫酸塩またはリン酸塩置換基によって置換することによって、正味電荷を上 記のシスティンまたはシスチン硫黄保護基またはその他の適当なシスティンまた はシスチン硫黄保護基中に導入することができることは理解されるであろう。

また本発明者らは、アミド化酵素調製物中に存在する銅がキレート状態で存在す るならば、アミド化生産物の収率が改善しうろことを発見した。銅のキレート化 はシスティンまたはシスチンの硫黄基の保護に代えて、または好ましくは該保護 と組合せて使用することができる。

銅のキレート化はポリペプチドの沈殿を減少させる上に銅の酵素に対する接近可 能性を調節する点で有益であるように思われる。この後者の面においては、本発 明者らはさらにある場合には銅はアミド化酵素の活性を増大させる一方過剰の銅 は酵素活性を阻害することを発見した。

銅のキレート化はこの困難を克服するように思われる。

かくして、本発明の第３の観点においては、本発明はＣ末端アミ゛ド基を有する 第１のポリペプチドを生産するＣ末端グリシンアミノ酸残基を含む第２のポリペ プチドをアミド化酵素調製物と反応させる工程を含む方法において、該アミド化 酵素調製物は銅をキレート化しうる化合物を含むことを特徴とする。方法を提供 する。

適当、なキレート化化合物はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ＞　およびペニ シラミンを含む。

本発明者らは、キレート試薬の添加は自由鋼のレベルを減少させることによシポ リペプチドおよびアミド化酵素双方に対する阻害的影響を減少させるが、該酵素 の補因子として作用するために充分な銅のレベルを維持することを発見した。

図面の簡単な説明 本発明を添付図面を参照して下記の実施例について説明する。添付図面は高性能 液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のトレースを示す。

第１図ニドレース１は０分インキュベーションにおけるｈＣＴ−ｇｌ）’および ブタ脳下垂体アミド化酵素を含む反応混合物のアリコツトのＨＰＬＣ）レースを 示す。

トレース２は４２０分のインキュベーション外におけるｈＣＴ−ｇ　Ｉ　Ｙおよ びブタ脳下垂体アミド化酵素を含む反応混合物のアリコツトのＨＰＬＣ）レース を示ス。

第２図ニドレース１はｈｃ’ｒ−ｇａｙおよびブタ脳下垂体アミド化酵素を含む ５４０分間インキュベートした反応混合分を遠心分離して得られたペレットのア リコツトのＨＰＬＣ）レースを示す。

トレース２はｈｃ’ｒ−ｇａｙおよびブタ脳下垂体アミド化酵素を含む５４０分 間インキュベートした反応混合物を遠心分離して得られた上澄みのアリコントの ＨＰＬＣ）レースを示す。

第３図ニドレース１はｈｃ’ｒ−ｇ　ｌ　ｙ％　Ｃｕ／ＥＤＴＡおよびアスコル ビン翠を含む反応混合物の調製直後に採取した試料のＨＰＬＣ）レースを示す。

トレース２はアスコルビン酸およびＣｕ／ＥＤＴへの不存在下においてｈｃ’ｒ −ｇａｙを含む反応混合物を一夜インキユベートした後に採取した試料のＨＰＬ Ｃ）レースを示す。

トレース３はｈＣＴ−ｇｌｙ、　Ｃｕ／ｍＤＴＡおよびアスコルビン酸を含む反 応混合物を一夜インキユベートした後に採取した試料のＨＰＬＣ）レースを示す 。

第４図は第３図に示すトレース３の感度を増加して行ったトレースを示す。

第５図ニドレース１はｈＣＴおよびＮ　ａ　２　Ｓ　Ｏ５を含む反応混合物を６ ０分間インキュベートした後採取したアリコツトのＨＰＬＣ）レースを示す。

トレース２はｈＣＴ−ｇｌｙおよびＮ　ａ　２　Ｓ　０５を含む反応混合物を６ ０分間インキュベートした後採取したアリコツトのＨＰＬＣ）レースを示す。

第６図ニドレース１はＳ−スルホン化ｈｃ’ｒ−ｇａｙおよびブタアミド化酵素 調製物を含む反応混合物の調製直後に採取したアリコツトのＨＰＬＣ）レースを 示す。

トレース２はＳ−スルホン化ｈｃ’ｒ−ｇ　ｔ　ｙおよびブタアミド化酵素調製 物を含む反応混合物を４時間インキュベートシた後採取したアリコツトのＨＰＬ Ｃ）レースを示す。

第７図ニドレース１はｈＣＴ−ｇｌｙ、　Ｃｕ／ＥＤＴＡおよびＮ　ａ　２０３ 　Ｐ　Ｓを含む反応混合物を３０分間反応させた後のアリコツトのＨＰＬＣ）レ ースを示す。

トレース２はｈ　ＣＴ−ｇ　ｌ　ｙｘ　Ｃｕ／ＥＤＴＡおよびＮ　ａ　２０３Ｐ 　Ｓを含む反応混合物を３０分間反応させた後採取したアリコツトのＨＰＬＣ） レースを示す。

トレース３はｈＣＴ−ｇ　１　ｙ％Ｃｕ／ＥＤＴＡおよびＮ　ａ　２０　ｓ　Ｐ 　Ｓを含む反応混合物を１５０分間反応させた後採取したアリコツトのＨＰＬＣ ）レースを示す。

浄書（内容に変更なし） 第８図ニドレース１はｈＣＴ−ｇ　ＩｙおよびＮａ５０５ＰＳを含む反応混合物 の調製直後に採取したアリコツトのＨＰＬＣトレースを示す。

トレース２はｈｃ’ｒ−ｇｔｙおよびＮａ５０５ＰＳを含む反応混合物を３０分 間反応させた後のアリコツトのＨＰＬＣ）レースを示す。

トレース３は、ｈｃ’ｒ−ｇｔｙおよびＮａ　５０　ｓ　ＰＳを含む反応混合物 の調製直後に６０分間反応させた後に採取したアリコツトのＨＰＬＣ）レースを 示す。

トレース４はコントロール反応混合物のアリコツトのＨＰＬＣトレースを示す。

第９図ニドレース１はｈＣＴ−ｇｕｙおよびＮａ　５０５　ＰＳを含む反応混合 物を調製直後に採取したアリコツトのＨＰＬＣトレースを示す。

トレース２はｈＣＴ−ｇｌｙおよびＮａ５０５ＰＳを含む反応混合物を３０分間 反応させた後のアリコツトのＨＰＬＣ）レースを示す。

第１０図はスルホン化ｈＣＧＲＰの試料の質量スペクトヒトカルシトニンはペゾ チドホルモンであって、更年期性骨多孔症その他カルシウム代謝の病気たと釆ば ベージェット病等の治療のため医学的利用が可能である。

ヒトカルシトニンの前駆体であるヒトカルシトニン−グリシン（ｈｃ’ｒ−ｇｔ ｙ　）は組替えＤＮＡ技術によってＥ、　ｃｏｌｉ　中で作られた（たとえば公 開ヨーロッパ特許出願ＢＰ−ＡＩ−０１３１３６３参照）。精製した前駆体は、 前記導入部の記述のとおり、アミド化酵素を使用して選択的条件下でアミド化す ることができる。

比較例Ａ アミド化反応中のヒトカルシトニル−グリシン基質の喪失を示すため実験を行っ た。

ヒトカルシトニル−グリシ／をアミド化酵素とともに３７℃でインキュベートし た。反応混合物（２１０μｔ）の組成は次のとおシである。

２５１ｒＬＭＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６，８）３　Ｑ　ＯｍＭ　ＮａＣ！ １００　μＭ　Ｃｕ　／　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ１、ｍＭ　アスコルビン酸 ２　ｍ９／−ヒトカルシトニル−グリシン１０００ユニツトＺｒｎ１　カタラー ゼ２００μｔブタ脳下垂体アミド化酵素 （使用したブタ脳下垂体アミド化酵素はＢｒａｄｂｕｒｙ＋Ａ、　Ｆ、およびＳ ｍｙｔｈ、　Ｄ、　Ｇ、　（１９８５年）著ｒＢｉｏｇｅｎｅｔ　１ｃｓｏｆ　 Ｎｅｕｒｏｈｏｒｍｏｎａｌ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　Ｊ　（１９８５年）１７１〜 １８６ページ記載の方法にしたがって部分的に精製した。）反応混合物の５μｔ アリコツ、トを０分および４２０分経過後に採取した。各アリコツ１４：ＨＰＬ ｃｉ使用して分析した。第１図はこれらの実験の結果を示すもので、この期間に わたって反応混合物の溶液相から９０％以上のヒトカルシトニル−グリシンが喪 失することを明らかに示している。

比較例Ｂ ヒトカルシトニル−グリシンが実際に沈殿したことを示すために、比較例Ａに記 載した実験を繰り返し、反応の終了時（約５４０分後）に残っている全試料（４ ３μｔ）を遠心分離した（　２０，００（ｌＸ５分）。その結果生じたペレット を氷状酢酸５０μｔに溶かし、１０μｔアリコツトをＨＰＬＣによシ分析した。

それに加えて、遠心分離後の上澄みの１０μｔアリコツ）’（ｊＨＰＬｃによシ 分析した。

実験の結果を第２図にされている。ヒトカルシトニル−グリシンの大部分（７１ ％）はペレット中に存在しており、ヒトカルシトニル−グリシンがかなり沈殿し ているアミド化補因子の存在下または不存在下におけるヒトカルシトニル−グリ シンの沈殿を示すために実験を行った。コントロールとしての１０　ｍＭ　ＰＩ ＰＥＳ　ＣｐＨ６，８）および３００　ｍＭ　ＮａＣ１を含む緩衝液中および同 一の緩衝液に０．３　ｍＭ　Ｃｕ／ＥＤＴＡおよび３ｍＭアスコルビン酸をそれ ぞれ０．２６μを添加したものの中でヒトカルシトニン−グリシンを３７℃で一 夜インキユベートした。各アリコツトを遠心分離（２０，００（ｌｘｓ分）ＬＨ ＰＬＣで分析した。実験の結果を第３図に示す。第３図においてトレース１は調 製直後の反応混合物２．８μｔを示し、該混合物の溶液相中にヒトカルシトニル −グリシンの存在を示す大きなピークを示している。トレース２　（７，５μｔ ）はＣｕ／ＢＤＴＡおよびアスコルビン酸の不存在下で一夜インキユベートシた 後のトレースヲ示し、トレース３（７，５ｔｘｔ）はＣｕ／ＢＤＴＡおよびアス コルビン酸の存在下で一夜インキユベートした後のトレースを示す。

第４図は、第３図に示すトレース３の感度を増加して流したトレースを示す。こ のトレースは、保持時間２．５分〜３．０分で複合多ピークの存在をはつきシ示 している。

複合多ピークはヒトカルシトニル−グリシンの重合生産物であると考えられる。

実施例１ ヒトカルシトニル−グリシンおよびヒトカルシトニンをＳ−スルホン化するため に実験を行った。

２　、５　Ｔｎ’ｉ／ｍｅ　ヒトカルシトニル−クリシン水溶液１００μｔに０ ．Ｉ　Ｍ　ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９，３）　５０μｔを添加した。

Ｉ　Ｍ　Ｎａ２ＳＯ３（１３ｔｘｔ）および０．０１　Ｍ　ＣｕＳＯ４（３μｔ ）を添加し、反応混合物を室温で６０分間靜装した。

もとのヒトカルシトニル−グリシンがすべて消失しく保持時間的２．７５分）か つ新しいスルホン化誘導体が現れる（保持時間的１．８分）ことにより反応は完 了したと判断された。関連するＨＰＬＣ）レースを第５図に示す。上側のトレー スはスルホン化ヒトカルシトニンを示し、これも上記と同様に処理されたもので ある。

Ｓ−スルホン化によってヒトカルシトニル−グリシンに与えられる安定を示すた め実験を行った。

Ｓ−スルホン化ヒトカルシトニルークリシンヲ比較例Ａ記載のブタアミド化酵素 とともに３７℃でインキュベートシた。反応混合物の複数のアリコツトを採取し 、遠心分離しく　２０．００（ｌＸ５分）、ＨＰＬＣによって分析した。

第６図はその結果生じたトレースを示す。このトレースはアミド化調製物で４時 間処理した後Ｓ−スルホン化ヒトカルシトニンとともに移動した（保持時間的２ ．５分）新しいピーク値（収率３０％）を示す。最初と最後の両ピークから判断 されるように、基質または生産物の沈殿はない。

上記諸実験において実施されたＨＰＬＣ決定の詳細は次のとおりである。

カラＡ　：　Ｈｙｐｅｒｓｉｌ　ＯＤＳ　１０　Ｘ　０．２ｃｍ％Ａ　：　１０ ｍＭ　ＮＨ４ＨＣＯ３ ％Ｂ　：　ＣＨ３ＣＮ グラジェント：　１５−５０％Ｂ　５分間流速：　１−７分 検出：　第１図　１．Ｉ　ＡＵＰＳ、Ａ２２５第２図　１．５　ＡＵＦＳ、Ａ２ ２５ 第３図　０．２　ＡＵＦＳ、Ａ２２５ 第４図　０．０２５　ＡＵＦＳ、Ａ２□５第５図および第６図　０．０５　ＡＵ ＦＳ、　Ａ２２５ｈｃＴ−ｇｌｙをチオホスホリル化しかつ実験の条件の変更に よる影響を決定するため実験を行った。

あらかじめ乾燥しておいたｈｃ’ｒ−ｇａｙの０．６■／ａｔ溶液１００　ｐｔ に０．０５　Ｍ　Ｎａ３０５ＰＳ　４０　ｔｔｔおよび１００ｍ　ＭＣｕ　／Ｅ 　Ｄ　Ｔ　Ａ溶液１０　ｔｔＬを添加した。１００ｍＭ）リス緩衝液１５０μｔ を添加することによって最終的に２００μｔを得た。２０μｔずつの複数の試料 を反応時間３０分、９０分、１５０分後にそれぞれ分析した。トレース（第７図 ）から判るように、生産物は時間が経っても出発物質に戻らず安定状態を保った 。

１００　ｍＭ　Ｃｕ／ＥＤＴＡ溶液１０　μｍのがわシに１０ｍＭＣｕ／、Ｅ　 Ｄ　Ｔ　Ａ溶液１０μｔを使用して反応を繰返した。このＣｕ／Ｂ　Ｄ　Ｔ　Ａ の減少は反応にほとんど影響を及ぼさないように見えた。コントロールとして反 応混合物からＮ　ａ　３０３　Ｐ　Ｓを除いたものを使って実験を行った。トレ ース（第８図）から判るように、反応は１００分後に完了した。

次の実験において、　Ｎａ３０３ＰＳの添加量を減少した。

すなわち１００ｍＭ最終Ｎ　ａ　３０３　Ｐ　ＳのかわシにｌＱｍＭ最終Ｎａ５ ＯｓＰＳを使用した。Ｃｕ／ＥＤＴＡの減少と同様に、この減少も反応に大きな 影響を及ぼさないように見えた（第９図）。これら最後の２つの実験から、反応 が起るために銅イオンは決定的に必要であるこ七、またＣｕ／ＥＤＴＡおよびＮ ａ３０３ＰＳの量は反応にほとんど影響？及ぼさないということが言える。

次にチオリン酸塩で保護したｈｃ’ｒ−ｇ＋ｙをほぼ実施例２において記載した ようにアミド化した。

ＨＰＬＣ決定の詳細は実施例２記載のとおりである。

ＰＥＮｌＮ５ＵＬＡＲＣＲＵＤＥ　ＣＧＲＰｌ　４．４■、トリス（２００ｒｎ Ｍｓ　１０　＋ｄ）、Ｎ　ａ　２　Ｓ　Ｏ５’　Ｉ　Ｍ　ｓ　５００　μｔ’、 Ｃｕ　１ＥＤＴＡ　（１０ｍＭ、１００／ｊ／！、）からなる反応混合物を室温 で静置し、複数のアリコツトを５ｙｎｃｈｒｏｐａｋ　ＣＭ３００上に注入する ため取出した。

Ａ　＝　ＨＰＬＣ水 Ｂ　＝　２　Ｍ　ＮａＣ４／２０ｍＭ（Ｐ）　ｐＨ６，００（すなわちＨＰ］、 ＣＨ２Ｏ１リットル中ｖｃＮａＣ６１１６，８８２＋希ＮａＣＨ添加Ｈ３ＰＯ３ ２ｄ、ｐＨ６，００）Ｃ＝へ１ｅＣＮ Ｔ−０〜３０％、ＸＢ＝　１　〜２０％、ｘｃ＝１０−１０Ｔ＝　３０〜５０％ 、％Ｂ−２０〜９０Ｘ、　％Ｃ−１０〜１０流速−３．０ｍｌ／分　波長＝２３ ０−ａ反応は３３０分後完了した。保持時間２０．３分におけるピークを採取し 凍結乾燥した。残留分を約３　ｍｌの０．１ｍＨｃＡｃ中に溶解し、脱塩のため ５ｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ　−１０上に注いだ。カラムを溶離した。第１のピークを 採取し凍結乾燥した。生成した残留分の試料を質量スペクトル分析に送った。

質量スペクトル（第１０図に示す）は酸性ｐＨで行われ、陽インオモードにおい て非常に弱いプロトン化分子イオンを示し、小さなフラグメントイオンは８０　 ａｍｕ低い一つの硫酸塩基の喪失を示した。

上記は本発明の一例として述べたものであって、本発明の範囲内で細部の変更は 可能であることは理解されよう。

叶／”７（Ｊ＜；ｙ　） Ｆ？／す（勃 “　上　Ａ　。

ｏｏ　１０　２０　３０ｔ、ｏ　ｓ・０吟〃Ｃり２ 手続補正書働式） 昭和６３年Ｖ月７日 ポリペプチドの生産 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 セルチック、リミテッド ４、代　理　人　（郵便番号１０５） 昭和６３　年　３　月　３　日 （発送日　昭和６３年３月８日） ６、補正の対象 特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の発明者の住所の欄および特許出 願人の代表者の欄、明細書第１１頁の翻訳文、および委任状ならびにその訳文７ 、補正の内容 １　明細書第１１頁の翻訳文については、別紙のとおり浄書した翻訳文（内容に 変更なし）を提出する。

２　他については別紙のとおり、訂正済の特許法第１８４条の５第１項の規定に よる書面、および委任状ならびにその訳文を提出する。

国際調査報告 ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＨＥ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＰ ＯＲＴ　ＯＮ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．第１のポリペプチドが１または複数のシステインまたはシスチンアミノ酸残 基を有する場合にＣ末端アミド基を有する第１のポリペプチドを生産する方法で あつて、該第１のポリペプチドのアミノ酸配列およびＣ末端グリシンアミノ酸残 基を含む第２のポリペプチドをアミド化酵素と反応させる工程を含む方法におい て、システインまたシスチンの１または複数の硫黄基が少くともアミド化工程中 保護されることを特徴とする方法。
2. ２．該第２のポリペプチドのシステインまたはシスチンの１または複数の硫黄基 は可逆的に保護される請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．該第２のポリペプチドのシステインまたはシスチンの１または複数の硫黄基 は亜硫酸塩基またはチオ硫酸塩基によつて保護される請求の範囲第１項記載の方 法。
4. ４．該第２のポリペプチドのシステインまたはシスチンの１または複数の硫黄基 は荷電保護基によつて保護される請求の範囲第１項記載の方法。
5. ５．該第１のポリペプチドはヒトカルシトニンまたはヒトカルシトニン遺伝子関 連ペプチドである前記各請求の範囲に記載の方法。
6. ６．１または複数のシステインまたはシスチンアミノ酸残基およびＣ末端グリシ ンアミノ酸残基を有し、各システインまたはシスチン硫黄基が保護されることを 特徴とするポリペプチド。
7. ７．各システインまたはシスチン硫黄基が亜硫酸塩またはチオ硫酸塩基によつて 保護される請求の範囲第６項記載のポリペプチド。
8. ８．該ポリペプチドはヒトカルシトニン−ｇｌｙまたはヒトカルシトニン遺伝子 関連ペプチド−ｇｌｙである請求の範囲第６項または第７項記載のポリペプチド 。
9. ９．Ｃ末端アミド基を有する第１のポリペプチドを生産する方法であつて第１の ポリペプチドのアミノ酸配列およびＣ末端グリシンアミノ酸残基を含む第２のポ リペプチドをアミド化酵素調製物と反応させる工程を含む方法において、該アミ ド化酵素調製物は銅をキレート化しうる化合物を含むことを特徴とする方法。
10. １０．該銅をキレート化しうる化合物はエチレンジアミン四酢酸を含む請求の範 囲第９項記載の方法。