DE3627448C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Laserspektroskopie, betrifft insbesondere fluorimetrische Laserdetektoren für die Mikrosäulenchromatografie und kann zur Analyse geringer Mengen fluoreszierender Flüssigkeiten verwendet werden.

An die Detektoren für die Flüssigkeitschromatografie werden folgende allgemeine Forderungen gestellt: hohe Empfindlichkeit, niedrige Nachweisbarkeitsgrenze, niedriger Rauschpegel, weiterer Linearitätsbereich. Außerdem ist es vom Standpunkt der chromatografischen Auflösung auch wichtig, eine Reihe von an die Konstruktion einer Küvette gestellten Forderungen zu erfüllen: geringes Fassungsvermögen, Fehlen einer Durchmischung getrennter Komponenten, schnelle Durchspülung des Flüssigkeitskanals des Detektors.

Die Konzentrationsempfindlichkeit des Detektors ist proportional der Menge einer in dessen Meßzelle befindlichen Substanz. Damit die Auflösung des Detektors hierbei nicht abfällt, ist folgende Bedingung zu erfüllen:

wobei V₀ das zu detektierende Volumen, das unmittelbar das Fassungsvermögen der Meßzelle des Detektors und das Fassungsvermögen des Flüssigkeitskanals vom Ausgang der Chromatografiesäule bis zur Meßzelle in sich einschließt, V₁ das Volumen der Substanz bei einer chromatografischen Zacke, S die Fläche des Innenquerschnitts der Chromatografiesäule, l deren Länge ist.

Ist andererseits V₀«V₁, dann sinkt die Empfindlichkeit des Detektors ab, da die Menge der zu messenden Substanz in der Zelle abnimmt. Jeder Chromatografiesäule ist daher ein eigenes zu detektierendes Volumen zugeordnet, das es zu wählen gilt.

Es ist ein fluorimetrischer Laserdetektor für die Mikrosäulenchromatografie (L. W. Hershberger, I. B. Callis and G. D. Christian "Analytical chemistry", v. 51, N. 9, 1979, p. 1444-1446) bekannt, der optisch verbunden einen Laser, eine Baugruppe zur Laserstrahlungserzeugung, eine zur Kommunizierung mit einer Chromatografiesäule vorgesehene Durchlaufküvette und einen Fluoreszenzstrahlungsempfänger aufweist.

Die Durchlaufküvette stellt bei diesem Detektor eine Kammer mit an allen vier Seiten angebrachten Quarzfenstern dar. Der Innenraum der Kammer ist mit einem Eluenten gefüllt, der auch im Flüssigkeitskanal der Chromatografiesäule verwendet wird. Im Unterteil der Kammer ist eine hydrodynamische Düse angeordnet, über die ein Strahl der zu untersuchenden Flüssigkeit eingespritzt wird. Die Fluoreszenzstrahlung wird durch das Objektiv des Empfängers in einer Richtung senkrecht zur Anregung gesammelt.

Die genannte Bauart des Detektors wird durch eine niedrige Empfindlichkeit gekennzeichnet.

Dies ist darauf zurückzuführen, daß das zu detektierende Volumen der Substanz viel kleiner als die Volumina bei chromatografischen Zacken ist, weil der Strahlquerschnitt der durch die Küvette fließenden Substanz wesentlich kleiner als der Querschnitt des Kanals der Mikrochromatografiesäule ist. Dies ist auch dadurch bedingt, daß der Strahl der zu untersuchenden Flüssigkeit von einer Schicht des Eluenten umgeben ist, deren Dicke den Strahldurchmesser um das 10- bis 20-fache übertrifft. Deshalb wird die Registrierung des Nutzsignals durch die Fluoreszenz des Eluenten wesentlich erschwert, die den Rauschpegel erhöht.

Es ist auch ein fluorimetrischer Laserdetektor für die Mikrosäulenchromatografie bekannt, der optisch verbunden einen Laser, eine Baugruppe zur Laserstrahlungserzeugung, eine zur Kommunizierung mit einer chromatografischen Mikrosäule vorgesehene Durchlaufküvette, eine Blende zur Regelung des Volumens der zu detektierenden Substanz in der Küvette und einen Fluoreszenzstrahlungsempfänger (H. Todoriki and A. Hirakana "Chemical and Pharmaceutical Bulletin", v. 28, N. 4, 1980, p. 1337-1339) enthält.

Die Durchlaufküvette ist in dieser Einrichtung in Form eines Quarzrohrs ausgeführt, an das für die Zufuhr der zu untersuchenden Flüssigkeit ein anderes Rohr kleineren Durchmessers senkrecht angeschweißt ist. In die obere Stirnfläche der Küvette ist ein faseroptischer Lichtleiter eingeführt, an dessen Ende eine Fokussierlinse angeklebt ist, die die Baugruppe zur Laserstrahlungserzeugung bildet. Die Linse ist etwas höher als die Verbindungsstelle der Rohre angeordnet, was es gestattet, die Diverenz der Laserstrahlung hinter dem faseroptischen Lichtleiter geringer zu halten. Die Fluoreszenz wird im Bereich des Übergangs der zu untersuchenden Flüssigkeit vom Rohr kleineren Durchmessers zum Rohr größeren Durchmessers angeregt. Hierbei wird der Lichtleiter mit der Linse in solch einer Höhe angeordnet, daß der divergierende Laserstrahl die Rohrwände in dem Bereich nicht erreicht, von dem die Fluoreszenzstrahlung gesammelt wird. Dieser Bereich wird durch eine runde verstellbare Blende gewählt, die auf einer Achse mit dem Flüssigkeitszuführungsrohr angeordnet ist. Dadurch wird hier der Fotoempfänger gegen eine gestreute Laserstrahlung geschützt.

Die beschriebene Konstruktion des Detektors wird durch keine hohe Auflösung gekennzeichnet, da die chromatografischen Fraktionen an dem Übergang des Flüssigkeitsstroms vom Rohr kleineren Durchmessers zum Rohr größeren Durchmessers stark verwaschen werden, wo der laminare Charakter des Stroms gestört wird.

Darüber hinaus wird die Fluoreszenz bei den betrachteten Konstruktionen der Detektoren durch einen nichtparallelen Laserstrahl erzeugt, weil die Fokussierung des letzteren durch sphärische Linsen verwirklicht wird. Dies steigert seinerseits den Anteil der gestreuten Laserstrahlung an den Grenzen von verschiedene Brechungsindices aufweisenden Medien.

Die betrachteten Konstruktionen der Detektoren gestatten es nicht, ein zu detektierendes Volumen für Mikrosäulen mit unterschiedlichen Parametern optimal zu wählen. Im Zusammenhang damit liegen beim Mikrosäulenwechsel Verluste an Empfindlichkeit oder Auflösung der Detektierung vor.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen fluorimetrischen Laserdetektor für die Mikrosäulenchromatografie zu schaffen, der solch eine optische Schaltung und solch eine Konstruktion der Baugruppe zur Laserstrahlungserzeugung und der Durchlaufküvette aufweist, die es gestatten, den Einfluß der gestreuten Laserstrahlung auf den Fluoreszenzstrahlungsempfänger zu beseitigen und eine stufenlose Regelung des zu detektierenden Volumens bei Vorhandensein eines laminaren Stroms der zu untersuchenden Flüssigkeit durchzuführen.

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß bei einem fluorimetrischen Laserdetektor für die Mikrosäulenchromatografie, der optisch verbunden einen Laser, eine Baugruppe zur Laserstrahlungserzeugung, eine zur Kommunizierung mit einer chromatografischen Mikrosäule vorgesehene Durchlaufküvette, eine Blende zur Regelung eines zu detektierenden Volumens einer Substanz in der Küvette und einen Fluoreszenzstrahlungsempfänger enthält, gemäß der Erfindung als Baugruppe zur Laserstrahlungserzeugung ein Zylinderlinsen enthaltendes Teleskop zum Einsatz gelangt, die Durchlaufküvette in Form eines rechtwinkligen Parallelepipeds mit einem inneren Durchgangskanal quadratischen Querschnitts ausgeführt und derart angeordnet ist, daß die Längsachse des Kanals senkrecht zur kollimierten Laserstrahlung gerichtet ist, die Blende zur Regelung des zu detektierenden Volumens die Form eines rechtwinkligen Trapezes aufweist, zwischen dem Teleskop und der Durchlaufküvette in der Weise angeordnet ist, daß die Grundlinien des Trapezes zur Längsachse des Kanals parallel liegen, und mit einem Mittel zu deren Verschiebung in eigener Ebene in einer senkrecht auf den Grundlinien stehenden Richtung versehen ist.

Der erfindungsgemäß ausgeführte fluorimetrische Laserdetektor für die Mikrosäulenchromatografie gestattet es, die Größe des zu detektierenden Volumens der Substanz entsprechend den Parametern der verwendeten chromatografischen Mikrosäule stufenlos zu regeln, weist eine hohe Empfindlichkeit und Auflösung auf, die durch eine optimale Wahl des zu detektierenden Volumens gewährleistet werden. Die Konstruktion der Küvette sichert in Verbindung mit der am Austritt des Zylinderlinsen enthaltenden Teleskops erzeugten kollimierten Laserstrahlung einen minimalen Einfluß der gestreuten Laserstrahlung auf den Fluoreszenzstrahlungsempfänger. Die Konstruktion der Küvette sorgt für einen laminaren Strom der Substanz im Bereich der Sammlung der Fluoreszenzstrahlung.

Die Erfindung wird nachstehend anhand eines konkreten Ausführungsbeispiels unter Bezugnahme auf die beigelegten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt

Fig. 1 eine optische Schaltung eines fluorimetrischen Laserdetektors für die Mikrosäulenchromatografie mit einer chromatografischen Mikrosäule,

Fig. 2 den gleichen Detektor wie Fig. 1 in perspektivischer Darstellung, ohne die Mikrosäule.

Der in Fig. 1, 2 gezeigte fluorimetrische Laserdetektor für die Mikrosäulenchromatografie enthält - optisch gekoppelt und hintereinander angeordnet - einen Laser 1, eine Baugruppe zur Laserstrahlungserzeugung bzw. ein Teleskop 2, eine Blende 3 zur Regelung eines zu detektierenden Volumens, eine Durchlaufküvette 4 (Meßzelle des Detektors), einen Fluoreszenzstrahlungsempfänger 5 und eine Lichtfalle 6. Der Strahlungsempfänger 5 ist derart angeordnet, daß die optische Achse seines Empfangsobjektivs senkrecht auf der Achse des Laserstrahls steht. Das Teleskop 2 besteht aus zwei Zylinderlinsen - einer Zerstreuungs- und einer Sammellinse 2′ bzw. 2′′. Die Durchlaufküvette 4 ist in Form eines rechtwinkligen Parallelepipeds mit einem inneren Durchgangskanal 7 quadratischen Querschnitts ausgeführt. Die Küvette 4 ist in der Weise angeordnet, daß die Längsachse des Kanals 7 senkrecht zur kollimierten Laserstrahlung gerichtet ist. Die Blende 3 zur Regelung des zu detektierenden Volumens weist die Form eines rechtwinkligen Trapezes auf, ist zwischen dem Teleskop 2 und der Küvette 4 derart angeordnet, daß die Grundlinien des Trapezes parallel zur Längsachse des Kanals 7 liegen. Die Blende 3 ist mit einem Mittel 8 zur Verschiebung in deren Ebene in einer auf den Grundlinien des Trapezes senkrecht stehenden Richtung (Pfeilrichtung A in Fig. 2) versehen. Als Mittel 8 zur Verschiebung kann beispielsweise eine Feinstellschraube verwendet werden.

Die chromatografische Mikrosäule 9 ist mittels einer Gewindeverbindung an der Eintrittsfläche der in einer metallischen Fassung bzw. Halterung 10 untergebrachten Küvette 4 befestigt. Zwischen der Küvette 4 und der Säule 9 ist eine Fotoplastscheibe mit einem metallkeramischen Filter 11 angeordnet.

Der Detektor arbeitet wie folgt.

Die getrennten Komponenten einer zu analysierenden Mischung von Substanzen strömen aus der chromatografischen Säule 9 durch das metallkeramische Filter 11 in den Durchgangskanal 7 der Küvette 4 ein, ohne den laminaren Charakter des Stroms zu stören. Der Laserstrahl wird durch das Teleskop 2 von einem Strahl runden Querschnitts zu einem flachen Strahl umgeformt, bei dem die Breite des Querschnitts gleich der des Kanals 7 zum Durchlauf der zu untersuchenden Flüssigkeit ist. Die Länge des Querschnitts des Laserstrahls wird mit Hilfe der trapezförmigen Blende 3 reguliert, die vor der Durchlaufküvette 4 (Meßzelle des Detektors) liegt. Im weiteren passiert der Laserstrahl die Küvette 4, die Säule der zu untersuchenden Flüssigkeit bei einer vorgegebenen Höhe, wobei in der belichteten Säule eine Fluoreszenz angeregt wird, und wird dann in der Lichtfalle 6 gelöscht. Die Fluoreszenzstrahlung wird aus dem angeregten Volumen der Flüssigkeit durch das Objektiv des Empfängers 5, beispielsweise eines Fotoelektronenvervielfachers, in einer senkrecht zum Laserstrahl liegenden Ebene gesammelt.

Die rechteckige Form der aus nichtlumineszierendem Quarz hergestellten Küvette 4 und die quadratische Form des Querschnitts des Innenkanals 7 tragen zu einer erheblichen Verringerung der Streuung der Laserstrahlung bei.

Die verstellbare Blende 3 in Form des rechtwinkligen Trapezes ist in der Weise angeordnet, daß deren zu den Grundlinien senkrecht verlaufende Seite parallel zu einer Wand der Küvette 4 und in der gleichen Höhe mit der Stirnfläche der letzteren liegt, an der die chromatografische Mikrosäule 9 befestigt wird. Die angegebene Anordnung der Blende 3 sorgt für eine Fluoreszenzanregung in der Säule der zu untersuchenden Flüssigkeit, sobald diese die Säule 9 verlassen hat, und führt somit auf ein Mindestmaß das Volumen des Flüssigkeitskanals des Detektors nach der Säule. Die Verschiebung der Blende 3 in Pfeilrichtung A gestattet es, die Höhe der Säule der durch die Laserstrahlung bei konstanter Leistungsdichte angeregten Flüssigkeit stufenlos zu ändern. Dies macht es möglich, für jede chromatografische Mikrosäule ihr eigenes zu detektierendes Volumen optimal zu wählen, was es gestattet, eine Analyse mit hoher Empfindlichkeit und Auflösung durchzuführen.

Es wurde ein Versuchsmuster eines erfindungsgemäßen fluorimetrischen Laserdetektors für die Mikrosäulenchromatografie hergestellt.

Die Meßküvette 4 des Detektors rechteckiger Form wurde aus Quarz gefertigt, das unter der Wirkung der Laserstrahlung nicht luminesziert. Die Außenmaße der Küvette sind 4 × 10 × 20 mm, die Maße des Innenkanals betragen 0,5 × 0,5 mm. Das Zylinderteleskop sicherte die Erzeugung eines Laserstrahls, der im Schnitt die Form eines Streifens der Abmessungen 0,5 × 7 mm aufweist. Um eine streng rechteckige Form des Querschnitts des Laserstrahls unter gleichmäßiger Leistungsverteilung über die Fläche des ersteren zu erzielen, begrenzte die Blende 3 die Höchstlänge des Streifens auf 6, dessen Mindestlänge auf 1 mm. Das zu detektierende Volumen konnte also von 0,25 bis 1,5 µl stufenlos geregelt werden. Das Volumen des Detektors hinter der Säule lag in allen Fällen nicht über 0,05 µl. Die Fluoreszenzstrahlung wurde bei einer Wellenlänge von 325 nm angeregt und bei einer Wellenlänge von 550 nm registriert. Unter diesen Bedingungen wurde bei einer Mikrosäule von 0,6 × 170 mm (M=8.10³) eine Grenzempfindlichkeit von 2.10^-16 Mol für die Detektivierung von DNS-Aminosäuren bei einer chromatografischen Zacke erreicht.

Claims (2)

1. Fluorimetrischer Laserdetektor für die Mikrosäulenchromatografie, der optisch verbunden

   • - einen Laser (1),
   • - eine Baugruppe zur Laserstrahlerzeugung,
   • - eine mit einer chromatografischen Mikrosäule (9) kommunizierende Durchlaufküvette (4),
   • - eine Blende (3) zur Regelung eines zu detektierenden Volumens in der Küvette (4) und
   • - einen Fluoreszenzstrahlungsempfänger (5) enthält,
2. dadurch gekennzeichnet, daß

   • - die Baugruppe zur Laserstrahlerzeugung ein Zylinderlinsen enthaltendes Teleskop (2) aufweist,
   • - die Durchlaufküvette (4) in Form eines rechtwinkligen Parallelepipeds mit einem inneren Durchgangssignal (7) quadratischen Querschnitts ausgeführt und derart angeordnet ist, daß die Längsachse des Kanals (7) senkrecht zur kollimierten Laserstrahlung verläuft,
   • - die Blende (3) zur Regelung des zu detektierenden Volumens, die Form eines rechtwinkligen Trapezes aufweist, zwischen dem Zylinderteleskop (2) und der Durchlaufküvette in der Weise angeordnet ist, daß die Grundlinien des Trapezes zur Längsachse des Kanals (7) parallel liegen, und mit einem Mittel (8) zu deren Verschiebung in der eigenen Ebene in einer senkrecht auf den Grundlinien stehenden Richtung versehen ist.