AT390841B - Fluorimetrischer laserdetektor - Google Patents

Description

Nr. 390 841

Die Erfindung betrifft einen fluorimetrischen Laserdetektor zur Mikrosäulenchromatografie, mit einem Laser, dem ein Laserstrahlerzeugungssystem nachgeordnet ist, und mit einer zur Kommunikation mit einer chromatografischen Mikrosäule vorgesehenen Durchlaufküvette im Weg des Laserstrahls, der eine Blende zur Regelung des zu detektierenden Volumens einer Substanz in der Durchlaufküvette zugeordnet ist, und der ein 5 Fluoreszensstrahlungsempfänger nachgeordnet ist. Ein solcher Laserdetektor kann z. B. zur Analyse geringer Mengen fluoreszierender Flüssigkeiten verwendet werden.

An die Detektoren für die Flüssigkeitschromatografie werden folgende allgemeine Forderungen gestellt: hohe Empfindlichkeit, niedrige Nachweisbarkeitsgrenze, niedriger Rauschpegel, weiter Liniearitätsbereich. Außerdem ist es vom Standpunkt der chromatografischen Auflösung auch wichtig, eine Reihe von an die Konstruktion einer 10 Küvette gestellten Forderungen zu erfüllen: geringes Fassungsvermögen, Fehlen einer Durchmischung getrennter Komponenten, schnelle Durchspülung des Flüssigkeitskanals des Detektors.

Die Konzentrationsempfindlichkeit des Detektors ist proportional der Menge einer in dessen Meßzelle befindlichen Substanz. Damit die Auflösung des Detektors hierbei nicht abfällt, ist folgende Bedingung zu erfüllen: 15 1 V0<— Vj = S //Vm, 2 wobei (V0) ein zu detektierendes Volumen, das unmittelbar das Fassungsvermögen der Meßzelle des Detektors 20 und das Fassungsvermögen des Flüssigkeitskanals vom Ausgang der Chromatografiesäule bis zur Meßzelle in sich einschließt, (V^ ein Volumen der Substanz bei einer chromatografischen Zacke, (S) eine Fläche des

Innenquerschnitts der Chromatografiesäule und (I) deren Länge ist.

Ist andererseits Vq « Vp dann sinkt die Empfindlichkeit des Detektors ab, da die Menge der zu messenden Substanz in der Zelle abnimmt. Jeder Chromatografiesäule ist daher ein eigenes zu detektierendes Volumen 25 zugeordnet, das zu wählen ist.

Es ist ein fluorimetrischer Laserdetektor für die Mikrosäulenchromatografie (L.W. Hershberger, I.B. Callis and G.D. Christian "Analytical Chemistry", 51, N. 9, 1979, p. 1444-1446) bekannt, der einen Laser, ein Laserstrahlungssystem, eine zur Kommunikation mit einer Chromatografiesäule vorgesehene Durchlaufküvette und einen Fluoreszenzstrahlungsempfänger aufweist. Die Durchlaufküvette ist bei diesem Detektor durch eine 30 Kammer mit Quarzfenstem an allen vier Seiten gebildet. Der Innenraum der Kammer ist mit einem Eluenten gefüllt, der auch im Flüssigkeitskanal der Chromatografiesäule verwendet wird. Im Unterteil der Kammer ist eine hydrodynamische Düse angeordnet, über die ein Strahl der zu untersuchenden Flüssigkeit eingespritzt wird. Die Fluoreszenzstrahlung wird durch das Objektiv des Empfängers in einer Richtung senkrecht zur Anregung gesammelt. Typisch für diese Bauart des · Detektors ist die niedrige Empfindlichkeit. Dies ist darauf 35 zurückzuführen, daß das zu detektierende Volumen der Substanz viel kleiner ist als die Volumina bei chromatografischen Zacken, weil der Strahlquerschnitt der durch die Küvette fließenden Substanzen wesentlich kleiner ist als der Querschnitt des Kanals der Mikrochromatografiesäule. Dies ist auch dadurch bedingt, daß der Strahl der zu untersuchenden Flüssigkeit von einer Schicht des Eluenten umgeben ist, deren Dicke den Strahldurchmesser um das 10- bis 20fache übertrifft. Deshalb wird die Registrierung des Nutzsignals durch die 40 Fluoreszenz des Eluenten wesentlich erschwert, die den Rauschpegel erhöht

Bei einem bekannten fluorimetrischen Laserdetektor der eingangs angegebenen Art (s. H. Todoriki und A. Hirakana "Chemical and Pharmaceutical Bulletin",v. 28, N. 4,1980, p. 1337-1339) ist die Durchlaufküvette in Form eines Quarzrohres ausgeführt, an das für die Zufuhr der zu untersuchenden Flüssigkeit ein anderes Rohr kleineren Durchmessers senkrecht angeschweißt ist. In die obere Stirnfläche der Küvette ist ein faseroptischer 45 Lichtleiter eingeführt, an dessen Ende eine Fokussierlinse angeklebt ist, die das Laserstrahlungssystem bildet. Die Linse ist etwas höher als die Verbindungsstelle der Rohre angeordnet, wodurch es möglich ist, die Divergenz der Laserstrahlung hinter dem faseroptischen Lichtleiter geringer zu halten. Die Fluoreszenz wird im Bereich des Überganges der zu untersuchenden Flüssigkeit vom Rohr kleineren Durchmessers zum Rohr größeren Durchmessers angeregt. Hierbei wird der Lichtleiter mit der Linse in einer solchen Höhe angeordnet, daß der 50 divergierende Laserstrahl die Rohrwände in jenem Bereich nicht erreicht, von dem die Fluoreszenzstrahlung gesammelt wird. Dieser Bereich wird durch eine runde verstellbare Blende gewählt, die auf einer Achse mit dem Flüssigkeitszuführungsrohr angeordnet ist. Dadurch wird hier der Fotoempfänger gegen Laserstreustrahlung geschützt

Auch bei diesem Detektor ist das Auflösungsvermögen niedrig, da die chromatografischen Fraktionen an dem 55 Übergang des Flüssigkeitsstroms vom Rohr kleineren Durchmessers zum Rohr größeren Durchmessers stark verwaschen werden, wo der laminare Charakter des Stroms gestört wird. Darüber hinaus wird die Fluoreszenz durch einen nichtparallelen Laserstrahl erzeugt, weil dessen Fokussierung durch sphärische Linsen verwirklicht wird. Die steigert seinerseits den Anteil der gestreuten Laserstrahlung an den Grenzen von verschiedene Brechungsindices aufweisenden Medien. Mit den bekannten Detektoren ist es nicht möglich, ein zu detektierendes 60 Volumen für Mikrosäulen mit unterschiedlichen Parametern optimal zu wählen. Im Zusammenhang damit ergeben sich beim Mikrosäulenwechsel Einbußen in der Empfindlichkeit oder Auflösung. -2-

Nr. 390 841

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen fluorimetrischen Laserdetektor der eingangs angegebenen Art zu schaffen, bei dem der Einfluß der gestreuten Laserstrahlung auf den Fluoreszenzstrahlungsempfänger beseitigt und eine stufenlose Regelung des zu detektierenden Volumens bei Vorhandensein eines laminaren Stroms der zu untersuchenden Flüssigkeit möglich ist.

Diese Aufgabe wird beim fluorimetrischen Laserdetektor der eingangs erwähnten Art erfmdungsgemäß dadurch gelöst, daß das Laserstrahlerzeugungssystem als Zylinderteleskop mit zwei Zylinderlinsen ausgebildet ist, daß die Durchlaufküvette in Form eines rechtwinkeligen Parallelepipeds mit einem inneren Durchgangskanal von quadratischem Querschnitt ausgeführt ist, wobei die Längsachse des Durchgangskanals senkrecht zum kollimierten Laserstrahl ausgerichtet ist, und daß die Blende die Form eines rechtwinkeligen Trapezes aufweist und zwischen dem Zylinderteleskop und der Durchlaufküvette mit den Grundlinien des Trapezes parallel zur Längsachse des Durchgangskanals angeordnet ist, wobei die Blende in Richtung senkrecht zu den Grundlinien des Trapezes, beispielsweise mit Hilfe einer Feineinstellschraube, verschiebbar ist.

Bei einer solchen Ausbildung des fluorimetrischen Laserdetektors ist es möglich, die Größe des zu detektierenden Volumens der Substanz entsprechend den Parametern der verwendeten chromatografischen Mikrosäule stufenlos zu regeln. Weiters wird eine hohe Empfindlichkeit und Auflösung ermöglicht, die durch eine optimale Wahl des zu detektierenden Volumens gewährleistet werden. Die angegebene Ausbildung der Durchlaufküvette sichert ferner in Verbindung mit der am Ausgang des Zylinderteleskops erzeugten kollimierten Laserstrahlung einen minimalen Einfluß der gestreuten Laserstrahlung auf den Fluoreszenzstrahlungsempfänger, und sie sorgt für einen laminaren Strom der Substanz im Bereich der Sammlung der Fluoreszenzstrahlung.

Die Erfindung wird nachstehend anhand eines in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispiels noch weiter erläutert. Es zeigen: Fig. 1 ein optisches Schema eines fluorimetrischen Laserdetektors zur Mikrosäulenchromatografie mit einer chromatografischen Mikrosäule; und Fig. 2 den Detektor von Fig. 1 in perspektivischer Darstellung, wobei die Mikrosäule weggelassen wurde.

Der in Fig. 1 und 2 gezeigte fluorimetrische Laserdetektor zur Mikrosäulenchromatografie enthält einen Laser (1), ein Laserstrahlerzeugungssystem, das durch ein Zylinderteleskop (2) gebildet ist, eine Blende (3) zur Regelung eines zu detektierenden Volumens, eine Durchlaufküvette (4) (Meßzelle des Detektors), einen Fluoreszenzstrahlungsempfänger (5) und eine Lichtfalle (6). Der Strahlungsempfänger (5) ist derart angeordnet, daß die optische Achse seines Empfangsobjektives senkrecht auf der Achse des Laserstrahls steht. Das Zylinderteleskop (2) besteht aus zwei Zylinderlinsen einer Streulinse (2') und einer Sammellinse (2"). Die Durchlaufküvette (4) ist in Form eines rechtwinkeligen Parallelepipeds mit einem inneren Durchgangskanal (7) von quadratischem Querschnitt ausgeführt. Die Durchlaufküvette (4) ist in der Weise angeordnet, daß die Längsachse des Kanals (7) senkrecht zur kollimierten Laserstrahlung gerichtet ist. Die Blende (3) weist die Form eines rechtwinkeligen Trapezes auf, und sie ist zwischen dem Zylinderteleskop (2) und der Durchlaufküvette (4) derartig angeordnet, daß die Grundlinien des Trapezes parallel zur Längsachse des Kanals (7) liegen. Die Blende (3) ist, z. B. mittels einer Feinstellschraube (8), in ihrer Ebene in einer zu den Grundlinien des Trapezes senkrechten Richtung (Pfeilrichtung (A) in Fig. 2) verschiebbar.

Die chromatografische Mikrosäule (9) ist mittels einer Gewindeverbindung an der Eintrittsfläche der in einer metallischen Fassung bzw. Halterung (10) untergebrachten Durchlaufküvette (4) befestigt. Zwischen der Durchlaufküvette (4) und der Mikrosäule (9) ist eine Scheibe aus Fluorkunststoff mit einem metallkeramischen Filter (11) angeordnet.

Der Detektor arbeitet wie folgt

Die getrennten Komponenten einer zu analysierenden Mischung von Substanzen strömt aus der chromatografischen Mikrosäule (9) durch das metallkeramische Filter (11) in den Durchgangskanal (7) der Durchlaufküvette (4) ein, wobei der laminare Charakter des Stroms nicht gestört wird. Der Laserstrahl wird durch das Zylinderteleskop (2) von einem Strahl runden Querschnitts zu einem flachen Strahl umgeformt, bei dem die Breite des Querschnitts gleich jener des Durchgangskanals (7) ist. Die Höhe des Querschnitts des Laserstrahls wird mit Hilfe der trapezförmigen Blende (3) reguliert, die vor der Durchlaufküvette (4) liegt. Im weiteren passiert der Laserstrahl die Durchlaufküvette (4), die Säule der zu untersuchenden Flüssigkeit bei einer vorgegebenen Höhe, wobei in der belichteten Säule eine Fluoreszenz angeregt wird, und er wird dann in der Lichtfalle (6) gelöscht. Die Fluoreszenzstrahlung wird aus dem angeregten Volumen der Flüssigkeit durch das Objektiv des Strahlungsempfängers (5), beispielsweise eines Fotoelektronenvervielfachers, in einer senkrecht zum Laserstrahl liegenden Ebene gesammelt.

Die rechteckige Form der aus nichtlumineszierendem Quarz hergestellten Küvette (4) und die quadratische Form des Querschnitts des Innenkanals (7) tragen zu einer erheblichen Verringerung der Streuung der Laserstrahlung bei.

Die verstellbare Blende (3) in Form des rechtwinkeligen Trapezes ist in der Weise angeordnet, daß deren zu den Grundlinien senkrecht verlaufende Seite parallel zu einer Wand der Durchlaufküvette (4) und in der gleichen Höhe mit der Stirnfläche der letzteren liegt, an der die chromatografische Mikrosäule (9) befestigt wird. Die angegebene Anordnung der Blende (3) sorgt für eine Fluoreszenzanregung in der Säule der zu untersuchenden Flüssigkeit, sobald diese die Säule (9) verlassen hat, und reduziert somit das Volumen des Flüssigkeitskanals des Detektors nach der Säule auf ein Mindestmaß. Die Verschiebung der Blende (3) in Pfeilrichtung (A) gestattet es, die Höhe der Säule der durch die Laserstrahlung bei konstanter Leistungsdichte angeregten Flüssigkeit stufenlos -3-

Claims (1)

1. Nr. 390 841 zu ändern. Dies macht es möglich, für jede chromatografische Mikrosäule ein eigenes zu detektierendes Volumen optimal zu wählen, da es gestattet, eine Analyse mit hoher Empfindlichkeit und Auflösung durchzuführen. Es wurde ein Versuchsmuster eines erfindungsgemäßen fluorimetrischen Laserdetektors für die Mikrosäulenchromatografie hergestellt. Die Meßküvette (4) des Detektors rechteckiger Form wurde aus Quarz gefertigt, der unter der Wirkung der Laserstrahlung nicht luminesziert. Die Außenmaße der Küvette (4) betrugen 4 x 10 x 20 mm, die Maße des Innenkanals 0,5 x 0,5 mm. Das Zylinderteleskop (2) war zur Erzeugung eines Laserstrahls ausgelegt, der im Querschnitt die Form eines Streifens mit den Abmessungen 0,5 x 7 mm aufwies. Um eine strenge rechteckige Form des Querschnitts des Laserstrahls unter gleichmäßiger Leistungsverteilung über dessen Fläche zu erzielen, begrenzte die Blende (3) die maximale Höhe des Streifens auf 6 mm, und seine Mindesthöhe betrug 1 mm. Das zu detektierende Volumen konnte also von 0,25 bis 1,5 μΐ stufenlos geregelt werden. Das Volumen des Detektors hinter der Säule lag in allen Fällen nicht über 0,05 μΐ. Die Fluoreszenzstrahlung wurde bei einer Wellenlänge von 325 nm angeregt und bei einer Wellenlänge von 550 nm 'l registriert. Unter diesen Bedingungen wurde bei einer Mikrosäule von 0,6 x 170 mm (M = 8.10 ) eine Grenzempfindlichkeit von 2.10'^ Mol für die Detektierung von DNS-Aminosäuren bei einer chromatografischen Zacke erreicht. PATENTANSPRUCH Fluorimetrischer Laserdetektor zur Mikrosäulenchromatografie, mit einem Laser, dem ein Laserstrahlerzeugungssystem nachgeordnet ist, und mit einer zur Kommunikation mit einer chromatografischen Mikrosäule vorgesehenen Durchlaufküvette im Weg des Laserstrahls, der eine Blende zur Regelung des zu detektierenden Volumens einer Substanz in der Durchlaufküvette zugeordnet ist, und der ein Fluoreszenzstrahlungsempfänger nachgeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Laserstrahlerzeugungssystem als Zylinderteleskop (2) mit zwei Zylinderlinsen (2', 2") ausgebildet ist, daß die Durchlaufküvette (4) in Form eines rechtwinkeligen Parallelepipeds mit einem inneren Durchgangskanal (7) von quadratischem Querschnitt ausgeführt ist, wobei die Längsachse des Durchgangskanals (7) senkrecht zum kollimierten Laserstrahl ausgerichtet ist, und daß die Blende (3) die Form eines rechtwinkeligen Trapezes aufweist und zwischen dem Zylinderteleskop (2) und der Durchlaufküvette (4) mit den Grundlinien des Trapezes parallel zur Längsachse des Durchgangskanals (7) angeordnet ist, wobei die Blende (3) in Richtung senkrecht zu den Grundlinien des Trapezes, beispielsweise mit Hilfe einer Feineinstellschraube (8), verschiebbar ist. Hiezu 1 Blatt Zeichnung -4-