SE458156B - Laserfluorometrisk detektor foer mikropelarkromatografi - Google Patents

Description

458 156 inre volym fylles med elueringsmedlet, som även användes i den kromatografíska pelarens strömningskanal. Den undre delen av kammaren är försedd med ett hydrodynamiskt strâlmunstycke, genom vilket provet insprutas. Fluorescensemissionen uppfàngas av objektivet 5. mottagaren i en riktning vinkelrätt mot den excíterade stråln ingen .

Nackdelen med denna detektor är dess otillräckliga känslighet.

Denna beror pá att den detekterade volymen av utflödet är väsentligt mindre i förhållande till volymen av de kroma- tografiska topparna, eftersom tvärsektionen för den ström, som flyter genom cellen, är väsentligt mindre än tvärsektíonen för den kromatografiska pelarens inre diameter. En ytterligare bidragande faktor är att provströmmen är omgiven av strömmen av elueringsmedel, vars tjocklek överstiger provströmmens dia- meter med en faktor av 10 till 20. Fluorescens från eluerings- medlet, som adderas till brusnivån, är ett allvarligt handi- kapp för en användbar sígnalregistrering.

En annan laserfluorometrisk detektor för mikropelar- kromatografi är även känd (se exempelvis H Todorikí, A Hira- kawa, Chemical & Pharmaceutical Bulletin, Vol 28, nr 4, 1980, s 1 337-1 339), vilken innefattar beståndsdelar, som är optískt förbundna med varandra: en laser, en enhet för bildning av laseremission, en genomströmningscell avsedd för kommunikation med den kromatografiska pelaren, en bländare för reglering av provets volym i cellen och en mottagare för fluorescensemis- sion.

Genomströmningscellen i denna anordning är ett kvarts- rör med ett annat kvartsrör med mindre diameter vinkelrätt förbundet därmed såsom inlopp för ett prov. En optisk fiber i den övre änden av genomströmningscellen, varvid en mikrolins är fäst vid fiberns utgángsände, som utgör enheten för bildning av laseremission. införes Mikrolinsen placeras något ovanför det område, där de två rören är förbundna med varandra i ändamål att minska divergensen hos laserstràlen efter fibern.

Fluoroscenssignalen bildas i den zon, där det strömmande provet kommer in i röret 458 156 med större diameter fràn röret med den mindre diametern. Fibern med mikrolinsen placeras så, att den divergerande laserstrálen icke när rörväggarna i den zon, där fluorescensemissionen upp- samlas. Denna zon kan väljas medelst en rund, reglerbar bländare, som är placerad koaxiellt med provinföringsröret. På detta sätt skyddas fotomottagaren från spritt laserljus.

Denna anordning har den nackdelen, att detektorns upp- lösningsförmâga icke är tillräckligt hög. Kromatografiska fraktioner störes allvarligt, när provströmmen rör sig från röret med mindre diameter in i röret med större diameter, och den laminära strömningen störes.

Dessutom exciteras i de bägge ovannämnda detektorerna fluorescensen medelst en icke parallell laserstràle, eftersom den senare fokuseras medelst sfäriska linser. Detta i sin tur bidrar till spridd laserstràlning vid de gränser, där medier med olika brytningsindex möter varandra.

Med ovannämnda detektorer kan man heller icke åstad- komma ett optimalt val av provvolymer för olika mikropelare. Om mikropelaren utbytes mot en annan kan känsligheten eller upp- lösningsförmàgan vid detekteringen påverkas.

Uppfinningen har till ändamål att åstadkomma en laser- fluorometrisk detektor för mikropelarkromatografi, som har en sådan optisk anordning och är försedd med en sådan enhet för bildning av laseremission samt en genomströmningscell, som gör det möjligt att undanröja verkningarna av spridd laserstràl- ning på mottagaren för fluorescensemissionen och att jämnt reglera den detekterade volymen, samtidigt som provets laminära strömming förblir ostörd.

Detta àstadkommes med en laserfluorometrisk detektor för mikropelarkromatografi, som innefattar följande, med var- andra optiskt förbundna element, en laser, en enhet för bild- ning av laserljus, en genomströmningscell i form av en rät- vinklig parallellepiped med en invändig, kvadratisk genom- strömningškanal och anordnad för kommunikation med en mikro- kromatografipelare, en bländare i form av en rätvinklig trapets och försedd med en anordning för bländarens förflyttning vinkelrätt mot trapetsens bas för inreglering av den detektera- de volymen av utflödet i genomströmningscellen och en mottagare för fluorescensemission, varvid enligt uppfinningen enheten för bildning av laseremission är ett cylindriskt teleskop, genomströmningscellen är en rätvinklig parallellepiped med en 458 156 invändig, kvadratisk genomströmningskanal, som är placerad så, att kanalens längdaxel är vinkelrât mot riktningen för laser- ljuset, som gjorts parallellt, att bländaren är placerad mellan det cylindriska teleskopet och genomströmningscellen, så att trapetsens bas är parallell med kanalens'längdaxel och den sida av trapetsen, som är vinkelrät mot trapetsens bas är placerad i nivå med den ände av cellen, vid vilken mikrokromatografipela- ren är fäst, och att ytan av cellens genomströmningskanal sam- manfaller med kromatografipelarens tvärsektion utan att över- skrida densamma.

Den laserfluorometriska detektorn för mikropelarkroma- tografi enligt uppfinningen uppvisar sådana fördelar såsom en jämn inreglering av det detekterade provets volym i enlighet med parametrarna hos den speciella kromatografiska mikropelare som användes. Detektorns känslighet och upplösningsförmàga är höga till följd av det optimala valet av det detekterade pro- vets volym. Genomströmningscellen och laserstràlningen, som gjorts parallell och erhålles vid det cylindriska teleskopets utlopp medför att verkan av spritt laserljus på mottagaren för fluorescensemission blir minimal. Genomströmningscellen är så utformad, att provets strömning i den zon, där fluorescens- emissionen tillvaratas, förblir laminär.

Uppfinningen beskrives närmare nedan under hänvisning til bifogade ritning, på vilken fig 1 visar en optisk anordning i en laserfluorometrisk detektor enligt uppfinningen för mikro- pelarkromatografí med en kromatografisk mikropelare, och fig 2 visar anordningen i fig 1 och detektorn enligt uppfinningen utan mikropelaren i perspektiv.

En laserfluorometrisk detektor för mikropelarkroma- tografi, som visas i fig 1 och 2, omfattar följande bestånds- delar, som är optiskt förbundna med varandra och anordnade ef- ter varandra: en laserenhet 1, en enhet för bildning av laser- strålning, som utgöres av ett cylindriskt teleskop 2, en bländare 3 för inreglering av det detekterade provets volym, en genomströmningscell 4, som är detektorns mätcell, en mot- tagare 5 för fluorescensemission och en ljusfälla 6. Mottagaren 5 är placerad så, att ingángsobjektivets optiska axel är vin- kelrät mot lasersträlens axel. Det cylindriska teleskopet består av två linser, en negativ lins 2' och en positiv lins PA 458 156 2". Genomströmníngscellen 4 är en rätvinklig parallellepiped med en genomgående inre kanal '7 med kvadratisk tvärsektion.

Genomströmningscellen 4 placeras så, att kanalens 7 längdaxel är vinkelrät mot riktningen för laserljuset, som gjorts paral- lellt. Bländaren för inställning av det detekterade provets volym är en rätvinklig trapets, som placeras mellan det cylind- riska teleskopet 2 och genomströmningscellen 4, så att tra- petsens bas är parallell med kanalens 7 axel. Bländaren 3 är försedd med en anordning 8 för dess förflyttning i dess plan och i en riktning vinkelrätt mot trapetsens bas, såsom antydes medelst pilen A i fig 2. Anordningen 8 kan exempelvis vara en mikrometerskruv.

En kromatografisk pelare 9 är genom en gängad förbind- ning fäst vid genomströmningscellens 4 övre ände, vilken cell är uppburen i en metallhållare 10. En teflonring och ett filter 11 av cermet är placerad mellan genomströmningscellen 4 och pelaren 9.

Den laserfluorometriska detektorn enligt uppfinningen arbetar pà följande sätt.

Utflödet fràn den kromatografiska pelaren 9, som består av separerade fraktioner av den substans som skall analyseras, matas genom filtret 11 av cermet till den genomgående kanalen 7 i genomströmningscellen 4, varvid den laminära strömningen förblir ostörd. Laserstràlen omformas medelst det cylindriska teleskopet 2 från en rund stràle till en plan sádan. Den plana stràlens bredd är lika med bredden av den kanal 7, genom vilken provet strömmar. Denna bredd hos laserstrålen kan regleras me- delst den trapetsformade bländaren 3, som är placerad framför genomströmningscellen 4, som utgör detektorns mätcell. Laser- stràlen passerar genom cellen 4 och vätskepelaren analyseras.

Fluorescens exciteras i vätskepelaren och släckes i ljusfällan 6. Fluorescensemissionen tillvaratas av objektívet i mottagaren 5, som kan vara en fotomultiplikator, i ett plan vinkelrätt mot laserstràlen. En spridning av laserstrålningen minskas i hög grad genom den rektangulära formen hos genomströmningscellen 4, som är framställd av icke-luminescent kvarts, och den kvadra- tiska formen hos den ínvändiga genomgående kanalen 7.

-A 458 156 Den reglerbara bländaren 3, som har formen av en rät- vinklig trapets, placeras så att dess sida vinkelrätt mot basen även är parallell med genomströmningscellens 4 vägg och i nivå med den ände av cellen, vid vilken den kromatografiska mikro- pelaren 9 är fäst. Ett sådant läge hos bländaren 3 medför den fördelen, att fluorescens exciteras i provet omedelbart efter det att detta lämnar pelaren 9. Den utströmmande volymen kan Vidare kan bländaren 3 för- flyttas i riktningen av pilen A, och på detta sätt kan höjden av den vätskepelare, som exciteras medelst laserljus, regleras jämnt, därför hållas vid ett minimum. samtidigt som effekttätheten förblir oförändrad. Detta möjliggör val av en optimal volym hos det detekterade provet för varje särskild kromatografisk pelare, vilket bidrar till känsligheten och upplösningsförmâgan vid analysen.

En prototyp av den laserfluorometriska detektorn för mikropelarkromatografi har framställts enligt uppfinningen.

Mätcellen 4 i den kvadratiska detektorn framställdes av kvarts, som icke frambringar någon luminescens, utsattes för laserstrålning. Mätcellens när cellen dimensioner var 4x10x20 mm, och den invändiga kanalen hade dimensionerna 0,5x0,5 mm. Det cylindriska teleskopet åstadkom en laserstråle, vars tvärsektion utgjordes av ett band med dimensionerna 0,5x7 mm. Bländaren 3 begränsade bandbredden från 1 till 6 mm i ändamål att åstadkomma en strikt rektangulär tvärsektion hos laserstràlen, i vilken effekten var líkformigt fördelad. Det detekterade provets volym kunde jämnt regleras från 0,25 till 1,5 mikrolíter. I samtliga fall översteg volymen i detektorn efter pelaren icke 0,05 mikroliter. Fluorescensemission exci- terades vid en våglängd av 325 nm och registrerades vid 550 nm.

Vid användning av en mikropelare 0,6x170 mm (M=8-103) uppgick tröskelkänsligheten för detektorn till 2'10_16 mol i den kroma- tografiska toppen för dinatriumsalter av aminosyror.

Claims (1)

1. 458 156 P a t e n t k r a v Laserfluorometrisk detektor för mikropelarkromatografi, innefattande följande, med varandra optiskt förbundna element, en laser (1), en enhet för bildning av laserljus, en genom- strömningscell (4) i form av en rätvinklig parallellepiped med en invändig, kvadratisk genomströmningskanal (7) och anordnad för kommunikation med en mikrokromatografipelare (9), en blän- dare (3) i form av en rätvinklig trapets och försedd med en anordning för bländarens förflyttning vinkelrätt mot trapetsens bas för inreglering av den detekterade volymen av ut- flödet i genomströmningscellen (4) och en mottagare (5) för fluorescensemission, k ä n n e t e c k n a d a v att enheten för bildning av laserljus är ett cylindriskt teleskop (2), att genomströmningscellen (4) är en rät- vinklíg parallellepiped med en invändig, kvadratisk genomströmningskanal (7), som är placerad sà, att kanalens (7) längdaxel är vinkelrät mot riktningen för laserljuset, som gjorts parallellt, att bländaren (3) är placerad mellan det cylindriska teleskopet (2) och genomströmníngscellen (4), sà att trapetsens bas är parallell med kanalens (7) längdaxel och den sida av trapetsen, som är vinkelrät mot trapetsens bas är placerad i nivå med den ände av cellen (4), vid vilken mikro- kromatografipelaren (9) är fäst, och att ytan av cellens (4) genomströmningskanal sammanfaller med kromatografipelarens tvärsektion utan att överskrida densamma.