DE3622591A1 - Verfahren und vorrichtung zur herstellung eines regelbaren und reproduzierbaren temperaturgradienten und seine verwendung - Google Patents
Verfahren und vorrichtung zur herstellung eines regelbaren und reproduzierbaren temperaturgradienten und seine verwendungInfo
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Description
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren
zur Herstellung eines regelbaren und reproduzierbaren
Temperaturgradienten in einer vorgegebenen Richtung von
wärmeleitenden Platten für die Auftrennung von Stoffge
mischen in flächigen Trennmedien. Weiterhin betrifft
die Erfindung eine Vorrichtung zur Herstellung eines
solchen Temperaturgradienten sowie ihre Verwendung zur
Auftrennung von Stoffgemischen, in denen mindestens
eine Komponente im Temperaturbereich des Temperaturgra
dienten eine thermische Umwandlung erfährt.
Es ist bekannt, daß eine Reihe von höhermolekularen
Naturstoffen bei steigenden Temperaturen Umwandlungen
bzw. irreversible Veränderungen erfahren und daß diese
Veränderungen auch analytisch ausgewertet werden kön
nen. D.R. Thatcher und B. Hodson haben in Biochem.
(1981), 197, S. 105-109 die Denaturierung von Proteinen
und Nukleinsäuren unter Anwendung eines thermischen
Gradienten bei der Elektrophorese untersucht und dabei
festgestellt, daß hierbei thermisch verursachte Verän
derungen sichtbar gemacht werden können. Zur Erzeugung
des thermischen Gradienten haben sie ein Gerät konstru
iert, welches von beiden Seiten an eine vertikale Poly
acrylamid-Gelplatte gelegt werden konnte, wobei thermo
statisch kontrolliertes Wasser verschiedener Temperatu
ren durch die beiden Enden der Aluminiumplatten gelei
tet wurde. Die beiden Platten waren miteinander in Se
rie geschaltet, wobei man annahm, daß sich hierbei ein
identischer thermischer Gradient ausgebildet hat.
Diese Vorrichtung ist nicht nur konstruktiv kompliziert
und schwierig handhabbar, sonder weist auch den prinzi
piellen Fehler auf, daß sich hiermit kein regelbarer
und reproduzierbarer Temperaturgradient herstellen
läßt. Allein dadurch, daß der Strom des Wasserbades
durch die in Serie geschalteten Platten geleitet wurde,
hat sich ein unerwünschter und störender Temperaturgra
dient ausgebildet zwischen Zu- und Ableitung des jewei
ligen Wasserbades. Dies wiederum führt zu verschiedenen
Temperaturen und nicht-parallelen Temperaturgradienten
in den beiden Platten. Dies wiederum führt dazu, daß
die Gelelektrophoreseplatte auf der Vorder- und Rück
seite verschiedene Temperaturen aufwies.
Die vorliegende Erfindung hat sich zunächst die Aufgabe
gestellt, einen regelbaren und reproduzierbaren Tempe
raturgradienten herzustellen in einer vorgegebenen Rich
tung von wärmeleitenden Platten für die Auftrennung von
Stoffgemischen in flächigen Trennmedien. Dabei sollte
dies mit möglichst geringem konstruktiven und apparati
ven Aufwand erfolgen und dennoch gewährleisten, daß
möglichst wenig Störungen auftreten.
Diese Aufgabe konnte jetzt überraschend einfach dadurch
gelöst werden, daß man mit nur einer Platte arbeitet
und daß eine Kante in der Platte mittels einer oder
mehrerer Heizvorrichtungen erwärmt und die gegenüber
liegende Kante der Platte mittels einer oder mehrerer
regelbarer Kühlvorrichtungen gekühlt wird, wobei der
Energiefluß der Heizvorrichtung(en) einerseits und der
Kühlvorrichtung(en) andererseits größer ist als der
Energiefluß durch die Platte. Untersuchungen an recht
eckigen Platten mit derartigen Heiz- und Kühlvorrich
tungen haben gezeigt, daß auf diese Weise in der Platte
ein praktisch linearer Temperaturgradient erzeugt wer
den kann und dieser Temperaturgradient von der Platte
auf die angrenzenden flächigen Trennmedien übertragen
wird. Es hat sich weiterhin gezeigt, daß bei wärmeiso
lierender Abdeckung des flächigen Trennmediums auf der
Seite, die der Platte abgewandt ist, sich der gleiche
Temperaturgradient durch die gesamte Schicht hindurch
ausbildet. Die Temperatur auf den beiden Seiten des
Trennmediums ist somit nahezu identisch. Es kann daher
nicht zu den Störungen kommen, die durch verschiedene
Aufheizung der beiden Seiten des Trennmediums durch
zwei Platten zu beobachten sind.
Besonders einfach kann sowohl die Erwärmung der einen
Kante der Platte als auch die Kühlung der gegenüberlie
genden Kante mit Hilfe von thermostatisierten Flüssig
keitsbädern erfolgen. Prinzipiell kann aber auch die
Heizung der einen Kante mit Hilfe einer elektrischen
Heizung erfolgen, wobei sowohl Heizdrähte als auch Pel
tier-Elemente in Frage kommen.
Um bei Verwendung von thermostatisierten Flüssigkeits
bädern zu gewährleisten, daß der Energiefluß der Heiz
vorrichtung einerseits und der Kühlvorrichtung anderer
seits größer ist als der Energiefluß durch die Platte,
genügt es nicht, an den Plattenenden Bohrungen anzubrin
gen, welche von dem Flüssigkeitsbad durchströmt werden.
Es werden vielmehr größerdimensionierte Metallblöcke
durchbohrt und vollflächig mit den Kanten der Platte
verbunden. Vorzugsweise werden einfach oder doppelt
durchbohrte Metallblöcke verwendet, die eine deutlich
breitere Außenkante aufweisen als die Dicke der wärme
leitenden Platte.
Bei einfach durchbohrten Metallblöcken bildet sich
durch den Energiefluß in die Platte ein gewisser Tempe
raturgradient zwischen Zu- und Ablauf aus. Dieser Tem
peraturgradient wird dann als relativ geringfügiger
Fehler des erfindungsgemäß herzustellenden Temperatur
gradienten auf der Platte an diese weitergegeben. Um
auch diese Störungen des Temperaturgradienten in der
Platte zu vermeiden, verwendet man am einfachsten dop
pelt durchbohrte Metallblöcke, durch die das jeweilige
Flüssigkeitsbad nacheinander in beiden Richtungen durch
gepumpt wird. Der Temperaturgradient zwischen eintre
tendem und austretendem Flüssigkeitsbad wird dadurch
geringer und kompensiert sich innerhalb des Metall
blocks. Prinzipiell ist es auch möglich, diesen Fehler
etwas zu kompensieren, indem man bei einfach durchbohr
ten Blöcken eine den Temperaturgradienten entsprechende
Winkelabweichung von der parallelen Anordnung wählt und
so die geringere Temperaturdifferenz zwischen Ausflüs
sen durch einen geringeren Abstand ausgleicht, was dann
zum gleichen Gradienten führt. Wesentlich störender als
ein nicht idealer Gradient sind die Abweichungen der
Temperatur auf der Ober- und Unterseite von flächigen
Trennmedien bei der Verwendung von zwei Platten, deren
Temperaturgradient nicht völlig übereinstimmt, so wie
dies im Stand der Technik der Fall war.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist, daß es möglich ist, nicht nur wie im Stand der
Technik einen Temperaturgradienten senkrecht zur Lauf
richtung, sondern auch parellel zur Laufrichtung herzu
stellen. Hierdurch ist es möglich, gereinigte, chroma
tographisch einheitlich erscheinende Fraktionen zu un
tersuchen.
Es wurde bereits in einigen Fällen festgestellt, daß es
sich dabei um Substanzgemische handelte, die bei noch
maliger Auftrennung unter Einwirkung eines parallelen
Temperaturgradienten aufgetrennt werden konnten. Dies
ist darauf zurückzuführen, daß die einzelnen Komponen
ten des einheitlich erscheinenden Gemisches sich ther
misch verschieden verhalten und daher beim Durchwandern
des flächigen Trennmediums an verschiedenen Stellen
umgewandelt werden und daher ihre Wanderungsgeschwin
digkeit verändern. Bei Anwendung eines parallelen Tem
peraturgradienten ist es weiterhin möglich, gleichzei
tig mehrere Proben zu untersuchen.
Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zusammen
mit Gelplatten für die Elektrophorese ist es beispiels
weise möglich, Viroide, Satelliten-Ribonukleinsäuren
von Viren und Viren mit doppelsträngiger RNA nachzuwei
sen und zu unterscheiden. Weiterhin ist es möglich,
Protein-Nukleinsäure-Komplexe sowie Mutationen zu ana
lysieren, da sich auch diese in sehr spezieller Weise
thermisch unterscheiden lassen. Einige dieser Trennpro
bleme konnten sich bisher nur mit Hilfe der sehr schwer
reproduzierbaren und äußerst schwierig herstellbaren
Gradientenplatten für Gelelektrophorese lösen lassen.
Bekanntgeworden sind insbesondere derartige Gradien
tenplatten mit einem Harnstoffgradienten oder einem
Gradienten eines Inhibitors (vgl. L.S. Lerman et al.,
Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 1984. 13, S. 399-423).
Eine besonders einfache und bevorzugte Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist in der anliegen
den Fig. 1 dargestellt, welche mit ihren Dimensionen
geeignet ist, in einem handelsüblichen Gelelektrophore
se-Gerät eingesetzt zu werden, nämlich dem LKB 2117
Multiphor II.
In dieser Figur bedeutet
In dieser Figur bedeutet
- 1 die wärmeleitende Platte,
2 eine Kante und
3 die gegenüberliegende Kante,
4 eine regelbare Heizvorrichtung und
5 eine regelbare Kühlvorrichtung.
In der anliegenden Fig. 2 ist schematisch der Aufbau
einer Temperaturgradienten-Gelelektrophorese darge
stellt.
In dieser Figur bedeutet
In dieser Figur bedeutet
- 1 eine Kupferplatte,
5 einen Kühlkanal,
6 eine Polytetrafluorethylen-Folie zur elektrischen Isolation,
7 eine das Gel tragende Folie,
8 das Gel,
9 einen Flüssigkeitsfilm zwischen Gel und Abdeckfolie,
10 eine Abdeckfolie,
11 eine auf der Abdeckfolie liegende Glasplatte,
12 eine Glasplatte zum Anpressen der Elektrodenkontakttücher,
13 Elektrodenkontakttücher,
14 Polyethylenfolie um die Elektrodenkontakttücher,
15 Elektrodenpufferbecken
16 eine Elektrode und
17 eine Geltasche.
Zur Durchführung der Temperaturgradienten-Gelelektro
phorese wird das Gel horizontal auf die Thermostati
sierplatte gemäß Fig. 1 gelegt. Das elektrische Feld
im Gel wird über zwei Filterpapiere oder Schwammtücher
hergestellt, die in puffergefüllte Elektrodenkammern
führen. Anstelle der für horizontale Elektrophoresen
handelsüblichen Filterpapiere haben sich auch in de
stilliertem Wasser ausgekochte Haushaltsschwammtücher
gut bewährt, da sie eine größere Saugfähigkeit und nach
dem Autoklavieren geringere mikrobiologische Verunrei
nigungen zeigen.
Die Thermostatisierplatte besteht beispielsweise aus
zwei quaderförmigen Kupferblöcken mit quadratischem
Querschnitt (210 mm×30 mm×30 mm) und einer zentra
len zylindrischen Bohrung von 15 mm Durchmesser. Sie
werden an den gegenüberliegenden Seiten einer Stirnflä
che einer 210 mm×190 mm×5 mm großen Kupferplatte
angelötet. An die Enden der zylindrischen Bohrung wer
den Messingoliven angebracht, an die die Zu- und Abfüh
rungen zweier Wasserthermostaten angeschlossen werden.
Die untere Grenze des Temperaturgradienten (T 1) wird
durch einen kühlbaren Julabo F 20-HC Thermostaten und
die obere Grenze (T 2) durch einen Haake F 3 Thermostaten
hergestellt. Nach Anschluß der Thermostaten an die Ther
mostatisierplatte stellt sich innerhalb von wenigen
Minuten ein konstanter Temperaturgradient ein. Der Tem
peraturgradient zwischen Einlaß und Auslaß der Kupfer
blöcke betrug weniger als 0,5°C. Die mit der Apparatur
maximal einstellbare Temperaturdifferenz betrug 70°C.
Messungen der Temperatur oberhalb und unterhalb des
Gels ergaben maximale Abweichungen von 1°C. Die Elek
trophorese wurde zunächst bei T 1=T 2=10°C und einer
Spannung von 100 V begonnen und wieder gestoppt, nach
dem an der zurückgelegten Laufstrecke abgeschätzt wer
den konnte, daß die zu untersuchende Probe vollständig
in die Gelmatrix eingedrungen war. Es wurde dann die
Spannung abgeschaltet, das Gel einschließlich der Auf
tragstasche mit Elektrodenpuffer überschichtet und mit
der hydrophilen Seite einer Gelbondfolie luftblasenfrei
abgedeckt. Diese Maßnahme und das Überziehen der in die
puffergefüllten Elektrodengefäße führenden Schwammtü
cher mit handelsüblicher Haushaltsfolie hat sich als
wirksamer Schutz gegen Austrocknung erwiesen. Auf die
Abdeckfolie wurden zur thermischen Isolation des Gels
noch zwei 5 mm dicke Glasplatten gelegt, durch die man
die Bewegung der Farbstoffindikatoren im Gel verfolgen
kann. Dann wird der Temperaturgradient erzeugt, indem
die Heizung und Kühlung eingestellt werden. In weniger
als 5 Minuten hat sich auf der Thermostatisierplatte
und im Gel ein linearer Gradient eingestellt. Um eine
vollständige Gleichgewichtseinstellung der Konformation
der zu untersuchenden Proben zu gewährleisten, wurde
vorsichtshalber weitere 10 Minuten equilibriert. Diese
Zeitdauer der Equilibrierung ist ein Kompromiß zwischen
möglichst vollständiger Equilibrierung der zu untersu
chenden Probe und einer möglichst geringen Diffusion
der Probe in der Gelmatrix. Danach wird in einem drit
ten Schritt die Elektrophorese eingeschaltet bei einer
Spannung von 300 V. Abgeschaltet wird, wenn im Indika
tor zu erkennen ist, daß die Probe nahezu am anderen
Ende der Gelplatte angelangt ist.
Das Verfahren wurde inzwischen erfolgreich angewendet
für den Nachweis und die Unterscheidung von Viroiden,
die Diagnose von Viren, die doppelsträngige oder zirku
läre Nukleinsäure enthalten, sowie den Nachweis und die
Charakterisierung verschiedener Stämme, beispielsweise
vom Rotavirus.
Weiterhin war es möglich, die symptomregulierenden Sa
telliten-RNAs am Beispiel des Gurkenmosaikvirus und des
Erdnußstauchevirus experimentell zu belegen und eindeu
tig zwischen symptomverstärkenden und symptomabschwä
chenden Satelliten-RNAs zu unterscheiden. Schließlich
ist es gelungen, Protein-Nukleinsäure-Komplexe zu ana
lysieren und in einem Beispiel experimentell zu bele
gen, daß durch eine Mutation in einer regulatorischen
Sequenz eine einfach zu analysierende Fehlfunktion
feststellbar war. Die Methode ist daher auch geeignet,
Mutationen in Proteinen zu analysieren. Es konnten Mu
tanten analysiert werden, die sich nur geringfügig in
ihrer Nuklotialsequenz unterscheiden. Eine solche Ana
lyse war bisher nur mit dem aufwendigen Harnstoffgradi
enten-Verfahren möglich.
Claims (11)
1. Verfahren zur Herstellung eines regelbaren und reprodu
zierbaren Temperaturgradienten in einer vorgegebenen
Richtung von wärmeleitenden Platten für die Auftrennung
von Stoffgemischen in flächigen Trennmedien, dadurch
gekennzeichnet, daß eine Kante der Platte mittels einer
oder mehrerer regelbarer Heizvorrichtungen erwärmt und
die gegenüberliegende Kante der Platte mittels einer
oder mehrerer regelbarer Kühlvorrichtungen gekühlt
wird, wobei der Energiefluß der Heizvorrichtung(en)
einerseits und der Kühlvorrichtung(en) andererseits
größer ist als der Energiefluß durch die Platte.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichent, daß
sowohl die Erwärmung der einen Kante als auch die Küh
lung der gegenüberliegenden Kante mit Hilfe von thermo
statisierten Flüssigkeitsbädern erfolgt.
3. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Erwärmung der einen Kante mit Hilfe
einer elektrischen Heizung erfolgt.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß als flächiges Trennmedium für Stoff
gemische Gelplatten für die Elektrophorese verwendet
werden.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß als flächiges Trennmedium für Stoff
gemische Chromatographieplatten verwendet werden.
6. Vorrichtung zur Herstellung eines regelbaren und repro
duzierbaren Temperaturgradienten in einer vorgegebenen
Richtung von wärmeleitenden Platten für die Auftrennung
von Stoffgemischen in flächigen Trennmedien, bestehend
aus der wärmeleitenden Platte (1), einer oder mehrerer
regelbarer Heizvorrichtungen (4) an der Kante (2) und
einer oder mehrerer regelbarer Kühlvorrichtungen (5) an
der gegenüberliegenden Kante (3), wobei sowohl die Heiz
vorrichtung(en) (4) als auch die Kühlvorrichtung(en)
(5) so dimensioniert sind, daß der Energiefluß größer
ist als der Energiefluß durch die Platte (1).
7. Vorrichtung gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß sowohl die Heizvorrichtung (4) als auch die Kühlvor
richtung (5) aus thermostatisierten Flüssigkeitsbädern
bestehen.
8. Vorrichtung gemäß Ansprüchen 6 oder 7, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Heizvorrichtung einen elektrischen
Heizdraht oder Peltier-Elemente enthält.
9. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch
gekennzeichnet, daß sie dimensionsmäßig adaptiert ist
für kommerzielle Gelelektrophorese-Geräte.
10. Verwendung einer Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche
6 bis 9 zur Auftrennung von Stoffgemischen, in denen
mindestens eine Komponente im Temperaturbereich des
Temperaturgradienten eine thermische Umwandlung er
fährt.
11. Verwendung einer Vorrichtung gemäß Anspruch 10 zum
Nachweis und zur Unterscheidung von Viroiden, viralen
Nukleinsäuren, Satelliten-RNAs, zur Analyse von Mutati
onen in Nukleinsäuren, zur Analyse von Mutationen in
Proteinen und zur Analyse von Protein-Nukleinsäure-Kom
plexen.
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