DE3587685T2

DE3587685T2 - Dialysierzelle.

Info

Publication number: DE3587685T2
Application number: DE3587685T
Authority: DE
Inventors: Jerald C Nelson
Original assignee: Individual
Current assignee: NICHOLS INSTITUTE DIAGNOSTICS SAN JUAN CAPISTRANO
Priority date: 1984-07-05
Filing date: 1985-07-04
Publication date: 1994-07-14
Anticipated expiration: 2005-07-05
Also published as: DK309785A; ATE98770T1; EP0170098B1; PT80778B; EP0170098A2; PT80778A; DK167415B1; EP0170098A3; JPS6186904A; IE851707L; JPH0661430B2; DE3587685D1; DK309785D0; GR851646B; IE61606B1

Description

Die Erfindung betrifft eine Dialysezelle. Insbesondere betrifft die Erfindung eine wegwerfbare Zelle oder Einmalgebrauchszelle, die wirtschaftlich herzustellen und leicht anwendbar ist.
Während der letzten zehn Jahre hat es Bemühungen gegeben, für klinische Laboratorien und klinische Forschungslaboratorien ein Verfahren zur Abschätzung freier Hormonkonzentrationen ohne deren indirekte Messung zu entwickeln. Die Gleichgewichtsdialyse wird als das beste Verfahren zur Trennung eines proteingebundenen Liganden von einem freien Liganden angesehen und wird besonders im Schilddrüsenbereich eingesetzt, wo jodierte Tracer verwendet werden. Sie wird jedoch als unhandliches, schwer ausführbares Verfahren betrachtet, das gänzlich außerhalb des Tätigkeitsfeldes der routinemäßigen klinischen Chemie liegt.
Dazu haben zwei Faktoren beigetragen. Einer davon ist, daß die Art und Weise der Messung der dialysierbaren Fraktion von Thyroxin, die eine Gleichgewichtsdialyse von Serum erfordert, dem eine Tracermenge von mit Radiojod markiertem Thyroxin zugesetzt wurde, mit einem geheimnisvollen Nimbus umgeben ist. Dieser Nimbus ist zum Teil auf eine nicht vollständig verstandene Dejodierung des Thyroxins zurückzuführen, die unmittelbar nach seiner Herstellung auftritt. Wenn ein Labor mit Radiojod markiertes Thyroxin von einem Unternehmen kaufen müßte, das Radionuklide verkauft, dann wäre das Produkt bei der Ankunft der Sendung im Labor mit Radiojodiden und einigen mit Radiojod markierten Thyroxinen verunreinigt. Es sind Verfahren verfügbar, um dieses Material unmittelbar vor seiner Verwendung nochmals zu reinigen, jedoch während der Inkubation (die zum Erreichen des Gleichgewichts notwendig ist), tritt eine weitere Dejodierung auf, so daß die Radioaktivität des Dialysats stets aus mindestens zwei Molekülspezies besteht: aus Radiojodid, das während der Dialyse-Inkubation entstanden sein kann, und dem mit Radiojod markierten Thyroxin. Das Verhältnis der einen Molekülspezies zur anderen variiert in Abhängigkeit vom klinischen Zustand des Patienten, dem das Serum entnommen wurde.
Im Hinblick auf die Dialyse selbst ist aus veröffentlichte Untersuchungen zu erkennen, daß es wichtig ist, die chemische Zusammensetzung des Serums während der Dialyse auf einer physiologischen Konstante zu halten. In der Bemühung, um dieses Jodidverunreinigungsproblem herumzukommen, und weil in Serumproteinen kein Jodid vorkommt, werden in fast allen chemischen Zusammensetzungen für die Dialyse, die bisher für die Messung von freien Hormonen einschließlich Thyroxin entwickelt wurden, einfache Puffer verwendet, die das Ionenmilieu der Serumproteine extrem verzerren und die Serumproteine verdünnen. Im Ergebnis läßt sich keine genaue Messung beispielsweise der dialysierbaren freien Thyroxinfraktion unter Verwendung unverdünnter Serumproben ausführen, wenn nicht ein großes Dialysatvolumen verwendet wird, um das Jodid herauszuverdünnen.
Standardverfahren für die Messung von freiem Thyroxin in Serum erfordern eine Dialyse zum Abtrennen der freien Form von der proteingebundenen Form. Die Aufteilung von Thyroxin zwischen der freien und der gebundenen Form wird abgeschätzt, indem der Probe vor der Dialyse mit Radiojod markiertes Thyroxin zugesetzt wird. Die Dialyse wird unter Verwendung einer verdünnten Serumprobe und/oder eines großen Dialysatvolumenüberschusses ausgeführt, um die pH-Kontrolle (die eine starke Auswirkung auf die T&sub4;-Bindung an Serumproteine hat) zu unterstützen und zur Minimierung der Wirkung von verunreinigendem Jodid beizutragen, die eine große methodische Schwierigkeit darstellt. Direkte Radioimmunoassays (RIA) von T&sub4; in Serumdialysaten, die den durch den Tracer T&sub4; verursachten, durch spontane Dejodierung und Radiojodid-Verunreinigung des Tracers T&sub4; entstandenen Artefakt vermeiden sollten, sind bereits früher beschrieben worden.
Es ist jetzt entdeckt worden, daß die Dejodierungsgeschwindigkeit des Tracers T&sub4; während der Gleichgewichtsdialyse-Inkubation für verschiedene Seren unterschiedlich ist und daß die Radiojodid-Verunreinigung des Tracers T&sub4; in den Dialysaten verschiedener Seren unterschiedlich ist. Außerdem hat man festgestellt, daß die Wirkung der Verdünnung von Serumproteinen auf Seren von verschiedenen klinischen Erkrankungen unterschiedlich ist.
Offenbar wäre es wünschenswert, freie T&sub4;-Konzentrationen nach einem Verfahren zu messen, welches das endogene Milieu so wenig wie möglich verzerrt. Bei einem solchen Verfahren würde man eine direkte Messung des freien T&sub4; durch Radioimmunoassay verwenden und den Zusatz von mit Radiojod markierten T&sub4;-Tracern vermeiden. Ferner würde man dabei die Serumprobe so wenig wie möglich verdünnen, einen Puffer verwenden, der einem Ultrafiltrat des Serums so ähnlich wie möglich ist, und die Dialyseprozedur nicht nur bei physiologischen Temperaturen, sondern auch in einem Gasmilieu ausführen, das die physiologische in-vivo-Situation nachahmt.
Die erfindungsgemäße Dialysezelle ist so konstruiert, daß sie diese Aufgabe löst, indem sie die Dialyse eines kleinen Puffervolumens gegenüber einem großen Volumen der Serumprobe in einer Atmosphäre ermöglicht, die physiologische Konzentrationen von Blutgasen enthält. Bei Beendigung der Dialyse kann die Dialysatprobe zur quantitativen Radioimmunoassay-Bestimmung volumetrisch aus der Dialysezelle in die RIA-Röhre pipettiert werden, und die Dialysezelle kann weggeworfen werden.
Die folgenden Literaturstellen enthalten Offenbarungen in bezug auf Dialysezellen: Helenius, T. und Liewendahl, K., "Improved Dialysis Method for Free Thyroxin in Serum Compared with Five Commercial Radioimmunoassays in Nonthyroidal Illness and Subjects with Abnormal Concentrations of Thyroxin-Binding Globulin" (Verbessertes Dialyseverfahren für freies Thyroxin in Serum im Vergleich zu fünf kommerziellen Radioimmunoassays bei nichtthyreoidaler Erkrankung und Versuchspersonen mit anomalen Konzentrationen von thyroxinbindendem Globulin), Clinical Chemistry, Bd. 29, Nr. 5 (1983), S. 816-822; Lee, N.D. und Pileggi, V.J., "Measurement of "Free" Thyroxin in Serum" (Messung von "freiem" Thyroxin in Serum), Clinical Chemistry, Bd. 17, Nr. 3 (1971) S. 166-173; sowie Elkins, R.P. und Ellis, S.M., "The Radioimmunoassay of Free Thyroid Hormones in Serum" (Radioimmunoassay von freien Schilddrüsenhormonen in Serum), (Excerpta Medica, 7th International Thyroid Conference, Abstract Nr. 158 (1976), S. 597-600; Weeke, J., & Orskov, J., Recent Advances in Clinical Biochemistry (Churchill-Livingston: Edinburgh, New York (1978)), S. 111-128; US-PS-4 077 875, erteilt an Kremer am 7. März 1978.
Die von Helenius u. a. beschriebene Dialysezelle weist statt einer inneren und einer äußeren Kammer eine obere und eine untere Kammer auf. Beim Zusammenbau dieser Zelle würde Luft, die u. U. in der unteren Kammer eingeschlossen ist, zur Membran aufsteigen und die Diffusion dialysierbarer Substanzen stören. Für den Zusammenbau der Zelle nach Helenius u. a. sind ein Gummiring zur Befestigung der Membran an der oberen Kammer sowie eine Aluminiumklemmvorrichtung mit zwei Schrauben erforderlich, um die obere und die untere Kammer dichtschließend zusammenzuhalten. Diese Zelle ist nicht wegwerfbar und muß vor der Wiederverwendung ausgewaschen und gründlich gespült werden.
Die Zelle nach Ekins u. a. besteht aus einer oberen Kammer und einer unteren Kammer, die das Problem eingeschlossener Luft unterhalb der Dialysemembran aufwirft, welche die Dialyse behindern würde. Bei der Zelle nach Ekins u. a. wird die untere Kammer mit Dialysat gefüllt; dann wird eine Membran über die untere Kammer gespannt und von einer Zwischeneinheit, welche die Serumprobe enthält, in die untere Kammer hineingedrückt. Diese Zwischeneinheit wird ihrerseits durch einen Deckel mit Schraubkappe abgedeckt, der die gesamte Kammer verschließt. Diese Zelle ist nicht für den Gasaustausch zur umgebenden Luft hin offen, sie ist schwieriger zusammenzusetzen und besteht nicht aus wegwerfbarem Material.
Die Zelle nach Lee u. a. findet gegenwärtig breite Anwendung in der Gleichgewichtsdialyse. Sie besteht aus zwei Akrylkunststoffhälften, deren jede einen ausgeschnittenen Hohlraum von passender Größe sowie Bohrungen aufweist, durch die Bolzen eingesetzt werden können, um jede Hälfte mit der anderen zu verbinden. Zwischen die Hälften wird eine Dialysemembran eingelegt, die Bolzen und Muttern werden festgezogen (dieser Schritt ist kritisch, da eine Undichtigkeit zu Fehlern führt), und die Probe wird durch eine enge Öffnung an einer Seite eingeführt, während der Puffer durch eine ähnliche Öffnung an der anderen Seite eingeführt wird. Diese Kammer ist teuer und nicht wegwerfbar. Sie erfordert einen erheblichen Arbeitsaufwand für das Auswaschen und die Vorbereitung der Kammer vor der Verwendung und zwischen einzelnen Analysen. Ferner sind die Öffnungen zu klein, um die Einstellung eines Gleichgewichts mit den umgebenden Gasen oder eine Probenahme mit gewöhnlichen quantitativen Handpipettiergeräten zu ermöglichen.
Die von Weeke u. a. dargestellte Dialysezelle besteht aus einer Dialyseröhre, die in einem Reagenzglas fixiert ist, wobei ein Stöpsel auf dem Reagenzglas die Röhre hält und ihre beiden Enden verschließt. Dadurch entstehen eine innere und eine äußere Kammer, die aber beide gegen die umgebende Atmosphäre abgeschlossen bleiben, wobei die Probenahme bei der inneren Kammer schwierig wird. Außerdem ist für die Handhabung der nasse Dialyseröhre, das verlustlose Einfüllen einer Probe oder eines Puffers in die Röhre und das Verschließen beider Enden nach dem Einhängen der Röhre in das Reagenzglas und für das Einfüllen des Reagenzglasinhalts um die Röhre herum ein erhebliches Maß an Handfertigkeit und Geschick erforderlich.
Die US-A-4 077 875, die als Ausgangspunkt für Anspruch 1 aufgefaßt wird, offenbart eine Ultrafiltrationsvorrichtung, in der eine äußere und eine innere Buchse, eine Membran und ein Verdrängungskörper in einem Behälter angeordnet sind. Die Membran wird an ihrem offenen Ende zwischen einem leicht konischen Innenverbinder der äußeren Buchse und einem Außenverbinder der inneren Buchse eingelegt. Der Verdrängungskörper erstreckt sich in einen Membranbeutel hinein und sorgt so auch bei geringem Fluidvolumen für einen guten Fluidkontakt mit dem größten Teil der Membranoberfläche. Die Vorrichtung weist keine speziellen Einrichtungen zum Abdichten der Membran auf.
Die Zelle nach Kremer ist so konstruiert, daß der Inhalt der inneren Kammer in einer dünnen Schicht an der Dialysemembran ausgebreitet wird, indem der größte Teil dieser Kammer mit festem Material (Verdrängungskörper) gefüllt wird. Die Einrichtung ist nicht wegwerfbar und kompliziert zusammenzusetzen, auseinanderzunehmen, auszuwaschen und zur Wiederverwendung vorzubereiten.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Dialysezelle zu schaffen, die herstellbar, einfach und billig ist und den Transport einer Flüssigkeit, außer durch die Dialysemembran, wirksam verhindert.
Erfindungsgemäß wird eine Dialysezelle mit den Merkmalen gemäß Anspruch 1 geschaffen. Weitere Ausführungsbeispiele der Erfindung werden in den abhängigen Ansprüchen 2 bis 5 definiert, während Anspruch 6 die Anwendung einer erfindungsgemäßen Dialysezelle in Kombination mit einer Pufferzusammensetzung für die Serumdialyse definiert.
Die erfindungsgemäße Dialysezelle wird nachstehend unter Bezugnahme auf Fig. 1 näher erläutert, die eine Querschnittsdarstellung der erfindungsgemäßen Dialysezelle zeigt.
Wie dargestellt, weist die Zelle 100 eine Einmalgebrauchsampulle 102 und einen Membranzylinder auf, der allgemein mit 104 bezeichnet wird. Eine abnehmbare Kappe 106 wird im Schnappsitz auf den Membranzylinder 104 und auf die Ampulle 102 aufgesetzt.
Der Membranzylinder 104 weist einen äußeren Zylinder 110 mit einem konischen Seitenwandabschnitt 112 auf, der sich zu einem offenen Endabschnitt 114 verjüngt. Ein erstes Dichtungsglied 116 erstreckt sich von der Außenfläche des Zylinders 110 seitlich nach außen. Ein Vorsprung 118 erstreckt sich von der Innenwandfläche des Zylinders 110 nach innen; Zweck und Funktion des Vorsprungs 118 werden weiter unten ausführlicher beschrieben. Der Membranzylinder 104 weist ferner einen inneren Zylinder 120 mit einem konischen Wandabschnitt 122, der sich zu einem offenen Ende 124 verjüngt, sowie einen geraden Wandabschnitt 123 auf, der sich vom weitesten Teil des konischen Wandabschnitts 122 aus erstreckt. In der Außenwandfläche des inneren Zylinders 120 sind periphere Nuten 126 und 128 ausgebildet. Ein zweites Dichtungsglied 130 erstreckt sich von der Außenfläche des Zylinders 120 seitlich nach außen. Der gerade Seitenwandabschnitt 123 endet in einem offenen Endabschnitt 129.
Die Dichtungen 116 und 130 sind vorzugsweise von einem Typ, der von der V-Tech, Inc. aus Los Angeles, Kalifornien, unter der Bezeichnung "Click-Stick" vertrieben wird. Die Öffnung 124 in dem Zylinder 120 ist durch eine semipermeable Dialysemembran 140 verschlossen. Die Membran 140 wird vorzugsweise aus einem Polyzellulosematerial von bekanntem Typ hergestellt. Die Membran 140 wird über die Außenfläche zumindest eines Teils des konischen Wandabschnitts 122 gespannt. Die Membran erstreckt sich an der Seite der konischen Wand 122 so weit nach oben, daß sie in die Aussparung 128 hineingedrückt werden kann. Ein kompressibles O-Ring-Dichtungsglied 150 wird über der Membran 140 in die Nut 128 eingesetzt. Typischerweise sind Dialysemembranen verhältnismäßig steif, und es ist schwierig, mit ihnen eine fluiddichte Abdichtung herzustellen. Ein Zweck des kompressiblen O-Rings 150 besteht darin, sich an die sehr kleinen, in der Membran ausgebildeten Wülste und Rillen anzuschmiegen, wenn die Membran in die Nut 128 gepreßt wird. Durch das Anschmiegen an diese Mikrorillen und -wülste kann der O-Ring die Membran wirksam an die Wandflächen der Nut 128 anpressen, um eine fluiddichte Abdichtung herzustellen.
Die Zylinder 110 und 120 werden rund um die Membran 140 im Preßsitz übereinandergeschoben, um zwischen ihnen eine "Kegeldichtung" auszubilden. Um zu gewährleisten, daß die Zylinder fest miteinander verriegelt bleiben, sitzt der Vorsprung 118 in der Nut 126, um eine Schnappsitzarretierung zu bilden, welche die Zylinder 110 und 120 aneinander festhält. Das Zusammenfügen der Zylinder 110 und 120 im Preßsitz bewirkt außerdem ein weiteres Zusammendrücken des O-Rings 150. Die Innenwandfläche 113 des Zylinders 110 drückt gegen den O-Ring 150 und preßt ihn in die Nut 128, wobei die Druckkräfte des O-Rings verstärkt werden, die auf den Abschnitt der Membran 140 in der Nut 128 wirken.
Die Ampulle 102 vervollständigt die Grundkonstruktion der Dialysezelle. Die Ampulle und die Zylinder 110, 120 werden vorzugsweise aus chemisch verträglichen, inerten Kunststoffmaterialien hergestellt, die vorzugsweise durchsichtig sind. Die Ampulle 102 ist am oberen Ende offen und besitzt in dem dargestellten Ausführungsbeispiel einen Boden 162, der zusammen mit einer Wand 164 eine Kammer abgrenzt, in welche die verriegelten Zylinder 110, 120 eingesetzt werden können. Ein sich nach unten erstreckender Abschnitt 166 der Wand 164 dient als Fuß für die Zelle.
Wenn der Membranzylinder 104 in die Ampulle 102 eingesetzt ist, liegen die Dichtungen 116 und 130 an der Innenfläche der Ampullenwand 164 an. Die Dichtung 130 wirkt vor allem als Stabilisierungsglied für den Membranzylinder, besonders wenn die Kappe 106 abgenommen ist, wie weiter unten ausführlicher diskutiert wird. Die Dichtung 116 begrenzt zusammen mit der Ampullenbodenwand 162 und der Membran 140 eine erste (äußere) Kammer 170. Eine zweite (innere) Kammer 172 wird innerhalb des Membranzylinders 104 durch die Innenfläche der Zylinderwände 122 und die Membran 140 begrenzt. Die Kammer 172 kann entweder zur umgebenden Atmosphäre hin offen oder, wie in Fig. 1 gezeigt, mit der Kappe 106 abgedeckt sein. Die Kappe 106 weist, wie dargestellt, eine Rippe 182 auf, die in einem Raum 184 zwischen den Wänden der Ampulle 102 und des Membranzylinders 104 sitzt. Die Rippe 182 ist so bemessen, daß sie dichtschließend an dem Zylinderwandabschnitt 123 und fest (aber nicht notwendigerweise dichtschließend) an der Ampullenwand 164 anliegt.
Vor Gebrauch wird die Dialysezelle zusammengesetzt, indem zunächst die Membran 140 vorgewaschen und dann der Membranzylinder 104, wie oben beschrieben, zusammengesetzt wird. Die Ampulle 102 wird dann teilweise mit einer vorgegebenen Menge Dialysepuffer gefüllt. Der Membranzylinder 104 wird in die Ampulle eingesetzt, so daß die Dichtung 116 in Funktion tritt und den Dialysepuffer in der Kammer 170 einschließt. Dann kann die gesamte Einheit mit der Kappe 106 verschlossen und vormontiert und gebrauchsfertig versandt werden.
Um mit der Dialyse zu beginnen, kann der Anwender eine Serumprobe durch eine X-Schlitzöffnung in der Kappe 106 in die Kammer 172 pipettieren. Um die Dialyse zu beenden, entfernt der Anwender gewöhnlich die Kappe mit dem daran befestigten Membranzylinder von der Ampulle 102.
Wie oben bemerkt, sitzt die Kappe 106 im Preßsitz über dem offenen Ende 129 des Membranzylinders 104. Die Dialysezelle ist so konstruiert, daß beim Abnehmen der Kappe, z. B. nach Abschluß der Dialyse, der Membranzylinder an der Kappe befestigt bleibt, um aus der Ampulle 102 entfernt zu werden. Anschließend kann die Kappe vom Membranzylinder abgenommen und wieder auf die Ampulle aufgesetzt werden, um die Lagerung und den Versand der Dialysatprobe zu ermöglichen. Der Deckel der Kappe 106 enthält vorteilhafterweise eine selbstschließende X-Schlitzöffnung, um die Zugabe oder Entnahme von Fluid, z. B. von Serum, mit einem normalen Pipettiergerät in die bzw. aus der Kammer 172 zu ermöglichen, ohne dazu die Kappe 106 abzunehmen. Die Standardkappe mit geschlossenem Deckel kann gegen eine Schnappkappe mit einer offenen Öffnung im Deckel ausgewechselt werden. Die offene Öffnung gestattet eine kontrollierte Verdunstungsgeschwindigkeit des Serums in der oberen Kammer während der Dialyse-Inkubation. Um das Gleichgewicht zwischen Wasserverlust durch Verdunstung und Wasseraufnahme durch Osmose aufrechtzuerhalten, muß die Größe der Öffnung der Dauer und der Temperatur der Dialyse-Inkubation angepaßt werden. Dies ermöglicht eine Dialyse der Serumprobe in der Kammer 172 ohne Verdünnung.
In einem Beispiel hatte die offene Öffnung in der Kappe einen Durchmesser von 1,0 cm. Die Gesamthöhe der Kammer 172 betrug 35 mm. Die Dialyse wurde an einer Serumprobe von 0,6 ml bei Raumtemperatur 18-20 Stunden lang ausgeführt. Es zeigte sich, daß das Dialysat eine vernachlässigbare Menge osmotisch aktiver Proteine enthielt.
Ein weiteres Merkmal der Erfindung, wie sie in Fig. 1 dargestellt wird, ist die Verwendung magnetischer Rührperlen 186 in der Kammer 170. Die Rührperlen können während des Zusammenbaus in die Zelle 100 eingebracht werden. Während der Dialyse kann die Zelle auf einer Magnetrühreinheit oder einer mechanischen Schütteleinheit montiert werden, um zu bewirken, daß die Perlen das in der Kammer 170 enthaltene Fluid umrühren. In Vorversuchen unter Verwendung von Glukose verkürzte sich durch das Rühren die Zeit bis zum Erreichen des Diffusionsgleichgewichts von 16 Stunden auf 2 Stunden.
Einer der Vorteile der Baugruppe nach Fig. 1 ist, daß die Membran 140 vor dem Zusammensetzen vorgewaschen und dann naß transportiert und gelagert werden kann. Dialysemembranen müssen bekanntlich vor dem Gebrauch gewaschen werden. Durch ihre Polyzellulosestruktur werden sie jedoch beim Trocknen rissig und undicht. Daher müssen sie naß transportiert und gelagert werden. Dadurch, daß die Zelle mit eingefülltem Dialysepuffer vormontiert werden kann, gestattet die vorliegende Erfindung eine nasse Lagerung der Membran und verhindert so die Rißbildung und die Undichtigkeit, die andernfalls auftreten würden.
Ein weiteres Merkmal ist, daß der O-Ring 150 in der maskierten Nut 128 "verborgen" ist, um einen Kontakt zwischen dem O-Ring-Material und der Serumprobe zu verhindern. Es hat sich gezeigt, daß bestimmte O-Ring-Materialien das Proteinbindungsgleichgewicht in Seren stören. Die vorliegende Konstruktion verhindert diese Störung, welche die Ergebnisse und damit eine auf den Dialyseergebnissen beruhende Diagnose nachteilig verändern kann.
Die oben beschriebene Dialysezelle ist leicht anwendbar und kann nach Gebrauch ohne weiteres weggeworfen werden. Das einzigartige Dichtungssystem hält die Dialysemembran fest und verhindert eine Undichtigkeit zwischen den Kammern. Das Ausmaß der osmotischen Wasseraufnahme wird durch Kontrolle der Membranfläche gesteuert. Außerdem kann ein Gleichgewicht zwischen dem Wasserverlust durch Verdunstung aus der Kammer 172 und der osmotischen Wasseraufnahme durch die Membran 140 hergestellt werden.
Zu den Merkmalen der Erfindung, die vom Hersteller und/oder dem Anwender zu berücksichtigen sind, gehören die Porengröße der Dialysemembran, das Verhältnis Dialysemembranfläche/Volumen der inneren Kammer (zur Optimierung des Diffusionsgleichgewichts), die Verwendung von Materialien, die keine für die Analyseverfahren "giftigen" Substanzen freisetzen und auch keine freien Liganden binden, sowie ein bequemer Zugang durch den Deckel mit Handpipettiergeräten.
Gegenwärtig bekannte und verwendete Dialysezellen oder -kammern werden alle aus verhältnismäßig teuren Materialien hergestellt. Sie müssen alle vor dem Gebrauch zusammengesetzt und nach dem Gebrauch auseinandergenommen werden, worauf ein neues, sauberes Membranstück eingelegt und die Zelle wieder zusammengesetzt und dann wiederverwendet wird. Dies ist äußerst arbeitsaufwendig und ist ein Hauptgrund dafür, weshalb gewöhnliche klinische Laboratorien eine solche Dialyse nicht durchführen wollen. Sie sind nicht bereit, die für die Dialyse notwendigen Handarbeiten auszuführen und sich mit den Extravaganzen der Tracerzersetzung und der Dialysechemie zu befassen. Außerdem ermöglichen die vorhandenen Dialysezellen während des Ablaufs der Dialyse und beim Abschluß der Dialyse zwar den Zugang entweder zur Serumkammer oder zur Pufferkammer, haben aber keine so großen Öffnungen, daß sich ein Gasgleichgewicht zwischen der Umgebung und dem Serum sowie dem Dialysat herstellen läßt. Dies bedeutet, daß der Körpermechanismus zur Kontrolle des pH-Werts mit einem Bikarbonatpuffer, d. h. mit Hilfe des Kohlendioxiddrucks in der Atmosphäre, nicht anwendbar ist.
Die vorliegende Erfindung weist mehrere Vorteile gegenüber bekannten Dialysezellen auf. Erstens wird eine Dialysezelle für einmaligen Gebrauch geschaffen. Die Teile lassen sich leicht herstellen und zusammensetzen.
Zweitens kann ein Ende der Dialysekammer durch eine genügend große Öffnung zur Atmosphäre hin offen gelassen werden, so daß erstmals eine CO&sub2;-Umgebung unter Anwendung eines Dialysatpuffers, der die gleiche Ionenzusammensetzung wie Serumwasser aufweist, zur Einstellung physiologischer pH-Werte verwendet werden kann. Als Alternative kann ein nichtphysiologischer Puffer verwendet werden, der Serum-CO&sub2; entweichen läßt. Wenn der Test unter Verwendung eines nichtphysiologischen Puffers in Zimmerluft ausgeführt wird, muß ein Puffer verwendet werden, der das gesamte endogene Bikarbonat in Kohlensäure umwandelt, und dann muß die Kohlensäure in die Umgebung entweichen können, um den pH-Wert wieder auf 7,4 zu bringen. Unverdünntes Serum kann nicht verwendet werden, wenn keine Gelegenheit zur Einstellung eines Gasgleichgewichts mit der Umgebung besteht, entweder für das gelöste CO&sub2;, das im physiologischen Zustand durch Säureneutralisierung mit Bikarbonat entsteht, oder durch atmosphärisches CO&sub2;, das im physiologischen Zustand in das Serum eintritt. Bei der Entnahme von Serum aus dem Körper entweicht das gelöste CO&sub2; in die Luft; das längere Zeit im Labor gelagerte Serum hat einen pH-Wert von 8,5 bis 9, was zu einer radikalen pH-Wert-Änderung der Bindung von Hormonen an Serumproteine führt. Solche pH-Werte sind für die Gleichgewichtsdialyse zur Messung von freien Hormonen nicht akzeptabel. Früher wurde dieses Problem überwunden, indem die Serummenge in einem Verhältnis von etwa 1 zu 10 bis 1 zu 150 mit einer Pufferlösung verdünnt und dann gegen ein annähernd äquivalentes bis um 20 Mol größeres Volumen im Dialysat dialysiert. Bei solchen Serumverdünnungen wird die Frage des Gasaustausches wirklich rein akademisch. Bei der vorliegenden Erfindung wird die Notwendigkeit einer Verdünnung des Serums überhaupt vermieden.
Ein weiteres Merkmal der Erfindung liegt darin, daß sie effektiv mit der Serumprobe entweder in der inneren oder der äußeren Kammer und mit der Pufferlösung oder dem Dialysat in der jeweils anderen Kammer genutzt werden kann. Bei bekannten, in Gebrauch befindlichen Dialysezellen ist die Funktion darauf beschränkt, daß die Serumprobe in die innere Kammer (entspricht dem Dialysebeutel der vorliegenden Erfindung) und die Pufferlösung oder das Dialysat in die äußere Kammer (vergleichbar mit der Ampulle) eingebracht werden.
Wenn ein Patient ein Medikament eingenommen hat, das die Bindung von Hormonen an Proteine hemmt, kann die Serumprobe verdünnt werden. Die Verdünnung der Serumprobe vermindert die Konzentration des Hemmstoffs, wodurch sich wiederum die Kinetik der Moleküle verändert, die sich an Serumproteine binden, z. B. von T&sub4;. Jede Dialyse ist wegen des onkotischen, osmotischen Drucks der Serumproteine natürlicherweise mit einem gewissen Wassertransport von der Pufferseite zur Serumseite verbunden. Eine Möglichkeit zur Minimierung des Wassertransports besteht darin, daß man ein großes Serumvolumen verwendet und das Dialysatvolumen auf zweckmäßige Weise klein hält. Eine durch die Zelle nach Fig. 1 gegebene Möglichkeit zur Vermeidung des Wassertransportproblems besteht darin, für die Einstellung eines Gleichgewichts zwischen der Wasserverdunstung aus der Serumprobe und der Wasserosmose aus dem Puffer durch die Membran in die Serumprobe zu sorgen.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß die dialysierte Pufferlösung aus der Dialysezelle ohne Störung des Serums entnommen werden kann. Dann kann eine direkte Radioimmunoassay-Analyse an dem dialysierten Puffer ausgeführt werden. Da dem System während der Dialyse kein Tracer zugesetzt wird, läßt sich dadurch die Tracerzersetzung vermeiden.
Die Erfindung kann in vielen Gleichgewichtsdialyse-Situationen zur Messung freier oder ungebundener Hormone, Medikamente, Neuropeptide, Elektrolyte, eines biologisch aktiven Moleküls, das in biologischen Fluiden an Proteine gebunden ist, oder allgemein für eine beliebige Molekültrennung angewendet werden, wenn man dialysierbare Moleküle (z. B. Salze) von nichtdialysierbaren (z. B. Makromolekülen, wie etwa Proteinen) trennen möchte.
Zu den Substanzen, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Zelle nachgewiesen werden können, gehören Thyroxin (Tetrajodthyronin), Tr&ijlig;odthyronin, Testosteron, Kortisol, Östradiol, bestimmte Krampfmittel wie Karbamazapin, Valproinsäure oder Phenytoin, oder Benzodiazepine wie z. B. Valium, Librium und dergleichen. Von besonderem Interesse ist die Bestimmung biologischer Substanzen, die an substanzbindende Proteine gebunden sind.
Es werden Puffer eingesetzt, die den pH-Wert zwischen 7,0 und 7,8 halten, am besten zwischen 7,2 und 7,6. Die Puffer sollten im allgemeinen Salze in normaler Serum-Ionenkonzentration, organische Säurepuffer, insbesondere organische Sulfonsäurepuffer, sowie Antibiotika aufweisen, die das Wachstum von grampositiven Kokken, gramnegativen Bakterien und von Pilzen hemmen können. Ein neutraler Träger, der die zu bestimmende biologische Substanz nicht binden kann, wie z. B. ein nicht T&sub4;-bindendes Immunoglobulin, am besten Kaninchen-IgG, sollte ebenfalls vorhanden sein, um Adsorptionsverluste zu verhindern. Eine Substanz mit hohem Molekulargewicht, die sich an Glas oder allgemein an die Wände der Dialysezelle, aber nicht an die zu bestimmende biologische Substanz binden kann, wie z. B. Gelatine, sollte zugesetzt werden, um eine nichtspezifische Adsorption der zu bestimmenden biologischen Substanz an den Wänden der Dialysezelle zu verhindern. Weitere Substanzen wie Harnstoff, Hydroxysäuren oder Aminosäuren, z. B. Milchsäure oder Glutaminsäure, können ebenfalls der Pufferzusammensetzung zugesetzt werden, um physiologische Serumprofile genauer widerzuspiegeln.
Zu den verwendbaren organischen Puffern gehören:
ACES (N-2-azetamido-2-aminoäthansulfonsäure);
ADA (N-2-azetamidoaminodiessigsäure);
Bizin (N,N-bis(2-hydroxyäthyl(glyzin)));
Bis-tris-propan (1,3-bis[tris(hydroxymethyl)methylamino]propan);
Diäthylmalonsäure;
Glyzinamid;
Glyzylglyzin;
HEPES (N-2-hydroxyäthylpiperazin-N¹-2-äthansulfonsäure);
HEPPS (N-2-hydroxyäthylpiperazin-N¹-3-propansulfonsäure);
Imidazol;
MOPS (3-(N-morpholino)propansulfonsäure);
PIPES (Piperazin(N-N¹-bis-2-äthansulfonsäure));
TES (2-[tris-(hydroxymethyl)methyl]aminoäthansulfonsäure);
Tetramethylammoniumhydroxid;
Trizin (N-[tris(hydroxymethyl)methyl]glyzin);
Triäthanolamin;
TRIS (Tris(hydroxymethyl)aminomethan).
Ein bevorzugter Puffer enthält Kalium-, Kalzium-, Magnesium- und Natriumionen in normalen physiologischen Serumkonzentrationen; Chlorid-, Phosphat- und Schwefelanionen in normalen physiologischen Serumkonzentrationen; eine der vorerwähnten organischen Puffermischungen in Konzentrationen, die unter den gewünschten Bedingungen in einem Bereich von 7,0 bis 7,8, am besten von 7,2 bis 7,6, zur Aufrechterhaltung einer beträchtlichen Pufferkapazität ausreichen; eine geeignete Mischung von Antibiotika, wie weiter oben beschrieben, in ausreichenden Konzentrationen, um das Wachstum unerwünschter Mikroorganismen weitgehend zu verhindern oder zu hemmen; Gelatine in ausreichender Konzentration, um die Wand der Dialysezelle zu bedecken und die Adsorption der zu messenden biologischen Substanz verhindern zu können; und einen zusätzlichen neutralen Proteinträger, wie z. B. Kaninchen-IgG, in ausreichender Konzentration, um erhebliche Adsorptionsverluste der zu bestimmenden Substanz an Wänden oder Membranen zu verhindern.
Spezifische Merkmale des Dialysezellen-Puffer-Systems zur Messung von serumfreiem Thyroxin (T&sub4;) sind die folgenden:

1. Kammervolumina:

Der T&sub4;-RIA (Radioimmunoassay) verwendet eine 500-ul-Probe. Die untere Kammer ist so ausgelegt, daß sie 2,4 ml Dialysat aufnehmen kann, und ermöglicht so eine doppelte Ausführung des RIA, wobei genügend Dialysat für eine Wiederholung des RIA bei problematischen Proben sowie Zugaben für Pipettierverluste und osmotische Verluste übrig bleiben. Die obere (Serum-) Kammer ist so ausgelegt, daß sie 0,6 ml Serum aufnehmen kann (siehe die nachstehende pH-Wert-Kontrolle).

2. pH-Wert-Kontrolle:

Die T&sub4;-Bindung ist pH-abhängig. Der pH-Wert muß im Bereich zwischen 7,2 und 7,6 gehalten werden. Für die pH-Wert-Kontrolle wurde HEPES-Puffer ausgewählt, da sein pKa-Wert bei 37ºC gleich 7,4 ist. Das HEPES-Anion verdrängt T&sub4; aus den Bindungsproteinen, wenn die Konzentration größer als etwa 60 mM ist. Zur Kontrolle des pH-Werts von Seren mit Azidose und Alkalose wird eine effektive HEPES-Konzentration von 240 mM benötigt. Um diese Gesamtpufferkapazität zu erreichen, ohne die Anionenkonzentration von 60 mM zu überschreiten, wurde ein Puffervolumen vorgesehen, das gleich dem Vierfachen des Serumvolumens war. Der HEPES-Puffer kann dann in einem 5 mal größeren Volumen als dem Serumvolumen allein verteilt werden (Serum = 1, Puffer = 4), wodurch sich die Serumkonzentration des HEPES-Anions auf 48 mM verringert und eine Störung der T&sub4;-Gleichgewichte durch das HEPES-Anion vermieden wird, während die erforderliche Pufferkapazität erhalten bleibt.

3. Membranfläche:

Es wurde experimentell festgestellt, daß die Verwendung einer kreisförmigen Membranfläche von 1 cm² die optimale Fläche liefert, welche die Einstellungszeit des Diffusionsgleichgewichts an die Einstellungszeit des Proteinbindungsgleichgewichts zu T&sub4; (16 Stunden) anpaßt, wenn die obere Kammer 0,6 ml Serum und die untere Kammer 2,4 ml Dialysat enthält und kein Rühren angewendet wird.

4. Proteinkonzentrationen im Dialysat:

Zur Minderung der Adsorptionsverluste muß das Dialysat Protein enthalten. Gelatine und Gammaglobulin binden T&sub4; nicht. Sie stören bei hohen Konzentrationen den Radioimmunoassay. Es wurde festgestellt, daß keines der beiden Proteine allein ausreichend war, die T&sub4;-Adsorption auszuschließen und gleichzeitig die Gelatine- und Gammaglobulin- Konzentrationen unter der störenden Höhe zu halten. Daher enthält der Dialysepuffer unter den Schwellwerten liegende Konzentrationen beider Proteine in einer Mischung, welche die T&sub4;-Adsorption an Kunststoffen und Membranen ausschließt.

5. Dialysat-Chemie

Außer dem HEPES-Puffer, Gelatine und Gammaglobulinen gehören zu den übrigen Bestandteilen des Dialysatpuffers die nichtproteinartigen Bestandteile des Serums mit Konzentrationen von 1 mM oder mehr, um ein faktisch physiologisches Milieu für die Dialysereaktion zu schaffen.

6. Antibiotika

UHR die Möglichkeit eines Bakterienwachstums während der Dialyse-Inkubation auszuschließen, wird eine Mischung aus Penizillin, Gentamyzin, Streptomyzin und Amphoterizin B verwendet. Die Konzentration jedes Bestandteils liegt unter der Schwellwertkonzentration, die zur Änderung des T&sub4;-Bindungsgleichgewichts erforderlich ist.
Ein optimierter Puffer für die T&sub4;-Messung ist:
NaCl : 5265 mg/l;
DL-Milchsäure : 1008 mg/l;
L-Glutaminsäure : 561 mg/l;
KCl : 224 mg/l;
KH&sub2;PO&sub4; : 180 mg/l;
CaCl&sub2;·2H&sub2;O : 275 mg/l;
MgSO&sub4;·7H&sub2;O : 246 mg/l;
Harnstoff : 300 mg/l;
Gelatine : 500 mg/l;
Kaninchen-IgG : 200 mg/l;
HEPES-Natriumsalz : 5891 mg/l;
HEPES-Säure : 6046 mg/l;
Penizillin : 100000 E/l
Streptomyzin : 100 mg/l
Amphoterizin : 250 ug/l; und
Gentamyzin : 100 mg/l.
Der Puffer wird vor Gebrauch in entionisiertem Wasser angesetzt.

Claims

1. Dialysezelle mit einer Ampulle (102) und einem Membranzylinder (104) als Einsatzstück, wobei der Membranzylinder (104) einen äußeren Zylinder (110) mit einem konisch geformten Wandabschnitt (112), der sich zu einem offenen Endabschnitt (114) verjüngt; einen inneren Zylinder (120) mit einem konisch geformten Abschnitt (122), der zu dem konisch geformten Abschnitt (112) des äußeren Zylinders (110) komplementär ist und sich zu einem offenen Ende (124) verjüngt, und einen geraden Wandabschnitt (123) aufweist, der sich vom weitesten Abschnitt des konisch geformten Abschnitts (122) zu einem offenen Endabschnitt (129) erstreckt; sowie einer Dialysemembran (140), die über der Außenfläche wenigstens eines Teils des konisch geformten Abschnitts (122) des inneren Zylinders (120) angeordnet ist und sich über das offene Ende (124) erstreckt und zwischen der Außen- bzw. Innenfläche der konisch geformten Abschnitte des inneren bzw. äußeren Zylinders (120 bzw. 110) eingeklemmt ist, wobei die Dialysemembran (140) und der innere Zylinder (120) eine innere Fluidkammer (172) bilden; dadurch gekennzeichnet, daß

a) die Dialysemembran (140) über das offene Ende (124) gespannt und durch ein kompressibles, als O-Ring ausgebildetes Dichtungsglied (150), das über der Membran (140) in eine periphere Nut (128) eingesetzt wird, die in der Außenfläche des konisch geformten Abschnitts (122) des inneren Zylinders (120) vorgesehen ist, in die Nut (128) gepreßt wird,

b) daß eine Schnappsitzarretierung mit einer peripheren Nut (126) in dem inneren Zylinder (120) und einem Vorsprung (118), der sich von der Wandoberfläche des äußeren Zylinders (110) erstreckt und mit der Nut (126) im Eingriff ist, zur Befestigung des inneren (120) und des äußeren Zylinders (110) aneinander vorgesehen ist, und

c) daß ein erstes Dichtungsglied (116) sich von der Außenfläche des äußeren Zylinders (110) seitlich nach außen gegen die Ampullenwand (164) erstreckt und ein zweites Dichtungsglied (130) sich von der äußeren Wandfläche des inneren Zylinders (120) seitlich nach außen gegen die Ampullenwand (164) erstreckt, wobei zwischen der Membran (140), dem Dichtungsglied (116) und der Bodenwand (162) der Ampulle eine äußere Fluidkammer (170) abgegrenzt ist.

2. Dialysezelle nach Anspruch 1, wobei die Ampulle (102) und der Membranzylinder (104) durch eine Kappe (106) abgedeckt sind, wobei die Kappe (106) eine Rippe (182) aufweist, die in einen Raum (184) zwischen den Wänden der Ampulle (102) und des Membranzylinders (104) eingreift, so daß beim Abnehmen der Kappe (106) der Membranzylinder (104) an der Kappe (106) befestigt bleibt und aus der Ampulle (102) entfernt wird.

3. Dialysezelle nach Anspruch 2, wobei der Deckel der Kappe (106) eine selbstschließende X-Schlitzöffnung aufweist, um die Zugabe oder Entnahme von Fluid in die bzw. aus der Kammer (172) innerhalb des inneren Zylinders (120) und der Membran (140) zu ermöglichen.

4. Dialysezelle nach Anspruch 2, wobei der Deckel der Kappe (106) eine offene Öffnung aufweist.

5. Dialysezelle nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die magnetische Rührperlen (186) in der äußeren Fluidkammer (170) aufweist.

6. Anwendung der Dialysezelle nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 in Kombination mit einer Puffermischung für die Dialyse von Serum, wobei die innere Kammer (172) die Puffermischung und die äußere Kammer (170) das Serum enthält, das sich über die Dialysemembran (140) in Kontakt mit der Puffermischung befindet.