PT80778B

PT80778B - Celula de dialise

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Publication number: PT80778B
Application number: PT80778A
Authority: PT
Original assignee: Nelson Jerald C
Priority date: 1984-07-05
Filing date: 1985-07-05
Publication date: 1987-09-18
Also published as: DE3587685T2; DK309785D0; GR851646B; JPS6186904A; IE851707L; IE61606B1; DE3587685D1; JPH0661430B2; DK167415B1; DK309785A; EP0170098A2; ATE98770T1; EP0170098B1; PT80778A; EP0170098A3

Description

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 representa um primeiro modelo de realização da câmara de diãlise da célula de diãlise caracterist_i ca do presente invento;

A Figura 2 representa um segundo modelo de realização da câmara de diãlise;

A figura 3 representa um primeiro modelo de realização

da célula de diãlise completa:

A figura 4 representa um segundo modelo de realização da célula de diâlise completa;

A Figura 5 representa uma câmara de diâlise de lados direitos com um suporte para um tubo de diâlise de forma cónica, montada num frasco equipado com uma tampa modificada; e

A figura 6 representa uma vista em corte de um outro modelo de realização da célula de diâlise característica do presente invento.

DESCRIÇÃO DOS MODELOS DE REALIZAÇAO PREFERENCIAIS

Os vários modelos de realização da célula de diâlise característica do presente invento serão a seguir descritos de uma maneira pormenorizada e com referância aos desenhos anexos.

Segundo um modelo de realização, a célula de diãlise compreende uma câmara, genericamente designada com o número de referência (10) que ê de preferência constituída por um invólucro de plástico rigido ou semi-rígido, e um frasco (26),. A câmara (10) é composta por uma parte (12) de parede lateral cilindrica. A partir da parte (12) de parede lateral cilindrica estendem-se umas tiras de suporte. Entre as tiras (14) encontram-se formados uns rasgos (16). Noutra versão, que se encontra representa na figura 1, a câmara (10) apresenta uma parte (18) de parede lateral de diâmetro alargado que se estende

a partir da zona da parte (12) de parede lateral que se encontra mais afastada daquela onde se encontram situadas as tiras (14) e os rasgos (16). Entre as partes (12) e (18) da parede lateral de menor e de maior diâmetro, respecti vamente, encontra-se definido um ressalto (20). A câmara (10) apresenta uma parte superior aberta (22). Na câmara de diálise ê enfiado, um tubo de diãlise (24) (de qualquer tipo conhecido) até este ficar aplicado sobre as tiras (14) e sobre pelo menos uma parte da parede lateral (12). 0 tubo de dialise vai ficar vedado no fundo (25)

da câmara (10) e em torno da parede lateral (12) de maneira a determinar a formação de um saco de diãlise.

Conforme se encontra representado na figura 1, as tiras (14) acham-se inclinadas para dentro, em direcção das suas extremidades, de modo a determinar a formação de um suporte para tubos de diálise de forma cónica. Numa versão alternativa, que se acha representada na Fig. 2, as tiras dão continuação à forma cilíndrica da parte (12) da parede lateral cilíndrica, isto é, as tiras (14) não apresentam qualquer inclinação. Caso se pretenda um suporte adicional as tiras podem terminar numa placa inferior (28) que pode, da própria, apresentar uns rasgos proprios para dar continuação aos rasgos (16) (conforme se encontra representado na Fig. 2). Em alternativa esta placa inferior (28) pode ser inteiriça em toda a sua extenção a fim de conferir maior rigidez à estrutura.

A câmara de diálise (10) pode então ser colocada no interior de um frasco (26) de maneira a que a sua parte superior, incluindo a parte superior aberta (22), se estenda para o lado de fora da parte de cima de frasco (26). A célula de diálise vais ficar assim divi dida num compartimento interior (32) e num compartimento exterior (34); o tubo ou membrana de diálise (24) proporciona a formação de uma barreira selectiva entre os dois com partimentos.

Na fig. 3 encontra-se representada uma versão modificada da câmara com tiras direitas que se caha representada na Fig. 2, é em que a câmara apresenta uma parte superior (18) de maior diâmetro, à semelhança daquela que se encontra representada na Fig. 1. Conforme se encontra representado na Fig. 3, o ressalto (20) vai ficar assente sobre o rebordo (27) do bocal ou boca do frasco (26). Quando a boca do frasco (26) tem a mesma dimensão (ou uma dimensão ligeiramente menor) que a parte de fora do cilindro (12), o frasco mantêm a câmara (10) em posição, conforme se encontra representado na Fig. 4. Quando a boca do frasco é maior do que o cilindro (12) pode ser aplicada no frasco uma tampa (36) que apresenta um furo central (38) no interior do qual é enfiado o cilín dro (12) que aí vai ficar firmemente encaixado.

Quando se desejar que haja uma ventilação do compartimento interior a fim de estabelecer um equilíbrio com os gases de meio ambiente (por exemplo com o C0₂), a extremidade aberta (22) da câmara (10) deverá manter-se descoberta. Quando se desejar também que haja uma ventilação directa do compartimento exterior (34) deverá ser utilizado um frasco (26) de maior dimensão e a tampa (38) que ê utilizado para suportar a câmara de diálise deve conter uma asberturas de ventilação (40), conforme se encontra representado na fig. 5. A extremidade aberta (22) da câmara (10) e as aberturas (40) da tampa (38) do frasco Também podem ser utilizadas para se poder ter acesso directo aos compartimentos interior ou exterior, a fim de se proceder â adição ou â extracção de reagentes ou de amostra Tipicamente o volume do compartimento interior da célula de diálise pode variar entre 150 ul e 5 ml e o volume do compartimento exterior entre 1 ml e 6 ml. Isto permite

uma vasta gama de aplicações que não eram possíveis com as células já existentes.

A célula de diálise é concebida para permitir realizar a diálise de um pequeno volume de um líquido tampão contra um grande volume de uma amostra de soro (de preferência no seio de uma atmosfera contendo concentrações fisiológicas de gases do sange). A câmara de diálise (10) ê montada no interior do frasco (26) onde se acha contida a amostra de soro de maneira a que a parte inferior do saco de diálise vá ficar mergulhada no seio da amostra de soro. 0 saco de diálise contem inicialmente um agente tampão; o tubo ou membrana de diálise (24) permite que tenha lugar a osmose, indo elevadas concentrações de substâncias (como por exemplo a tiroxina livre) que se encontram presentes no soro migrar para o seio do tampão que se acha contido no saco de diálise até se atingir uma situação de equilíbrio. Quando termina a diálise, a amostra de dialisado pode ser retirada e analisada.

A câmara de diálise (10) e o frasco (26) devem ser de preferência descartável e poderem ser deitados para depois de utilizados.

Quando o fluido que se acha contido no frasco (26) se encontra e um nivel superior ao do fluido que se acha contido no saco de diálise, uma parte do conteúdo do compartimento exterior vai ficar colocada junto à parte da mambrana de diálise onde existe ar no lado oposto àquele onde se encontra situado fluido.

Verifica-se uma evaporação na atmosfera ambiente na zona da interface desta membrana que fica situada entre o ar e o fluido que se acha contido no frasco. Quando o soro ê colocado no frasco e este ê cheio acima do nível do saco, as perdas de vapor de água podem ser compensadas pelos ganhos osmóticos de ãgua devidas à

concentração de proteínas no soro. Isto conduz a um aumento liquido nulo de conteúdo de água no soro e â manutenção das concentrações de proteínas no soro idênticas à que este apresenta na condição in vivo. Esta ê uma característica que o presente invento apresenta e que não foi descrita em nenhum dos outros sistemas de diálise já conhecidos.

Finalmente, quando a diálise termina a câmara de diálise (10) descartável pode ser retirada e o frasco (26) tapado e a amostra a ser preservada a fim de ser armazenada com vista a ser praticamente submetida a ensaios.

De uma maneira sumária diremos que os anteriormente descritos modelos de realização do presen te invento apresentam as seguintes características:

A amostra de soro é colocada num

frasco normalizado

Uma camara de diálise (10), oca e de^ cartável, que é aberta na parte de cima, ê enfiada no inte rior do frasco (26) e mergulhada no soro, dando assim origem à criação de uma célula de diálise que apresenta um compartimento de diálise exterior onde se encontra contido o soro e um compartimento ou saco de diálise interior e vazio no interior do qual pode ser depositado tampão.

A câmara de diálise pode ser cheia com tampão dialisado através da parte superior aberta (22) da câmara de diálise.

Quando a diálise tiver terminado o tampão pode ser quantativamente retirado por meio de uma pipeta manual a fim de ser analisado, podendo a câmara de

I

-16diãlise ser retirada do frasco e deitada fora, podendo o frasco ser tapado a fim de se armazenar o soro.

A extremidade aberta da câmara de diá lise permite o rápido equilíbrio dos gases dissolvidos com os gases do meio ambiente (por exemplo 5% de C0₂ para o controlo do pH do soro ou dos tampões de bicarbonato) e um fácil acesso com pipetas manuais próprias para a recolha quantitativa de amostras.

A relação entre o volume de compartj. mento interior e o volume do compartimento exterior pode ser alterada simplesmente através da utilização de frascos de diferentes dimensões.

Não existem parafusos, grampos, porcas ou pernos para apertar. Os dois compartimentos da célula de diálise são mantidos em posição por meio da acção da gravidade e/ou do atrito.

Uma vez que todas as partes são descartáveis não existe lavagem das câmaras usadas a fim de poderem ser novamente utilizadas.

Na fig. 6 encontra-se representado um outro modelo de realização preferencial do invento. Neste modelo de realização preferencial a célula de diálise e cilíndrica. Evidentemente que podem ser utilizados outras formas sem que por isso se saia do âmbito de invento.

Neste modelo de realização a célula (100) compreende um frasco descartável (102) e um cilindro^Aporta-membrana genericamente designado com o número de referência (104) . Sobre o cilindro porta-membrana (104) ê sobre o frasco (102) ê montada à pressão e com efeito de

mola uma tampa amovível (106).

".ÃTT

0 cilindro porta-membrana (104) inclui um cilindro exterior (110) que apresenta uma parte (112) de parede cónica que converge em direcção a uma parte terminal âberta (114). Existe um primeiro elemento de vedação (116) que se estende lateralmente e no sentido de dentro para fo ra a partir da superficie exterior do cilindro (110). Existe uma protuberância (118) que se estende no sentido de fora para dentro a partir da superficie interior da pare_ de do cilindro (110); a finalidade e o funcionamento da protuberância (118) serão descritos mais adiante de uma maneira mais pormenorizada. 0 cilindro porta-membrana (104) ainda compreende um cilindro interior (120) que apresenta uma parte (122) de parede cónica que converge em direcção a uma extremidade aberta (124) e uma parte(123) de parede cilindrica que se estende a partir da parte mais larga da secção (122) de parede cónica.

Na superficie exterior da parede do cilindro interior (120) encontram-se formadas umas ranhuras circunferenciais (126) e (128). Existe um segundo

) elemento de vedação (130) que se estende lateralmente e

no sentido de dentro para fora a partir da superficie exterior do cilindro (120). A secção (123) de parede de lados direitos tremina numa parte terminal aberta (129).

Os elementos de vedação (116) e (130) são de preferência de um tipo que é comercializado pela V-Tech Inc. de Los Angeles, Califórnia, sob o nome de "Click-Stick". A abertura (124) existente no ci1indro(120) é fechada com uma membrana de diãlise semi-permeável (140)

A membrana (140) ê feita de preferência com um material â base de policelulose de tipo conhe-

eido. A membrana (140) é estendida sobre a extremidade aberta (124) e ê apertada contra a superfície exterior de pelo menos parte da secção (122) de parede cónica. A membrana sobe ao longo da parede cónica (122) o suficiente

ί para poder ser retirada dentro do encaixe (128). Uma anilha vedante de secção circular (0-ring) compressivel (150) ê montada na ranhura (128) sobre a membrana (140).

Tipicamente as membranas de diálise são relativamente rígidas e ê dificil forlar com elas uma vedação estanque a fluidos. Uma das finalidades da utilização da anilha vedante de secção circular (0-ring) (150) consiste em fazer com que ela própria se vã moldar ou adaptar às muito pequenas arestas e canais que se formam na membrana quando esta ê comprimida no interior da ranhura ou encaixe (128). Ao adaptar-se ela própria a estes micr£ canais e arestas, a anilha vedante de secção circular (0-ring) pode comprimir de uma maneira eficaz a membrana contra a superfície de paredes de canal (128) de modo a proporcionar a criação de uma vedação estanque a fluidos.

Os cilindros (110) e (120) são mon j tados à pressão um no outro, com a membrana (140) colocada entre elas, a fim de formar um "cone de vedação" entre

eles. A fim de se poder tirar e ter a certeza de que os cilindros se mentêm firmemente presos um ao outro, a protuberância (118) vai encaixar na ranhura ou encaixe (126) e a fim de promover a criação de um fecho ou freio de encai> xe rápido, com estalido, que faz com que os cilindros

(110) e (120) se mantenham encostados e apertados um contra o outro. A montagem à pressão dos cilindros (110) e (120) um contra o outro também vai contribuir para comprimir ain da mais a anilha vedante de secção circular (0-ring) (150).

A superfície interior (113) da parede do cilindro (110) vai exercer pressão contra a anilha vedante (0-ring) (150) espalmando-a no interior do canal (128) e fazendo com que

-19as forças de compressão exercidas pela anilha vedante (0ring) sobre a parte de membrana (140) que se acha situada no interior do canal (128) sejam aumeniadas.

0 frasco (102) completa a construção básica da célula de diãlise. 0 frasco e os cilindros (110) e (120) são de preferência feitos de materiais plásticos inertes e quimicamente compatíveis que são de preferência transparentes. 0 frasco (102) ê aberto na parte de cima e, no caso de modelo de realização representado na figura, apresenta um fundo (162), que, juntamente com as paredes (164), vai determinar a formação de uma câmara no interior da qual podem ser introduzidos os cilindros (110) e (120) que se acham encaixados um ao outro.

Uma parte (166) da parede (164) que se estende para o lado de baixo vâi actuar como uma base de apoio para a célula.

Com o cilindro porta-membrana (104) em posição no frasco (102), os elementos de vedação (116) e (130) vão assentar contra a superficie interior da parede (164) do frasco. 0 elemento de vedação (130) actua basicamente como um elemento de estabilização do cilindro porta-membrana, especialmente quando a tampa (106) tiver sido retirada, conforme será oportunamente descrito de uma manei ra mais pormenorizada. 0 elemento de vedação (116), juntamente com a parede (162) do fundo de frasco e com a membrana (140), vai determinar a formação de um primeiro compartimento (170). Um segundo compartimento (172) é definido no lado de dentro do cilindro porta-membrana (104) pela superficie interior das paredes (122) e (123) do cilindro e pela membrana (140). 0 compartimento (172) pode encontrar-se aberto para a atmosfera ambiente ou, tal como se encontra representado na Fig. 6, encontra-se coberto com a tampa (106). A tampa (106) conforme se encontra representa·

mia

-20do na fig. , apresenta uma aba (182) de perfil em forma de U que vai encaixar num espaço (184) existente entre as pare des de frasco (102) e o cilindro porta-membrana (104).

A aba (182) ê dimensionada de maneira a ir encontar firmemente e de forma estanque contra a parte (123) de parede cilíndrica e firmemente (mas não necessariamente de forma estanque) contra a parede (164) do frasco.

Antes de ser utilizada, a célula de diálise ê montada procedendo-se primeiro a uma pré-lavagem da membrana (140) e depois à montagem do cilindro porta-membrana (104) de acordo com a maneira anteriormente descrita. 0 frasco (102) é depois parcialmente cheio com uma pré-determinada quantidade de tampão de diálise. 0 cilindro porta-membrana (104) é introduzido no frasco, de maneira que o elemento de vedação (116) vai actuar no sentido de confinar o tampão de diálise ao compartimento (170).

A unidade na sua totalidade pode então ser tapada com a tampa (106) e embalado no estado de pré-montada e pronta para ser utilizada.

Para dar inicio à diálise o utilizador pode pipetar uma amostra de soro para o interior do compartimento (172) através de uma abertura constituída por uma fenda em forma de X existente na tampa (106). Para concluir a diálise o utilizador irá normalmente retirar do frasco (102) a tampa juntamente com o cilindro porta-membrana que a ela se encontra ligada.

Conforme foi anteriormente referido, a tampa (106) ê montada à pressão sobre a extremidade abejn ta (129) do cilindro porta-membrana (104). A construção da célula de diálise é concebida de maneira a que quando a tampa é retirada, por exemplo, por ocasião da conclusão de diálise, o cilindro porta-membrana mantém-se ligado â tampa a fim de ser retirado do frasco (102). A seguir a tampa

-21pode ser retirada do cilindro porta-membrana e tornada a ser colocada no frasco a fim de permitir que a amostra de dialisada possa ser armazenada e remetida. E convenienteque a parte de cima da tampa (106) contenha uma abertura constituída por uma fenda em forma de X que se fecha automaticamente, a fim de permitir que o fluido, por exemplo, o soro, possa ser adicionado ou retirado do compartimento (172) por meio de uma pipeta normalizada sem que para isso seja necessário retirar a tampa. A tampa fechada normalizada pode ser substituída por uma tampa de montagem rápida, com emissão de um estalido, que apresenta uma abertura na parte de cima. A abertura permite que se verifique um grau de evapcração controlado do soro se atingir o equilíbrio da difusão.

Uma das vantagens do modelo de realização que se encontra representado na Fig. 6 consiste no facto de a membrana (140) poder ser pré-lavada antes de se proceder â montagem e poder depois ser transportada e armazenada no estado de embebida em fluido. E sabido que as membranas de diálise precisam de ser lavadas antes de serem utilizadas. No entanto a sua estrutura policelulósica irá fracturar-se e deixar que se verifiquem perdas por fuga de fluido caso sejam secas. Deste modo elas precisam de ser transportadas e armazenadas no estado de embebidas em fluido. 0 presente invento, na medida em que permite que a célula possa ser pré-montado com o tampao de dialise no seu lugar, permite que a membrana possa ser armazenada no estado húmido, ou seja, embebida em fluido, impedindo assim que se verifiquem as fracturas e as perdas por fuga de fluido que caso contrário se iriam registar.

Ainda outra earacterística deste modelo de realização é a que a anilha vedante de secção circular (0-ring) (140) vai ficar "escondida" no canal reentrante (128) a fim de evitar o contacto entre o material da

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anilha vedante de secção circular (0-ring) e a amostra de doro. Descobriu-se que certos materiais de que são constituídas as anilhas vedantes (0-ring) vão perturbar o equilíbrio de ligação âs proteinas no soro. A presente concepção evita esta perturbação que pode alterar de forma prejudicial os resultados e por consequência um diagnóstico baseado nos resultados da diálise.

A célula de diálise anteriormente descrita é facil de utilizar e pode ser imediatamente deitada fora depois de ter sido utilizada. 0 invulgar sistema de elementos de vedaçao faz com que a membrana de diálise se mantenha em posição e impede que se verifiquem fugas entre os compartimentos. A intensidade dos ganhos de água devidos à osmose ê controlada por intermédio do controlo da superfície de exposição da membrana. Além disso pode ser estabelecido um equilíbrio entre as perdas de água por evaporação verificada s a partir do compartimento (172) e os ganhos de água devidos à osmose que se verificam através da membrana (140).

Entre as características do invento que devem ser apreciadas pelos fabricantes e/ou pelos utilizadores encontram-se incluídas a dimensão dos poros da membrana de diálise, a superfície de exposição da membrana de diálise/ o volume do compartimento interior (a fim de optimizar o equilíbrio de difusão), a utilização de materiais que não libertam substancias que iriam "envenenar" os métodos analíticos utilizados nem vão absorver ligandos livres e o conveniente acesso que as pipetas manuais podem ter através da parte de cima da célula. Com respeito aos modelos de realização que se encontram representados nas Figs. 1 a 5, temos que um factor adicional a ser tomado em consideração consiste no facto de a área transversal total determinada pelos rasgos (16) ser suficientemente grande em comparação com o volume do saco de diálise para permitir uma rápida permuta entre

os gases dissolvidos e os gases do meio ambiente.

As células ou câmaras de diálise correntemente conhecidas e utilizadas são todas feitas de materiais relativamente caros. Todas elas precisam de ser montadas antes de serem utilizadas, de ser desmontadas depois de serem utilizadas e da introdução de uma nova membrana devidamente limpa, de tornarem a ser montadas e só depois novamente utilizadas. Isto ê extremamente trabalhoso e constitue o principal motivo pelo qual os laboratórios de análises clinicas normais não desejam realizar este tipo de análises. A estes laboratórios não agrada o facto de terem que depender da habilidade manual necessária para realizar as diálises, e de terem que se preocupar com os caprichos da degradação dos marcadores e com a química da dj_ álise. Além disso, as células de diálise já existentes, apesar de permitirem o acesso quer ao compartimento onde se encontra contido o soro quer ao compartimento onde se encontra contido o tampão durante a realização de diálise, não apresentam aberturas suficientemente grandes de maneira a permitir que se estabeleça um equilíbrio gasoso o meio ambiente, por um lado, e o soro e o dialisado, por outro.

Isto quer dizer que não ê possível utilizar-se o mecanismo utilizado pelo corpo humano, que consiste em controlar o pH com um tampão à base de um bicarbonato, isto ê, com a pressão do dioxido de carbono existente na atmosfera.

0 presente invento tem várias vantagens em relação às células de diálise já conhecidas. Em primeiro lugar ê proporcionada uma célula de diálise descartável. As partes de que esta ê constituída são fáceis de fabricar e de montar. Nos modelos de realização que se encontram representados nas Figs. 1 a 5, o frasco (26) é largamente comercializado pelos fornecedores de equipamento de laboratório.

Em segundo lugar, uma das extremidades da câmara de dialise pode ser deixado aberta para a atmosfera, com uma abertura suficientemente grande para permitir, pela primeira vez, que um ambiente de C0₂ possa ser utilizado para se conseguir obter pH's fisiológicos através da utilização de um tampão dialisado que apresenta a mesma composição iónica que a água do soro. Em alternativa pode ser utilizado um tampão não fisiológico que permite que o C0₂ libertado pelo soro possa ser utilizado.

Se o ensaio for realizado no seio do ar ambiente, utilizando um tampão fisiológico, deve ser utilizado um tampão capaz de fazer com que todo o bicarbonato endógeno se trans forme em ácido carbónico, sendo depois necessário deixar que o ácido carbónico se possa libertar para o meio ambiente a fim de fazer com que o pH volte a apresentar o valor de 7,4. Não pode ser utilizado soro não diluído a menos que exista a possibilidade de se estabelecer um equilíbrio gasoso com o meio ambiente, tanto por parte de C0₂ dissolvido que se formou a partir da neutralização do ácido com bicarbonato de/no estado não fisiológico como por parte do CO presente na atmosfera de que penetrou no soro no estad§ fisiológico. Quando o soro é retirado do corpo humano, e Co₂, nele dissolvido vai libertar-se no seio do ar; o soro que se acha colocado na prateleira do laboratório apresenta um pH de 8,5 a 9,0., o que dá origem a uma alteração do pH do radical de ligação das hormonas às proteínas do soro.

Esses valores do pH são inadmissíveis na diálise de equilíbrio destinada à medição das hormonas livres. Antigamente este problema era ultrapassado procedendo-se ã diluição da fracção constituída pelo soro, na ordem de cerca de 1 para 10 a 1 para 150, com uma solução tampão e procedendo depois â sua dialise contra um volume aproximadamente equivalente a um volume de dialisado que lhe

25superior em cerca de 20 moles. Com estas diluições do soro, o resultado da permuta de gases torna-se efectivamente discutível. 0 presente invento evita a necessidade de ter que se diluir a totalidade do soro.

Outra característica do presente invento consiste na possibilidade de a amostra de soro poder ser colocada tanto na câmara interior como na câmara exterior e a solução tampão, ou dialisado, na outra camara As células de diãlise já conhecidas que têm sido utilizadas até ao presente momento limitam as suas funções à colocação da amostra de soro na câmara interior (equivalente ao saco de diãlise no caso do presente invento) e à colocação da solução tampão, ou dialisado, na câmara exterior (comparável ao frasco) .

Quando um paciente tiver ingerido uma droga que inibe a ligação das hormonas às proteínas, as amostras de soro podem ser diluídas. A diluição da amostra de soro reduz a concentração do inibidor o que por sua vez vai alterar a cinética das moléculas, por exemplo de T^, que se encontram ligadas às proteínas do soro. Qualquer diálise

ί implica naturalmente alguma transferência de água que vai

passar do lado onde se encontra o tampão para o lado onde se encontra o soro devido à pressão oncótica e osmótica das proteínas do soro. Uma forma de minimizar a transferência de água consiste em fazer, de uma maneira prática, com que o volume de soro seja grande eo volume de dialisado

I seja pequeno.

Os modelos de realização que se encontram representados nas Figs. 1 a 5 cumpremde uma maneira económica e eficaz com esta condição na medida em que permitem que a amostra de soro seja colocada no frasco de grande volume e que a solução tampão seja colocada no saco de diálise que apresenta um volume mais pequeno. Isto

-26faz com que a pressão no lado onde se encontra colocado o soro aumente o suficiente para inibir a transferência de água. Uma outra maneira para evitar o problema da transferência de água, que ê resolvido pelo modelo de realização que se encontra representado na Fig. 6, consiste em promover o equilíbrio entre a evaporação de água a partir da amostra de soro e a osmose de água através da membrana que se verifica do tampão para a amostra de soro.

Outra vantagem do presente invento consiste no facto de ele permitir que a solução tampão dialisada possa ser retirada da célula de diâlise sem perturbar o soro. E então possivel proceder depois à realização de uma análise por meio de ensaio radioimunológico directo do tampão dialisado. Uma vez que durante a realização da diâlise não é adicionado nenhum marcador, fica também resolvido o problema da deterioração dos marcadores.

Este invento pode ser utilizado um muitas situações de diâlise de equilíbrio destinadas à medição de hormonas livres ou não ligadas, de drogas, de nervo-peptídeos, de electrolitos, de quaisquer moléculas biologicamente activas que se encontram ligadas a proteínas em fluidos biologicos ou, de uma maneira geral, de qualquer separação molecular em que se pretenda separar moléculas dialisáveis (por exemplo, sais) das moléculas não dialisãveis (por exemplo, macromolêculas tais como as proteínas).

Entre as substancias que podem ser detectadas através da utilização da célula característica do presente invento encontram-se incluídas a tiroxina, a tri_ iodotironina, a testosterona, o cortisol, o estradiol, certos anti-convulsivos tais como a carbamazapina, o ácido valproico ou a feniltoína, ou benzodiazepinas tais como o valium o Librium, e outras do mesmo tipo. De preferência e particularmente de interesse é determinação de substância biológicas que se encontram ligadas a proteínas de ligação a substancias.

São utilizados tampões que fazem com que o pH se mantenha com um valor situado entre 7,o e

7,8 de preferência entre 7,2 e 7,6. Os tampões devem compreender normalmente sais presentes e na concentração iónica idêntica aquela que ê normal do soro, tampões de ácidos orgânicos, especialmente tampões de ácido sulfônico orgânico, antibióticos capazes de inibir o crescimento de cocos Gram-positivos, de baterias Gram-negativas e de fungos.

Deve encontrar-se também presente um veiculo neutro, incapaz de se ligar à substancia biológica que se pretende determinar, como por exemplo uma imu^ noglobulina que não se liga ao T^, de preferencia a IgG de coelho, a fim de se evitar as perdas por absorção.

Deve ser também adicionada uma substância de elevado peso molecular, capaz de se ligar ao vidro, ou, de uma maneira geral, às paredesda célula de diãlise, mas incapaz de se ligar ã substancia biológica que se pretende determinar, como por exemplo a gelatina,, a fim de evitar a absorção não especifica da substancia biologica que se pretende determinar às paredes da célula de diálise.

Podem ser também adicionadas à composição tampão substancias adicionais, tais como a ureia, os hidroxiãcidos ou os aminoácidos, por exemplo o ãcido láctico ou o ãcido glutâmico, a fim de imitar de uma maneira mais perfeita os perfis do soro fisiológico.

Entre os tampões orgânicos que podem ser utilizados encontram-se incluídos os seguintes:

ACES (ácido N-2-acetamido-2-aminoetanossulfónico);

ADA (ácido Ν-2-acetamidoaminodiacético);

BICINE (N,N-bis-(2-hidroxietil(glicina));

B IS-TRIS-PROPANO-(1,3-bis/"tris(hidroximeti1)meti1amino7propano);

ACIDO DIETILMALONICO;

GLICINOAMIDA (glicinamida);

GLICILGLICINA;

1

HEPES (ácido Ν-2-hidroxietilpiperazino-N -2-etanossulfÓnico);

HEPPS (ácido Ν-2-hidroxietiIpiperazíno-N -3-propanossulfónico) ;

IMID3AZOLE;

MOPS(ácido 3-(N-morfolino)propanossulfónico);

PIPES (ácido piperazino(N-N -bis-2-etanossulfónico);

} TES(ácido 2-/~tris-(hidroximeti1)meti17-amino-etanossulfónico);

HIDROXIDO DE TETRAMETILAMONIO;

TRISINA(N-/“tris(hidroximetiI)metiIglicina);

> TRIETANOLAMINA;

TRIS(tris(hidroximeti1)aminometano).

Um tampão preferencial é aquele que

compreende iões potássio, cálcio e sodio em concentrações fisiológicas idênticas àquelas que são normais do soro; ani RffS -29ões; cloreto de fosfato e sulfato em concentrações fisiológicas idênticas àquelas que são normais do soro; um dos anteriormente referidos compostos tampão orgânicos em concentrações suficientes para que se mantenha uma substancial capacidade de tamponagem sob as condições pretendidas numa gama de 7,0 a 7,8, de preferência de 7,2 a 7,6; uma adequada mistura de antibióticos tais como aqueles que foram anteriormente descritos, em concentrações suficientes para evitar ou inibir de uma maneira substancial o crescimento de microorganismos indesejáveis; gelatina numa concentração suf ciente para cobrir as paredes célula de diãlise e capaz de impedir a adsorção da subatancia biologica que está a ser medida; e um adicional de portador de proteínas neutro, como por exemplo o IgG de coelho, numa concentração suficiente para impedir que se verifiquem substanciais perdas por adsorção da substancia que está a ser determinada por parte das paredes ou das membranas.

As caracteristicas especificas do sis tema célula de diálise/tampão proprio para a medição da tiroxina livre (T₄) do soro são as seguintes:

1. Volume dos compartimentos

No ERI ê utilizada uma amostra de 500 jul. 0 compartimento inferior é concebido para conter 2,4 ml de dialisado, permitindo assim efectuar um ERI em duplicado com uma quantidade de dialisado remanescente suficiente para repetir o ERI nas amostras com problemas, mais tolerantes para as perdas por pipetagem e para as perdas osmóticas. 0 compartimento superior (onde se acha contido o soro) foi concebido para conter 0,6 ml de soro (ver controlo de pH apresentado a seguir).

-302. Controlo do pH

A ligação do depende do pH.

0 pH deve ser controlado de maneira a que o seu valor se man tenha na gama compreendida entre 7,2 e 7,6. 0 tampão

HEPES tem sido escolhido para o controlo de pH devido ao facto de o seu pKa a 37°C ser de 7,4. 0 anião HEPES vai deslocar o das proteínas de ligação se a concentração for superior a cerca de 60mM. Para se efectuar o controlo do pH dos soros com acidose e alcalose ê necessário utilizar uma eficaz concentração de HEPES de 240 mM,.

A fim de se a conseguir atingir esta capacidade total de tamponagem sem se utilizar a concentração de 60mM de aniões, foi concebida a utilização de um vo lume de tampão quatro vezes superior ao volume de soro. 0 tampão HEPES pode ser então distribuido num volume cinco vezes maior do que o volume apenas do soro (soro=1; tampão =4), fazendo assim reduzir a concentração do anião HEPES para 48 mM e impedir que o anião HEPES vá interferir com o equilíbrio do T^; ao mesmo tempo que se mantêm a neces sária capacidade total de tamponagem.

3. Superficie de exposição da membrana

Foi determinado experimentalmente

que a utilização de uma membrana de diálise circular com ?

uma área de 1 cm tem a superficie de exposição óptima, c_a paz de fazer com que o tempo de equilíbrio da difusão se ajuste ao tempo de equilíbrio da ligação das proteínas ao

(16 horas) quando 0 compartimento superior contem 0,6 ml de soro e 0 compartimento inferior contem 2,4 ml de diálisado, e não é utilizada agitação.

-314. Concentração das proteínas no dialisado

A fim de se eliminarem as perdas por adsorção o tampão dialisado deve conter proteínas. A gelatina e a gamaglobulina não se ligam ao T^. Elas vão vão interferir com o ensaio radioimunológico a altas concentrações. A fim de se eliminar a adsorção de e ao mesmo tempo manter as concentrações de gelatina e de gamaglobulina abaixo do nivel de interferência, foi determinado que também não era adequado utilizar apenas uma proteina. Em consequência disso o tampão de diálise contem uma concentra ção sub-limiar de ambas as proteínas numa formulação que elimina a adsorção de T₄ por parte dos materiais plásticos e das membranas;

5. Química do dialisado

Para além do tampão HEPES, da gelatina e das gamaglobulinas, as restantes constituintes do tampão dialisado incluem os constituintes não proteínas de soro com concentrações de 1mM ou mais a fim de proporcionarem a criação de um ambiente virtualmente fisiológico para a reacção de diálise.

6. Antibióticos

A fim de se eliminar a possibilidade de se verificar um crescimento de baterias durante a incubação de diálise, é utilizada uma mistura de penicilina, gentamicina, estroptomicina e anfotericina B.

A concentração de cada constituinte é inferior à concentração limiar necessária para alterar o equilíbrio de ligação do T^.

1

ΤΪΜΓ

Um tampão optimizado para a medição

do ê o seguinte:

NaCl : 5265 mg/1

) Acido DL-láctico : 561 mg/1;

KC1 : 224 mg/1 KH₂P0₄: 180 mg/1:

CaCl₂.2H₂0 : 275 mg/1;

) MgS0₄.7H₂0: 246 mg/1

Ureia : 300 mg/1 Gelatina : 500 mg/1 ;

IgG de coelho : 200 mg/1;

Sal de sódio de HEPES : 5891 mg/1 Acido HEPES : 6046 mg/1;

Penicilina : 100.000 U/l;

Estreptomicina : 100 mg/1;

Anfotericina : 250 ug/1; e

) Gentamicina : 100 mg/1.

nizada antes

0 tampão é

de ser utilizado.

preparado em água deqio0 presente invento pode ser realizado de acordo com outras formas especificas sem que por isso se afaste do espirito ou das caracteristicas essenciais do invento. 0 presente invento do modelo de realiza ção é apresentado apenas a título ilustrativo e não limita tivo, sendo o âmbito do invento caracterizado mais pelas reivindicações anexas do que pela memória descritiva que

-33acaba de ser apresentada. Todas as alterações que sejam introduzidas e que caiam dentro do âmbito do significado e da gama de equivalência das reivindicações são por conse guinte consideradas como abrangidas por estas.

1

Claims

REIVINDICAÇÕES

1-. - Dispositivo de recolha de

j amostras próprio para ser utilizado juntamente com um reci | piente de gargalo aberto capaz de conter um material fluído,

h

caracterizado por compreender um elemento oco de suporte que pode ser introduzido no interior do referido recipiente atra, vés da parte aberta do gargalo, elemento de suporte esse que compreende uma parte ou corpo principal cujo diâmetro é me nor do que o do gargalo aberto do recipiente, uma primeira

ff

p parte terminal que se estende a partir da parte ou corpo prin :í —

| cipal e que vai desembocar na atmosfera ambiente através da i parte aberta do gargalo do recipiente, e uma série de tiras • alongadas que se estendem a partir da parte ou corpo principal e que determinam a formação de uma segunda parte termi nal, indo as referidas tiras formar uma estrutura de suporte

j geralmente rígida.

; ι

;t

í

|
2^ã. - Dispositivo de recolha de

{ amostras, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por j compreender também um tubo de diálise que se acha aplicado so Íí bre as referidas tiras e que é fechado numa das suas extremi;í dades a fim de determinar a formação de um saco de diálise Ί que é aberto numa das suas extremidades e a cujo interior se í; pode ter directamente acesso através da primeira parte termií nal da estrutura de suporte.

11

ι
3^â. - Célula de diálise, de a:j cordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida
5 parte ou corpo principal do referido elemento de suporte aμ

: presentar uma primeira parte substancialmente cilíndrica que íi se estende desde a extremidade aberta do referido elemento

de suporte até uma segunda parte substanciaImente cónica que termina na referida segunda parte terminal que se encontra situada na zona mais afastada daquela onde se encontra situada a referida extremidade aberta, e por as referidas tiras se

I

referida segunda parte terminal do comprimento da referida parte de configuração cilíndrica.

subscónica

estenderem a partir da tancialmente ao longo e em direcção â parte

i 4^ã. - Célula de diálise, de

ί acordo com a reivindicação 3, caracterizada por compreender !í ainda umas aberturas em forma de rasgo que se acham defini das entre as referidas tiras e que se estendem a partir da referida segunda extremidade em direcção à referida extremida

Η de aberta, e por o referido tubo de diálise se poder apoiar

!j

íj nas referidas tiras.

!

j 5^â. - Célula de diálise, ca racterizada por compreender:

um frasco que ê próprio para conter um primeiro fluído

I

i, e que apresenta uma extremidade aberta, ou seja, um bocal;

h

ií

j¹ um elemento Ôco e alongado que é próprio para conter um

ji segundo fluído e que pode ser introduzido no interior da re•i ferida parte terminal aberta do referido frasco, sendo o reí! ferido elemento aberto numa das suas extremidades a fim de

ί permitir que se estabeleça comunicação directa entre o inteI- rior do elemento Ôco e a atmosfera ambiente, apresentando H ainda o referido elemento pelo menos uma abertura que se acha ' situada na zona mais afastada daquela onde se encontra situaí da a referida extremidade aberta a fim de permitir que se es'1

tabeleça uma comunicação directa entre o interior do referido

I 'j elemento Ôco e um meio que se acha contido no interior do rei;

i| ferido frasco quando o referido elemento ôco ê introduzido no !í referido frasco; e

uma membrana de diálise que se acha colocada sobre a referida abertura que se encontra situada na zona mais afastada daquela onde se encontra situada a referida extremidade aberta, na zona de comunicação entre o referido meio que se

I

í acha contido no frasco e o interior do elemento ôco.

I

I 6^. - Célula de diãlise, de acorde

|j com a reivindicação 5, caracterizada por as paredes do referi_ í do elemento Ôco serem constituídas por um material substan ' cialmente rígido e impermeável aos fluídos, por a referida

I

ί abertura compreender uma série de aberturas alongadas e em j forma de rasgo que se acham definidas entre as tiras que se

I encontram afastadas umas das outras e se estendem a partir

ι

!! da extremidade oposta àquela onde se encontra situada a refe ) ji rida extremidade aberta e em direcção â referida extremidade

I (

| aberta, e por a referida membrana se apoiar nas referidas tj_ ras.

j 7^a. - Célula de diálise, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por o referido elemeii

: to alongado apresentar uma primeira parte substancialmente jí cilíndrica que se estende desde a referida extremidade aberií ta até uma segunda parte substancialmente cónica que termina " numa segunda parte terminal que se acha situada na zona mais

íi

;; afastada daquela onde se encontra situada a referida extrem/ ii dade aberta, e por as referidas tiras se estenderem a partir

ii

ί ! da referida segunda parte terminal, substancialmente ao lonj: go do comprimento da referida parte cónica e em direcção â

íi

ji referida parte de configuração cilíndrica.

ι 8^a. - Câmara de diálise, caracte

:j rizada por compreender:

í

Ί

,! um elemento cilíndrico ôco e alongado que se encontra

aberto numa das suas extremidades a fim de permitir que se

, estabeleça uma comunicação directa entre um primeiro ambien¹ te exterior e o interior do referido elemento cilíndrico;

uma série de aberturas rasgadas na parede lateral do re. ferido elemento cilíndrico na zona mais afastada daquela onde

-37! se encontra situada a referida extremidade aberta, a fim de

ί

p permitir que estabeleça uma comunicação directa entre um sei gundo ambiente exterior e o interior do referido elemento ci

ί

: líndrico; e

uma membrana de diãlise que é colocada sobre as referi| das aberturas, na zona de comunicação entre o referido seguji I do ambiente exterior e o interior do referido elemento cilí_n ií ^dricoί

ί 9â. - Célula de diâlise, de acor

i do com a reivindicação 8, caracterizada por as paredes do re ί ferido elemento ôco serem constituídas por um. material subsJ tancialmente rígido e impermeável aos fluídos, por a referii

I da abertura compreender uma série de aberturas alongadas e | em forma de rasgo que se acham definidas entre as tiras que ι se encontram afastadas umas das outras e se estendem a par I tir da extremidade oposta àquela onde se encontra situada a il referida extremidade aberta e em direcção â referida extrem/ i| dade aberta, e por a referida membrana se apoiar nas referi'[ das tiras.

| il 10^â. - Célula de diãlise, de

acordo com a reivindicação 9,caracterizada por o referido ele

ll mento alongado apresentar uma primeira parte substancialmente cilíndrica que se estende desde a referida extremidade a:í

berta atê uma segunda parte substancialmente cónica que termina numa segunda parte terminal que se acha situada na zona

I í; mais afastada daquela onde se encontra situada a referida ex jl tremidade aberta, e por as referidas tiras se estenderem a ií partir da referida segunda parte terminal, substancialmente ll ao longo do comprimento da referida parte cónica e em direcíi ção â referida parte da configuração cilíndrica.

11^â. - Célula de diãlise para a realização de uma diãlise de equilíbrio destinada a separar

i,

ί

as moléculas dialisáveis das moléculas não dialisáveis, caracterizada por compreender:

' um frasco descartável próprio para conter um primeiro

i fluído e que apresenta uma extremidade aberta, ou seja, um ' boca 1;

t

um elemento ôco, alongado e descartável, que é próprio I para conter um segundi fluído e que pode ser introduzido na ί referida extremidade aberta do referido frasco, encontrandoί -se o referido elemento aberto numa das suas extremidades a ; fim de permitir que se estabeleça uma comunicação directa ejo

tre o interior do elemento ôco e a atmosfera ambiente, sendo a abertura da referida extremidade aberta suficientemente

I

i grande para permitir que se estabeleça um equilibrio gasoso ! com a atmosfera, sendo as paredes do referido elemento ôco | constituídas por um material substancialmente rígido e imper • meável a fluídos, apresentando ainda o referido elemento Ôco ,j uma série de aberturas alongadas e em forma de rasgo que se

acham situadas na extremidade mais afastada daquela onde se

: 1

ij encontra situada a referida extremidade aberta a fim de peri; mitir que se estabeleça uma comunicação directa entre o inte ;í rior do referido elemento Ôco e um meio que se encontra conJ tido no referido frasco quando o referido elemento ôco ê in'1 troduzido no referido frasco; e

•j

j uma membrana de diálise que é colocada sobre as referiil das aberturas em forma de rasgo que se acham situadas na zo!

• na mais afastada daquela onde se encontra situada a referida ΐ extremidade aberta, na zona de comunicação entre o referido ij meio que se acha contido no frasco e o interior do elemento ^! Ôco.

I

12^â. - Célula de diálise, de acor do com a reivindicação 11, caracterizada por as referidas aberturas em forma de rasgo se acharem formadas entre as ti ras que se encontram afastadas umas das outras e se estende-

39í rem a partir da extremidade oposta àquela onde se encontra

ii situada a referida extremidade aberta e em direcção â referi ι j da extremidade aberta, a por a referida membrana se apoiar ; nas referidas tiras.

13^â. - Célula de diálise, de

acordo com a reivindicação 12, caracterizada por o referido elemento alongado apresentar um obturador que se encontra aplicado junto â referida parte terminal aberta e que coopera com o bocal do referido frasco a fim de vedar eficazmente o referido frasco quando o referido elemento alongado ê introduzido no referido frasco, apresentando ainda o referido ele mento alongado uma parte substancialmente cilíndrica e de s£ perfície inteiriça que se estende a partir da referida extre midade aberta, indo as referidas tiras estender-se desde a referida parte de superfície inteiriça até uma segunda e estrutura Imente parte rigida terminal do referido elemento alongado, de maneira a definir juntamente com a referida membrana um saco destinado a conter um fluído.

14^â. - Aparelho próprio para a realização de uma diálise de equilíbrio, caracterizado por compreender:

ί um primeiro compartimento destinado a conter um fluído

e que se acha eficazmente vedado de maneira a não ficar ex i

posto â acção do meio ambiente:

. um segundo compartimento destinado a conter um fluído e

; cujas paredes determinam a formação de uma primeira abertura ! que permite a comunicação entre os referidos primeiro e se gundo compartimentos e de uma segunda abertura que permite que se estabeleça uma comunicação directa entre o referido seguii do compartimento e o meio ambiente;

uma membrana

semi-permeável que é constituída por um ma

40i terial à base de policelulose e que cobre a referida primeij ra abertura;

' um sistema de vedação próprio para fazer com que a refe

. ^! rida membrana estabeleça com as paredes do referido segundo ’ ; compartimento uma relação de vedação estanque aos fluídos, a

I fim de impedir de uma maneira substancialmente eficaz que a

¹ transferência de fluídos entre os referidos compartimentos

i

; não se verifique senão através da referida membrana; e

í

I

por o referido segundo compartimento ter uma configuração tal que as perdas por evaporação que são experimentadas por um dado fluído, e que se verificam a partir do referido

1

segundo compartimento e atrvés da referida segunda abertura, j serem substancialmente iguais aos ganhos osmóticos que são

i

i experimentados pelo referido fluído e que se verificam a par I tir do referido primeiro compartimento, para o interior do

jj referido segundo compartimento e através da referida membrana.

i]

(j

Ί

, 15^â. - Aparelho de acordo com a

reivindicação 14, caracterizado por o referido sistema de ve

Ί dação se encontrar ele próprio vedado de modo a não poder co municar com os referidos primeiro e segundo compartimentos.

ί! 16^â. - Aparelho próprio para a rea

! lização de uma diálise de equilíbrio, caracterizado por com

preender:

) / um primeiro recipiente que apresenta uma parte própria

ij para conter um primeiro fluído;

=l

um segundo recipiente que apresenta uma parte que é pró

pria para conter um segundo fluído, que se pode introduzir

; no interior do referido primeiro recipiente e que apresenta uma primeira abertura que permite que se estabeleça a comunj_ cação entre as partes dos referidos primeiro e segundo recipientes onde se encontram contidos os fluídos e umas paredes que determinam a formação da referida abertura;

-41uma membrana semi-permeável que cobre a referida primei^ ra abertura existente no referido segundo recipiente;

um sistema de vedação próprio para fazer com que a refe rida membrana estabeleça com as paredes do referido segundo recipiente uma relação de vedação estanque aos fluídos, a fim de impedir de uma maneira substancial que a transferência do fluído para dentro e para fora do referido segundo reci piente não se verifique se não através da referida membrana;

apresentando o referido segundo recipiente uma segunda abertura que permite que se estabeleça uma comunicação dire£ ta entre a referida parte onde se encontra contido o segundo fluído, e a atmosfera ambiente; e

apresentando a referida parte onde se encontra contido o segundo fluído uma configuração tal que as perdas por evaporação que são experimentadas por um dado fluído, e que se verificam a partir da referida parte onde se encontra contido o segundo fluído e através da referida segunda abertura, serem substancialmente iguais aos ganhos osmóticos que são experimentados pelo referido fluído, e que se verificam a par tir da referida parte onde se encontra contido o primeiro flu_í do, para o interior da referida parte onde se encontra contj_ do o segundo fluído e através da referida membrana.

17^â. - Processo para a preparação de uma composição tampão própria para ser utilizada na deter minação de uma substância biologicamente activa que se encoii tra normalmente presente no soro humano, numa forma em que se acha ligada a proteina ou isenta de proteínas, e que denota uma propensão para uma adsorção não específica em relação ao vidro ou ao plástico, caracterizado por ser realizado de maneira a que a referida composição compreenda uma solução aquosa de:

(1) um ácido orgânico com um pKa compreendido entre

-42¹ 7,0 e 7,8, juntamente com um sal apropriado desse mesmo ácido, a fim de fazer com que o pH do referido tampão se man tenha compreendido entre 7,0 e 7,8;

Π

'i (2) uma mistura de gelatina e de imunoglobulina G, en! contrando-se a referida mistura presente numa quantidade su| ficiente para impedir de uma maneira substancial a adsorção ; não específica da referida substância em relação ao vidro ou

i

ao plástico;

: (3) uma mistura de antibióticos numa quantidade sufi ' ciente para suprimir de uma maneira substancial o crescimeni

) to de côcos Gram-negativos, de bactérias Gram-positivas e de fungos no seio do referido tampão; e

(4) um sal ou uma mistura de sais que se encontra(m)

J normalmente presente(s) no soro humano, numa concentração ! substancialmente idêntica àquela em que o sal ou a mistura ! de sais se encontra(m) presente(s) no soro humano, composi; ção essa que é utilizada em combinação com a célula de diá; lise de acordo com as reivindicações 1, 5, 11, 14 ou 16.