JPH0640818B2 - 微生物培養方法、培養用前処理装置及び培養装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、微生物培養方法、培養用前処理装置及び培養
装置に関する。さらに詳しくは、微生物と微生物発育阻
害作用を有する物質を含有する体液から微生物発育阻害
作用を有する物質を吸着除去した体液を増菌用培地に投
入して効率的に微生物を培養する微生物培養方法、培養
用前処理装置及び培養装置に関する。

〔従来の技術〕

従来より、敗血症やエンドトキシンシヨツク等の重症感
染症の確定診断は、感染症患者の血液、髄液、尿等の体
液を培養し、原因菌を同定することにより行われてい
る。

しかしながら、これら患者の体液には通常、検査前に投
与された抗生物質が高濃度で残存しているため、そのま
ま体液を培地に加えただけでは抗生物質の菌に対する発
育阻害作用が働き、菌が充分検出できるまで増殖させる
ことができない。従つて、体液培養法での原因菌の検出
率は極めて低いといわれている。かかる抗生物質の影響
を除くためには、抗生物質の体液中濃度が最低になつた
ときに体液を採取する方法の他に、近年次の方法が検討
され、実施されているものもある。

(1) 培養に供する体液中の抗生物質を最小発育素子濃
度以下にまで不活性化剤で前もつて不活性化する。

(2) 培養に供する体液中の抗生物質を最小発育素子濃
度以下にまでイオン交換樹脂で前もつて除去する（米国
特許第3,531,463号）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、抗生物質の体液中濃度が最低になつたと
きに体液を採取する方法では、抗生物質の体液中濃度が
低くなるまで患者への最適抗生物質の投与が長時間停止
されることになり、患者が危険な状態に陥ることにな
る。上記(1)の方法は、不活性化剤として例えばソジウ
ムポリアネトールスルフエートを増菌培地に直接添加す
るもので、現に添加した培地も市販されてはいるが、検
出率はせいぜい１５％程度で低く、決して有効な方法で
あるとはいい難い。又、(2)の方法は、生理食塩水中に
イオン交換樹脂を懸濁させたものをバイアル瓶に入れて
おき、これに採取した患者体液を加え振とうした後、内
容液を培地に投入する方法であるが、抗生物質は一般に
血中蛋白質であるアルブミンへの吸着性が強く、この方
法では抗生物質、アルブミン、イオン交換樹脂の間に吸
着平衡が成立し、抗生物質濃度を充分下げられない場合
が多い。通常、原因菌を精度よく検出するためには抗生
物質の濃度を１μｇ／ml以下にして培養するのが望まし
いとされており、従つて本発明の目的は、上記問題点が
なく、精度よく原因菌を検出するための微生物培養方
法、培養用前処理装置及び培養装置を提供することにあ
る。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは上記目的を達成するため鋭意検討を重ね、
微生物と微生物発育阻害作用を有する物質を含有する体
液を吸着剤を充填した吸着筒を通過させて微生物培養に
供した場合、極めて効率よく微生物を培養できることを
見出し、本発明に至つた。すなわち本発明は、微生物と
微生物発育阻害作用を有する物質を含有する体液を外気
と接触することなく吸着剤を充填した吸着筒を通過さ
せ、該通過させた混合液を増菌用培地に投入して培養す
ることを特徴とする微生物培養方法、培養用前処理装置
及び培養装置である。

本発明においては、微生物と微生物発育阻害作用を有す
る物質を含有する例えば血液、尿等の体液は微生物培養
に供する前に、吸着剤を充填した吸着筒（以下、単に吸
着筒と略す）を通過せしめる必要がある。かかる吸着剤
としては本発明方法を阻害せずに抗生物質等の微生物発
育阻害作用を有する物質吸着するものであればよく、例
えば活性炭、ヒドロキシアパタイト、正リン酸カルシウ
ム等のリン酸カルシウム系焼結多孔体、多孔性ガラス、
アルミナ、イオン交換樹脂等が挙げられる。これらの吸
着剤は球状でも破砕状でもよく、通常、直径０．１〜
１．０mmのものが実用的であり、好ましく使用される。
又、これらの吸着剤にさらに親水性樹脂を被覆してマイ
クロカプセル化した粒状の吸着剤は、微生物と微生物発
育阻害作用を有する物質を含有する血液、尿等の体液
（以下、被処理液という）を変性させることがないた
め、好ましく使用される。これらの吸着剤のなかでも活
性炭、リン酸カルシウム系焼結多孔体は抗生物質等の微
生物発育阻害を有する物質（以下、阻害物質という）を
よく吸着し、好ましく用いられる吸着剤である。

該吸着筒の形状には特に制限はないが、円筒形のものが
実用的で好ましく用いられる。微生物培養に用いられる
液量は通常５〜２０mlとされているので、これによつて
吸着筒のサイズが規定される。吸着筒のサイズが大きす
ぎると処理後、吸着筒内に被処理液が多量に残留するた
め培養に供する試料量が過小になり、好ましくない。
又、小さすぎれば処理能力上問題がある。これらのこと
から吸着筒内に充填される吸着剤の量は１〜１５mlとす
ることが好ましい。吸着筒のサイズはこの吸着剤を収容
するに必要な大きさのものが要求されるが、更に吸着能
力を充分発揮させるためには、吸着筒の長さと内径との
関係をも考慮するのが好ましい。すなわち、吸着筒の有
効長をＬ(cm)、有効断面の直径（以下、有効内径とい
う）をＤ(cm)とするとき、この比率の好ましい範囲は４
≦L/D≦３０である。L/Dが４よりも小さいか又は３０よ
りも大きいと吸着効率が悪くなる傾向がある。

又、被処理液を流す速度も自由であるが、阻害物質の吸
着効果を上げるためには、以下に規定する範囲にするこ
とが好ましい。すなわち被処理液量をＱ(ml)、吸着筒の
有効長をＬ(cm)、有効内径をＤ(cm)とするとき被処理液
の流速Ｖ(ml/min)を とすることが好ましい。流速が よりも大きいと阻害物質の吸着効果が低く、吸着剤の種
類によつては圧損が大きくなる。又、余り小さいと処理
に時間がかかり実用的ではない。通常は２０分以内に処
理が終るように上述の式を満足する範囲で吸着筒の有効
内径および有効長が決められる。

一例として、有効長８cm、有効内径１．４cmの吸着筒を
用いて１０mlの液を処理するときの操作条件を試算して
みる。Ｌ＝８、Ｄ＝１．４、Ｑ＝１０であるから、０．
５≦Ｖ≦３．２となり、従つて被処理液の流速を０．５
〜３．２ml／minの範囲とするのが好ましい。

被処理液として血液を使用する場合、吸着剤はヘパリ
ン、クエン酸ソーダ等の抗血液凝固剤を含有した脱気し
た約０．９％の生理食塩水又はそれと等浸透圧の為害性
のない脱気された液体に浸漬された後、乾燥させること
なく湿潤状態で吸着筒に充填される。吸着筒は生理食塩
水又はそれと等浸透圧の為害性のない脱気された液体で
満たされている方が吸着効率がよく好ましい。吸着除去
すべき阻害物質が蛋白質と結合している場合には、上記
抗血液凝固剤にさらに蛋白質キレート剤（例えばエチレ
ンジアミン４酢酸等）を含有させることが好ましい。か
かる蛋白キレート剤を使用すれば蛋白から阻害物質を切
り離すことができ、阻害物質を効率よく除去することが
できる。吸着筒、導管等は使用前に放射線滅菌、高圧蒸
気滅菌等の滅菌処理されるが、滅菌処理として１１０〜
１４０℃の水蒸気を使用する場合には、吸着筒に入れる
抗血液凝固剤としては熱安定性の高いクエン酸ソーダが
好ましい。クエン酸ソーダの場合、生理食塩液10mlに対
し２５mg含有させるのが好ましい。又、酸素の存在は本
発明方法を実施するうえで好ましくないので窒素等の不
活性ガスで導管をも含めた系内を充分置換しておくのが
よい。

以下、本発明の培養方法、培養用前処理装置及び培養装
置を具体的に図によつて説明する。第１図は本発明の微
生物培養用前処理装置の一例を示した図であり、４は被
処理液導入口３と処理液導出口６を有する吸着剤を充填
した吸着筒である。該導入口は通常カバー１を有するゴ
ム状の弾性体２（具体的には混注ボタン）で密封されて
おり、ここから注射器等により被処理液が注入される。
吸着筒は前述した吸着剤が充填されており、通常は垂直
に設置して使用される。

吸着筒の下部には、吸着剤が落下しないようにナイロン
等のメツシユフイルター５が設けられる。

導管８の長さにはとくに制限はないが、短かすぎでも長
すぎても不便であるので通常、導管部には送液ポンプを
設置して、かつ操作しやすい２０〜４０cmの範囲で使用
するのが実用的である。又導管の管径についてもとくに
制限はないが、通常１〜５mmのものが実用的であり好ま
しい。導管の先端には増菌用培養ボトルのゴム栓に穿刺
するために注射針等の穿刺部が接続されており、該穿刺
部はカバー１０で密封されている。カバーは装置全体を
密閉するとともに穿刺部表面の外部微生物による汚染を
も防止する機能をも有する。穿刺部の大きさは被処理液
が無理なく増菌培養ボトルへ導入されるものであれば何
ら制限はない。又、図に示したように保護カバーにシリ
コーン等のボール１１を入れて穿刺部を穿刺し、密閉す
る方法もとられる。導管は必要に応じて分岐管７で複数
に分岐されて用いられるが、通常は２〜４本で用いられ
る。

第２図は本発明の培養装置の一例を示した図であり、導
管部に送液ポンプ１３が設置され、かつ導管先端部の穿
刺部は増菌用培養ボトル１４と連結されている状態を示
している。

又、本発明においては、同図に示すような体液貯留用バ
ツグ１２を吸着筒の上部に設けてもよい。該バツグは５
〜３０mlの内容積のものが適当であり、内部には必要に
応じてゴム状弾性体２を通じて少量の血液凝固防止剤が
添加され、空間部は窒素ガス等の不活性ガスで置換して
使用するのが好ましい。

以上述べた吸着筒、導管及び液貯留用バツグの材質は被
処理液を変性させないものであればとくに制限はなく、
通常はポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニ
ル、ポリカーボネート、シリコーン等のプラスチツクが
用いられる。

送液ポンプ及び増菌用培養ボトル以外は包装され、放射
線あるいは高圧蒸気で滅菌して供給される。

本発明の装置は通常次の様な操作で被処理液の処理に供
される。

(1) 装置を包装よりとり出し、導管を送液ポンプにセ
ツトし、注射針を増菌用培養ボトルに穿刺する。

(2) 採取した体液（被処理液）の入つた注射器の針を
吸着筒上部の混注ボタンに穿刺する。

(3) 送液ポンプを始動し、被処理液を培養ボトルに送
入する。

増菌培養ボトルは通常減圧になつているのでスムーズに
被処理液を流すことができる。

増菌後、培養ボトルを装置からはずし、所定の条件で固
定用培地で培養することにより菌の種類を精度よく決め
ることができる。従つて、適切な抗生物質とその投与量
を設定することができ、治療にフイードバツクすること
ができる。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例１ 平均粒子径０．８mmの粒状活性炭（呉羽化学工業(株)製
ＢＡＣ−ＭＵ−Ｌ）１２mlを生理食塩水に浸漬後、クエ
ン酸ナトリウム２５mg含有の生理食塩水とともに内径
１．４cm、高さ７．８cmのポリカーボネート製円筒状カ
ラムに充填した。ヒト全血１８mlに抗生物質としてセフ
アゾリンナトリウムを１mg／mlの濃度になるように加
え、上記カラムに流速１ml／minで流した。流出してき
た血液中の抗生物質濃度を高速液体クロマトグラフイー
で測定したところ、０．４μｇ／ml以下であつた。

実施例２〜４ 抗生物質としてアンピシリンナトリウム、ペントシリン
ナトリウム及びセフオペラゾンナトリウムを用いた以外
は実施例１と同様の試験を行つた（それぞれ実施例２、
３及び４）が、処理後の血液中の抗生物質濃度はいずれ
も０．４μｇ／ml以下であつた。

比較例１ 実施例１で用いたものと同じ活性炭１．５ｇを10ccの注
射筒に入れたものを用意した。これに実施例１で用いた
抗生物質添加ヒト全血５mlを加え、１２０cpmで１０分
間振とう後、この血液中の抗生物質濃度を測定したとこ
ろ２μｇ／mlであつた。

比較例２ ソジユームポリアニトールスルフエイト５mgを含む生理
食塩水に陽イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＣ８
４）、陰イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ９３）
各々１０mlを加え全量を２５mlとする。これをバイアル
瓶に入れ実施例１で用いた抗生物質添加ヒト全血８mlを
加え、１２０cpmで１５分間振とう後、この血液中の抗
生物質濃度を測定したところ２μｇ／mlであつた。

実施例５ 実施例１で用いたものと同じ活性炭６mlを有効内径１．
０cm、有効長７．７cmのポリプロピレン製円筒状カラム
に充填し、オートクレーブ滅菌した。ヒト全血１８mlに
セフアゾリンナトリウムを１mg／ml、黄色ブドウ状球菌
を１０³個／mlの割合で加え、０．８ml／minの速度で上
記カラムに流し、流出してきた血液をトリプチケース・
ソイ・プロス培地（ＢＢＬ社）に注入した。

別に空試験として処理前の血液５mlを同じ培地に入れ、
３７℃で７日間培養した。処理したものにはブドウ状球
菌の発生がみられたが、処理前のものにはブドウ状球菌
の発明がみられず、本発明の方法による効果は明らかで
ある。

実施例６ 平均粒子径０．１mm、平均細孔径２０nmの破砕状ヒドロ
キシアパタイト（三井東圧化学(株)製ＨＣＡ−１００
Ｘ）を、有効内径０．８cm、有効長１２cmのポリ塩化ビ
ニル製カラムに生理食塩水とともに充填し、放射線滅菌
した。次にアンピシリンナトリウム１mg／ml、大腸菌を
１０⁴個／mlの割合で加えた尿モデル液（１中に食塩
９ｇ、尿素１０ｇ、アルブミン４０mgを含む）１０mlを
流速０．７ml／minで処理し、実施例５と同様の培養を
行つた。処理前のものでは大腸菌の発生がみられなかつ
たが、処理後のものでは、２日目に培地中での大腸菌の
増殖がみられた。

〔発明の効果〕

以上のように、本発明の培養方法及び装置によれば、微
生物と微生物発育阻害作用を有する物質を含有する体液
から極めて効率的に阻害物質を吸着除去できるので、か
かる処理を施した体液を増菌用培地で微生物培養に供す
ることにより、効率よく微生物を培養することができ
る。増菌した微生物は同定しやすく高精度で菌の種類を
決めることができるので、適切な抗生物質とその投与量
を設定することができ、本発明の有用性は大きい。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の微生物培養前処理装置の一例を示す概
略図であり、第２図は本発明の微生物培養装置の一例を
示す概略図である。 １……導入口カバー、８……導管 ２……ゴム状弾性体、９……穿刺部 ３……被処理液導入口、10……穿刺部カバー ４……吸着筒、11……シリコーンボール ５……メツシユフイルター、12……体液貯留用バツグ ６……処理液導出口、13……送液ポンプ ７……分岐管、14……増菌用培養ボトル

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:44） (72)発明者 神応 善宣 岡山県岡山市南輝２丁目26−38 (72)発明者 高木 俊昭 岡山県倉敷市酒津1660 (56)参考文献 特開 昭60−232084（ＪＰ，Ａ) 大岳望（外４名）「物質の単離と精製 （東京大学出版会）」（昭56−11−15) Ｐ．57−87

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】微生物と微生物発育阻害作用を有する物質
   を含有する体液を外気と接触することなく吸着剤を充填
   した吸着筒を通過させ、該通過させた体液を増菌用培地
   に投入して培養することを特徴とする微生物培養方法。
2. 【請求項２】該吸着剤は活性炭である特許請求の範囲第
   (1)項記載の微生物培養方法。
3. 【請求項３】該吸着剤はリン酸カルシウム系焼結多孔体
   である特許請求の範囲第(1)項記載の微生物培養方法。
4. 【請求項４】体液導入口と導出口を有する吸着剤を充填
   した吸着筒と導管とから構成された微生物培養用前処理
   装置であって、該吸着筒の導入口は穿刺可能なゴム状弾
   性体で密封され、該吸着筒の導出口は先端に密封された
   穿刺部を有する該導管に連結されている微生物培養用前
   処理装置。
5. 【請求項５】該導管は複数の導管である特許請求の範囲
   第(4)項記載の微生物培養用前処理装置。
6. 【請求項６】該吸着筒は体液貯留用バッグを具えた吸着
   筒である特許請求の範囲第(4)項又は第(5)項記載の微生
   物培養用前処理装置。
7. 【請求項７】体液導入口と導出口を有する吸着剤を充填
   した吸着筒、導管、送液ポンプ及び増菌用培養ボトルと
   から構成された微生物培養装置であって、該吸着筒の導
   入口は穿刺可能なゴム状弾性体で密封され、該吸着筒の
   導出口は先端に密封された穿刺部を有する該導管に連結
   され、該導管には送液ポンプが設置され、さらに該導管
   は先端の穿刺部を通じて増菌用培養ボトルと連結されて
   いる微生物培養装置。
8. 【請求項８】該導管は複数の導管である特許請求の範囲
   第(7)項記載の微生物培養装置。
9. 【請求項９】該吸着筒は体液貯留用バッグを具えた吸着
   筒である特許請求の範囲第(7)項又は第(8)項記載の微生
   物培養装置。