BR112020021030A2

BR112020021030A2 - Método de monitoramento da oxigenação de um enxerto e método de determinação da viabilidade de um enxerto

Info

Publication number: BR112020021030A2
Application number: BR112020021030-7A
Authority: BR
Inventors: Franck Zal
Original assignee: Hemarina
Priority date: 2018-04-17
Filing date: 2019-04-15
Publication date: 2021-01-19
Also published as: FR3080002B1; FR3080002A1; US20210172900A1; EP3780954A1; WO2019201863A1

Abstract

a presente invenção se refere a um método para monitorar a oxigenação de um enxerto, compreendendo: a) misturar uma solução de armazenamento de órgãos de preferência com pelo menos uma molécula escolhida a partir de hemoglobina extracelular de anelídeos, suas globinas e seus protômeros de globina, a fim de obter uma composição, em um recipiente vedado; b) imersão do enxerto na composição obtida em a); c) a introdução de uma sonda de oxigênio na composição obtida em a), ou na composição da etapa b); e d) o fechamento do recipiente hermético, as etapas c) e d) sendo realizadas simultaneamente ou em qualquer ordem. também se refere a um método para determinar a viabilidade de um enxerto.

Description

DE MONITORAMENTO DA OXIGENAÇÃO DE UM ENXERTO E

[001] A presente invenção se refere a um método para monitorar a oxigenação de um enxerto enquanto aguarda seu transplante.

[002] A entrega de enxertos requer condições higiênicas e de temperatura particularmente rigorosas, a fim de manter o enxerto em um estado adequado para ser implantado. O procedimento de entrega de enxerto convencional inclui uma primeira etapa de explante durante a qual o enxerto é retirado de um doador em condições assépticas, geralmente na sala de cirurgia.

O enxerto é então colocado em um frasco vedado que é colocado em um primeiro saco plástico hermeticamente fechado por um clipe de fechamento.

Este conjunto é então colocado em um segundo saco plástico do mesmo tipo e fechado da mesma forma. O conjunto é colocado em um refrigerador de transporte isolante cheio de uma substância refrigerante (por exemplo gelo e/ ou géis eutéticos) que permite manter o enxerto a uma temperatura ligeiramente acima de 0 °C. Os sachês que recobrem o frasco hermético protegem o enxerto de qualquer contato com a substância refrigerante e com o ar ambiente potencialmente portador de germes. Ao chegar ao destino, o conjunto que consiste em dois sachês e o frasco contendo o enxerto é retirado do refrigerador de transporte isolante e introduzido na sala de implante, que também é asséptica.

[003] Este método é, portanto, complicado: a embalagem deve ser estéril, adequada ao órgão, e o transporte deve ser feito rapidamente.

[004] Apesar disso, o transplante tem uma vida útil limitada, que varia de acordo com o órgão (por exemplo, 4 horas para um coração, 10 horas para um fígado e pulmões; 36 horas para um rim).

[005] Existe, portanto, a necessidade de um método que permita aumentar a viabilidade do enxerto, inclusive durante o seu transporte. Este método deve ser simples de implementar e deve ser compatível com todos os meios de transporte (rodoviário, mas também aéreo). Esse método deve permitir a avaliação fisiológica do enxerto de maneira abrangente e rápida.

[006] A Depositante encontrou agora um método que responde a este problema. Esse método é simples de implementar e permite prolongar a vida útil do enxerto. Em particular, o método de acordo com a invenção permite avaliar a oxigenação do enxerto.

[007] O objeto da invenção é, portanto, um método para monitorar a oxigenação de um enxerto, compreendendo: a) fornecer uma solução de armazenamento de órgãos em um recipiente vedado. De preferência, a solução de armazenamento de órgãos é misturada com pelo menos um transportador de oxigênio de modo a obter uma composição. De preferência, a solução de armazenamento de órgãos é misturada com pelo menos um transportador de oxigênio selecionado a partir de hemoglobina extracelular de anelídeos, suas globinas e seus protômeros de globina, a fim de obter uma composição, no recipiente vedado; b) imergir o enxerto na solução ou composição obtida em a), para obter uma segunda composição; c) a introdução de uma sonda de oxigênio na solução ou na composição obtida em a), ou na segunda composição da etapa b); d) o fechamento do recipiente hermético, e - as etapas c) e d) sendo realizadas simultaneamente ou em qualquer ordem.

[008] O método de acordo com a invenção refere-se, portanto, a um parâmetro fisiológico, isto é, a quantidade de oxigênio dissolvido presente no meio que envolve o enxerto. Isso, portanto, reflete com precisão a viabilidade do enxerto.

[009] O método de acordo com a invenção pode incluir uma etapa e) de transporte do recipiente vedado, em particular para o local de transplante do enxerto para um receptor.

[010] O receptor é preferencialmente um mamífero. De preferência, o receptor é um ser humano, em particular à espera de um transplante, ou então um mamífero não humano, por exemplo um porco.

[011] O método de acordo com a invenção compreende uma etapa a) de fornecer uma solução de armazenamento de órgãos em um recipiente vedado. Essa solução de armazenamento de órgãos é, em particular, conforme descrito abaixo.

[012] De preferência, a solução de armazenamento de órgãos é misturada com pelo menos um transportador de oxigênio. De preferência, a solução de armazenamento de órgãos compreende pelo menos um transportador de oxigênio. Um tal transportador de oxigênio é vantajosamente escolhido entre as moléculas que se ligam ao oxigênio de uma forma reversível.

De preferência, esse transportador é escolhido entre a hemoglobina extracelular de anelídeos, suas globinas e seus protômeros de globina.

[013] De preferência, o método de acordo com a invenção compreende, portanto, uma etapa a) de mistura de uma solução de armazenamento de órgão com pelo menos um transportador de oxigênio, de preferência pelo menos uma molécula escolhida entre hemoglobina extracelular de anelídeos, suas globinas e seus protômeros de globina, a fim de para obter uma composição, em um recipiente vedado.

[014] A composição da etapa a) compreende: - pelo menos um transportador de oxigênio, de preferência pelo menos uma globina, um protômero de globina ou uma hemoglobina extracelular de anelídeos, e - uma solução de armazenamento de órgãos.

[015] O transportador de oxigênio de acordo com a invenção é de preferência pelo menos uma molécula selecionada a partir de entre a hemoglobina extracelular de anelídeos, as suas globinas e os seus protômeros de globina. A hemoglobina extracelular dos anelídeos está presente em todas as três classes de anelídeos: Poliquetas, Oligoquetas e Aquetas. Falamos de hemoglobina extracelular porque ela não está naturalmente contida em uma célula e pode, portanto, circular livremente no sistema sanguíneo sem modificação química para estabilizá-la ou torná-la funcional.

[016] A hemoglobina extracelular de anelídeos é um biopolímero gigante com peso molecular entre 2.000 e 4.000 kDa, feito de aproximadamente 200 cadeias polipeptídicas que variam de 4 a 12 tipos diferentes, geralmente agrupados em duas categorias.

[017] A primeira categoria, compreendendo 144 a 192 elementos, agrupa as chamadas cadeias polipeptídicas que carregam um sítio ativo do tipo heme e são capazes de se ligar reversivelmente ao oxigênio; são cadeias do tipo globina cujas massas estão entre 15 e 18 kDa e que são muito semelhantes às cadeias do tipo e dos vertebrados.

[018] A segunda categoria, compreendendo 36 a 42 elementos, agrupa as cadeias polipeptídicas denominadas ou com pouco ou nenhum sítio ativo, mas permitindo a montagem de subunidades denominadas duodécimos ou protômeros.

[019] Cada molécula de hemoglobina consiste em dois hexágonos sobrepostos que foram chamados de bicamada hexagonal, enquanto cada hexágono é formado pela montagem de seis subunidades (ou ou na forma de uma gota d A molécula nativa é composta por doze dessas subunidades (dodecâmero ou protômero). Cada subunidade possui massa molecular entre 200 e 250 kDa e constitui a unidade funcional da molécula nativa.

[020] De preferência, a hemoglobina extracelular de anelídeos é escolhida a partir das hemoglobinas extracelulares de Anelídeos Poliquetas, de preferência das hemoglobinas extracelulares da família Arenicolidae e das hemoglobinas extracelulares da família Nereididae. Ainda mais preferencialmente, a hemoglobina extracelular de anelídeos é escolhida de hemoglobina extracelular de Arenicola marina e hemoglobina extracelular de Nereis, mais preferencialmente hemoglobina extracelular de Arenicola marina.

[021] De acordo com a invenção, a composição também pode compreender pelo menos um protômero de globina da hemoglobina extracelular de anelídeos. O referido protômero constitui a unidade funcional da hemoglobina nativa, como indicado acima.

[022] Finalmente, a composição também pode incluir pelo menos uma cadeia de globina da hemoglobina extracelular de anelídeos. Uma tal cadeia de globina pode, em particular, ser escolhida a partir de cadeias de globina do tipo Ax e/ ou Bx de hemoglobina extracelular de anelídeos.

[023] A hemoglobina extracelular de anelídeo e seus protômeros de globina têm atividade intrínseca da superóxido dismutase (SOD) e, portanto, não requerem antioxidantes para funcionar, ao contrário do uso da hemoglobina de mamíferos, para a qual as moléculas antioxidantes estão contidas dentro dos glóbulos vermelhos e não estão relacionadas com hemoglobina. Por outro lado, a hemoglobina extracelular de anelídeos, seus protômeros de globina e/ ou suas globinas não requerem um cofator para funcionar, ao contrário da hemoglobina de mamíferos, especialmente humanos. Finalmente, a hemoglobina extracelular de anelídeos, seus protômeros de globina e/ ou suas globinas como não possuem um tipo sanguíneo, permitem evitar qualquer problema de reação imunológica.

[024] Como demonstrado nos exemplos, a hemoglobina extracelular de anelídeos, em particular a hemoglobina extracelular de Arenicola marina, permite que o oxigênio seja transferido para o enxerto por várias horas,

por exemplo pelo menos 10 horas, de preferência pelo menos 15 horas, de preferência pelo menos 20 horas, de preferência pelo menos 21, 22, 23, 25 ou 28 horas, especialmente em comparação com a solução de armazenamento de órgãos sozinha.

[025] Além disso, a hemoglobina extracelular dos anelídeos, em particular a hemoglobina extracelular de Arenicola marina, permite manter a pO2 da solução ou composição na qual o enxerto se banha a um nível constante, por várias horas, por exemplo pelo menos 10 horas, preferencialmente pelo menos 15 horas, preferencialmente pelo menos 20 horas, preferencialmente pelo menos 21, 22, 23, 25, 28 ou 30 horas.

[026] A solução de armazenamento de órgãos ajuda a manter o metabolismo básico das células que constituem o transplante. Ele atende a um triplo objetivo: lavar o sangue arterial do enxerto, levar o enxerto uniformemente à temperatura de armazenamento desejada, proteger e prevenir lesões causadas por isquemia e reperfusão e otimizar a recuperação da função. A solução de armazenamento de órgãos é, portanto, clinicamente aceitável.

[027] A solução de armazenamento de órgãos é uma solução aquosa com um pH entre 6,5 e 7,5, compreendendo sais, de preferência íons de cloreto, sulfato, sódio, cálcio, magnésio e jarássio; açúcares, de preferência manitol, rafinose, sacarose, glicose, frutose, lactobionato (que é um agente impermeabilizante) ou gluconato; antioxidantes, preferencialmente glutationa; agentes ativos, de preferência inibidores da xantina oxidase, tais como alopurinol, lactatos, aminoácidos, tais como histidina, ácido glutâmico (ou glutamato), triptofano; e opcionalmente coloides tais como hidroxietil amido, polietileno glicol ou dextrano.

[028] De acordo com uma forma de realização preferencial da invenção, a solução de armazenamento de órgãos é escolhida entre: - a solução da Universidade de Wisconsin (UW ou Viaspan®),

que tem uma osmolalidade de 320 mOsmol/ kg e um pH de 7,4, da seguinte formulação para um litro, em água: - Lactobionato de jarássio: 100 mM;

- KOH: 100 mM;

- NaOH: 27 mM;

- KH2PO4: 25 mM;

- MgSO4: 5 mM;

- Rafinose: 30 mM;

- Adenosina: 5 mM;

- Glutationa: 3 mM;

- Alopurinol: 1 mM;

- Hidroxietil amido: 50 g/ l;

- IGL-1®, tendo uma osmolalidade de 320 mOsm/ kg e um pH de 7,4, com a seguinte formulação, para um litro em água:

- NaCl: 125 mM;

25 mM;

5 mM;

- Rafinose: 30 mM;

- Lactobionato de jarássio: 100 mM;

- Glutationa: 3 mM; - Alopurinol: 1 mM;

- Adenosina: 5 mM; - Polietileno glicol (peso molecular: 35 kDa): 1 g/ l;

- Celsior®, tendo uma osmolalidade de 320 mOsm/ kg e um pH de 7,3, com a seguinte formulação para um litro em água:

- Glutationa: 3 mM;

- Manitol: 60 mM;

- Ácido lactobiônico: 80 mM;

- Ácido glutâmico: 20 mM;

- NaOH: 100 mM; - Cloreto de cálcio dihidratado: 0,25 mM;

- MgSO4: 1,2 mM;

- KCl: 15 mM;

- Hexahidrato de cloreto de magnésio: 13 mM;

- Histidina: 30 mM; - SCOT 15 Multi Organs Abdominaux® e SCOT 30 Vascular

Grafts® da Macopharma, ambos compreendendo, em particular, polietileno glicol de alto peso molecular (20 kDa);

- BMPS Belzer®, ou solução de perfusão de máquina Belzer,

ou KPS1, compreendendo, em particular, 100 mEq/ l de sódio, 25 mEq/ l de jarássio, um pH de 7,4 à temperatura ambiente e tendo uma osmolaridade de

300 mOsm/ l;

- Solução Custodiol® HTK, da seguinte formulação para um litro em água, sendo o pH 7,20 à temperatura ambiente, e a osmolalidade sendo

310 mOsm/ kg:

- NaCl: 18,0 mM;

- KCl: 15,0 mM;

- KH2PO4: 9 mM;

- 2-cetoglutarato de jarássio hidrogenado: 1,0 mM;

- Hexahidrato de cloreto de magnésio: 4,0 mM;

- Histidina, HCl;

- H2O: 18,0 mM;

- Histidina: 198,0 mM;

- Triptofano: 2,0 mM;

- Manitol: 30,0 mM;

- Cloreto de cálcio dihidratado: 0,015 mM;

- Euro-Collins®, tendo uma osmolalidade de 355 mOsm/ kg e um pH de 7,0, e com a seguinte formulação para um litro em água:

- Sódio: 10 mM; - Jarássio: 115 mM;

- Cloreto: 15 mM;

- H2PO4-: 15 mM;

- HPO42-: 42,5 mM;

- HCO3-: 10 mM;

- Glicose: 194 mM;

- Soltran®, tendo uma osmolalidade de 486 mOsm/ kg e um pH de 7,1, e da seguinte formulação para um litro em água:

- Sódio: 84 mM;

- Jarássio: 80 mM;

- Magnésio: 41 mM;

- Sulfato -: 41 mM; - Manitol: 33,8 g/ l;

- Citrato: 54 mM;

- Glicose: 194 mM;

- Perfadex®, com osmolaridade de 295 mOsmol/ l e da seguinte formulação em água: - 50g/ l de dextrano 40 (peso molecular: 40.000);

- Na+: 138 mM;

- K+: 6 mM;

- Mg2+: 0,8 mM;

- Cl-: 142 mM;

- O42-: 0,8 mM;

- (H 2PO4- + HPO42-): 0,8 mM; e

- Glicose: 5 mM;

- Ringer lactate®, da seguinte formulação, em água, sendo o pH entre 6,0 e 7,5 à temperatura ambiente e tendo uma osmolaridade de 276,8 mOsmol/ l: - Na+: 130 mM;

- K+: 5,4 mM;

- Ca2+: 1,8 mM;

- Cl-: 111 mM;

- Lactatos: 27,7 mM;

- Plegisol®, da seguinte formulação, em água:

- KCl: 1,193 g/ l;

- MgCl 2, 6 H2O: 3,253 g/ l;

- NaCl: 6,43 g/ l;

- CaCl2: 0,176 g/ l;

- Solução do Hôpital Edouard Henriot, com a seguinte formulação em água, sendo o pH igual a 7,4 à temperatura ambiente e tendo uma osmolaridade de 320 mOsmol/ l:

- KOH: 25 mM;

- NaOH: 125 mM; - KH2PO4: 25 mM;

- M MgCl2: 5 mM;

- MgSO4: 5 mM;

- Rafinose: 30 mM;

- Lactobionato: 100 mM;

- Glutationa: 3 mM; - Alopurinol: 1 mM;

- Adenosina: 5 mM; - Hidroxietil amido 50g/ l;

- e a solução Steen®, composta por albumina sérica humana,

dextrana e eletrólitos extracelulares com baixa concentração de jarássio.

[029] Todas essas soluções de armazenamento de órgãos são produtos comerciais.

[030] De preferência, a composição da etapa a) tem um pH entre 6,5 e 7,6 e compreende: - pelo menos uma globina, um protômero de globina ou uma hemoglobina extracelular de anelídeos, de preferência Arenicolidae; - íons cálcio, preferencialmente em uma quantidade entre 0 e 0,5 mM; - KOH, preferencialmente em uma quantidade entre 20 e 100 mM; - NaOH, preferencialmente em uma quantidade entre 20 e 125 mM; - KH2PO4, preferencialmente em uma quantidade entre 20 e 25 mM; - MgCl2, preferencialmente em uma quantidade entre 3 e 5 mM; - pelo menos um açúcar escolhido a partir de rafinose e glicose, de preferência em uma quantidade entre 5 e 200 mM; - adenosina, preferencialmente em uma quantidade entre 3 e 5 mM; - glutationa, de preferência em uma quantidade entre 2 e 4 mM; - alopurinol, preferencialmente em uma quantidade entre 0 e 1 mM; e - pelo menos um composto escolhido de hidroxietil amido, polietileno glicois de diferentes pesos moleculares e albumina de soro humano, preferencialmente em uma quantidade entre 1 e 50 g/ l.

[031] Normalmente, a hemoglobina extracelular de anelídeos, seus protômeros de globina e/ ou suas globinas, está presente em uma concentração, em relação ao volume final da composição, de entre 0,001 mg/ ml e 100 mg/ ml, de preferência entre 0,005 mg/ ml e 20 mg/ ml, mais preferencialmente entre 0,5 mg/ ml e 5 mg/ ml, em particular 1 mg/ ml.

[032] Normalmente, a composição da etapa a) tem uma osmolaridade entre 250 e 350 mOsm/ l, de preferência entre 275 e 310 mOsm/ l, mais preferencialmente de cerca de 302 mOsm/ l.

[033] O recipiente vedado utilizado no método de acordo com a invenção, em particular na etapa a), é qualquer recipiente adequado para transportar o enxerto. Esses recipientes são conhecidos do estado da técnica.

Em particular, o recipiente pode ser conforme descrito no pedido FR 2 994 163.

De preferência, o recipiente vedado pode corresponder ao kit Biotainer 2.8l.

Pode estar incluído em uma maleta de transporte, como a comercializada sob o nome Vitalpack® pela E3 Cortex.

[034] De preferência, o recipiente vedado é um frasco (ou embalagem primária rígida) de tamanho suficiente para conter o enxerto e a composição da etapa a) fechado com uma tampa com uma alça. De preferência, a tampa compreende uma abertura, de preferência circular, permitindo a passagem da sonda de oxigênio. Esta abertura é à prova d as bordas da abertura são preferencialmente revestidas com um selo à prova d e permitem que a sonda de oxigênio seja fixada.

[035] De preferência, o recipiente vedado é colocado em um recipiente de plástico flexível conforme definido abaixo, definindo um primeiro volume interior hermético denominado volume útil e um segundo volume hermético denominado volume de reserva adjacente ao primeiro volume, um elemento de vedação que se estende entre os dois volumes para definir um limite hermético entre os dois volumes. Em particular, o recipiente vedado é colocado no volume útil. Finalmente, o recipiente vedado, colocado no volume útil do recipiente, pode ser colocado em uma bolsa de transporte. Uma substância refrigerante, especialmente usada durante o transporte, pode ser colocada no recipiente.

[036] De preferência, o recipiente de plástico flexível define um primeiro volume interno vedado (volume útil) e um segundo volume vedado (volume de reserva) adjacente ao primeiro volume, um elemento de vedação que se estende entre os dois volumes para definir um limite hermético entre os dois volumes. O primeiro volume compreende na sua extremidade oposta ao segundo volume um dispositivo para abrir e selar hermeticamente um primeiro acesso ao primeiro volume, o segundo volume sendo moldado de modo que um recorte através do segundo volume libere duas porções de pega do recipiente, a separação do qual remove a borda hermética entre os dois volumes para formar um segundo acesso ao primeiro volume distinto do primeiro acesso. Assim, o corte do volume de reserva protege o elemento de vedação de qualquer retenção de líquido, em particular da substância refrigerante utilizada durante o transporte.

Em particular, quaisquer vestígios de líquido permanecem na parede externa do recipiente, enquanto o interior das porções de pega (e, portanto, o elemento de vedação) são preservados de qualquer poluição. A separação das porções de pega garante que nenhuma poluição possa migrar para o elemento de vedação.

[037] A introdução do recipiente vedado através de um primeiro acesso e sua extração através de um segundo acesso protege o recipiente vedado, evitando que este último seja exposto a uma possível contaminação do primeiro acesso que teria ocorrido durante as operações de embalagem.

[038] Vantajosamente, tal recipiente é produzido sobrepondo duas folhas de material plástico flexível com bordas livres unidas entre si. Desta forma, o recipiente pode ser facilmente feito nas dimensões do conteúdo (recipiente vedado). As bordas unidas das folhas de plástico podem ser unidas usando ligações destacáveis. Isso permite então, por simples tração, uma abertura corolária do sachê em todo o seu comprimento e liberta o conteúdo sem que seja necessário enrolar a embalagem em torno do recipiente lacrado.

Vantajosamente, o elemento de vedação compreende uma conexão destacável entre duas superfícies de plástico.

[039] No final da etapa a), uma solução de armazenamento de órgãos é assim obtida e contida em um recipiente vedado.

[040] No final da etapa a), uma composição é preferencialmente obtida, com base em hemoglobina, globina ou protômero de globina de anelídeo e uma solução de armazenamento de órgão, contida em um recipiente vedado.

[041] A etapa b) compreende então a imersão do enxerto nesta composição. O enxerto pode ser qualquer órgão que possa ser transplantado.

De preferência, o enxerto é um rim, um coração, um pâncreas, um pulmão, um fígado ou então uma unidade coração-pulmão.

[042] No final da etapa b), obtém-se então um enxerto que é imerso na solução obtida na etapa a) ou na composição obtida na etapa a). De preferência, o enxerto está completamente imerso na solução ou na composição.

[043] Assim, a quantidade de solução ou composição utilizada varia de acordo com o volume do enxerto. Por exemplo, a proporção de peso composição (mililitro): enxerto (grama) está entre 2: 1 e 4: 1.

[044] Então, o método de acordo com a invenção compreende a introdução de um sensor de oxigênio na solução ou composição obtida em a), ou na composição da etapa b): esta é a etapa c).

[045] É importante observar que a sonda de oxigênio é introduzida diretamente na composição, e não no enxerto. Na verdade, o monitoramento clássico da oxigenação do enxerto normalmente inclui a avaliação da taxa de consumo de oxigênio do órgão total (WOOCR para taxa de consumo de oxigênio de órgão inteiro) e usa uma sonda de oxigênio que é colocada diretamente nos sistemas de irrigação do enxerto, por exemplo na artéria e veia (portanto a montante e a jusante) do enxerto. Essa manipulação não é necessariamente fácil de implementar, leva algum tempo (pelo menos alguns minutos) e pode ser prejudicial ao enxerto.

[046] Pelo contrário, de acordo com o método da presente invenção, a sonda de oxigênio é introduzida diretamente na composição ou na solução na qual o enxerto é banhado. Isso evita qualquer etapa invasiva no enxerto.

[047] Assim, a etapa c) do método de acordo com a invenção compreende preferencialmente a introdução de uma única sonda de oxigênio na solução ou composição obtida em a), ou na composição da etapa b). A sonda de oxigênio é preferencialmente única. Em particular, o método de acordo com a invenção não usa duas sondas de oxigênio.

[048] A sonda de oxigênio introduzida, em particular, não é colocada em contato com o enxerto, em particular não diretamente no sistema de irrigação do enxerto (isto é, artéria ou veia). De preferência, a sonda de oxigênio é introduzida na solução de armazenamento de órgãos compreendendo pelo menos um transportador de oxigênio, no qual o enxerto se banha.

[049] A sonda de oxigênio, ou oxímetro, utilizada torna possível medir a concentração de oxigênio molecular na mistura líquida obtida em a) ou b), portanto, medir a quantidade de oxigênio dissolvido presente na solução ou composição da etapa a) ou na a composição da etapa b). Essa medida evita qualquer etapa invasiva do enxerto.

[050] De preferência, a sonda de oxigênio é um eletrodo Clark. Compreende uma cabeça de sonda revestida com uma membrana, a cabeça de sonda consistindo em um eletrodo composto por um cátodo de platina e um ânodo de prata imerso em um eletrólito (em particular uma solução alcalina de fosfato de sódio Na3PO4, por exemplo a 50 g/ l). O conjunto eletrodo/ eletrólito é separado do meio líquido pela membrana, que é permeável ao dioxigênio, mas impermeável à água e íons.

[051] O princípio de funcionamento é o seguinte: uma diferença de potencial (por exemplo 800 mV) é estabelecida entre o ânodo e o cátodo, o oxigênio presente entre os eletrodos é reduzido. A intensidade da corrente resultante é proporcional à concentração de oxigênio no eletrólito.

[052] De preferência, de acordo com outra forma de realização, a sonda de oxigênio é um sensor para medir o oxigênio dissolvido por medição óptica, em particular por luminescência. Nesse caso, não inclui membrana nem eletrólito. Essa sonda está disponível comercialmente, em particular sob a referência Optod (gama Digisens) da Ponsel.

[053] De preferência, a sonda de oxigênio é um modelo portátil, de preferência um modelo de bolso. De preferência, este é o modelo ProfiLine Oxi 3205 da WTW.

[054] De preferência, a sonda é à prova d De preferência, é fixado à tampa do recipiente vedado.

[055] De acordo com a presente invenção, na etapa c), a sonda de oxigênio é colocada diretamente na composição, portanto, no meio em que o enxerto está imerso. É muito mais simples, conveniente e rápido. Além disso, essa etapa não é prejudicial ao enxerto, pois é estritamente não invasiva.

[056] De acordo com uma forma de realização, a sonda de oxigênio pode ser introduzida diretamente na solução ou composição obtida na etapa a), então o enxerto é adicionado à referida composição.

[057] De acordo com outra forma de realização, o enxerto é primeiro adicionado à solução ou composição da etapa a), então a sonda de oxigênio é introduzida na mistura resultante. Na verdade, uma vez que a sonda é, em particular, fixada na tampa do recipiente vedado, ela pode ser introduzida na mistura ao mesmo tempo que a etapa de fixação da tampa no recipiente vedado, portanto, ao mesmo tempo que a etapa d).

[058] O método de acordo com a invenção compreende uma etapa d) de fechamento do recipiente vedado. De acordo com a invenção, as etapas c) e d) podem ser realizadas simultaneamente ou em qualquer ordem.

[059] Conforme indicado acima, no caso em que a sonda é fixada à tampa do recipiente vedado, pode ser introduzida na mistura ao mesmo tempo que a etapa de fixação da tampa no recipiente vedado; neste caso, as etapas c) e d) são simultâneas.

[060] Se a sonda ainda não estiver conectada à tampa, ela pode ser inserida: - quer antes do fechamento do recipiente: neste caso, a etapa c) ocorre antes da etapa d); e - ou após o fechamento do recipiente: neste caso, a etapa d) ocorre antes da etapa c).

[061] Depois que o recipiente é fechado, o enxerto pode ser transportado em boas condições até o seu destino.

[062] Em particular, graças à presença da sonda de oxigênio na composição, o monitoramento da oxigenação do enxerto é feito em tempo real.

[063] Além disso, pela presença de uma globina, um protômero da globina ou uma hemoglobina extracelular de anelídeos na composição, o transporte pode ser realizado por qualquer meio (transporte terrestre ou aéreo), e não requer nenhuma condição especial. Isso é, portanto, vantajoso em comparação com o uso de oxigênio gasoso, que está presente em recipientes específicos (garrafas em geral) mantidos a uma determinada pressão e, portanto, menos fácil de transportar (especialmente por via aérea).

[064] A etapa de transporte e) pode ser realizada colocando o recipiente vedado em um recipiente adequado. Um tal recipiente é conhecido do estado da técnica e é adequado para transportar enxertos. De preferência, este recipiente é um saco de transporte, por exemplo, conforme descrito no pedido EP 1 688 124. É mais particularmente um caso para transportar um enxerto para transplante compreendendo pelo menos uma parede interna delimitando pelo menos dois compartimentos cada um tendo uma parte que pode ser aberta, um primeiro compartimento sendo destinado a receber um ou mais frascos e/ ou potes de amostras biológicas do doador (por exemplo, sangue) protegido por um bloco de material flexível e elástico, enquanto um segundo compartimento contém um tanque isotérmico destinado a receber o recipiente vedado de acordo com a invenção. O tanque isotérmico pode incluir gelo picado ou blocos de material eutético.

[065] Em particular, o transporte é realizado colocando o recipiente lacrado em uma caixa comercializada com o nome Vitalpack® pela E3 Cortex.

[066] De acordo com a presente invenção, o enxerto pode ser armazenado em perfusão dinâmica.

[067] O método de acordo com a invenção também pode compreender, após a etapa d) e/ ou e), uma etapa e de estabelecer uma curva de calibração que representa a pO2 da composição obtida em a) na qual o enxerto está imerso, opcionalmente normalizado com no que diz respeito ao peso do enxerto, em função do tempo.

[068] A pO2 é especialmente expressa em mmHg ou em bar ou em %.

[069] A obtenção dessa curva de calibração permite deduzir, para um determinado enxerto, a duração ideal de oxigenação. Por exemplo, para um rim, a obtenção de uma curva de calibração permite deduzir a duração máxima da oxigenação, caso se deseje um pO2 de pelo menos 50%.

[070] Assim, a presente invenção também se refere a um método para determinar a viabilidade de um enxerto, compreendendo o uso da curva de calibração descrita acima. Esta curva é, em particular, obtida de acordo com o método descrito acima.

[071] Tal método para determinar a viabilidade de um enxerto inclui as seguintes etapas, em particular: (i) fornecer uma solução de armazenamento de órgãos em um recipiente vedado. De preferência, a etapa (i) compreende misturar uma solução de armazenamento de órgão com pelo menos um transportador de oxigênio escolhido de hemoglobina extracelular de anelídeos, suas globinas e seus protômeros de globina, a fim de obter uma composição, em um recipiente vedado; (ii) imersão do enxerto na solução ou na composição obtida em (i); (iii) a introdução de uma sonda de oxigênio na solução ou na composição obtida em (i), ou na composição da etapa (ii); (iv) fechar o recipiente lacrado, sendo as etapas (iii) e (iv) realizadas simultaneamente ou em qualquer ordem; então (v) transporte do recipiente vedado, em particular para o local de transplante do enxerto para um recipiente; e - e em que o tempo máximo decorrido entre a etapa (ii) e o final da etapa (v) é determinado de acordo com a curva de calibração descrita acima, mantendo a referida pO2 em um valor fisiologicamente aceitável.

[072] Por de pO2 fisiologicamente aceitável um valor que dá a viabilidade do enxerto.

[073] Deve-se notar que todas as condições operacionais e formas de realização das etapas (i) a (v) são conforme descritas para as etapas a) a e) acima.

[074] A invenção é agora ilustrada com o auxílio dos seguintes exemplos.

EXEMPLO 1: ESTUDO DE ARMAZENAMENTO DE UM RIM DE PORCO EM UMA SOLUÇÃO

CONSERVANTE COM OU SEM HEMOGLOBINA DE ANELÍDEO

[075] O objetivo deste estudo é estabelecer uma ligação entre os efeitos da hemoglobina extracelular de Arenicola marina (M101) na redução de lesões de isquemia/ reperfusão em armazenamento estático a frio e o mecanismo de ação da molécula. Para estabelecer esta ligação, medições sequenciais são realizadas tanto no nível funcional quanto no nível celular.

MÉTODOS

1. HEMO2LIFE®

[076] A hemoglobina extracelular de Arenicola marina foi usada para formular um produto comercial, HEMO2life® (Hemarina SA), um aditivo para soluções de armazenamento. HEMO2life® é fabricado de acordo com as Boas Práticas de Fabricação de Medicamentos da UE.

2. ARMAZENAMENTO DO RIM

[077] Ambos os rins foram explantados do mesmo animal (porco) 18 minutos após a parada circulatória.

[078] Os rins foram lavados com 200 ml de solução de armazenamento de órgãos UW (Bridge to Life) ou 200 ml de UW + 1 g/ l HEMO2life®. Os rins foram pesados após o aperto. Os rins foram imediatamente imersos em reservatório de órgãos hermeticamente fechado e preenchidos com 800 ml de suas respectivas soluções (solução padrão: UW e UW + HEMO2life® 1 g/ l) a 6 °C.

[079] Em seguida, os reservatórios foram transportados para o laboratório em condições hipotérmicas a 4 °C, enquanto as medições sucessivas de pO2 e biomarcadores começam em 1 hora.

[080] Dois outros reservatórios (controles) são usados para medir os mesmos parâmetros sem rim dentro e servem como controles para UW e UW + HEMO2life® 1g/ l.

[081] Os reservatórios foram colocados em uma mesa vibratória com agitação lenta.

3. ANÁLISES ANÁLISES FUNCIONAIS DE M101

[082] A medição sequencial foi realizada em 1h, 4h, 6h, 24h, 30h, 48h, 55h: análises funcionais HEMO2life®.

[083] Ligação ao oxigênio: a funcionalidade do M101 é seguida por espectrofotometria que permite a caracterização da oxiemoglobina (HbO2) e da desoxihemoglobina (desoxi-Hb). Os espectros de absorção são registrados na faixa de 370-640 nm (UVmc2, SAFAS, Mônaco) de acordo com o método descrito por Thuiller et al. 2011, Supplementation With a New Therapeutic Oxygen Carrier Reduces Chronic Fibrosis and Organ Dysfunction in Kidney Static Storage: A New O2 Therapeutic Molecule Improves Static Kidney Storage.

Am J Transplant. Setembro de 2011; 11 (9): 1845 MONITORAMENTO DE PO2 E PH

[084] As medições sequenciais foram realizadas a cada hora, de 1h às 12h; 24h a 36h e 48 a 55h para o pH e O2 dissolvido da solução de armazenamento.

[085] O O2 dissolvido (dO2) e o pH são medidos usando um sensor de O2 (WTW Oxi 3205) e um sensor de pH (WTW pH3110) diretamente no tanque fechado (hermético).

RESULTADOS

[086] Os resultados estão nas Figuras 1 e 2.

ANÁLISES FUNCIONAIS DE M101

[087] As análises funcionais mostram que a assinatura espectral de M101 de t0 a 52h revela a presença de hemoglobina na forma oxyHb. A molécula permanece na forma oxyHb do início até as 52h, o que significa que há oxigênio disponível na solução de armazenamento.

[088] A assinatura espectral de M101 de 52h a 55h é característica do deoxyHb e mostra que a molécula transferiu todo o seu oxigênio para a solução.

MONITORAMENTO DE PO2 E PH

[089] Para os controles, a pO2 foi medida a 100% de O2 dissolvido nos dois reservatórios em t0 e não diminui por 55 horas a 6 °C.

[090] Isso significa que não há captação de O2 nessas condições sem rins.

[091] Para os rins, os respectivos pesos são 273,4g (UW + HEMO2life® 1 g/ l) e 268,0g (UW). A temperatura ambiente durante a experiência é mantida a 6 °C.

[092] A pO2 é indexada a 100% de O2 dissolvido a 6 °C no início do experimento. Na primeira hora, a pO2 diminui rapidamente para 50% em ambas as soluções.

[093] Os resultados da pO2 estão na Figura 1. A pO2 continua a diminuir acentuadamente na solução que não contém HEMO2life® para atingir 0% após 24 h. A evolução de pO2 na solução de armazenamento contendo HEMO2life® é desacelerada e então estabilizada por 1 a 30 horas em aproximadamente 50% de oxigênio dissolvido (p50). Este platô corresponde, portanto, à situação em que pO2 = p50. É somente após 30h que o oxigênio dissolvido cai lentamente para 0% em 52h.

[094] Esses resultados, somados aos resultados funcionais, mostram que o HEMO2life® é um bom transportador de oxigênio e é capaz de distribuí-lo à medida que é armazenado, de t0 até 52 horas. Às 52h, medições paralelas de pO2 e análise funcional mostram que, neste momento, o O2 dissolvido está a 0% na solução de armazenamento, o que significa que o HEMO2life® entregou todo o oxigênio transportado. HEMO2life® é um excelente doador de oxigênio para um fluido. A molécula distribui oxigênio para manter

50% do O2 dissolvido de 1h a 30h, depois até que o oxigênio transportado se esgote de 30 a 52h. Um declínio é observável em 30h e o O2 dissolvido diminui lentamente para atingir 0% em 52h. Sem o HEMO2life®, 50% da pO2 é atingida após 1h, e a pO2 já atinge 0% após 24h.

[095] Os resultados do pH estão na Figura 2. No reservatório não contendo o rim, foi medido o pH. É muito estável nos dois reservatórios contendo UW (pH de 7,4) e UW + HEMO2life® 1 g/ l (pH de 7,5).

[096] Em reservatórios com rins, o pH é muito estável na solução a que foi adicionado HEMO2life® 1 g/ l, por volta de 7,4, desde o início até 55h.

O pH na solução de armazenamento UW sem HEMO2life® a 1 g/ L diminui de 7,4 para 7,1 em 55h. A diferença é provavelmente explicada pela acidose do reservatório contendo o rim sem HEMO2life® a 1 g/ l.

[097] Esses resultados demonstram claramente o uso benéfico de HEMO2life® a 1 g/ L além da solução de armazenamento em baixa temperatura.

A evolução da pO2 mostra que o HEMO2life® transfere oxigênio 28h a mais do que a solução de armazenamento sozinha. Além disso, o HEMO2life® mantém o oxigênio dissolvido na solução a 50% por 30h, ou seja, em um nível constante permitindo um armazenamento muito melhor do órgão. As análises bioquímicas confirmam esses resultados.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. MÉTODO DE MONITORAMENTO DA OXIGENAÇÃO DE UM ENXERTO, caracterizado por compreender: a) fornecer uma solução de armazenamento de órgãos e misturar essa solução com pelo menos um transportador de oxigênio, para obter uma composição, em um recipiente vedado; b) imergir o enxerto na composição obtida em a) para obter uma segunda composição; c) a introdução de uma sonda de oxigênio na composição obtida em a), ou na segunda composição da etapa b); d) o fechamento do recipiente hermético; e - as etapas c) e d) sendo realizadas simultaneamente ou em qualquer ordem.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por: - a etapa a) compreender misturar a solução de armazenamento de órgãos com pelo menos um transportador de oxigênio escolhido a partir de hemoglobina extracelular de anelídeos, suas globinas e seus protômeros de globina, a fim de obter uma composição, no recipiente vedado; e - a etapa b) compreender a imersão do enxerto na composição obtida em a).

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por compreender uma etapa e) de transporte do recipiente vedado, em particular para o local de transplante do enxerto para um receptor.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela etapa c) compreender a introdução de uma única sonda de oxigênio na composição obtida em a), ou na segunda composição da etapa b).

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela sonda de oxigênio da etapa c) ser um eletrodo ou sensor Clark para medição de oxigênio dissolvido por medição óptica, em particular por luminescência.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela sonda de oxigênio da etapa c) compreender uma cabeça de sonda revestida com uma membrana, a cabeça da sonda consistindo em um eletrodo composto por um cátodo de platina e com um ânodo de prata imerso em um eletrólito, sendo a referida membrana permeável ao oxigênio, mas impermeável à água e aos íons.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por compreender uma etapa e de estabelecimento de uma curva de calibração que representa a pO2 da composição obtida em a) na qual o enxerto está imerso, opcionalmente normalizado em relação ao peso do enxerto, em função do tempo.

8. MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DA VIABILIDADE DE UM ENXERTO, caracterizado por compreender a utilização da curva de calibração obtida de acordo com o método, conforme definido na reivindicação 7.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por compreender: (i) fornecer uma solução de armazenamento de órgãos, preferivelmente em mistura com pelo menos um transportador de oxigênio, preferivelmente selecionado a partir de hemoglobina extracelular de anelídeos, suas globinas e seus protômeros de globina, a fim de obter uma composição, em um recipiente vedado; (ii) imersão do enxerto na composição obtida em (i); (iii) a introdução de uma sonda de oxigênio na composição obtida em (i), ou na composição da etapa (ii);

(iv) fechar o recipiente vedado, sendo as etapas (iii) e (iv) realizadas simultaneamente ou em qualquer ordem; então (v) transporte do recipiente vedado, em particular para o local de transplante do enxerto para um recipiente; - e em que o tempo máximo decorrido entre a etapa (ii) e o final da etapa (v) é determinado de acordo com a curva de calibração obtida de acordo com o método, conforme definido na reivindicação 3, mantendo a referida pO2 em um valor fisiologicamente aceitável.

10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 9, caracterizado pela hemoglobina extracelular de anelídeos ser escolhida a partir de hemoglobinas extracelulares de anelídeos poliquetas, preferivelmente a partir de hemoglobinas extracelulares da família Arenicolidae e hemoglobinas extracelulares da família Nereididae, mais preferivelmente entre a hemoglobina extracelular de Arenicola marina e a hemoglobina extracelular de Nereis, mais preferivelmente a hemoglobina extracelular de Arenicola marina.

11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pela solução de armazenamento de órgãos ser uma solução aquosa com um pH entre 6,5 e 7,5, compreendendo sais, preferivelmente de cloreto, sulfato, sódio, íons cálcio, magnésio e jarássio; açúcares, preferivelmente manitol, rafinose, sacarose, glicose, frutose, lactobionato (que é um agente ou gluconato; antioxidantes, preferivelmente glutationa; agentes ativos, preferivelmente inibidores da xantina oxidase, tais como alopurinol, lactatos, aminoácidos, tais como histidina, ácido glutâmico (ou glutamato), triptofano; e, opcionalmente, coloides tais como hidroxietil amido, polietileno glicol ou dextrano.