DE3006769A1

DE3006769A1 - Verfahren zum betreiben von vorrichtungen, die protein enthaltende biologische fluessigkeiten analysieren, und zubereitung fuer die verwendung in diesem verfahren

Info

Publication number: DE3006769A1
Application number: DE19803006769
Authority: DE
Inventors: Anne Rosengaard Eisenhardt; Holger Bie Thomasen
Original assignee: Radiometer AS
Current assignee: Radiometer AS
Priority date: 1979-02-23
Filing date: 1980-02-22
Publication date: 1980-08-28
Also published as: DK151397B; US4867797A; DK151397C; DK80979A; DE3006769C2

Description

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Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Betreiben bzw. Bedienen von Vorrichtungen, die Protein enthaltende biologische Flüssigkeiten analysieren, sowie eine Zubereitung für die Verwendung in diesem Verfahren.

Vorrichtungen bzw. Instrumente, die biologische Flüssigkeiten analysieren, werden in großem Umfange verwendet. So sind beispielsweise Blut-, Serum- oder Plasmaanalyseinstrumente in mehr oder minder automatisierter Form in Krankenhäusern und Laboratorien, in denen es von Bedeutung ist, die Werte von Blutparametern, wie z.B. den pH-Wert, den P„ , den P_ , den Hämoglobingehalt, die Elektrolytkon-

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zentration und dgl., sowie die davon abgeleiteten Parameter, wie z.3. den "5tandard-Bicarbonat"-Wert zu kennen, unerläßlich. Heutzutage müssen diese Parameter mit großer Genauigkeit bestimmt werden und in einigen klinischen Situationen, beispielsweise in der Chirurgie, kann die genaue und zuverlässige Bestimmung der Blutparameter von entscheidender Bedeutung sein. Diese Instrumente müssen deshalb ein hohes Maß an Genauigkeit und Zuverlässigkeit aufweisen.

Blut-,.Serum- oder Plasmaanalyseninstrumente (nachfolgend zur Abkürzung als "Blutanalyseninstrumente¹¹ bezeichnet) werden in der Regel so bedient bzw. betrieben, daß ein Analysierarbeitsgang, bei " dem eine Probe in die Vorrichtung eingeführt wird, um einen oder mehrere Parameter zu bestimmen, und ein Spülarbeitsgang, bei dem eine Spüllösung manuell oder automatisch durch das Instrument hindurchgeleitet wird, die entweder auf die gleiche Weise wie die Probe oder, insbesondere bei automatischen Instrumenten, automatisch aus einem mit dem Instrument verbundenen Spüllösungs-Reservoir einge-

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führt wird, miteinander abwechseln. Die normale Dauer des Spülarbeitsganges liegt in der gleichen Größenordnung wie die normale Dauer jedes Analysierarbeitsganges. In geeigneten Zeitintervallen "~ wird ein Eicharbeitsgang durchgeführt, bei dem die Meßeinheiten des Instruments gegenüber EichflUssigkeiten oder Eichgasen geeicht werden, wonach mit der SpUllösung gespült wird. Bei bestimmten Typen von Instrumenten wird die Eichung automatisch in Zeitintervallen durchgeführt, die in das Instrument einprogrammiert sind.

Bei der praktischen Verwendung von Blutanalyseninstrumenten wurde gefunden, daß die Instrumente manchmal ein bestimmtes Maß von Meßfehlern ergeben. Es wurde gefunden, daß der an dem Instrument abgelesene Wert von den Daten der Vergleichs-StandardflUssigkeiten abweicht oder daß die Ansprechzeit einer oder mehrerer der Meßeinheiten ungewöhnlich lang wird. Es wird angenommen, daß diese Probleme in erster Linie auf Ablagerungen auf den Nachweisflächen der Meßeinheiten, insbesondere auf Ablagerungen von Proteinen oder proteinhaltigen Substanzen oder Lipiden aus den in der Apparatur analysierten Blutproben, zurückzuführen sind.

Es wurde nun gefunden, daß diese Meßfehler oder Stabilitätsprobleme in Instrumenten, die Protein enthaltende biologische Flüssigkeiten analysieren, beispielsweise in Blutanalyseninstrumenten, dadurch verhindert oder minimal gehalten werden können, daß man den Spülarbeitsgang der Instrumente mit einer Spulflüssigkeit durchführt, die Subtilisin oder ein subtilisinartiges Enzym in gelöstem Zustand enthält.

Erfindungsgemäß werden Subtilisin oder subtilisinartige Enzyme in SpUllösungen (Waschlösungen) für Vorrichtungen verwendet, die Protein

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enthaltende biologische Flüssigkeiten analysieren, beispielsweise in Blutanalysenvorrichtungen, um Meßfehler zu vermeiden, die auf Proteinablagerungen zurückzuführen sind. Eine bevorzugte Spül- bzw. Waschlösung enthält Subtilisin, einen Boratpuffer und Germizide.

Aus den weiter unten folgenden Beispielen geht hervor, daß durch die Verwendung einer solchen Spül- bzw. Waschlösung (nachfolgend der Einfachheit halber stets als "Spüllösung" bezeichnet) die Meßfehler oder Instabilitätsprobleme, die auf Proteinablagerungen und andere Ablagerungen in Meßkammern und Transportleitungen der Instrumente zurückzuführen sind, minimal gehalten werden, ohne daß die Genauigkeit der Instrumente dadurch beeinträchtigt wird.

Konventionelle Spüllösungen für Blutanalyseninstrumente bestehen in der Regel aus Wasser oder wäßrigen Lösungen von Natriumchlorid in physiologischer Konzentration, die gegebenenfalls Germizide enthalten, die frei von Puffern und anderen Bestandteilen sind, welche die Meßergebnisse beeinflussen könnten. Es sind verschiedene Spüllösungen im Handel erhältlich und sie werden in der Regel in solchen Portionen auf den Markt gebracht oder hergestellt, die für eine 1- bis 2-wöchige normale Verwendung ausreichen.

Erfindungsgemäß ist es nun gelungen, eine Subtilisin enthaltende Spüllösung zu entwickeln, in der das Subtilisin eine vernünftige Aktivität für einen Zeitraum von beispielsweise 2 bis 3 Wochen bei Raumtemperatur beibehält, bei der jedoch andererseits trotz der Tatsache, daß sie einen Puffer enthält, keinerlei Fehler in den Meßergebnissen auftreten.

Es ist bekannt, Ablagerungen in Blutanalyseninstrumenten mittels einer

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Subtilisin enthaltenden Detergenslösung zu entfernen (vgl. das Instruction-Manual für das 0SM2 Oxygen Saturation Meter der Firma Radiometer A/5, Kopenhagen, Seite 4, "Entfernung von Proteinablagerungen"), bei diesem Verfahren wird jedoch bei unterbrochenem Betrieb der Apparatur die das Enzym enthaltende Detergenslösung durch das Probentransportsystem des Instruments eingeführt und die Lösung wird 2 bis 24 Stunden lang darin belassen, wonach die Lösung entfernt und das System mit destilliertem Wasser gespült wird.

Diese bekannte Verwendung von Subtilisin ist für dieses Enzym konventionell, da sie eine lange Inkubationszeit umfaßt und daran schließt sich das Spülen mit von dem Enzym' freiem destilliertem Wasser vor Wiederaufnahme der Messungen an.

Es ist auch bereits bekannt, eine Trypsin und Triethanolamin enthaltende Standard- und/oder Spüllö'sung für die Bedienung bzw. den Betrieb eines Durchluß-BIutcalcium-Meßsystems zu verwenden, vgl. "Instruction Manual model 99-20 serum calcium flow-thru system, Orion Research Incorporated, USA 1969, Form IM99-20/966" und verschiedene Literaturdiskussionen des Systems, wie z.B.:

R.S. Hattner, J.W. Johnson, D.S. Bernstein, A. Wachman und J. Brackman, "Electrochemical determination of apparent ionized serum calcium using a calcium-selective electrode: the method and values in normal humans and a comparison to total serum calcium", Clin. Chim. Acta, 28 (1970), 67-75,

F. Lindegärde und 0. Zettervall, "Serum ionized calcium in a normal population studied with a calcium ion-sensitive electrode", j. _Israel

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H.D. Schwartz, B.C. McConville und E.F. Christopherson, "Serum ionized calcium by specific ion electrode", Clin. Chim. Acta, j$l (1970,97-107,

Ting-Kai l_i und J.T. Piechocki, "Determination of serum ionic calcium with an ion-selective electrode: evaluation of methodology and normal values", Clinical Chemistry,
Bd. 17, Nr. 5, 1971, 411-416,

C. Fuchs, K. Paschen, P.G. Spieckermann und C. ν. Westberg, "Bestimmung des ionisierten Calciums im Serum mit einer ionenseiektiven Durchflußelektrode: Methodik und Normalwerte", Klinische Wochenschrift, 50. Jahrgang, 17. Heft, 1. September 1972, 824-832,

F. Lindegärde, "Potentiometric determination of serum
ionized in α normal human population", Clin. Chim. Acta, (1972), 477-484,

Seamonds,Bette, Towfighi, Javad and Arvan, A. Dan, "Determination of ionized calcium in serum by use of an ionselective electrode", Clinical Chemistry, Bd. 18, Nr. 2, 1972, 155-160,

V.L. Subryan, M.M. Popovtzer, S.D. Parks und E.B. Reeve, "Measurement of serum ionized calcium with the ionexchange electrode", Clinical Chemistry, Bd. 18, Nr. 12, 1972, 1459-1462,

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H. Jack Ladenson und George N. Bowers, "Free calcium in serum. I. Determination with the ion-specific electrode, and factors affecting the results", Clinical Chemistry, 19, 565, 1973.

Eine jüngere Arbeit, in der die Verwendung von Trypsinlösungen in Verbindung mit Calcium-Durchfluß-Elek.troden beschrieben wird, ist diejenige von R.W. Cattrall und Kwok-Tai Fong, Talanta, Bd. 25, 1978, 541-543, gemäß der der Probenarm des Calciummeßsystems nach jeder Messung mit destilliertem Wasser gespült wird, das 0,50 Gew./Vol.-^ Trypsin enthält.

Aus dem obengenannten Instruction-Manual geht jedoch hervor, daß die Trypsin enthaltenden Lösungen täglich frisch hergestellt werden müssen, wodurch ihre Verwendung umständlich und ungeeignet wird/ insbesondere in Verbindung mit modernen Apparaturen, die aufgrund ihres hohen Automatisierungsgrades im übrigen verhältnismäßig wenig Arbeit machen.

Wie aus den nachfolgenden Beispielen hervorgeht, wurde außerdem überraschend gefunden, daß selbst sehr niedrige Subtilisin-Konzentrationen in den erfindungsgemäßen Lösungen weit wirksamer sind in bezug auf die Entfernung von Ablagerungen nach biologischen Flüssigkeiten als Trypsinlösungen, auch wenn diese eine viel höhere Konzentration besitzen. Ohne an irgendeine Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß einer der Gründe für die überraschende Wirksamkeit von Subtilisin für diesen Zweck der sein kann, daß Subtilisin und subtilisinartige Enzyme keine eindeutige Spezifität aufweisen (oder, anders ausgedrückt, Breitband-Enzyme sind) und deshalb die vielen verschiedenen Proteine, die in den zu entfernenden

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Verunreinigungen enthalten sein können, universeller zersetzen. Ein anderes wichtiges Merkmal von Subtilisin ist in diesem Zusammenhang das, daß es besser in der Lage ist, Esterbindungen zu zersetzen, was bei der Entfernung von LLpidablagerungen in den Instrumenten von Bedeutung sein kann.

Obgleich die oben diskutierten bekannten Verwendungen von Trypsin enthaltenden Lösungen alle in Verbindung mit Durchfluß-Apparaturen stehen, d.h. in Verbindung mit Apparaturen, in denen die Messung durchgeführt wird, während die Probenlösung durch die Meßeinheit geleitet wird, wurde erfindungsgemäß gefunden, daß die Subtilisin enthaltenden Lösungen ohne Beeinträchtigung der Meßergebnisse auch unter statischen Meßbedingungen verwendet werden können, bei denen während der Messung ein Volumen der das Enzym enthaltenden Spüllösung notwendigerweise als Remineszenz in der Meßkammer vorliegt.

Wie üblich steht der Ausdruck "subtilisinartige Enzyme" für Enzyme, die ebenso wie Subtilisin Endopeptidasen darstellen und eine breite Spezifitat aufweisen, d.h. in der Lage sind, Peptidbindungen zwischen vielen verschiedenen Aminosäuren aufzubrechen im Gegensatz zu beispielsweise trypsin- und pepsinartigen Enzymen, die eine verhältnismäßig enge Spezifität aufweisen und deshalb in der Lage sind, nur eine verhältnismäßig geringe Anzahl von Typen von Peptidbindungen aufzubrechen. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind unter subtilisinartigen Enzymen vorzugsweise Enzyme zu verstehen, die im Hinblick auf ihre Stabilitätseigenschaften Subtilisin ähneln, d.h. mit anderen Worten, eine gute Stabilität in Lösung aufweisen.

Nach dem allgemein anerkannten internationalen Enzymnomenklatursystem von 1972 werden die subtilisinartigen Enzyme eingeteilt in die Klasse

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3.4, insbesondere in die Unterklassen 3.4.22, 3.4.24 und 3.4.99 und in die Unterklasse, zu der die Subtilisine gehören, d.h. 3.4.21, wobei es sich bei den betrachteten Enzymen dieser Unterklasse um diejenige mit einer breiten Spezifität handelt im Gegensatz zu beispielsweise Trypsin, das ebenfalls zu dieser Unterklasse gehört.

Beispiele für spezifische Enzyme, die für die Zwecke der vorliegenden ~ Erfindung geeignet sind, sind 3.4.21.1 Chymotrypsin A und B, 3.4.21.2 Chymotrypsin C, 3.4.21.9 Acrosin, 3.4.21.11 Elastase, 3.4.21.14 der Subtilisin-Klassifizierung, umfassend "Subtilisin Carlsberg" (euch als Subtilisin A und B oder Subtilopeptidase A und B bezeichnet) und BPN¹ (Nagarseproteinase), Subtilisin Novo und ähnliche Enzyme, die von Bacillus pumilis und Bacillus licheniformis gebildet werden, 3.4.21.13 Phaseolus proteinase, 3.4.21.15 Aspergillus-Alkaliproteinase, 3.4.21.16 Alternaria-endopeptidase, 3.4.21.17 Arthrobacter-Serinproteinase, 3.4.21.18 Tenebrio-a-proteinase, 3.4.22.2 Papain, 3.4.22.5 Bromelcin, 3.4.22.7 Asclepain, 3.4.22.9 Hefeproteinase B, 3.4.24.2 Sepia-proteinase und das Handeisprodukt "Pronase", das von der Firma BDH Chemicals Ltd., England, erhältlich ist und bei dem es sich um eine Mischung handelt, die mehrere Breitbandproteinasen enthält.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bediente bzw. betriebene Instrument kann irgendeine Vorrichtung sein, die irgendeinen Parameter oder einen Bestandteil des Blutes oder irgendeine andere biologische Flüssigkeit analysiert, wobei zwischen einem Analysenarbeitsvorgang und einem Spülarbeitsvorgang abgewechselt wird, was in den meisten praktischen Fällen bedeutet, daß unmittelbar nach der Analyse einer speziellen Probe ein Spülarbeitsgang durchgeführt wird, bevor die nächste Probe eingeführt und analysiert wird. Der

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Bereich der vorliegenden Erfindung erstreckt sich aber auch auf die Fälle, in denen eine Anzahl von Proben analysiert werden, bevor ein Spülarbeitsgang durchgeführt wird. Die normale Dauer jedes Spülarbeitsganges liegt in der gleichen Größenordnung wie die normale Dauer jedes Analysierarbeitsganges (normalerweise in der Größenordnung von ein paar Minuten oder weniger), im Unterschied zu der konventionellen Inkubierung mit einer Subtilisin enthaltenden Lösung, wie oben bei der Diskussion des Standes der Technik angegeben. Beispiele für Instrumente, die mit Erfolg unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens betrieben bzw. bedient werden können, sind Blutgasanalysatcren, die den pH-Wert, den P_m und den P_ bestimmen, Sauerstoffsättigungsmeter, Instrumente

zur Bestimmung des Hämoglobingehaltes und Instrumente zur Bestimmung der Konzentration von speziellen Elektrolyten in biologischen Flüssigkeiten, insbesondere Blut. Beim bekannten Betrieb solcher Instrumente folgt auf jede Analyse einer Probe in der Regel eine Spülung mit einer Spüllösung, die aus einem mit der Vorrichtung verbundenen Reservoir entnommen wird.

Aufgrund der begrenzten Stabilität der Enzyme in Lösung wird die erfindungsgemäße, ein Enzym enthaltende SpUllösung normalerweise nicht fabrikmäßig hergestellt, sondern sie wird vorzugsweise hergestellt vom Endverbraucher durch Auflösen des Enzyms in Wasser oder in einer wäßrigen Lösung. Vorzugsweise ist gleichzeitig ein pH-Puffer, der auf einen für das Enzym geeigneten pH-Wert, für Subtilisin auf einen Wert innerhalb des Bereiches von pH 7 bis 9,5, abpuffert, in einer niedrigen Konzentration enthalten entweder in der Form, daß die Lösung den Puffer bereits enthält, oder in der Form, daß das aufzulösende Enzym in einer Zubereitung enthalten ist,

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die auch eine Puffersubstanz enthält.

Die Enzymkonzentration in der erfindungsgemäßen Spüllösung (Waschlösung) liegt normalerweise innerhalb des Bereiches von 0,05 bis 50 Anson-Einheiten (AU) pro Liter, zweckmäßig innerhalb des Bereiches von 0,1 bis 2,0, vorzugsweise von 0,2 bis 1,0, beispielsweise bei etwa 0,5 AU pro Liter für Subtilisin, und die Konzentration des pH-Puffers, der beispielsweise ein Phosphatpuffer, ein John-Lindsay-Universalpuffer (Zitronensäure, H₃PO₃, KH₂PO. +

Veronal) oder vorzugsweise ein Boratpuffer sein kann, liegt Vorzugs—

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weise in der Größenordnung von etwa 0,2x10 H bis 5 χ 10 M,

-3 -3

insbesondere bei 10 M bis 4x10 M, besonders bevorzugt bei

-3
etwa 3 χ 10 M in der Spüllösung vor. Ein Merkmal der Erfindung besteht darin, daß es möglich ist, eine für die normale Verwendung über einen Zeitraum von 2 Wochen ausreichend stabile, Subtilisin enthaltende Lösung herzustellen, d.h. die Pufferkapazität reicht aus, um zu vermeiden, daß der pH-Wert absinkt durch das C0„ der umgebenden Luft, wodurch die Stabilität und Aktivität des Subtilisin bis zu einem hohen Ausmaße abnehmen würde, während gleichzeitig die Pufferkapazität gering genug ist, um die Verwendung der Spüllösung beispielsweise in einer Blutgasanalysenvorrichtung zu erlauben, ohne daß irgendein nachteiliger Einfluß auf die pH-Werte und P__ -Messungen auftritt.

Es wurde gefunden, daß durch die Gegenwart von geeigneten Germiziden die Stabilität des Enzyms in der wäßrigen Lösung zunimmt, und es ist daher bevorzugt, daß die Spüllösung ein oder mehrere Germizide enthält, welche die Aktivität des Enzyms nicht wesentlich herabsetzen. Die Germizide werden in der Regel in einer niedrigen, jedoch noch ausreichenden Konzentration in der Lösung, im allgemeinen in einer Kon-

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zentration in der Größenordnung von 1 bis 1000 ppm verwendet. Eine bevorzugte Germizidkombination für die Verwendung in. der Spüllösung ist eine Kombination aus einem Bakterizid und einem Fungizid. Spezifische Germizide, die, wie gefunden wurde, mit Subtilisin in der Praxis kompatibel (verträglich) sind und dessen Stabilität erhöhen, sind Didecyldimethylammoniumbromid und Trichlortert.-butylalkohol, die vorzugsweise in Kombination verwendet werden. Andere Beispiele für Germizide, die in der erfindungsgemäßen Lösung verwendet werden können, sind Phenylquecksilber(ll)nitrat und Kupfer(ll)chlorid, die zweckmäßig in Kombination in einer Konzentration von jeweils 1 bis 5 ppm verwendet werden können.

Eine Lösung, die ein Enzym enthält, das ausgewählt wird aus der Gruppe Subtilisin und der substilisinartigen Enzyme, einen pH-Puffer, insbesondere einen Boratpuffer, und ein Germizid, ist an sich neu und stellt einen Aspekt der vorliegenden Erfindung dar. Eine solche Spullösung kann mit oder ohne ein Salz, vorzugsweise Natriumchlorid, zur Erzielung einer physiologischen Ionenstärke nicht nur zum Betreiben bzw. Bedienen einer Blutanalysenapparatur nach dem vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren, sondern auch für andere Spül- und Reinigungszwecke, beispielsweise zum Spülen oder Reinigen einer klinischen Apparatur oder anderer Gegenstände, bei denen es von Bedeutung ist, proteinhaltige und/oder Lipidablagerungen auf wirksame Weise zu entfernen oder zu verhindern, verwendet werden.

Eine bevorzugte erfindungsgemäße Zubereitung ist eine solche, die in im Handel erhältlichen Spüllösungen aufgelöst werden kann und die deshalb das Enzym in trockener Form zusammen mit einer ausreichenden Menge Puffersubstanz in trockener Form enthält,

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so daß man nach dem Auflösen die gewünschte Puffer- und Enzymkonzentration in der Spüllösung, die erfindungsgemäß verwendet wird, erhält.

Eine solche Zubereitung (Zusammensetzung) ist vorzugsweise in einem geschlossenen Behälter verpackt, bei dem es sich beispielsweise um eine Phiole mit einem durchstoßbaren Septum handelt, so daß die Zubereitung (Zusammensetzung) wieder aufgelöst wird durch Einspritzen von Wasser oder der Spüllösung, die aus einer Spritze eingespritzt, durch die Spritze abgezogen und in den Abschnitt der Spüliösung überführt wird, für den sie bestimmt ist. Das Enzym mit einer solchen Zusammensetzung ist vorzugsweise Subtilisin und der pH-Puffer ist vorzugsweise ein Boratpuffer. Die Mengen an Enzym und Boratpuffer sind abgestimmt auf das Endvolumen der herzustellenden, das Enzym enthaltenden Spüllösung.

Die erfindungsgemäße Zubereitung bzw. Zusammensetzung wird vorzugsweise hergestellt durch Gefriertrocknen einer das Enzym und den Puffer und (s. unten) gegebenenfalls ein Germizid oder eine Kombination von Germiziden enthaltenden wäßrigen Lösung. Die wäßrige Lösung wird zweckmäßig direkt in den Behälter, in dem sie verpackt werden soll, beispielsweise eine Phiole, eindosiert und in situ gefriergetrocknet. Die Kombination von Auflösung und Gefriertrocknung ist nicht nur eine geeignete Art der Dosierung des Enzyms mit einer ausreichenden Genauigkeit, sondern die Gefriertrocknung bietet auch den Vorteil, daß sie dem Puffer eine voluminöse Struktur verleiht, die in Wasser leicht wieder aufgelöst werden kann, wenn die erfindungsgemäße Lösung durch Anrühren (Wiederherstellung) der gefriergetrockneten Zubereitung hergestellt wird.

Ein anderer Typ einer geeigneten Einheitsdosierungs-Zubereiturtg,

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die das Enzym und gegebenenfalls den Puffer enthält, ist ein poröser Körper, in welchem das Enzym und der gegebenenfalls vorhandene Puffer in den Poren in festem Zustand absorbiert sind, die mit Wasser oder wäßrigen Lösungen wieder aufgelöst und ausgelaugt werden, beispielsweise ein poröser Kunststoffkörper oder ein poröser Körper aus einem gesinterten anorganischen Material, wie Aluminiumsilicat/Aluminiutr.oxid. Die porösen Körper können gewünschtenfalls einen ferromagnetischen Kern enthalten, so daß sie als Rührkörper verwendet werden können, die durch ein äußeres Magnetfeld bewegt werden können, wie beispielsweise in der dänischen Patentanmeldung Nr. 2 737/78 beschrieben. Eine geeignete Art der Herstellung von porösen Körpern mit absorbiertem Enzym besteht darin, geeignete poröse Körper in eine gepufferte Enzymlösung einzutauchen, gegebenenfalls unter Anlegung eines Vakuums und anschließende Aufhebung des Vakuums zur Erzielung einer besseren Penetrction in den porösen Körper und anschließendes Trocknen des auf diese Weise imprägnierten Körpers, zweckmäßig durch Gefriertrocknen. Die porösen Körper werden zweckmäßig in luftdichte Behälter verpackt, vorzugsweise in Kunststoff-"Blasen "-Verpackungen,.

Die erfindungsgemäße Zubereitung kann außerdem ein Germizid enthalten, um die Lagerungsbeständigkeit der Zubereitung zu erhöhen. Das Germizid oder die Germizide können entweder in der Zubereitung in einer der gewünschten Endkonzentration des Germizids und der fertigen Spüllösung entsprechenden Konzentration vorliegen oder sie können, wenn die Zubereitung für die Auflösung in einer Spüllösung verwendet wird, die bereits ein Germizid enthält, in einer geringeren Konzentration vorliegen, die lediglich dazu dient, in geeigneter Weise die Zubereitung vor ihrer Auflösung gegen mikrobiellen Abbau (Zersetzung) zu schützen. Entsprechend den obigen Angaben ist eine bevor-

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zugte Germizidkombination eine solche aus einem Fungizid und einem Bakterizid und spezifische Beispiele für geeignete Germizide sind Didecyldimethylammoniumbromid, Triehlor-tert.-butylalkohol, Phenylquecksilber(ll)nitrat und Kupfer(ll)chlorid.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das Spülen oder Durchspülen unter Verwendung der ein Enzym enthaltenden Spüllösung normalerweise auf genau die gleiche Weise durchgeführt wie bei Verwendung einer normalen Spüliösung, die für das fragliche spezifische Instrument geeignet ist.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

Beisoiel 1

tine ein Enzym enthaltende Spüllösung wurde wie folgt hergestellt: Zu 1 1 entionisiertem Wasser wurde Natriumchlorid (von Analysenqualität) bis zu einer Konzentration von 0,150 M zugegeben und Tris-Puffer (Tris-(h/droxymethyl)aminomethan) wurde bis zu einer Konzentration von 0,001 M zugegeben. Zu der erhaltenen Lösung wurden 10 ml einer Lösung von 2 g/l reinem kristallinem Subtilisin (Subtilisin A von der Firma Novo Industri A/S, Kopenhagen, Aktivität 25 Anson-Einheiten (AU) pro Gramm) in entionisiertem Wasser zugegeben, wobei diese Lösung am gleichen Tage frisch hergestellt worden war.

Die erhaltene, das Enzym enthaltende Spüllösung wurde als Spüllösung in dem automatisierten Spülarbeitsgang nach jeder Blutanalyse in zwei automatischen Blutgasinstrumenten (ABLI der Firma Radiometer A/S, Kopenhagen) verwendet. Als analysierte Proben wurde Donor-

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blut verwendet. Pro Tag wurden etwa 25 Injektionen von Blutproben und dementsprechend 25 daran anschließende automatische SpUlarbeitsgänge plus häufige (etwa 1 mal pro Stunde) automatische Eichung mit nachfolgender Hindurchleitung der Spüllösung durchgeführt. Während der Zeiträume (beispielsweise am Abend und über Nacht), während denen keine Analysen durchgeführt wurden, wurde bei den Instrumenten ein normaler automatischer Eicharbeitsgang etwa 1 mal pro Stunde mit nachfolgendem Spülen durchgeführt.

Jedes Instrument enthielt 2 Flüssigsensoren und die Spannung an diesen Flüssigsensoren wurde bestimmt als Basis zur Bestimmung des Verunreinigungsverhinderungseffektes, der durch die Zugabe des Enzyms zu der Spüllösung erzielt wurde, da angenommen wird, daß jede Abnahme der Output-Spannung durch Verunreinigung der MeBfläche des Flüssigsensors verursacht wird. Nach 2-wöchigem Betrieb unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Spüllösung wurden die Instrumente weitere 2 Wochen lang mit einer auf die gleiche Weise hergestellten Spüllösung, in der jedoch das Subtilisin weggelassen wurde, betrieben.

Ein unilaterialer t-Test mit den aufgezeichneten Flüssigsensor-Spannungen zeigte, daß eine wesentlich bessere Reinigung (eine höhere Flüssigsensor-Spannung) bei drei der vier eingebauten Flüssigsensoren erzielt wurde durch Zugabe des Enzyms, während kein Anzeichen für eine höhere Spannung an dem vierten Flüssigsensor festgestellt wurde (andererseits aber auch kein Anzeichen für eine niedrigere Spannung). Erfahrungsgemäß treten bei Donorblut-Proben nicht die gleichen Kontaminationsprobleme auf, wie sie bei der praktischen Verwendung der Instrumente vorkommen, weil Blut von kranken Patienten im allgemeinen eine viel höhere Neigung zur

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Kontamination hat als Blut von gesunden Personen, und insbesondere können einige individuelle Blutproben von kranken Patienten eine außergewöhnlich störende Kontamination in dem Instrument ergeben.

Beispiel 2

Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 wurde eine SpUllösung hergestellt. Die Vorratslösung war ein paar Tage alt und enthielt eine solche Menge an Subtilisin A in einem 0,001 M Trispuffer in entionisiertem Wasser, daß 2 ml der Lösung 10 mg Subtilisin A enthielten. In einem Krankenhaus wurde diese Spüllösung mit einer Spüllösung ohne Enzymgehalt beim Betrieb eines Blutgasanalysenins-ruments ÄBL2 von der Firma Radiometer A/S, Kopenhagen, verglichen. Die Vorrichtung führte automatische Spül- und Eicharbeitsgcnge auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben durch. Vor der Verwendung der das Enzym enthaltenden Spüllösung war die vorübergehende Differenz für die pH-Elektrode des Instruments, ausgedrückt als Differenz zwischen den zuerst abgelesenen Daten, enthaltend die Spannung der pH-Elektrode nach der Einführung einer neuen Probe, und den dritten Daten, abgelesen für die gleiche Probe, unbefriedigend hoch: 0,017 + 0,006, ausgedrückt als pH-Wert. Die dieser über einen Zeitraum entsprechenden Einzelergebnisse sind aus der nachfolgenden Tabelle ersichtlich. Nach der Einführung der das Enzym enthaltenden Spüllösung nahm diese Differenz auf 0,007 + 0,0015 ab. Nach einer Woche stieg sie jedoch schwach an auf 0,009 + 0,003, was, wie angenommen wird, auf eine verminderte Enzymaktivitqt zurückzuführen ist, die wahrscheinlich der Tatsache zuzuschreiben ist, daß die Vorratslösung, die keine Germizide enthielt, vor der Herstellung der Spüllösung bereits ein paar

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Tage alt gewesen war und an der Luft transportiert worden war.

Tabelle

Spüllösung ohne Enzym

Spüllösung mit Enzym

Datum	Δ pH	Datum	Δ pH
	0.015	3/11	0.Q10
	0.011	3/11
	0.012		0.010
1/11	0.020	3/11	0.007
1/11		4/11	0.007
1/11	0.013	4/11	0.006
	0.028	4/11	0.006
	0.029	4/11	0.005
3/11	0.020	4/11	0.006
3/11	0.016	4/11	0.008
3/11	0.017	4/11	0.008
	0.014	6/11	0.009
			0.008
		6/11	0.008
		7/11	0.009
			0.016
			0.010
			0.006
			0.009
			0.006
			0.012
		9/11	0.006
			0.008
			0.013
		9/11	0.009

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Beispiel 3

Auf die gleiche V/eise wie in Beispiel 2 wurde eine Spüllösung hergestellt, wobei die in diesem Falle verwendete Vorratslösung zwischen ihrer Herstellung und ihrer Verwendung im gefrorenen Zustand aufbewahrt worden war. Die Spüllösung wurde im Krankenhausbetrieb eines Blütgasanalyseninstruments ABL2 der Firma Radiometer" A/S_f Kopenhagen, verwendet. Vor der Verwendung der das Enzym enthaltenden Spüliösung wurde eine Spullösung ohne irgendeinen Enzym— gehalt verwendet und die Vorrichtung zeigte einen Fehler in der Ablesung der Hämoglobinmessungseinheit, wobei die Ablesung mit einem Standard ohne irgendeinen Hämoglobingehalt 1 g-% Hämoglobin ergab. Schon etva 12 Stunden nach der Einführung der Subtilisin enthaltenden Spüllösung in das Instrument wurde die Ablesung der hfcmoglobinmeßeinheit zu 0 g-% gegenüber dem obengenannten Standard und dieser Wert wurde während der Woche, innerhalb der die Subtilisin enthaltende Spüllösung verwendet wurde, beibehalten. Als die Subtilisin enthaltende SpüllSsung danach gegen die übliche Spüllösung ausgetauscht wurde, stieg die Ablesung auf der Hämoglobinmeßeinheit gegenüber dem Standard ohne Hämoglobin wieder auf etwa 1 g-%.

Beispiel 4

Vorschriften für die Herstellung von erfindungsgemäßen Enzymzubereitungen

1.) Eine Einheitsdosis der Enzymzubereitung eignet sich für die Auflösung in 1/2 1 Spüllösung, die 0,150 M in bezug auf Natriumchlorid ist und 0,003 % "Deciquam 222" von der Firma Struers, Kopenhagen (Didecyldimethylammoniumbromid) und 0,1 % Trichlor-tert.-butylalkohol

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enthält. Die Einheitsdosis besteht aus 0,25 AU Subtilisin A (von der Firma Novo Industri A/S, Kopenhagen), 0,16 g Na_B O-(entsprechend einer Endkonzentration von 0,84 χ 10 M in der

_3 Spüllösung, was einer Boratkonzentration von 3,4 χ 10 M entspricht), 12 χ 10~ g Deciquom 222-und 4 χ !θ" g Trichlortert.-butylalkohol. Diese Zubereitung wird wie folgt hergestellt: 1 kg entionisiertes Wasser, 10 g KCl von Analysenqualität _t 0,03 g Deciquam 222, 1 g Trichlor-tert.-butylalkohol und 40 g Na₂B₄O₇.!OH-O verden gelöst und danach werden 62,5 AU Subtilisin A zugegeben· Das Rühren wird fortgesetzt, bis eine vollständige Lösung erzielt worden ist. Die Lösung wird steril filtriert und 4 ml-Portionen der Lösung werden in sterile Phiolen überführt. Die Lösung wird unter sterilen Bedingungen 3 bis 4 Stunden lang bei -45 C gefriergetrocknet, danach werden die Phiolen 15 Stunden lang bei

-2
S χ 10 mm Hg getrocknet. Anschließend werden die Phiolen, noch unter sterilen Bedingungen, mit einem Gummiseptum und einem Ketcllring verschlossen.

Bei der Verwendung der Zubereitung werden 5 ml der obengenannten Spüllösung mittels einer Spritze in die Phiole injiziert, danach wird die Phiole gründlich geschüttelt. Die Mischung wird in die Spritze eingesaugt und unmittelbar vor der Verwendung der Spüllösung in die Spüllösungsflasche überführt.

2.) In eine Lösung von 10 g Subtilisin A pro 100 ml Wasser, das mit einem"1 M Boratpuffer bei pH 8 abgepuffert ist, werden poröse Zylinder, hergestellt aus Aluminiumsilika-tyÄluminiumoxid, mit einer Länge von 10 mm, einem Durchmesser von 5 mm und einer Porosität von 30 % eingetaucht. Die Zylinder werden etwa 10 Minuten lang in der Flüssigkeit belassen, danach werden sie aus der Flüssigkeit heraus-

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genommen und bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet. Die auf diese Weise behandelten Zylinder weisen eine Aktivität von 0,05 AU pro Zylinder auf, dies entspricht 28 % des theoretischen Wertes.

Das gleiche Verfahren wird wiederholt, diesmal jedoch unter Anlegung von Vakuum an die Flüssigkeit mit den Zylindern. Nach 10 Minuten wird das Vakuum aufgehoben.

Beispiel 5

Es wurde eine Untersuchung durchgeführt bezüglich der Fähigkeit von Subtiiisin bzw. Trypsin Ablagerungen in Glasröhrchen, durch die für einen langen Zeitraum Blut geleitet worden war, zu entfernen.

ICO Kapillarröhrchen (Durchmesser 1,25 mm, Länge 125 mm), die mit Blut halb gefüllt waren, wurden so gedreht, daß das Blutvolumen ständig von der einen Hälfte des Röhrchens in die andere Hälfte des Röhrchens gelangte. Nachdem sie 85 Stunden lang auf diese Weise behandelt worden waren, wurden die Röhrchen sehr gründlich zuerst mit Wasser und danach mit einer 0,150 M NaCl-Lösung durchgespült. Bei etwa 40 Röhrchen zeigte das Ende (der Boden) eine Ablagerung, die durch das Durchspülen nicht entfernt worden war. Diese kontaminierten Röhrchen wurden in drei Portionen mit etwa 12 Röhrchen in jeder Portion aufgeteilt. Die Kapillarröhrchen wurden mit Spülflüssigkeiten der nachfolgend angegebenen Zusammensetzung gefüllt und danach in diese eingetaucht:

A) 20 mg kristallines Subtiiisin A Novo pro Liter 3 χ 10~³ M Na₂B₄O₇JOH₂O

0,15 M NaCl
pH ~>7

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B) 600 mg kristallines Trypsin (Sigma Nr. T-8253)

-3

3 χ 10 M Triäthanolamin

0,150 M NaCl
pH ^ 7

C) 0,150 M NaCl

Die Spüllösung B entspricht in bezug auf ihren Gehalt an Trypsin und Triäthanolamin der für Calcium-Durchflußsysteme verwendeten bekannten Standardlösung.

Nach lo-stündigsüi Stehenlassen der Spüllösungen wurden die Röhrchen niit 0_r150 M NaCl gründlich durchgespült. Die visuelle Bewertung ergab die folgenden Ergebnisse:

Spüllösung. Ergebnis

A auf einigen der Röhrchenböden wurde ein sehr

schwacher Niederschlag festgestellt

B auf fast allen Röhrchenböden war ein deutlicher

Niederschlag sichtbar

C auf allen Röhrchenböden waren deutliche Nieder

schläge erkennbar.

Die nach der Enzymbehandlung auf den Kapillarröhrchen-Bb'den verbleibenden Proteinniederschläge wurden mit Stärkeblau (die Proteine anfärbt) angefärbt. Es war sehr leicht zu erkennen, daß die Böden der mit der Spüllösung A behandelten Röhrchen viel weniger gefärbt waren als die Böden der mit der Spüllösung B bzw. C behandelten Röhrchen.

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Um eine quantitative spektrophotometrische Bestimmung zu ermöglichen, wurde die Konzentration des innerhalb einer bestimmten Zeitspanne freigesetzten Stärkeblaus für jede Gruppe von Röhrchen gemessen.

Alle Röhrchen wurden mit einer Natriumchloridlösung gründlich durchgespült und auf eine Länge von 4 cm zugeschnitten. Danach wurden sie alle mit einer Natriumchloridlösung gefüllt und die gefärbten Niederschläge wurden mittels eines Stahlstückes, das unter Verwendung eines äußeren Magneten bewegt wurde, entfernt. Nachdem die Flüssigkeit 2 Stunden lang auf diese Weise behandelt worden war, wurde sie aus den Röhrchen ausgegossen und für jede Gruppe von Röhrchen auf 3 ml verdünnt. Die Extinktion jeder verdünnten Lösung wurde in einem Spektrophotometer bei 650 nm unter Verwendung von 0,150 M NaCl als Bezugssubstanz bestimmt. Dabei wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Soüllösunq Extinktion relative Extintion

A Subtilisin 0,0025 1

B Trypsin 0,049 20

C 0,150M NaCl 0,137 " 55

Nach dem Lambert-Beer-Gesetz sind die Extinktion und die Substanzkonzentration zueinander proportional (E =λχ C χ 1), was bedeutet, daß diese spektrophotometrische Messung auch bestätigte, daß in den mit Trypsin gespülten Röhrchen viel größere Mengen an Protein zurückblieben als in den mit Subtilisin gespülten Röhrchen.

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Beispiel 6

Um den Einfluß der enzymhaltigen Spüllösung auf die in einer Blutgasanalysenvorrichtung erzielten Analysenergebnisse zu bestimmen, wurden vier Radiometer ABL^-Blutgas-Analyseninstrumente mit einer normalen Spüllösung, die aus einer 0_r150 M wäßrigen NaCl-Lösung bestand, betrieben und 4 ABL2-Instrumente wurden mit einer Subtilisin A enthaltenden Spüllösung (einer 0,150 M wäßrigen NaCl-Lösung, die 1 tnM Tris-Puffer und 0,50 AU/Liter Subtilisin A enthielt, pH 8,8) betrieben. Nach etwa 72-stündigem Betrieb wurden eile Instrumente zum Analysieren der gleichen Blutcharge verwendet, wobei pro Vorrichtung 5 Blutmessungen durchgeführt wurden. Eine unilaterale Fehleranalyse zeigte, daß keine Differenz zwischen dem pH-Wert, gemessen mit den Instrumenten unter Verwendung der normalen Spüllösung und den Instrumenten unter Verwendung der Subtilisin enthaltenden Spüllösung _f vorlag.

In einem weiteren Versuch wurde untersucht, ob die obengenannte Subtilisin A enthaltende Spüllösung bei ihrer Verwendung in einem ABL2-Blutgas-Meßinstrument die mit Präzisionsstandards gemessenen nachfolgend angegebenen Analysenwerte beeinflußte:

pH-Wert

H \

Die Standards wurden in das ABL2-Instrument eingespritzt, teilweise während einer Zeitspanne, während der es mit der obengenannten normalen Spullösung gespült wurde, und teilweise während einer Zeitspanne, während der das Instrument mit der Subtilisin A enthal-

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tenden Spüllösung gespült wurde.

Eine unilaterale Fehlejanalyse zeigte, daß die mit dem Instrument gemessenen obengenannten Blutparameter von der verwendeten Spüllösung nicht abhängig waren.

Die oben angegebenen beiden Experimente zeigen, daß die erfindungsgemäße subtilisin- und pufferhaltige Spüllösung die Genauigkeit der Messungen nicht beeinträchtigt.

Die Erfindung wurde zwar vorstehend unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen näher erläutert, es ist jedoch für den Fachmann selbstverständlich, daß sie darauf keineswegs beschränkt ist, sondern cc3 diese in vielfacher Hinsicht abgeändert und modifiziert werden können, ohne ocB dadruch der Rahmen der vorliegenden Erfindung vsrlcssen wird.

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Claims

PATENTANWÄLTE A. GRUNECKER Dl PL-INa H. KINKELDEY W. STOCKMAIR DR-ING. ■ Al* (CALTCCH K. SCHUMANN DR RER (MAT. · OPU-PHYS P. H. JAKOB G. BEZOLD OR RERΝ«· DPL-CHEM 8 MÜNCHEN 22 MAXIMILIANSTRASSE 43 22. Feb.1980 P 14 756 Radiometer A/S Emdrupvej 72, DK-24-00 Kopenhagen Verfahren zum Betreiben von Vorrichtungen, die Protein enthaltende biologische Flüssigkeiten analysieren, und Zubereitung für die Verwendung in diesem Verfahren Patentansprüche

1.) Verfahren zum Betreiben von Vorrichtungen, die Protein enthaltende biologische Flüssigkeiten analysieren, g e k e η η zeichnet durch alternierende Analysier- und Spülarbeitsgänge, wobei die normale Dauer jedes Spülarbeitsganges in der gleichen Größenordnung liegt wie die normale Dauer jedes Analysierarbeitsganges und der Spülarbeitsgang mit einer Spüllösung durchgeführt wird, die ein Enzym enthält, das ausgewählt wird aus der Gruppe Subtilisin und der subtilisinaftigen Enzyme.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymkonzentration 0,05 bis 50, insbesondere 0,1 bis 2,0, vorzugs-

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weise 0,2 bis 1,0 und speziell etwa O,5 AU pro Liter beträgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Spüllösung einen pH-Puffer, vorzugsweise einen Boratpuffer, enthält.

4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Spüllösung ein Salz in einer Konzentration, das zu einer Ionenstärke der Lösung führt, die den gleichen Wert hat wie die Ionenstärke von Blut, vorzugsweise Natriumchlorid in einer Konzentration von etwa 0,150 Mol/Liter, enthält.

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Spüllösung ein oder mehrere Germizide, welche" die Aktivität des Enzyms nicht wesentlich vermindern, vorzugsweise ein Bakterizid in Kombination mit einem Fungizid enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Spüllösung eine Kombination von Didecyldimethylammoniumbromid und Trichlorbutanol enthält, wobei die Konzentration des Didecyldimethylammqniumbromids vorzugsweise etwa 0,003 % und die Konzentration des Trichlorbutanols vorzugsweise etwa 0,1/2 betragen.

7. Spüllösung für die Verwendung in dem Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie enthält oder besteht aus Wasser, einem Enzym, das ausgewählt wird aus der Gruppe Subtilisin und der subtilisinartigen Enzyme, und einem pH-Puffer mit einem pH-Wert von 7 bis 9, insbesondere einem Boratpuffer, sowie gegebenenfalls einem oder mehreren Germiziden, welche die Aktivität des Enzyms nicht wesentlich herabsetzen.

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8. Zubereitung für die Verwendung zur Herstellung einer Spüllösung, dadurch gekennzeichnet, daß sie in fester Form und verpackt in einem geschlossenen Behälter enthält oder besteht aus einem Enzym, das ausgewählt wird aus der Gruppe Subtilisin und der subtilisinartigen Enzyme, einem pH-Puffer, vorzugsweise einem Boratpuffer, und gegebenenfalls einem Germizid.

9. Zubereitung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie enthält oder besteht aus einem Enzym, das ausgewählt wird aus der Gruppe Subtilisin und der subtilisinartigen Enzyme, einem pH-Puffer, vorzugsweise einem Boratpuffer, und einem Germizid.

10. Zubereitung nach Anspruch 8 und/oder 9, dadurch gekennzeichnet, cc3 das Enzym und der pH-Puffer gefriergetrocknet sind.

Tl. Zubereitung für die Verwendung zur Herstellung einer Spüllösung, die in dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 verwendbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß sie enthält oder besteht aus einem porösen Körper, der in seinen Poren ein Enzym, das ausgewählt wird aus der Gruppe Subtilisin und der subtilisinartigen Enzyme, in festem Zustand absorbiert enthält und der vorzugsweise außerdem in den Poren des Körpers auch einen pH-Puffer in festem, wasserlöslichem Zustand enthält.

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