DK151397B - Fremgangsmaade og praeparat til brug af instrumenter, der analyserer proteinholdige biologiske vaesker - Google Patents

Description

i 151397

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til brug ved drift af apparater, der analyserer proteinholdige biologiske væsker, samt et præparat til anvendelse ved fremgangsmåden.

Instrumenter, som analyserer biologiske væsker, anvendes i vid 5 udstrækning. Således er instrumenter til analyse af blod, serum eller plasma i mere eller mindre automatiseret form uundværlige i hospitaler og laboratorier, hvor det er af betydning at kende værdierne for sådanne blodparametre f.eks. pH, Pco2, Po2, hæmoglobinindhold, elektrolytkoncentration, etc., og deraf afledte parametre, f.eks.

10 "standardbicarbonat".

Nu til dags kræves det, at disse parametre bestemmes med stor nøjagtighed, og i visse kliniske situationer, f.eks. under kirurgiske indgreb, kan den nøjagtige og pålidelige bestemmelse af blodparametre være af afgørende betydning. Det er derfor nødvendigt, at disse 15 instrumenter udviser en høj grad af nøjagtighed og pålidelighed.

Instrumenter til analyse af blod, serum eller plasma (i det følgende for kortheds skyld betegnet "blodanalyseinstrumenter") arbejder typisk med vekslen mellem en analyseprocedure, under hvilken en prøve indføres i apparatet til bestemmelse af én eller flere parametre, 20 og en skylleprocedure, under hvilken en skyllevæske føres gennem instrumentet manuelt eller automatisk, idet skyllevæsken enten indføres ad samme vej som prøven eller, især for automatiske instrumenter, indføres automatisk fra et skyllevæskereservoir, som er forbundet med instrumentet. Skylleprocedurens normale varighed er af 25 samme størrelsesorden som den normale varighed af hver analyseprocedure. Med passende intervaller sker der en kalibreringsprocedure, under hvilken instrumentets måleenheder kalibreres med kalibreringsvæsker eller -gasser, hvorefter der skylles med skyllevæsken. I visse typer instrumenter udføres kalibreringen automatisk med intervaller, 30 som er programmeret i instrumentet.

Ved den praktiske anvendelse af blodanalyseinstrumenter har det vist sig, at instrumenterne undertiden giver en vis grad af målefejl. Det kan f.eks. vise sig, at instrumentets faktiske udlæsning afviger fra 2 151397 data målt på referencestandardvæsker, eller at responstiden for én eller flere af måleenhederne bliver unormalt lang. Det formodes, at disse problemer først og fremmest skyldes afsætninger af stof på måleenhedernes detektionsflader, især afsætninger af proteiner eller 5 proteinholdige stoffer eller lipider fra blodprøver, der analyseres i appa ratet.

Det har nu vist sig, at disse målefejls- eller stabilitetsproblemer i instrumenter, som analyserer proteinholdige biologiske væsker, f.eks. blodanalyseinstrumenter, kan undgås eller minimeres ved, at instru-10 menternes skylleprocedure foretages med en skyllevæske, der i opløst tilstand indeholder subtilisin eller en anden endopeptidase med bred specificitet, der har samme stabilitetsegenskaber i opløst tilstand som subtilisin.

Som det fremgår af eksemplerne, minimeres ved anvendelsen af en 15 sådan skyllevæske de problemer med målefejl eller ustabilitet, der kan tilskrives protein- og andre afsætninger i instrumenternes målekamre og transportkanaler, uden at instrumenternes nøjagtighed nedsættes.

Konventionelle skyllevæsker til blodanalyseinstrumenter består typisk af vand eller vandige opløsninger af natriumchlorid i fysiologisk 20 koncentration og eventuelt indeholdende germicider, og de er frie for buffersubstanser og andre bestanddele, der måtte kunne påvirke måleresultaterne. Forskellige skyllevæsker er kommercielt tilgængelige og forhandles eller fremstilles typisk i portioner, der er tilstrækkelige til 1 - 2 ugers normalt brug. I henhold til den foreliggende opfindelse 25 har det vist sig muligt at etablere en subtilisinholdig skyllevæske, i hvilken subtilisinet på den ene side vil bibeholde en rimelig aktivitet i et tidsrum på f.eks. 2-3 uger ved stuetemperatur, men som på den anden side på trods af, at den indeholder buffersubstans, ikke vil medføre nogen fejl i måleresultaterne. 1

Det er kendt at fjerne afsætninger i blodanalyseinstrumenter ved hjælp af en subtilisinholdig detergentopløsning (jvf. brugsanvisningen for OSM2 Oxygen Saturation Meter fra Radiometer A/S, København, side 4, "Removal of Protein Deposits"), men ved denne kendte frem- 3 151397 gangsmide afbrydes apparatets drift, den enzymholdige detergentopløsning indføres via instrumentets prøvetransportsystem, og opløsningen lades forblive i 2 - 24 timer, hvorefter opløsningen fjernes, og systemet skylles med destilleret vand.

5 Denne kendte anvendelse af subtilisin er konventionel for sådanne enzymer, da den omfatter en lang inkubationstid og efterfølges af skylning med det enzymfrie destillerede vand, før målingerne genoptages .

Det var også kendt at anvende en trypsin- og triethanolaminholdig 10 standard- og/eller skyllevæske ved driften af et gennemstrømningsmålesystem for blodcalcium, jvf. "Instruction Manual model 99-20 serum calcium flow-thru system, Orion Research Incorporated, USA 1969, form IM99-20/966" og forskellige litteraturbehandlinger af systemet, f.eks.: 15 Hattner, R. S., Johnson, J. W., Bernstein, D. S., Wachman, A.

og Brackman, J., "Electrochemical determination of apparent ionized serum calcium using a calcium-selective electrode: the method and values in normal humans and a comparison to total serum calcium", Clin. Chim. Acta, 28 (1970) 67-75.

20 Lindgarde, F. og Zettervall, 0., "Serum ionized calcium in a normal population studied with a calcium ion-sensitive electrode",

Israel J. Med. Sci., vol. 7, No. 3, March 1971.

Schwartz, H. D., McConville, B. C. og Christopherson, E. F., "Serum ionized calcium by specific ion electrode", Clin. Chim.

25 Acta, 31 (1971) 97-107.

Ting-Kai Li and Piechocki, Joseph T., "Determination of serum ionic calcium with an ion-selective electrode: evaluation of methodology and normal values", Clinical Chemistry, vol. 17, No. 5, 1971, 411-416. 1

Fuchs, C., Paschen K., Spieckermann P. G. og Westberg, C. v., "Bestimmung des ionisierten Calciums im Serum mit einer ionen- 4 151397 selektiven Durchflusselektrode: Methodik und Normalwerte",

Klinische Wochenschrift, 50. Jahrgang, 17. Heft, 1. September 1972, 824-832.

Lindgårde, F., "Potentiometric determination of serum ionized 5 calcium in a normal human population", Clin. Chim. Acta, 40 (1972) 477-484.

Seamonds, Bette, Towfighi, Javad og Arvan, Dan A., "Determination of ionized calcium in serum by use of an ion-selective electrode", Clinical Chemistry, vol. 18, No. 2, 1972, 155-160.

10 Subryan, V. L., Popovtzer, Μ. M., Parks, S. D. og Reeve, E.

B., "Measurement of serum ionized calcium with the ion-exchange electrode", Clinical Chemistry, vol. 18, No. 12, 1972, 1459-1462.

Ladenson, Jack H. og Bowers, George N., Jr., " Free calcium in serum. I. Determination with the ion-specific electrode, and 15 factors affecting the results", Clinical Chemistry, 19, 565, 1973.

Et nyere arbejde, som beskriver anvendelsen af trypsinopløsninger i forbindelse med calcium-gennemstrømningselektroder, er Cattrall, R.W. og Fong, Kwok-Tai, Talanta, Vol. 25, 1978, 541 - 543, i henhold til hvilket calciummålesystemets prøvegren skylles med destilleret 20 vand indeholdende 0,50% w/v trypsin efter hver måling.

Som det fremgår af den ovennævnte brugsanvisning, skal de trypsin-holdige opløsninger imidlertid fremstilles frisk samme dag, som de anvendes, og dette vil gøre det besværligt og uhensigtsmæssigt at anvende dem, især i forbindelse med moderne apparatur, som på 25 grund af den høje grad af automatisering ellers er forholdsvis lidet arbejdskrævende.

Endvidere har det, som det fremgår af de efterfølgende eksempler, overraskende vist sig, at selv meget lave koncentrationer af subtilisin i de her omhandlede opløsninger er meget mere effektive med hensyn 30 til fjernelse af afsætninger efter biologiske væsker end trypsinopløs- 5 151397 n i nger af endog meget højere koncentration. Selv om opfindelsen ikke skal begrænses til nogen teori, kan en af grundene til subtilisins overraskende effektivitet til dette formål være, at subtilisin og andre endopeptidaser med bred specificitet ikke har nogen klar specificitet 5 (eller, udtrykt på en anden måde, er bredspektrede enzymer), og at de derfor udvirker en mere universel nedbrydning af de mange forskellige proteiner, der kan være indeholdt i de urenheder, som skal fjernes. Et andet vigtigt træk ved subtilisin i denne forbindelse er, at det udviser evne til at nedbryde esterbindinger, hvilket kan være 10 af betydning ved fjernelsen af lipidafsætninger i instrumenterne.

Medens de ovenfor omtalte kendte anvendelser af trypsinholdige opløsninger alle har relation til gennemstrømningsapparater, dvs. apparater, i hvilke målingerne udføres, medens prøveopløsningen føres gennem måleenheden, har det i overensstemmelse med den foreliggende 15 opfindelse vist sig, at de subtilisinholdige opløsninger uden forringelse af måleresultaterne også kan anvendes under statiske målebetingelser, i hvilke et rumfang enzymholdigt skyllevæske nødvendigvis vil være tilbage som reminiscens i målekammeret under målingen.

I overensstemmelse med det ovenfor anførte angår opfindelsen således 20 en fremgangsmåde til brug ved drift af instrumenter, der analyserer proteinholdige biologiske væsker, ved hvilken fremgangsmåden der veksles mellem en analyseprocedure, hvor en prøve, der skal analyseres, indføres i instrumentet, og en skylleprocedure, hvor en en-zymholdig skyllevæske føres gennem instrumentets målekamre og 25 tilledninger, idet den normale varighed af hver skylleprocedure er af samme størrelsesorden som den normale varighed af hver analyseprocedure og højst udgør nogle minutter, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at skylleproceduren udføres med en skyllevæske indeholdende en pH-puffersubstans, fortrinsvis et borat, og et enzym 30 valgt blandt subtilisin og andre endopeptidaser med bred specificitet, der har samme stabilitetsegenskaber i opløsning som subtilisin, idet koncentrationen af enzym er 0,05-50 AU, især 0,1-2,0 AU, pr. liter.

Udtrykket "andre endopeptidaser med bred specificitet" skal her betegne endopeptidaser, der ligesom subtilisin har bred specificitet, 6 151397 dvs. er i stand til at bryde peptidbindinger mellem mange forskellige aminosyrer, i modsætning til f.eks. trypsin- og pepsinlignende enzymer, der har en relativt snæver specificitet og derfor kun er i stand til bryde et relativt lille antal peptidbindingstyper.

5 Med henvisning til det almindeligt anerkendte internationale enzym-nornen klatursystem fra 1972 klassificeres endopeptidaser i klasse 3.4, især i underklasserne 3.4.22, 3.4.24 og 3.4.99 og i den underklasse, hvortil subtilisinerne hører, dvs. 3.4.21, idet de blandt disse endopeptidaser, der er anvendelige til den foreliggende opfindelses formål, 10 er sådanne med bred specificitet i modsætning til f.eks. trypsin, der også hører til denne underklasse, og med samme stabilitetsegenskaber i vandig opløsning som subtilisin.

Eksempler på specifikke enzymer, der må formodes at være nyttige til den foreliggende opfindelses formål, er 3.4.21.1 chymotrypsin A og 15 B, 3.4.21.2 chymotrypsin C, 3.4.21.9 Acrosin, 3.4.21.11 Elastase, 3.4.21.14 subtilisinklassifikationen omfattende "Subtilisin Carlsberg" (også kaldet Subtilisin A og B eller Subtilopeptidase A og B), og BPN' (Nagarseproteinase), Subtilisin Novo og sådanne lignende enzymer, som produceres af Bacillus pumilis og Bacillus licheniformis, 20 3.4.21.13 Phaseolus proteinase, 3.4.21.15 Aspergillus alkaline pro teinase, 3.4.21.16 Alternaria endopeptidase, 3.4.21.17 Arthrobacter serine proteinase, 3.4.21.18 Tenebrio α-proteinase, 3.4.22.2 Papain, 3.4.22.5 Bromelain, 3.4.22.7 Asclepain, 3.4.22.9 Yeast proteinase B, 3.4.24.2 Sepia proteinase og det kommercielle produkt "Pronase", som 25 fås fra BDH Chemicals Ltd., England, og som er en blanding indeholdende flere bredspektrede proteinaser.

Det instrument, som anvendes i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan være et hvilket som helst apparat, der analyserer en hvilken som helst parameter eller bestanddel i blod eller en 30 hvilken som helst anden biologisk væske, og hvori der er vekslen mellem en analyseprocedure og en s kyl leprocedure, hvilket i de fleste praktiske tilfælde betyder, at der umiddelbart efter analysen på en bestemt prøve sker en renseprocedure, før den næste prøve indføres og analyseres. Den foreliggende opfindelse omfatter imidlertid også de 7 151397 tilfælde, hvor der analyseres et antal prøver lige efter hinanden, f.eks. i en væskestreng, før der udføres en skylleprocedure. Den normale varighed af hver skylleprocedure er af samme størrelsesorden som den normale varighed af hver analyseprocedure (normalt af stør-5 relsesorden nogle minutter) til forskel fra den konventionelle inkubation med en subtilisinlignende opløsning, som er nævnt ovenfor. Eksempler på instrumenter, der hensigtsmæssigt betjenes i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er blodgasanalysa-torer, der måler pH, Pco2 og Po2, oxygenmætningsmåleinstrumenter, 10 instrumenter til bestemmelse af hæmoglobinindhold og instrumenter til bestemmelse af koncentrationen af bestemte elektrolytter i biologiske væsker, især blod. Ved den kendte betjening af disse instrumenter efterfølges hver analyse på en prøve typisk af en skylning med en skyllevæske, som tages fra et med apparatet forbundet reservoir.

15 På grund af den begrænsede stabilitet af enzymer i opløsning vil den enzymholdige skyllevæske ifølge opfindelsen normalt ikke blive fabriksfremstillet, men vil fortrinsvis blive fremstillet af den endelige bruger ved, at enzymet opløses i vand eller en vandig opløsning. Det foretrækkes, at der samtidig i lav koncentration inkorporeres en 20 pH-buffersubstans, der bufrer til en pH-værdi, som egner sig for enzymet, for subtilisin i pH-området 7 - 9,5, enten derved, at opløsningen allerede indeholder buffersubstans, eller derved, at det enzym, der skal opløses, er indeholdt i et præparat, der også indeholder et bufferstof. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Enzymkoncentrationen i skyllevæsken ifølge opfindelsen vil som nævnt 2 være i området 0,05 - 50 Anson-enheder (AU) pr. liter, hensigts 3 mæssigt i området 0,1 - 2,0, fortrinsvis 0,2 - 1,0, f.eks. ca. 0,5, 4 AU pr. liter subtilisin, og koncentration af pH-buffersubstans, der 5 f.eks. kan være en phosphatbuffersubstans, John-Lindsay univer- 6 salbuffersubstans (citronsyre, H3P03, KH2PO,, + veronal) eller, fortrinsvis, en boratbuffersubstans, er fortrinsvis af størrelsesorde- 7 _ 3 _ 3 _3 _ 3 8 nen ca. 0,2 x 10” M - 5 x 10 M, fortrinsvis 10 M - 4 x 10 M og 9 _ 3 10 helst ca. 3 x 10 Mi skyllevæsken. Det er et særligt træk ved opfindelsen, at det er muligt at etablere en tilstrækkelig stabil subtili- 11 sinholdig opløsning til normal anvendelse over en 2 ugers periode, 8 151397 dvs. at bufferkapaciteten er tilstrækkelig til at undgå en sådan af den omgivende lufts C02 forårsaget pH-sænkning, som ville medføre en for stærk nedsættelse af subtilisinets stabilitet og aktivitet, medens bufferkapadteten dog samtidig er tilstrækkelig lav til at mulig-5 gøre skyllevæskens anvendelse i f.eks. blodgasanalyseudstyr uden nogen skadelig indvirkning på pH- og Pco2-målingerne.

Det har vist sig, at tilstedeværelsen af egnede germicider forøger stabiliteten af enzymet i den vandige opløsning, og det foretrækkes derfor, at skyllevæsken indeholder ét eller flere germidder, som ikke 10 medfører nogen væsentlig forringelse af enzymets aktivitet. Germici-derne er sædvanligvis til stede i en lav, men stadig effektiv koncentration i opløsningen, typisk en koncentration af størrelsesordenen 1 - 1000 ppm. En foretrukken germicidkombination til anvendelse i skyllevæsken er en kombination af'et bactericid og et fungicid. Speci-15 fikke germicider, der har vist sig at være forenelige med subtilisin i praksis og at forøge subtilisins stabilitet, er didecyldimethylammoni-umbromid og trichlor-tert.bytylalkohol, som fortrinsvis anvendes i kombination. Andre eksempler på germicider til anvendelse i opløsningen ifølge opfindelsen er phenylmercurinitrat og cuprichlorid, der 20 hensigtsmæssigt kan anvendes i kombination i en koncentration på 1 -5 ppm hver.

En skyllevæske, der indeholder vand, et enzym valgt blandt subtilisin eller andre endopeptidaser med bred specificitet, der har samme stabilitetsegenskaber i opløsning som subtilisin, idet koncentrationen 25 af enzym er 0,05 - 50 AU, især 0,1 - 2,0 AU, pr. liter, en pH-buf-fersubstans, der giver en pH-værdi på 7 - 9, især en boratbuffer, og et germicid, som ikke i nogen væsentlig grad nedsætter enzymets aktivitet, antages i sig selv at være hidtil ukendt og udgør et aspekt af den foreliggende opfindelse. 1

Opfindelsen angår også et præparat, der er beregnet til anvendelse ved fremstilling af en skyllevæske af den omhandlede art og som derfor i fast form indeholder et enzym valgt blandt subtilisin og andre endopeptidaser med bred specificitet, der har samme stabilitets- 9 151397 egenskaber i opløsning som subtilisin, en pH-buffersubstans, fortrinsvis et borat, et germicid og et salt.

Dette præparat er fortrinsvis pakket i en lukket beholder, der f.eks. kan være et hætteglas med gennemstikkeligt septum, således at præ-5 paratet genopløses ved injektion af vand eller skyllevæske, som injiceres fra en sprøjte, udtages igen gennem sprøjten og overføres til den portion skyllevæske, hvortil midlet er beregnet. Enzymet i dette præparat er fortrinsvis subtilisin, og pH-buffersubstansen er fortrinsvis et borat. Mængderne af enzymet og boratet tilpasses til det 10 slutrumfang af den enzymholdige skyllevæske, der skal fremstilles.

Dette middel ifølge opfindelsen fremstilles fortrinsvis ved frysetørring af en vandig opløsning indeholdende enzymet og buffersubstansen og (jvf. nedenfor) eventuelt et germicid eller en kombination af germi-cider. Den vandige opløsning udmåles hensigtsmæssigt direkte i den 15 beholder, i hvilken midlet skal emballeres, f.eks. et hætteglas, og frysetørres in situ. Dette er en hensigtsmæssig måde til at dosere enzymet med tilstrækkelig nøjagtighed, og frysetørringen har også den fordel, at den giver buffersubstansen en voluminøs struktur, som meget let genopløses i vand, når skyllevæsken ifølge opfindelsen skal 20 fremstilles ved rekonstituering af det frysetørrede præparat.

En anden type hensigtsmæssig enhedsdosis af et middel indeholdende enzym og eventuelt buffersubstans er et porøst legeme, hvori enzymet og eventuelt buffersubstans er absorberet i porøsiteterne i fast tilstand med henblik på at blive genopløst og udludet med vand eller 25 vandige opløsninger, f.eks. et porøst plastlegeme eller et porøst legeme af et sintret uorganisk materiale såsom aluminiumsilicat/alumi-niumoxid. De porøse legemer kan om ønsket indeholde en ferromagne-tisk kerne, således at de kan anvendes som omrøringslegemer, der kan bevæges ved hjælp af et ydre magnetisk felt, således som det er 30 beskrevet i dansk patentansøgning nr. 2737/78. En hensigtsmæssig måde til fremstilling af porøse legemer med absorberet enzym er at neddyppe egnede porøse legemer i en bufret enzymopløsning, eventuelt med påføring af vakuum og efterfølgende frigørelse af vakuumet 151397 ίο til opnåelse af en. bedre penetration ind i det porøse legeme, og derefter tørre det således imprægnerede legeme, hensigtsmæssigt ved frysetørring. De porøse legemer emballeres hensigtsmæssigt i lufttætte beholdere, fortrinsvis plastpakninger af "blistertypen".

5 Præparatet ifølge opfindelsen kan yderligere indeholde et germicid til forøgelse af præparatets opbevaringsstabilitet. Germicidet eller germi-ciderne kan enten være til stede i præparatet i en koncentration svarende til den ønskede s lutkoncentration af germicid i den endelige skyllevæske eller, når præparatet anvendes til opløsning i en skylle-10 væske, der allerede indeholder germicid, i en mindre koncentration, der blot tjener til at beskytte selve præparatet mod mikrobiel nedbrydning før dets opløsning. I overensstemmelse med det ovenfor anførte er en foretrukken germicidkombination et fungicid og et bac-tericid, og specifikke eksempler på egnede germicider er didecyldi-15 methylammoniumbromid, trichlor-tert.butylalkohol, phenylmercurinitrat og cuprichlorid.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres skylningen under anvendelse af den enzymholdige skyllevæske normalt efter nøjagtig samme rutine som med den normale skyllevæske, der er beregnet til 20 det bestemte pågældende instrument.

Opfindelsen belyses nærmere ved følgende eksempler:

Eksempel 1.

En enzymholdig skyllevæske fremstilles på følgende måde:

Til 1 liter afioniseret vand sættes natriumchlorid (analysekvalitet) til 25 en koncentration på 0,150M og TRIS (tri(hydroxymethyl)aminomethan) til en koncentration på 0,001M. Til den resulterende opløsning sættes 10 ml af en opløsning af 2 g/liter rent krystallinsk subtilisin (Subtili-sin A fra Novo Industri A/S, København, aktivitet 25 Anson-enheder (AU) pr. g) i afioniseret vand, hvilken opløsning er blevet frisk 30 fremstillet samme dag.

11 151397

Den resulterende enzymholdige skyllevaske anvendes som skyllevasken i den automatiserede s kyl leprocedure efter hver blodanalyse i to automatiske blodgasinstrumenter (ABL1 fra Radiometer A/S, København). Som de prøver, der analyseres, anvendes donorblod. Pr. dag 5 foretages ca. 25 injektioner af-blodprøver og, svarende hertil, 25 efterfølgende automatiske skylleprocedurer plus ofte (ca. én gang pr. time) automatisk kalibrering med efterfølgende gennemstrømning af skyllevasken. I de perioder (f.eks. om aftenen og natten over), hvor der ikke udføres analyser, foretager instrumenterne deres normale 10 automatiske kalibrerings procedure ca. 1 gang i timen med efterfølgende skylning.

Hvert instrument indeholder 2 vaskesensorer, og spandingen fra disse væskesensorer bestemmes som basis for bedømmelsen af den forureningshindrende effekt, der opnås ved tilsætning af enzym til 15 skyllevasken, da det antages, at en eventuel reduktion i udgangsspandingen forårsages af forurening på væskesensorens detektions-areal. Efter 2 ugers drift under anvendelse af den på ovenfor beskrevne måde fremstillede skyllevaske anvendes instrumenterne yderligere 2 uger med skyllevaske fremstillet på samme måde, men uden 20 subtilisinet.

En ensidig t-test på de registrerede væskesensorspændinger viser, at der ved tilsætning af enzymet opnås signifikant bedre rensning (højere væskesensorspænding) for 3 af de 4 indbyggede sensorer, medens der ikke er nogen signifikans for højere spænding for den fjerde 25 væskesensor (men på den anden side heller ikke nogen signifikans for lavere spænding). Erfaringsmæssigt medfører prøver af donorblod ikke samme forureningsproblemer, som der opstår ved den praktiske anvendelse af instrumenterne, da blod fra syge patienter almindeligvis har en meget højere tendens til at forurene end blod fra sunde per-30 soner, og især kan nogle individuelle blodprøver fra syge patienter give en overordentlig besværlig forurening i instrumentet.

12 151397

Eksempel 2.

En skyllevæske fremstilles på samme måde som beskrevet i eksempel 1. Stamopløsningen er nogle få dage gammel og indeholder en sådan mængde Subtilisin A i en Ο,ΟΟΙΜ TRIS i afioniseret vand, at 2 ml af 5 den færdige opløsning indeholder 10 mg Subtilisin A. I et hospital sammenlignes denne skyllevæske med en skyllevæske uden enzymindhold ved driften af et blodgasanalyseinstrument ABL2 fra Radiometer A/S, København. Apparatet udfører automatisk skylnings- og kalibreringsprocedurer på samme måde som beskrevet i eksempel 1. Før 10 anvendelsen af den enzymholdige skyllevæske er indsvingsforskellen for instrumentets pH-elektrode, udtrykt som forskellen mellem den første dataudlæsning indeholdende pH-elektrodens spænding efter indføring af en ny prøve og den tredje dataudlæsning for den samme prøve, utilfredsstillende høj: 0,017 ± 0,006, udtrykt som pH. De 15 enkelte resultater svarende til dette over en periode fremgår af nedenstående tabel. Efter indføring af den enzymholdige skyllevæske reduceres denne forskel til 0,007 ±0,0015. Efter en uge stiger den imidlertid lidt til 0,009 ±0,003, hvilket antages at skyldes en nedsat enzymaktivitet, der formodentligt må tilskrives det forhold, at stam-20 opløsningen, der ikke indeholdt germicider, allerede har været nogle dage gammel før fremstillingen af skyllevæsken.

13 151397

Med skyllevæske uden enzym Med den enzymholdige skyllevæs ke

Dato Δ pH Dato Δ pH

5 _ _ __ _ 0,015 3/11 0,010 0,011 3/11 0,012 0,010 1/11 0,020 3/11 0,007 10 1/11 4/11 0,007 1/11 0,013 4/11 0,006 0,028 4/11 0,006 0,029 4/11 0,005 3/11 0,020 4/11 0,006 15 3/11 0,016 4/11 0,008 3/11 0,017 4/11 0,008 0,014 6/11 0,009 0,008 6/11 0,008 20 7/11 0,009 0,016 0,010 0,006 0,009 25 0,006 0,012 9/11 0,006 0,008 0,013 30 9/11 0,009

Eksempel 3.

En skyllevæske fremstilles på samme måde som beskrevet i eksempel 2, idet den stamopløsning, der anvendes i dette tilfælde, er blevet opbevaret i frossen tilstand mellem sin fremstilling og anvendelse.

14 151397

Skyllevasken anvendes ved driften af et blodgasanalyseinstrument ABL2 fra Radiometer A/S, København, i et hospital. Før anvendelsen af den enzymholdige skyllevaske er der blevet anvendt en skyllevaske uden enzymindhold, og apparatet har vist en fejl i udfasningen 5 fra hamoglobinmåleenheden, idet udlasningen på en standard uden noget indhold af hamoglobin var 1 g% hamoglobin. Allerede ca. 12 timer efter indføringen af den subtilisinholdige skyllevaske i instrumentet bliver udlæsningen fra hæmoglobinmåleenheden 0 g% på den ovennævnte standard, og denne værdi opretholdes gennem hele den 10 uge, i hvilken der anvendes den subtilisinholdige skyllevaske. Når den subtilisinholdige skyllevaske derefter udskiftes med den sædvanlige skyllevaske, stiger hæmoglobinmåleenhedens udlæsning på standarden uden hæmoglobin igen til ca. 1 g%.

Eksempel 4.

15 Forskrifter for enzymholdige præparater ifølge opfindelsen.

1. En enhedsdosis af det enzymholdige middel er beregnet til at blive opløst i en 1/2 liter skyllevaske, som er 0,150M med hensyn til na-triumchlorid, og som indeholder 0,003% af "Deciquam 22" fra Struers, 20 København (didecyldimethylammoniumbromid) og 0,1% trichlor-tert.bu-tylalkohol. Enhedsdosen består af 0,25 AU Subtilisin A (fra Novo Industri A/S, København), 0,16 g Na2Bi,O7.10H2O (svarende til en _ 3 slutkoncentration på 0,84 x 10 M i skyllevasken, hvilket svarer til _3 _5 en boratkoncentration på 3,4 x 10 M), 12x10 g Deciquam 222 og _ 3 25 4 x 10 g trichlor-tert.butylalkohol.

Den enzymholdige enhedsdosis fremstilles på følgende måde: I 1 kg afioniseret vand opløses 10 g KCI af analysekvalitet, 0,03 g Deciquam 222, 1 g trichlor-tert.butylalkohol og 40 g Na2B„07.10H20, og derefter tilsættes 62,5 AU Subtilisin A. Der omrøres, indtil der er 30 opnået fuldstændig opløsning. Opløsningen sterilfiltreres, og portioner på 4 ml af opløsningen overføres til sterile hætteglas. Opløsningen 15 151397 frysetørres under sterile betingelser ved -45°C i 3 - 4 timer, hvor- _ 2 efter hætteglassene tørres i 15 timer ved 8 x 10 mm Hg.

Derefter lukkes hætteglassene, stadig under sterile betingelser, med kautsjukseptum og metalring.

5 Ved anvendelsen af midlet injiceres 5 ml af den ovennævnte skylle-væske ind i hætteglasset ved hjælp af en injektionssprøjte, hvorefter hætteglasset rystes omhyggeligt. Blandingen suges tilbage i sprøjten og overføres til flasken med skyllevæske umiddelbart før skyllevæsken skal anvendes.

10 2. I en opløsning af 10 g Subtilisin A pr. 100 ml vand, bufret med 1M boratbuffer ved pH-værdi 8, neddyppes porøse cylindre fremstillet af aluminiumsilicat/aluminiumoxid og med en længde på 10 mm, en diameter på 5 mm og en porøsitet på 30%. Cylindrene lades forblive i væsken i ca. 10 min., hvorefter de fjernes fra væsken og lufttørres 15 ved stuetemperatur. De på denne måde behandlede cylindre udviser en aktivitet på 0,05 AU pr. cylinder, hvilket er 28% af den teoretiske værdi.

Den samme procedure gentages, men denne gang under påføring af vakuum på væsken med cylindrene. Efter 10 min. ophæves dette 20 vakuum.

De fremstillede cylindre pakkes i plastpakninger af "blistertypen".

Hver cylinder er beregnet til fremstilling af 1 liter skyllevæske.

Eksempel 5.

Der foretages en undersøgelse af henholdsvis subtilisins og trypsins 25 evne til at fjerne afsætninger i glasrør, gennem hvilke der over et langt tidsrum er blevet ledet blod. 1 kapillarrør (diameter 1,25 mm, længde 125 mm), som er halvfyldt med blod, roteres således, at blodvolumenet konstant passerer fra den 15139* 16 ene halvdel af hvert rør til den anden halvdel af røret. Efter 85 timers behandling på denne måde skylles rørene meget grundigt, først med vand og derefter med 0,150M NaCI-opløsning.

På ca. 40 rør udviser rørenden en afsætning, som ikke er blevet 5 fjernet ved skylningen.

Disse forurenede rør inddeles i tre portioner med ca. 12 rør i hver portion. Kapillarrørene fyldes med og neddyppes derefter i skylle-væsker med følgende sammensætning: A. 20 mg krystallinsk Subtilisin A Novo pr. liter

10 3 x 10'3M Na2B4O?.10H2O

0,15M NaCI pH ~ 7 B. 600 mg krystallinsk trypsin pr. liter (Sigma No. T-8253) -3

3 x 10 M triethanolamin 15 0,150M NaCI

pH ~ 7

C. ' 0,150M NaCI

Skyllevæske B svarer med hensyn til indhold af trypsin og triethanolamin, til den kendte standard væske, der anvendes til gennemstrøm-20 ningssystemer til måling af calcium.

Efter henstand i 16 timer i s kyl levæskerne skylles rørene grundigt med. 0,150M NaCI.

Den visuelle bedømmelse, der foretages før den nedenfor omtalte farvning med amidoblåt, gav følgende resultater: 17 151397

Skyllevæske Resultat A. Meget ringe afsætning konstateres på nogle få af rørenderne.

5 B. En tydelig afsætning er synlig på næsten alle rørenderne.

C. Tydelige afsætninger ses på røren derne.

De proteinafsætninger, som bliver tilbage på kapillarrørenes ender 10 efter behandlingen med enzym, farves med amidoblåt (som farver proteiner). Det er meget let at ’se, at enderne på de rør, der er behandlet med skyllevæske A, har meget mindre farvning end enderne af de rør, der er behandlet med henholdsvis skyllevæske B og skyllevæske C.

15 Til opnåelse af en kvantitativ spektrofotometrisk bestemmelse måles den koncentration af amidoblåt, der afgives i en vis periode, for hver gruppe af rør:

Alle rør skylles grundigt med natriumchloridopløsning og skæres ud i længder på 4 cm. Derefter fyldes de alle med natriumchloridopløsning, 20 og de farvede afsætninger fjernes ved hjælp af et stykke stål, der bevæges med en udvendig magnet. Efter to timers behandling på denne måde hældes væsken ud fra rørene og fortyndes til 3 ml for hver gruppe rør. Ekstinktionen af hver enkelt fortyndet opløsning bestemmes på et spektrofotometer ved 650 nm under anvendelse af 25 0,150M NaCI som reference. Resultaterne er som følger:

Skyllevæske Ekstinktion Relativ ekstinktion A Subtilisin 0,0025 1 B Trypsin 0,049 20 30 C 0,150M NaCI 0,137 55 18 151397 I henhold til Lambert-Beers' lov er ekstinktionen og stofkoncentrationen proportionale (E = XxCx1), hvilket betyder, at denne spektrofotometriske måling også bekræfter, at der bliver meget større mængder protein tilbage i de rør, som er skyllet med trypsin, end i 5 de rør, som er skyllet med subtilisin.

Eksempel 6.

Til konstatering af de enzymholdige skyllevæskers indflydelse på de .analyseresultater, der opnås i blodgasanalyseinstrumenter, foretages driften af 4 Radiometer ABL2-blodgasanalyseinstrumenter med en 10 normal skyllevaske bestående af en 0,150M vandig NaCI-opløsning, og driften af 4 ABL2-instrumenter foretages med en Subtilisin A-holdig skyllevæske (en 0,150M vandig NaCI-opløsning indeholdende Ί mM TRIS og 0,50 AU/liter Subtilisin A, pH-værdi 8,8). Efter ca. 72 driftstimer anvendes alle instrumenterne til analyse på samme charge 15 blod, idet der foretages 5 blodmålinger pr. apparat. En ensidig variansanalyse viser, at der ikke er nogen forskel mellem pH målt på de instrumenter, der anvender den normale skyllevæske, og de instrumenter, der anvender den subtilisinholdige skyllevæske.

Ved et andet forsøg undersøges det, om den ovennævnte Subtilisin 20 A-holdige skyllevæske ved .anvendelse i et ABL2-blodgasmåleinstru-ment påvirker følgende analyser, målt på præcisionsstandarder:

PH

Ρα>2 P°2 25 Standarderne injiceres i ABL2-instrumentet dels i en periode, hvor instrumentet skylles med den ovennævnte normale skyllevæske, og dels i en periode, hvor instrumentet skylles med den Subtilisin A-holdige skyllevæske.

En ensidig variansanalyse viser, at værdierne af de ovennævnte 30 blodparametre, der måles på instrumentet, ikke afhænger af den anvendte skyllevæske.

Claims (10)

151397 De ovenfor anførte to forsøg viser, at den subtilisin- og buffersub-stansholdige skyllevæske ifølge opfindelsen ikke forringer målingernes nøjagtighed mere end den normale skyllevæske.

1. Fremgangsmåde til brug ved drift af instrumenter, der analyserer proteinholdige biologiske væsker, ved hvilken fremgangsmåden der veksles mellem en analyseprocedure, hvor en prøve, der skal analyseres, indføres i instrumentet, og en s kyl leprocedure, hvor en en-zymholdig skyllevæske føres gennem instrumentets målekamre og 10 tilledninger, idet den normale varighed af hver s kyl leprocedure er af samme størrelsesorden som den normale varighed af hver analyseprocedure og højst udgør nogle minutter, kendetegnet ved, at s kyl leproceduren udføres med en skyllevæske indeholdende en pH-puffersubstans, fortrinsvis et borat, 15 og et enzym valgt blandt subtilisin og andre endopeptidaser med bred specificitet, der har samme stabilitetsegenskaber i opløsning som subtilisin, idet koncentrationen af enzym er 0,05-50 AU, især 0,1-2,0 AU, pr. liter.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 20 kendetegnet ved, at koncentrationen af enzym er 0,2-1,0 AU og specielt ca. 0,5 AU pr. liter.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendeteg n et ved, at skyllevæsken indeholder et salt i en koncentration, der resulterer i en ionstyrke i skyllevæsken, der er af 25 samme niveau som ionstyrken i blod, hvilket salt fortrinsvis er natri-umchlorid i en koncentration på ca. 0,150 mol/liter.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at skyllevæsken indeholder ét eller flere germicider, som ikke medfører nogen væsentlig nedsættelse af enzy- 30 mets aktivitet. 151397

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at skyllevæsken indeholder didecyldime-thylammoniumbromid, fortrinsvis i en koncentration på ca. 0,003%.

6. Skyllevæske, 5 kendetegnet ved, at den indeholder vand, et enzym valgt blandt subtilisin eller andre endopeptidaser med bred specificitet, der har samme stabilitetsegenskaber i opløsning som subtilisin, idet koncentrationen af enzym er 0,05 - 50 AU, især 0,1 - 2,0 AU, pr. liter, en pH-buffersubstans, der giver en pH-værdi på 7 - 9, især en 10 boratbuffer, og et germicid, som ikke i nogen væsentlig grad nedsætter enzymets aktivitet.

7. Præparat til anvendelse ved fremstilling af en skyllevæske til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det i fast form indeholder et enzym 15 valgt blandt subtilisin og andre endopeptidaser med bred specificitet, der har samme stabilitetsegenskaber i opløsning som subtilisin, en pH-buffersubstans, fortrinsvis et borat, et germicid og et salt.

8. Præparat ifølge krav 7, kendetegnet ved, at enzymet er subtilisin, og at pH-buffe-20 ren er en boratbuffer.

9. Præparat ifølge krav 7 eller 8 pakket i et hætteglas med gennem-stikkeligt septum, kendetegnet ved, at enzymet og pH-buffersubstansen er frysetørret. 1

10. Præparat ifølge krav 7 eller 8, kendetegnet ved, at enzymet er absorberet i porøsiteterne i et porøst legeme.