DE3526544A1 - 3(alpha),14(alpha)-dihydroxy-5ss-cholansaeure und deren derivate - Google Patents
3(alpha),14(alpha)-dihydroxy-5ss-cholansaeure und deren derivateInfo
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Description
Geeignete Alkylester der erfindungsgemäßen 3α,14α-Dihydroxy-
5β-cholansäure sind beispielsweise der Methylester, der
Ethylester, der Propylester, der Butylester, der sec. Butylester,
der Isopropylester, der Isobutylester oder der tert.
Butylester.
Als Salze der 3α,14α-Dihydroxy-5β-cholansäure mit physiologisch
unbedenklichen Kationen seien beispielsweise genannt: Alkali-
oder Erdalkalimetallsalze, wie das Natriumsalz, das Kaliumsalz
oder Calziumsalz, ferner Kupfer(II)-salze, Ammoniumsalze
oder Salze mit organischen Aminen oder Aminosäuren, wie
das Pierazinsalz, das Morpholinsalz, das Methylglucaminsalz,
das Cholinsalz und das Lysinsalz.
Die erfindungsgemäß 3α,14α-Dihydroxy-5β-cholansäure und
deren Salze mit physiologisch unbedenklichen Kationen können
aus der vorbekannten 3α-Hydroxy-5β-cholansäure mittels
eines Verfahrens synthetisiert werden, welches dadurch
gekennzeichnet ist, daß man diese mit einer zur 14α-Hydroxylierung
befähigten Pilzkultur fermentiert und die erhaltene
3α,14α-Dihydroxy-5β-cholansäure gegebenenfalls mit Basen
physiologisch unbedenklicher Kationen in ihre Salze überführt.
Pilzkulturen, welche sich zur 14α-Hydroxylierung von 3α-
Hydroxy-5β-cholansäure eignen sind vorzugsweise solche
der Gattungen Mucor (wie zum Beispiel Mucor javanicus -
IFO 4569, Mucor mucedo - ATCC 7941 oder Mucor racemosus
- OUT 1066) oder Penicillium (wie Penicillium jamthinellum
- ATCC 10455). Ferner eignen sich zur mikrobiologischen
14α-Hydroxilierung der 3α-Hydroxy-5β-cholansäure beispielsweise
Pilzkulturen der Gattungen Spicaria (wie Spicaria
simplicissima - ATCC 13595), Helicostylum (wie Helicostylum
piriforme - ATCC 8992), Gelasinospora (wie Gelasinospora
autosteira - ATCC 16395 oder Gelasinospora calospora -
ATCC 16500), Neurospora (wie Neurospora crassa - ATCC 10336)
oder Nigrospora (wie Nigrospora sphaerica CBS 16726). Die
für diese Fermentation benötigten Mikroorganismen stehen
der Fachwelt zur freien Verfügung und können von den entsprechenden
Mikroorganismen-Sammlungen unter den oben genannten
Katalognummern bezogen werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird unter den Bedingungen
durchgeführt, die man üblicherweise bei der mikrobiologischen
Hydroxylierung von Substraten mit Pilzkulturen anwendet.
So werden zunächst in allgemein üblichen Vorversuchen die
günstigsten Fermentationsbedingungen, wie zum Beispiel
Auswahl des günstigsten Nährmediums, des geeigneten Substratlösungs-
oder Suspensionsmittel, der Substratkonzentration,
der technischen Bedingungen wie Temperatur, Belüftung,
pH-Wert und der optimalen Zeiten für Germination, Substratzugabe
und Substraktkontakt am Enzym des Mikroorganismus
analytisch, insbesondere dünnschichtchromatographisch,
ermittelt.
Dabei hat sich gezeigt, daß es zweckmäßig ist, Konzentrationen
von etwa 100 bis 2000 mg Substrat pro Liter Nährmedium
einzusetzen. Der pH-Wert wird vorzugsweise auf einen
Wert im Bereich von 5 bis 7 eingestellt. Die Züchtungstemperatur
liegt im Bereich von 20-40°C, vorzugsweise
von 25-35°C. Zur Belüftung werden vorzugsweise 0.5 bis
5 Liter pro Minute pro Liter Kulturbrühe zugeführt.
Die Umwandlung des Substrats wird zweckmäßigerweise durch
Analysen von Probeextrakten verfolgt.
Nach erfolgter Fermentation werden die Fermentationsprodukte
in an sich bekannter Weise isoliert. Die Isolierung
kann zum Beispiel in der Weise erfolgen, daß man die
Fermentationsansätze mit einem nicht mit Wasser mischbaren
organischen Lösungsmittel wie Äthylacetat, Butylacetat
oder Methylisobutylketon, extrahiert, die Extrakte einengt
und die so erhaltenen Rohprodukte gegebenenfalls durch
Chromatographie und/oder Kristallisation reinigt.
Die sich gegebenenfalls anschließende Veresterung der freien
Säure erfolgt nach an sich bekannten Arbeitsmethoden. So
kann man die Säure beispielsweise mit Diazomethan oder
Diazoethan umsetzen und erhält die entsprechenden Methyl-
oder Ethylester. Eine allgemein anwendbare Methode ist
die Umsetzung der Säure mit den C1-C6 Alkoholen in Gegenwart
von Carbonyldiimidazol oder Dicyclohexylcarbodiimid.
Eine Weitere Methode besteht darin, daß man die freie Säure
mit Dimethylformamidalkylacetalen in die entsprechenden
Säurealkylester überführt. Weiterhin kann man die Säure
in Gegenwart stark saurer Katalysatoren wie Chlorwasserstoff,
Schwefelsäure, Perchlorsäure, Trifluormethylsulfonsäure
oder p-Toluolsulfonsäure mit den Alkoholen oder den niederen
Alkancarbonsäureestern der Alkohole umsetzen.
Es ist aber auch möglich, die Carbonsäure in das Säurechlorid
zu überführen und dieses in Gegenwart basischer Katalysatoren
wie Pyridin, Collidin, Lutidin, oder 4-Dimethylaminopyridin
mit den C1-C6 Alkoholen umzusetzen.
Die gebildete 3α,14α-Dihydroxy-5β-cholansäure kann dann
gegebenenfalls mit Basen physiologisch unbedenklicher Kationen
oder beispielsweise deren Carbonate oder Hydrogencarbonate
unter Bedingungen, wie sie dem Fachmann wohl bekannt sind,
in ihre Salze überführt werden.
Ebenso wie andere Cholansäure-Derivate (Chenodesoxycholsäure,
Ursodesoxycholsäure, Lithocholsäure) besitzt die erfindungsgemäße
3α,14α-Dihydroxy-5β-cholansäure die Fähigkeit, die
Bildung von Gallensteinen zu verhindern und darüberhinaus
die Eigenschaft bereits gebildete Gallensteine aufzulösen.
Da sie und ihre Derivate sich durch eine gute Verträglichkeit
auszeichnen, sind sie zur Herstellung pharmazeutischer
Präparate, die beispielsweise als Cholagoga oder Gallenwegstherapeutica
Anwendung finden können, geeignet. Derartige
Präparate wie Tabletten, Kapseln, Dragees, Injektionslösungen
u. ä. enthalten beispielsweise 50 mg bis 1000 mg des Wirkstoffs
und können in gleicher Weise wie die übrigen Präparate
gleicher Wirkungsrichtung Anwendung finden.
Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele dienen zur Erläuterung
des erfindungsgemäßen Verfahrens, zur Herstellung der erfindungsgemäßen
Verbindungen.
Ein 2 l-Erlenmeyerkolben, der 500 ml einer 30 Minuten bei 120°C
im Autoklaven sterilisierten Nährlösung aus 3% Glucose,
1,0% Corn steep liquor, 0,2% NaNO3, 0,1% KH2PO4, 0,2%
K2HPO4, 0,05% MgSO4·7 H2O, 0,002% FESO4·7 H2O und 0,05% KCl
enthält, wird mit einer Schrägröhrenkultur des Stammes
Mucor javanicus IFO 4569) beimpft und 2 1/2 Tage bei 30°C auf
einem Rotationsschüttler geschüttelt.
Mit 250 ml dieser Anzuchtskultur wird ein 20 l-Vorfermenter beimpft, der mit 15 l eines 60 Minuten bei 121°C und 1,1 bar Überdruck sterilisierten Mediums der gleichen Zusammensetzung wie die Anzuchtskultur gefüllt ist. Unter Zugabe von Silicon SH als Antischaummittel wird bei 29°C und 0,7 bar Überdruck unter Belüftung (15 l/Min.) und Rühren (220 U/Min.) germiniert.
Mit 250 ml dieser Anzuchtskultur wird ein 20 l-Vorfermenter beimpft, der mit 15 l eines 60 Minuten bei 121°C und 1,1 bar Überdruck sterilisierten Mediums der gleichen Zusammensetzung wie die Anzuchtskultur gefüllt ist. Unter Zugabe von Silicon SH als Antischaummittel wird bei 29°C und 0,7 bar Überdruck unter Belüftung (15 l/Min.) und Rühren (220 U/Min.) germiniert.
Danach werden 1,8 l dieser Vorfermenterkultur unter sterilen
Bedingungen entnommen und damit ein 20 l-Hauptfermenter
beimpft, der mit 14 l eines wie oben sterilisierten Nährmediums
der gleichen Zusammensetzung wie die Vorfermenterkultur
beschickt ist. Nach einer Anwachsphase von 18 Stunden
unter Vorfermenterbedingungen wird eine sterilfiltrierte
Lösung von 3 g Lithocholsäure in 60 ml Dimethylformamid hinzugegeben
und weiter gerührt und belüftet. Der Verlauf der
Fermentation wird durch Entnahme von Proben kontrolliert, die
mittels Methylisobutylketon extrahiert und dünnschichtchromatographisch
analysiert werden. Nach 21 Stunden Kontaktzeit ist
die Umwandlung des Substrates vollständig. Die Kulturbrühe
wird filtriert, das Filtrat 3mal mit je 10 l Methylisobutylketon
extrahiert und die Extrakte mit dem Extrakt des gleichfalls
mittels Methylisobutylketon extrahierten Mycels vereinigt.
Nach Konzentrierung der Lösung im Umlaufverdampfer
wird anschließend bei 50°C Badtemperatur im Vakuum am Rotationsverdampfer
zur Trockne eingeengt. Den ölig-kristallinen
Rückstand chromatographiert man zur Aufreinigung über eine
Kieselgelsäure und eluiert mittels eines Lösungsmittelgradienten
Methylenchlorod - Methylenchlorid/Aceton. Die Hauptfraktion
wird wiederum zur Trockne eingeengt und schließlich aus
Aceton/Isopropylether kristallisiert. Man erhält 0,86 g reine
14α-Hydroxy-lithocholsäure (3α,14α-Dihydroxy-5β-cholansäure)
vom Schmelzpunkt 169-170°C.
0,5 g 3α,14α-Dihydroxy-5β-cholansäure werden in einem Gemisch
aus 10 ml Methanol und 20 ml Ether gelöst, die Lösung in
Eis-Kochsalzmischung auf -6°C abgekühlt und tropfenweise unter
Rühren mit einer etherischen Diazomethanlösung versetzt. Nach
vollständiger Umsetzung (DC-Kontrolle) werden zur Zerstörung
überschüssigen Diazomethans 0,5 ml Eisessig zugetropft. Danach
engt man die Reaktionslösung zur Trockne ein und reinigt
das Produkt durch Chromatographie über eine Kieselgelsäule.
Man erhält 0,41 g 3α,14α-Dihydroxy-5β-cholansäure-methylester
in Form eine farblosen Öls.
Eine Lösung von 0,7 g 3α,14α-Dihydroxy-5β-cholansäure in
15 ml Dimethylformamid wird nach Zugabe von 0,5 g Silberoxyd
und 0,7 ml Butylbromid 20 Min. zum Sieden erhitzt. Danach
wird das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abgekühlt, filtriert
und in Eiswasser eingerührt. Der ausgefallene Niederschlag wird
abgesaugt und in Chloroform gelöst. Die Chloroformlösung
filtriert man nochmals, wäscht mit Wasser neutral, trocknet
über Na2SO4 und engt zur Trockne ein. Zur Reinigung wird der
braune Rückstand über eine Kieselgelsäule chromatographiert
(Gradient Hexan - Hexan/Aceton) und die Hauptfraktion wiederum
zur Trockne eingeengt. Man erhält 0,66 g 3α,14α-Dihydroxy-5β-
cholansäurebutylester als gelbliches Öl.
400 mg 3α,14α-Dihydroxy-5β-cholansäure werden mit 100 ml
in ethanolischer Natriumethylatlösung versetzt und im Vakuum
weitgehend eingeengt. Der Rückstand wird mit Diethylether
verrieben und man erhält das Natriumsalz als amorphes weißes
Pulver.
Claims (3)
1. 3α,14α-Dihydroxy-5β-cholansäure und deren Derivate der
allgemeinen Formel
worin
X ein Wasserstoffatom, einen C1-C6-Alkylrest oder ein physiologisch unbedenkliches Kation bedeutet.
X ein Wasserstoffatom, einen C1-C6-Alkylrest oder ein physiologisch unbedenkliches Kation bedeutet.
2. Pharmazeutische Präparate enthaltend 3α,14α-Dihydroxy-
5β-cholansäure und/oder deren Derivate gemäß Anspruch 1.
3. Verfahren zur Herstellung von 3α,14α-Dihydroxy-5β-cholansäure
und deren Derivate gemäß Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man 3α-Hydroxy-5β-cholansäure mit einer
zur 14α-Hydroxylierung befähigten Pilzkultur fermentiert,
die erhaltene Hydroxy-Verbindung gegebenenfalls verestert
oder in ihre Salze überführt.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19853526544 DE3526544A1 (de) | 1985-07-22 | 1985-07-22 | 3(alpha),14(alpha)-dihydroxy-5ss-cholansaeure und deren derivate |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19853526544 DE3526544A1 (de) | 1985-07-22 | 1985-07-22 | 3(alpha),14(alpha)-dihydroxy-5ss-cholansaeure und deren derivate |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3526544A1 true DE3526544A1 (de) | 1987-07-02 |
Family
ID=6276676
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19853526544 Withdrawn DE3526544A1 (de) | 1985-07-22 | 1985-07-22 | 3(alpha),14(alpha)-dihydroxy-5ss-cholansaeure und deren derivate |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE3526544A1 (de) |
-
1985
- 1985-07-22 DE DE19853526544 patent/DE3526544A1/de not_active Withdrawn
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