DE3526544A1 - 3(alpha),14(alpha)-dihydroxy-5ss-cholansaeure und deren derivate - Google Patents

Description

Geeignete Alkylester der erfindungsgemäßen 3α,14α-Dihydroxy- 5β-cholansäure sind beispielsweise der Methylester, der Ethylester, der Propylester, der Butylester, der sec. Butylester, der Isopropylester, der Isobutylester oder der tert. Butylester.

Als Salze der 3α,14α-Dihydroxy-5β-cholansäure mit physiologisch unbedenklichen Kationen seien beispielsweise genannt: Alkali- oder Erdalkalimetallsalze, wie das Natriumsalz, das Kaliumsalz oder Calziumsalz, ferner Kupfer(II)-salze, Ammoniumsalze oder Salze mit organischen Aminen oder Aminosäuren, wie das Pierazinsalz, das Morpholinsalz, das Methylglucaminsalz, das Cholinsalz und das Lysinsalz.

Die erfindungsgemäß 3α,14α-Dihydroxy-5β-cholansäure und deren Salze mit physiologisch unbedenklichen Kationen können aus der vorbekannten 3α-Hydroxy-5β-cholansäure mittels eines Verfahrens synthetisiert werden, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man diese mit einer zur 14α-Hydroxylierung befähigten Pilzkultur fermentiert und die erhaltene 3α,14α-Dihydroxy-5β-cholansäure gegebenenfalls mit Basen physiologisch unbedenklicher Kationen in ihre Salze überführt.

Pilzkulturen, welche sich zur 14α-Hydroxylierung von 3α- Hydroxy-5β-cholansäure eignen sind vorzugsweise solche der Gattungen Mucor (wie zum Beispiel Mucor javanicus - IFO 4569, Mucor mucedo - ATCC 7941 oder Mucor racemosus - OUT 1066) oder Penicillium (wie Penicillium jamthinellum - ATCC 10455). Ferner eignen sich zur mikrobiologischen 14α-Hydroxilierung der 3α-Hydroxy-5β-cholansäure beispielsweise Pilzkulturen der Gattungen Spicaria (wie Spicaria simplicissima - ATCC 13595), Helicostylum (wie Helicostylum piriforme - ATCC 8992), Gelasinospora (wie Gelasinospora autosteira - ATCC 16395 oder Gelasinospora calospora - ATCC 16500), Neurospora (wie Neurospora crassa - ATCC 10336) oder Nigrospora (wie Nigrospora sphaerica CBS 16726). Die für diese Fermentation benötigten Mikroorganismen stehen der Fachwelt zur freien Verfügung und können von den entsprechenden Mikroorganismen-Sammlungen unter den oben genannten Katalognummern bezogen werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird unter den Bedingungen durchgeführt, die man üblicherweise bei der mikrobiologischen Hydroxylierung von Substraten mit Pilzkulturen anwendet. So werden zunächst in allgemein üblichen Vorversuchen die günstigsten Fermentationsbedingungen, wie zum Beispiel Auswahl des günstigsten Nährmediums, des geeigneten Substratlösungs- oder Suspensionsmittel, der Substratkonzentration, der technischen Bedingungen wie Temperatur, Belüftung, pH-Wert und der optimalen Zeiten für Germination, Substratzugabe und Substraktkontakt am Enzym des Mikroorganismus analytisch, insbesondere dünnschichtchromatographisch, ermittelt.

Dabei hat sich gezeigt, daß es zweckmäßig ist, Konzentrationen von etwa 100 bis 2000 mg Substrat pro Liter Nährmedium einzusetzen. Der pH-Wert wird vorzugsweise auf einen Wert im Bereich von 5 bis 7 eingestellt. Die Züchtungstemperatur liegt im Bereich von 20-40°C, vorzugsweise von 25-35°C. Zur Belüftung werden vorzugsweise 0.5 bis 5 Liter pro Minute pro Liter Kulturbrühe zugeführt. Die Umwandlung des Substrats wird zweckmäßigerweise durch Analysen von Probeextrakten verfolgt.

Nach erfolgter Fermentation werden die Fermentationsprodukte in an sich bekannter Weise isoliert. Die Isolierung kann zum Beispiel in der Weise erfolgen, daß man die Fermentationsansätze mit einem nicht mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel wie Äthylacetat, Butylacetat oder Methylisobutylketon, extrahiert, die Extrakte einengt und die so erhaltenen Rohprodukte gegebenenfalls durch Chromatographie und/oder Kristallisation reinigt.

Die sich gegebenenfalls anschließende Veresterung der freien Säure erfolgt nach an sich bekannten Arbeitsmethoden. So kann man die Säure beispielsweise mit Diazomethan oder Diazoethan umsetzen und erhält die entsprechenden Methyl- oder Ethylester. Eine allgemein anwendbare Methode ist die Umsetzung der Säure mit den C₁-C₆ Alkoholen in Gegenwart von Carbonyldiimidazol oder Dicyclohexylcarbodiimid.

Eine Weitere Methode besteht darin, daß man die freie Säure mit Dimethylformamidalkylacetalen in die entsprechenden Säurealkylester überführt. Weiterhin kann man die Säure in Gegenwart stark saurer Katalysatoren wie Chlorwasserstoff, Schwefelsäure, Perchlorsäure, Trifluormethylsulfonsäure oder p-Toluolsulfonsäure mit den Alkoholen oder den niederen Alkancarbonsäureestern der Alkohole umsetzen.

Es ist aber auch möglich, die Carbonsäure in das Säurechlorid zu überführen und dieses in Gegenwart basischer Katalysatoren wie Pyridin, Collidin, Lutidin, oder 4-Dimethylaminopyridin mit den C₁-C₆ Alkoholen umzusetzen. Die gebildete 3α,14α-Dihydroxy-5β-cholansäure kann dann gegebenenfalls mit Basen physiologisch unbedenklicher Kationen oder beispielsweise deren Carbonate oder Hydrogencarbonate unter Bedingungen, wie sie dem Fachmann wohl bekannt sind, in ihre Salze überführt werden.

Ebenso wie andere Cholansäure-Derivate (Chenodesoxycholsäure, Ursodesoxycholsäure, Lithocholsäure) besitzt die erfindungsgemäße 3α,14α-Dihydroxy-5β-cholansäure die Fähigkeit, die Bildung von Gallensteinen zu verhindern und darüberhinaus die Eigenschaft bereits gebildete Gallensteine aufzulösen. Da sie und ihre Derivate sich durch eine gute Verträglichkeit auszeichnen, sind sie zur Herstellung pharmazeutischer Präparate, die beispielsweise als Cholagoga oder Gallenwegstherapeutica Anwendung finden können, geeignet. Derartige Präparate wie Tabletten, Kapseln, Dragees, Injektionslösungen u. ä. enthalten beispielsweise 50 mg bis 1000 mg des Wirkstoffs und können in gleicher Weise wie die übrigen Präparate gleicher Wirkungsrichtung Anwendung finden.

Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele dienen zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens, zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen.

Beispiel 1

Ein 2 l-Erlenmeyerkolben, der 500 ml einer 30 Minuten bei 120°C im Autoklaven sterilisierten Nährlösung aus 3% Glucose, 1,0% Corn steep liquor, 0,2% NaNO₃, 0,1% KH₂PO₄, 0,2% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄·7 H₂O, 0,002% FESO₄·7 H₂O und 0,05% KCl enthält, wird mit einer Schrägröhrenkultur des Stammes Mucor javanicus IFO 4569) beimpft und 2 1/2 Tage bei 30°C auf einem Rotationsschüttler geschüttelt.
Mit 250 ml dieser Anzuchtskultur wird ein 20 l-Vorfermenter beimpft, der mit 15 l eines 60 Minuten bei 121°C und 1,1 bar Überdruck sterilisierten Mediums der gleichen Zusammensetzung wie die Anzuchtskultur gefüllt ist. Unter Zugabe von Silicon SH als Antischaummittel wird bei 29°C und 0,7 bar Überdruck unter Belüftung (15 l/Min.) und Rühren (220 U/Min.) germiniert.

Danach werden 1,8 l dieser Vorfermenterkultur unter sterilen Bedingungen entnommen und damit ein 20 l-Hauptfermenter beimpft, der mit 14 l eines wie oben sterilisierten Nährmediums der gleichen Zusammensetzung wie die Vorfermenterkultur beschickt ist. Nach einer Anwachsphase von 18 Stunden unter Vorfermenterbedingungen wird eine sterilfiltrierte Lösung von 3 g Lithocholsäure in 60 ml Dimethylformamid hinzugegeben und weiter gerührt und belüftet. Der Verlauf der Fermentation wird durch Entnahme von Proben kontrolliert, die mittels Methylisobutylketon extrahiert und dünnschichtchromatographisch analysiert werden. Nach 21 Stunden Kontaktzeit ist die Umwandlung des Substrates vollständig. Die Kulturbrühe wird filtriert, das Filtrat 3mal mit je 10 l Methylisobutylketon extrahiert und die Extrakte mit dem Extrakt des gleichfalls mittels Methylisobutylketon extrahierten Mycels vereinigt. Nach Konzentrierung der Lösung im Umlaufverdampfer wird anschließend bei 50°C Badtemperatur im Vakuum am Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt. Den ölig-kristallinen Rückstand chromatographiert man zur Aufreinigung über eine Kieselgelsäure und eluiert mittels eines Lösungsmittelgradienten Methylenchlorod - Methylenchlorid/Aceton. Die Hauptfraktion wird wiederum zur Trockne eingeengt und schließlich aus Aceton/Isopropylether kristallisiert. Man erhält 0,86 g reine 14α-Hydroxy-lithocholsäure (3α,14α-Dihydroxy-5β-cholansäure) vom Schmelzpunkt 169-170°C.

Beispiel 2

0,5 g 3α,14α-Dihydroxy-5β-cholansäure werden in einem Gemisch aus 10 ml Methanol und 20 ml Ether gelöst, die Lösung in Eis-Kochsalzmischung auf -6°C abgekühlt und tropfenweise unter Rühren mit einer etherischen Diazomethanlösung versetzt. Nach vollständiger Umsetzung (DC-Kontrolle) werden zur Zerstörung überschüssigen Diazomethans 0,5 ml Eisessig zugetropft. Danach engt man die Reaktionslösung zur Trockne ein und reinigt das Produkt durch Chromatographie über eine Kieselgelsäule. Man erhält 0,41 g 3α,14α-Dihydroxy-5β-cholansäure-methylester in Form eine farblosen Öls.

Beispiel 3

Eine Lösung von 0,7 g 3α,14α-Dihydroxy-5β-cholansäure in 15 ml Dimethylformamid wird nach Zugabe von 0,5 g Silberoxyd und 0,7 ml Butylbromid 20 Min. zum Sieden erhitzt. Danach wird das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abgekühlt, filtriert und in Eiswasser eingerührt. Der ausgefallene Niederschlag wird abgesaugt und in Chloroform gelöst. Die Chloroformlösung filtriert man nochmals, wäscht mit Wasser neutral, trocknet über Na₂SO₄ und engt zur Trockne ein. Zur Reinigung wird der braune Rückstand über eine Kieselgelsäule chromatographiert (Gradient Hexan - Hexan/Aceton) und die Hauptfraktion wiederum zur Trockne eingeengt. Man erhält 0,66 g 3α,14α-Dihydroxy-5β- cholansäurebutylester als gelbliches Öl.

Beispiel 4

400 mg 3α,14α-Dihydroxy-5β-cholansäure werden mit 100 ml in ethanolischer Natriumethylatlösung versetzt und im Vakuum weitgehend eingeengt. Der Rückstand wird mit Diethylether verrieben und man erhält das Natriumsalz als amorphes weißes Pulver.

Claims (3)

1. 3α,14α-Dihydroxy-5β-cholansäure und deren Derivate der allgemeinen Formel worin
X ein Wasserstoffatom, einen C₁-C₆-Alkylrest oder ein physiologisch unbedenkliches Kation bedeutet.

2. Pharmazeutische Präparate enthaltend 3α,14α-Dihydroxy- 5β-cholansäure und/oder deren Derivate gemäß Anspruch 1.

3. Verfahren zur Herstellung von 3α,14α-Dihydroxy-5β-cholansäure und deren Derivate gemäß Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 3α-Hydroxy-5β-cholansäure mit einer zur 14α-Hydroxylierung befähigten Pilzkultur fermentiert, die erhaltene Hydroxy-Verbindung gegebenenfalls verestert oder in ihre Salze überführt.