DE3446080A1

DE3446080A1 - Verfahren zur herstellung von hochreinem (gamma)- und (alpha)-cyclodextrin

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Publication number: DE3446080A1
Application number: DE19843446080
Authority: DE
Inventors: Miklós Dr. Járai; Sándor Dipl.-Chem. Piukovich; Gábor Dipl.-Chem.-Ing. Halásztelek Seres; József Dipl.-Chem.-Ing. Dr. Budapest Szejtli; geb. Gabányi Mária Dr. Szigetvári
Original assignee: Chinoin Gyogyszer es Vegyeszeti Termekek Gyara Zrt
Current assignee: Chinoin Private Co Ltd
Priority date: 1983-12-22
Filing date: 1984-12-18
Publication date: 1985-07-04
Also published as: NL8403866A; GB2151647A; US4835105A; HUT36177A; GB8432345D0; JPS60156398A; HU194939B; GB2151647B; FR2557138A1; FR2557138B1

Description

>Λ -· κ., U

Verfahren zur Herstellung von hochreinem Λ- und x-Cyclodextrin

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von hochreinem p- und x-Cyclodextrin.

Ea ist bekannt, daß die Cyclodextrine (Sohardingerdecfcrine, Cycloamylosen") aus miteinander durch öc(1—f4)-Bindungen verbundenen Anhydrogluoopyranoae-Sinheiten bestehende cyclische Oligosaccharide sind. Von ihnen haben das einen Ring mit 6, 7 beziehungsweise θ Gliedern aufweisende λ-, Q- beziehungsweise ^-Cyclodextrin (im folgenden CD) die größte Bedeutung. Infolge ihrer Hohlstruktur neigen sie zur 3ildung von Einschlußlcomplexen. Da sie die unterschiedlichsten Moleküle in ihre Hohlräume einschließen und dadurch vor unerwünschten äußeren Einwirkungen schützen können, zeigen Arzneimittel- und Lebensmittelindustrie ein reges

A 3300-77 3zö/to

j η A ^ υ ο O

Interesse an ihnen.

Die Cyclodextrine entstehen durch ensymatiachen Abbau von Stärke und sind nichW;oxi3che Verbindungen. Sie werden aus Stärke durch Einsatz ainea speziellen, t-gluoan-depolymerisierenden Enzyms, der Cyclodextrin-glucosyl-tranaferase (im folgenden CGf) (S.C. 24.1.19) hergestellt. Dieses linzyin wird im allgemeinen au3 aubmersen Kulturen von Bacillus uiacerans, Baoillua polymixa, Bacillus atearothermophilus, Baoillus oirculana, Klebaiella pneumoniae, alkalophilen Bacillus species N⁰ * 38-2, N⁰ = 17-1 gewonnen. CGT hat eine spezifische, nicht hydrolytische, vor allem auf der Übertragung der Glucosylgruppe beruhende atärkedegradierende Wirkung. Daa Enzym kann jedes Substrat nutzen, in welchem (l-^"4)-Gluoanbindungen vorliegen, zum Beispiel Amylose, Amylopektin, Glycogen usw. CGT stellt aua diesen Substraten ein Gemisch linearer und cyclischer Oligosaccharide her, wobei die cyclischen Oligosaccharide in einer konsekutiven Reaktionsreihe entstehen und im Reaktionsgemlaoh das ß-Cyclodextrin den größten Anteil hat.

Daa Verhältnis dar einzelnen Cyclodextrin-Koaponentan zueinander kann variiert werden, wenn man dem Stärke und CGT enthaltenden Reaktionsgemisch unlösliche Komplexe bildende Reagenzien zusetzt, weil sich diejenige Cyolodextrin-Koaponente, die mit dem jeweiligen Komplexbildner den stabilsten Komplex ergibt, im Reaktionagemiach anreiohert.

Ss ist bekannt, daß ein hauptsächlich x-CD enthaltendes Konveraionsgemiaoh durah Zusatz von aliphatischen Alkoholen mit 8-1Θ Kohlenstoffatomen erhalten werden kann. Gemäß der japanisohen Patentschrift Nr. 51-1294-1 wird zum Beispiel in einem praktiaoh gluooaefreien Stärkehydrolysat, das eine Reduktionafähigkeit von 0-2 Daxtro3eäquivalenten aufweist, die Bildung von oc-CD duroh Zusatz der Fällungsttdttel 1-Deoanol und 1-Nonanol gefördert. In einem der Au3-führungsbeispiale ist beschrieben, daß mit 1-Decanol als

Komplexbildner bei 45 °C innerhalb von 48 Stunden 36 % cc-Cyclodextrin erhalten werden konnten.

Gemäß US-PS 3 640 847 wird aus einem die Reduktionsfähigkeit von 20 Dextroseäquivalenten nicht übersteigenden Stärkehydrolysat durch Zusatz von aliphatisohe Ketten mit wenigstens 8 Kohlenstoffatomen enthaltenden Fällungsmitteln ebenfalls ein hauptsächlich «-Cyclodextrin enthaltendes Konversionsgemisoh hergestellt. Die Fällungsmittel können zum Beispiel Alkohole (1-Octanol, 1-Nonenol, 1-Deoanol, 1-Undeoanol, 1-Dodeoenol, 9-Decem-l-ol, 1-Octadeoanol), Aldehyde (1-Decanal, 1-Dodecanal), Ketone (2-Decanon), Fettsäuren

(1-Decansäure), Äther (Dideoyläther), Ester (Kethyloctanoat, Kethyldecanoat, Kethyldodecanoat), Thioalkohole (1-Decanthiol), Nitrile (1-Undecannitril) oder organische Halogenide (l-Decylchlorid) sein, d.h. aliphatische Kohlenstoffverbindungen, die in der Endgruppe Schwefel oder diesen an Elektronegativität übertreffende Atome enthalten. Gemäß einem der Ausführungsbeispiele bildet sich aus einem 30 %igen Kartoffelstärkehydrolysat innerhalb von 3 Tagen bei 55 °C in Gegenwart des Fällungsmittels 1-Decanol ein Konversionsgemisch, das bezogen auf das Gewicht der Stärke 65 $> «~CD enthält.

Es sind zahlreiche Moleküle bekannt, die mit oc-CD lSsliohe oder unlösliohe Einsohlußkomplexe bilden. Als Gestmolekül sind zum Beispiel halogenierte Benzolderivate, Benzol, Diphenyl, Cyclohexan, 4,4-Dihydroxy~diphenyl, Ter— phenyl, ο-Chiorphenol, Anilin, N-Methylanilin, p-Chlor-

n
anilin, Athylbromid, 1,6-Dibromhexan, 1,4-Dibrombutan,

Athylohloracetat, Propionsäure, Buttersäure, Cepronsäure, Dimethylglyoxim, elementares Chlor und Brom, Kaliumiodid, p-Cyjool, p-Phenylendiaorolein, Hjdrochinon, Vinyläthyläther, o-Chlorhydroohinon, 1,4-Butandithiol, 1,6-Hexandithiol, bis<10«Kercepto-decamethjlen)äther, Schwefelkohlenstoff geeignet tChem. Ber. ^p., 2561 /Ϊ95Ι73.

In US-PS 3 541 077 beschreibt Armbru3ter eine auch für den Industriellen Maßstab geeignete Methade zur Gewinnung von oc-CD aus Stärkakonvertgemischen. Die mit x-CD unlösliche Einschlaßkomplexe bildenden Gastmoleküle können sein: Cyolohexan, Tetrachloräthan, Trichloräthylen, Benzol, Hexan, 1-Ootanol, Toluol, Schwefelkohlenstoff. Dia praktische Anwendung der Methode wird dadurch erschwert, daß aioh das Konversionsgemisoh oder das Aufarbeitungsintermediär schwierig weiter reinigen lassen. Gründe dafür sind einesteils die schlechte Filtrierbarkeit, die der Bildung von hydrophoben intramolekularen Addukten mit der nicht umgesetzten Stärke zuzuschreiben iat, zum anderen der hohe Siedepunkt eines Teils der Fällungsmittel, der die Entfernung der Pällungsmittel mittels Wasserdampfdeatillation erschwert.

Es ist bekannt, daß $~CO mit folgenden Molekülen Einschlußkomplexe bildet: ohlorierta Benzolderivate, Benzol, Cycloalkane, Cyclohexanol, Naphthalin, Anthracen, 9,10-Diohloranthracen, Diphenyl, Terphenyl, Anilin, N-Methylanilin,

Ν,Ν-Dimethylanilin, Athylhroaiid, 8-Oxyohinolin, o-Chlorphenol, Jodkaliuisjodid, p-Cypol, iäphedrin [Cnem. 3er. 90. 2561 /1957/J. Zur industriellen Herstellung von ,^-0D in Stärkekonversionen wurden diese Gastmoleküle noch nicht verwendet.

Japanische Forscher haben ein Verfahren beschrieben, mit dem aus der bei der Herstellung von £-CD anfallenden Kristalliaationamutterlauge der Gehalt an (C-CD isoliert werden

3t

kann (Horikoahi et al., Proceedings of I International Conference of Cyclodextrins, Budapest, 1981. Reidel Publ. Co. 1982). Die bei der mit CGT aus alkalophilen species N - 38-2 vorgenommenen Herstellung von ß-CD anfallende Kristallisationamutterlauge wird zwecks Abbau des Gehaltes an linearen Dextrinen mit Amyloglucoaidase behandelt, die bei der Reaktion entstehende. Glucose wird mit einem Ionenaustauscher (Diaion PRX-Ol) aus dem Gemisch entfernt, der Gehalt an i^-GD wird

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auf siner GeIfiltaraäule (Toyo Pearl HW-40) abgetrennt und das ^p-CD naoh dem Eindampfen und Reinigen des Eluats kristallisiert. Das Verfahren hat den Nachteil, daß die Ausbeute an f-CD - /feil das Verfahren nicht auf die Gewinnung von ]p-GD gerichtet idt - ziemlich 3chleoht i3t: 20 kg pro Tonne der einlegetzton Kartoffeistarke.

Ziel der Erfindung sar die Ausarbeitung eine3 Verfahrens, mit dem aus ein und demselben Ausgangsmaterial je nach Wunsch hauptsächlich x-CD beziehungsweise hauptsächlich jt^-CD hergestellt werden kann.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß ein derartiges Verfahren möglich ist, wenn man dieses auf der in eigener Forschungsarbeit entdeckten Konaekutivität der CD-Bildung aufbaut. Gemäß diesem Raaktionsmechanismus entstehen das ß- und das (j*-CD aus dem bereits gebildeten ot-CD, und zwar bildet sich das j^-CD in der letzten Phase der Reaktion, wenn das Enzym bereits zum größten Teil inaktiviert ist. Daraus ist ersichtlich, daß in der konsekutiven Reaktionreihe die Menge des primär gebildeten iso-CD limitierend auf die Menge des f-CD wirkt, d.h. wenn die anfängliche Bildungsgeschwindigkeit des oc-CD erhöht wird, so wirkt 3ich das vorteilhaft auf die spätere ^-CD-Bildung aus.

Da bekanntermaßen zwischen den Hohlraumdurchmessern von <x~ und φ-CD ein großer Unterschied besteht, bilden die ?ällungsmittel für oc-CD im Molekülhohlraum von (Jp-CD nur Komplexe mit unzureichender Stabilitätskonstante, und im Überschuß des Pällungsmittels bildet sich f-CD entweder überhaupt nicht oder nur in vernachläasigbarer Menge.

Ee wurde nun gefunden, daß die Menge an ^-CD im Reaktionsmedium ansteigt, wenn man dem Konversionsgemisoh ein Gemisah aus ac- und ^-CD-Pällungaoltteln zusetzt. Die Reaktionsbedingungen werden zweckmäßig so gewählt, daß die Bildung des p-CD so sohneil wie möglioh verläuft, d.h. die

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Funktion des Enzyms CGT muß optimiert werden, und die disproportionierende ffirkung ist nach Xiögliohkeit zu verdrängen.

die Jj'oraohungen zeigten, kann zur Herstellung der einzelnen Cyolodextrin-Komponenten jade taylose und Amylopektin enthaltende Stärkeart (zum Beispiel Kartoffelstärke, Maisstärke, waxy-Maisstärke, ß-amyla3efreiea Getreidestärkeglycogen usw.) verwendet werden, wenn sie einer limitierten Hydrolyse unterzogen wird, deren iSrgebni3 din partielles Hydrolysat mit einer Reduktionsfähigkeit von höchstens 8 Dextroaeäquivalenten ist (die Dextroseäquivalentθ werden gemäß DIN 1263 bestimmt). Die zur Hydrolyse verwendete co-Amylase kann beliebigen Ursprungs sein, zum Beispiel von 3aoillus eubtilis, Bacillus polymixa, Bacillus licheniformis, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae usw. stammen. Schon in der Anfangsphase der limitierten Hydrolyse wird dafür gesorgt, daß in Ermanglung eines Gluoosylakzeptors keine Disproportionierung eintreten kann.

Nachdem das Jp-CD aus dem Reaktionsgenisch entfernt wurde, entsteht - vorausgesetzt, daß da3 2nzym nicht inzwischen seine Aktivität verloren hat - im zurückbleibenden Konversionsgemisch auoh eine beträchtliche Menge ß-CD.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Gewinnung von cc- beziehungsweise (T-CD werden die ?ällungsmittel kombiniert angewendet. Soll hauptsächlich x-CD gewonnen werden, so werden als selektive (X-CD-Pällungstnittel niedere aliphatische Ketone verwendet. Soll so viel wie möglich an (['-CD gebildet werden, so setzt man neben den erwähnten Ketonen auch alkylaubatituierte oder kondensierte Phenolderivate zu.

Als Ausgangsstoff für das erfindungsgemäße Verfahren kann zum Beispiel Maisstärke verwendet werden, die partiell hydrolysiert wurde. Der partielle Abbau wird tait x-Aaylase aus Baoillen, in Gegenwart von Caloiumlonen, bei pH etwa 7, in der ITärrne, vorzugsweise bei ΘΟ °C, vorgenommen. Wenn

die RaduktionafsLhigkeit des Hydrolyaats unter 8 Dextroseäquivalente abgesunken i3t, wird der enzyaatisohe Abbau durch ffarmeinaktivierung (z.B. 120 ⁰C, 1 bar Überdruck) abgebrochen, kuf diese Waise erhält man ein etwa 10-40 gew.-Mgea Stärkehydrolysat, das sin Gemi3ah von Dextrinen alt verhältnismäßig großer Kattenltinge enthält und zur schnellen Retrogradation neigt. Da die Retrogradationsprodukte der Wirkung von GGT weniger zugänglich 3ind_f muß zur Vermeidung von Retrogradation das GGT-iänzym sofort nach der Inaktivierung der oc-Amylase zugegeben werden. Daa verwendete Enzym 3tammt von Baoillus speoies. Bevorzugt kann zum Beispiel das von Bazillus speciea BM 10-08 !.WG 00154 hergestellte CG-T-Snzym verwendet werden. Um die schnelle Bildung von λ- und ^-CD zu fördern, werden Lösungen von Phenolderivaten in niederen aliphatischen Ketonen zugesetzt. Al3 Ketone kommen zum Beispiel Aceton, Diäthylketon, Methylethylketon, Methylpropylketon, Methyli3obutylketon, als kondensierte Phenolderivate 1-Naphthol und 2-Naphthol, als alkylsubstituierte Phenolderivate 2,4-Dimethylphenol und 2,6-Dimethylphenol in Frage.

oetzt man einen der erwähnten aliphatischen Ketone als selektives ?ällungsmittel für <x~CD ein, ao werden innerhalb von 24 Stunden bei 50-70 G und in Gegenwart einer Fällungsmittelmenge von 2-15 V0I.-/& Ausbeuten von auf daa Stärkesubstrat bezogen 25-40 & oc-GD erreicht. Beim Einsatz aliphati«· acher Ketone als Pällungsmittel 3tellt aich in der von CGT katalysierten Stärkekonversion das Gleichgewicht naoh etwa 24 Stunden ein. Im Reaktionsgemisoh liegt hauptsächlich cc-CD neben etwas ß-CD vor. Daa Gleichgewicht ist unabhängig von der angewendeten Enzymkonzentration.

Bei Zusatz von miteinander kombinierten Fällungsmitteln kann R -CD in hohen Ausbeuten erhalten werden» AI3 zur .Förderung der '^-CD-Bildung besondere geeignete Fällungamittelkombinationen seien die folgenden genannt ι Eethyläthy!keton

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and 2,4-Dimethylphenol beziehungsweise MethyläthyIketon und 1-Iaphthol jeweils im GewiohtsTerhältnis ItI. Mit diesen Kombinationen kann sun Beispiel ausgehend von einem 35 gew. igen Maiestärkehydrolysat, das der Einwirkung τοη CGI ausgesetzt ist, bei 35-45 °C und einer Reaktionszeit τοη 20-50 Stunden und bei Pällungsuittelmengen von 10 Vol.-jC eine Ausbeute τοη bis au 35 % ^-CD erzielt werden.

Aus dem KonTersationagemieoh kann das t^-CD auf folgende Weise isoliert werden: die in Heaktionsgemisoh unlösliohen Komplexe τοη ß- und A^1-CD «erden abfiltriert. Der Pllterkuoben wird zweoks Sntfernung des Fällungsmittels warm mit Methanol extrahiert. Dann wird der Gehalt an O-CD mit warmem, 66 £igen wäßrigen Methanol selektiv herausgelöst. Der Extrakt wird an Polymeradsorbentien (Amberlite XAD-2, IAD-4, Roehm and Haas Comp. Philadephiaf Diaion HP-20, Mitsubishi Chem· Ind. Ltd. Tokio) und starken Anion-Kationaustauschern (Tarion AD und Varion KS oder Amberlite IR 120 und IRA 410) τοη Ionen beziehungsweise den in Fällungemittel und Substrat enthaltenen nlohtionisohen Verunreinigungen befreit. Das erhaltene Bffluat wird auf 20 % Trookengehalt eingedampft und mit Aktivkohle weiter gereinigt. Die geklärte ((*-CD-Lösung wird auf einen Trookensubstansgehalt τοη 50 % eingedampft. Das ^-CD wird aus Wasser kristallisiert.

Das uc-CD wird wie folgt aus dem Konversionsgemisoh isoliertt um die nicht umgesetzte Stärke abzubauen, wird zu dem Reaktionsgemisoh Amjlogluoosidase gegeben. Das Überschuß des Pällungsmittels wird mittels Wasserdampfdestillation entfernt Die zurückbleibende Lösung wird auf ein Fünftel ihres Volumens aufkonzentriert und dann abgekühlt. Duron Zugabe τοη Qyclohexan kristallisiert der «κ-DC-Komplex. Br wird abfiltriert und getrocknet.

In den Versuohen wurde der Cyelodextringehalt dünnsohichtohromatographisoh bestimmt (Szejtli J.t Cyclodextrins, Their Inoluslon Complexes p. 53-54, Akadfoia Kiado, Budapest, 1982). Die AktiTität des CGT-Enayms wurde &aoh der Methode τοη

-AA-

Kitahata (Olcada, Kitahata, UU-PS 3 388 738) gomesaen. Dia Aktivität der zur ".tyirolyse verwendeten x-Amylase wurde nach der Methode von Jand3tedt u.a. (Cereal Chera. l6_, 712 /13397 bestimmt.

Die 2rfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert, ist jedoch nicht auf die 3ei3piele beschränkt.

Beispiel 1

Herstellung eines hauptsächlich x-CD enthaltenden Konversionsgemisches

170 g Maisstärke werden in 340 g Leitungswasser suspendiert und der pH-Wert der Suspension zuerst mit 10 gew.-#iger Salzsäure auf 5-6, dann mit 10 gew.-#iger Ca(OH) -Suspension auf 7,1-7,4 eingestellt. Dann wird die Stärke mit Hilfe von oc-Amylaaa (NOVO Induatri A.S. Koppenhagen, Typ BAN 240 L) verflüssigt. Dazu wird dia Stärke bei 80 C 15 Minuten lang der Einwirkung von 2 SKB-Einheiten/g Starke des Enzyms ausgesetzt (SKB-Sinheit: Aktivitätseinheit der Anyläse, s. Sanstedt, Kneen, Bergström: Cereal Chetn. 22., 108 HS52j). Anschließend wird der Überschuß de3 änzyms durch ffäraebehandlung bei 120 C in 30 Minuten inaktiviert. Das erhaltene Hydrolysat hat eine Reduktionsfähigkeit von 7,4 Dextroaeäquivalenten.

Zur Konversion werden je 3 ml des Hydrolysate in die 5 al fassenden Röhrchen eines geeigneten Blockreaktora (z.3. Pierce Chemical Cotap.» Rockford, Typ Reaoti-fherm) gefüllt und bei 45 °C mit pro g Stärke 24 Kitahata-Sinheiten des CGT-üizyms versetzt (Kitahata-Binheitι Aktivitätaeinheit von CGT{ Kitahata, Tauyama, Okada: Agr. Biol. Cham. JB, 387 Z19747) Das Bnzyo atammt von Baoillua species ΒΜ-10-3Θ, MHG 00154. In jedes Röhrohen werden 500 -ul Pällungsoaittel gegeben, und zwar: 1-Octanol, 1-Decanol, 1-Octadecanol, Methyläthylketon (5iSX), Diäthylketon (3t₂CO), Hethylpropylketon (ItSPROK), Methyllsobutylketon (JiIBUK), Aceton, destilliertes Wasser. Die Konversion erfolgt 5 Tage lang unter ständigem Rühren bei 45 ⁰C. Aua jeden Röhrohen wird täglich eine Probe ge-

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nommen und dünnschichtchromatographisch der Gehalt an den einzelnen CD-Komponenten bestimmt. Die Ergebnisse der dünnschiohtohromatographi3chen Untersuchungen werden ait einer halbquantitativen Methode der Flächenkotnparation ausgewertet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 zusammengestellt.

	Beispiel 2	Tabelle	2	3	1	3	ß-CD	2	3	5	jp—CD in	-	3
Pällungsmittel		:c-CD	A η	ζ a		h 1	¹ 1	θ r	T	a g	' 1 2	i - 2
	1	8	5	1	d	7	7	4	β )	I - 2	1
	(	10	12	3	I ι 3	7	6	6	I	¹ - 2	1
1-Octanol	T	7	VJl	2	ι 4	2	4	2		' - 1	1
1-Deoanol	ι ο	7	7		< 2	6	7		1 1	2
1-Octadecanol	ι 8	8	7		¹ 4	4	VJl		—3 3 - 1	4
MEK	I a	8	7		1 i 4	3	3			2
Diäthyllceton	I	3	4		i 2	8	8			1
MEPROK	'6	4	2		¹ 4	3	2			1
MIBUK	V/l	—L			; 3					_1
Aceton	1 \|3
!Fässer...	,UJ

Herstellung eines hauptsächlich f-CD enthaltenden Konversationsgemisches

Je 3 ml des gemäß Beispiel 1 hergestellten Kaisatärlcehydrolyaata werden in die Röhrchen des Blockreaktors gemäß Beispiel 1 gefüllt. 3ei 45 °C werden pro g ötärke 24 Kitahata-Einheiten CGT zugesetzt. Dann werden in jedes Röhrchen 500,ul Fällungsmittel eingebracht, und zwar: Methyläthylketon (MEK) und Toluol, Diäthylketon (Ht CO) und Toluol, Methylisobutylketon (MIBUK) und Toluol, MEK und Xylol, Et₂CO und Xylol, MIBUK und Xylol, jeweils als Gemische im Volumenverhältnia 1:1, beziehungsweise MEK und 1-Naphthol, MSK und 2,4-DIaethy1-phenol (2,4-DR?) im Gewichtsverhältnis 1:1, schließlich nur Toluol. Täglioh werden Proben genommen und dünnsohichtohroaatographisch untersucht. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 zusammengefaßt.

o-_:f'i -j J 3 O	libelle	3	2 A η ζ	2	3 a h 1	ß-CD	2 T	3 a g s	V-CD	2	in g/v	!	3
Pallungsmittel	■x-CD	ρ		1	1 der	10	16	1	—	3	-
	1		4	4	5	15	-	1	-	10
MSK + Toluol	3	1	r-l I	5	10	17	-	-	2	14
St-CO + Toluol	4	VJI	3	3	10	14	-	2	-	-
ViIBUK + Toluol	3	4	3	b	9	10	-	3
MEK + Xylol	5	2	1	VJ!	12	18	-	-
EtpGO + Xylol	VJl	3	r-l	8	11	15	-	13
MIBUK + Xylol	3	2	0	b	5	12	7	15
MEK + 1-Naphthol	4	1	1	5	6	12	6	-
MEK + 2,4-DMF	4			4			-
Toluol	3
Beispiel

Herstellung eines hauptsächlich if-CD enthaltenden Konversationsgemiaches

Dae gemäß Beispiel 1 hergestellte Stärkehydrolysat wird auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise der Konversion unterzogen. Die Reaktionatemperatur beträgt 40 G. Als Fällungsmittel werden die in der Tabelle 3 angegebenen Kombinationen in Form der im Gewiohtsverhältnis 1:1 bereiteten Gemische und in einer Menge von jeweils 500 ,ul. Die Konversion nird zwei Tage lang fortgesetzt. Die Ergebnisse der dünnschichtchromatographischen Auswertung der täglich genommenen Proben sind in der Tabelle 3 zusammengestellt.

4 4:330

.Fällung ami tt el

Tabelle 3

£-CD

C-CD

P-CD in

1. Tag 2. Tag 1. Jag 2, Tag 1. Pag 2.Tag

M£K +	2,4-DMP	4
	2,6-DMi¹	4
	1-Naphthol	6
	2-Naphthol	6
	Naphthalin	3
	Phenol	1
Wasser	2,4-DMP	1

1 2 1 4 1 1

a 9

6 9 2 4 5

10

7 2

5 7 5

1 1

13

10

14

Beispiel 4

Herstellung von rohem cc-CD

Zu 500 ml des gemäß Beispiel 1 hergestellten Maiastärkehydrolysats werden pro g Stärke 50 Kitahata-Einheiten CGT gegeben. Bei 45 C wird 50 Minuten lang kontinuierlich gerührt. Danach werden 50 ml Methylethylketon zugesetzt. Die Temperatur wird auf 55 C erhöht und die Konversion 10 Stunden lang fortgesetzt. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wird auf 4,3 eingestellt. Dann gibt man zu dem 3emisch Amyloglucosidase in einer Menge von 1 AGU/g Starke (AGUi Amyloglucosidase-Einheit; verwendetes linzym von NOVO Industri A.3. Koppenhagen, Typ AMG 150 L), Die nicht in Reaktion getretene überschüssige hoohmolekulare Stärkefraktion wird bei 55 C innerhalb von 16 Stunden hydrolysiert. Zweoka Entfernung des Methyläthylketon-Überschusses wird das Reaktionsgemische bei atmosphärischem Druok einer Wasserdampfdestillation unterzogen und dann auf ein Pünftel seines Volumens eingeengt. Nach dem Abkühlen auf 10 C werden 5 ml Cyoloheian zugegeben. Das Gemisch wird bei 5 G 16 Stunden lang stehengelassen und manohmal aufgeschüttelt. Der auskristallisierte co-CD-Cyclohexan-Komplex wird abfiltriert und im Sxaikkator getrocknet, äian erhält 34 g rohen x-CD-Koaplex.

Beispiel 5

Herstellung von rohem jp-CD

Zu 500 ml de3 gemäß Beispiel 1 hergestellten Mais-3tärkehydrolysat3 werden pro g Stärke 25 Kitahata-Sinhoiten CGT gegeben. Das Gemisch wird bei 45 G 50 Minuten lang kontinuierlich gerührt. Dann wird ein im Gewichtsverhältnis 1:1 bereitetes Gemisch aus Mothylathylketon und 1-Naphthol in diner Menge von 50 ml zugesetzt. Der pH betragt 5,5-6»5. Die Konversion wird bei der angegebenen Temperatur 24 Stunden lang fortgesetzt, dabei wird ständig gerührt. Denn wird da3 Reaktionsgemisch filtriert, dar Niederschlag wird getrocknet. Man erhält 120 g rohen .C -CD-Komplex.

Beispiel 6

Herstellung von ß-CD-Komplex

Das nach dem Abfiltrieren des J^-CD-Komplexes gemäß 3eiad.el 5 verbleibende Piltrat wird bei 40 ⁰G 2 Tage lang 3tehen gelassen. Dabei kristallisiert der ß-CD-läethyläthylketon/l-Naphthol-Komplex aus. Die Kristalle werden abfiltriert und getrocknet. 'Äan erhält 14 g rohen ß-CD-Komplex.

Beispiel 7

50 g des gemäß Beispiel 5 hergestellten rohen Jj-CD werden in 150 ml Leitungswasser suspendiert. Die Suspension wird durch Zusatz von 2 ml 40 £iger Natronlauge alkalisoh gemaaht. Dann wird das ?ällungsmittel mit I60 ml 1-Butanol extrahiert. Der Extrakt wird mittels Ionenaustausch weiter gereinigt. Die Hälfte der wäßrigen Phase wird auf eine Varion KS (H⁺) und Varion AD (OH**) enthaltende Mischbettsäule von 200 ml Volumen (Nitrokimiai Ipartelepek, ?Uzf6) und dann auf eine 100 ml stehende Phase enthaltende Säule aus Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical Ind. Ltd, Tokyo) aufgebracht. Die andere Hälfte der wäßrigen Phase wird zuerst auf eine Amberlite IR 120 (H⁺) und Amberlite IRA 400 (OH^-) enthaltende Mlschbettsäule (Roehm and Haas, Philadelphia) und dann auf eine 100 al stehende Phase enthaltende Säule

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aus Amberlite XAD-4 aufgebracht.

fahrend dar Chromatographie .»ird der Naphtholgehalt dar Sffluate dünnsohiohtohromatographisch verfolgt. Dar Ionengehalt beziehungsweise die soheinbare Leitfähigkeit wird konduktometrisch (mit einem Konduktometer Typ Radelkis OK 102/1) bestimmt. Die Ergebnisse sind in dar Tabelle 4 zusammengefaßt.

O tabelle 4-

Untersuchtes Naphtholgehalt scheinbare

Material Leitfähigkeit CuS]

Butanolraffinat +++ 149 000

üffluat von Varion KS + AD + 180

iäffluat von Diaion HP-20 - 130

Sffluat von Amberlite IR + IHA 400 + 115

üffluat von Amberlita XAD-4 - aO

3eispiel 8

Reinigung von rohem f· —CD

Von dem gemäß Beispiel 5 erhaltenen rohen j^-CD werden drei Portionen zu je 100 g getrennt voneinander in je 200 ml Wasser suspendiert. Die erste Suspension wird mit 400 ml Me-

tt
thanol, die zweite mit 400 ml Äthanol und die dritte mit 400 ml 2~Propanol versetzt. Die Gemische werden eine Stunde lang am Rückfluß gekocht. Die weitere Reinigung erfolgt auf die im Beispiel 7 beschriebene Weise durch Ionenaustausch. Die Ergebnisse der Effluatuntersuohungen sind in der Tabelle 5 zusammengestellt.

Erläuterung der Zeichenbedeutung am inde das 3eispielteil3

3445Q80

-4Ψ-

Tabelle 5

CH

,OH/H-0 C-H_c0H/H-0 CH-CH(OH)CH,/H-0

Ausgang«extrakt laphtholgehalt fr-CD-Gehalt

fiffluat τοη Tarion KS +1D Saphtholgehalt |f-CD-Gehalt

Sffluat τοη imberlite IR 120 + IRi 400

laphtholgehalt

Effluat; τοη laberlit· IHM

Haphtholgehalt J(i-CD-a»halt

Dar Vergleich dar Wirksamkeit Tersohiedener Ionenauetauscher zeigt, daß der Bit Methanol angesetzte V"-^CD-Extrakt wegen seines geringen Vaphtholgehaltes auoh mit den Ionenaustauscherharzen Tarion gereinigt «erden kann·

Beispiel 9

Herstellung τοη reinen )(V-CD und \B-CD-Komplex 50 g des gemäß Beispiel 5 hergestellten rohen ^-CD werden in 250 el !ethanol eine Stunde lang am Rüofcfluß gekooht. Dann wird der Feststoff abfiltriert und in einem Qe-Bisoh aus 500 nl Methanol und 250 ml Leitungswasser erneut eine Stunde lang am Rückfluß gekooht. Der erhaltene Extrakt wird filtriert, das Piltrat über laoht stehengelassen and dann der ausgefallene ß-CD-Komplex durch filtrieren abgetrennt. Man erhält 26 g ß-CD-Koaplex.

Das Hltrat wird durch jeine 20 al Varion IS (H⁺) beziehungsweise Yarion ID (OH**) enthaltende Mischbettsäule

⁺'Erläuterung der Zeiohenbedeutung am Ende des Beispielteils

mit einer Volumengeschwindigkeit von 40 al/Stunde hindurchgeleitet. Die au3 der oäule au3tratenda Flüssigkeit wird dann mit der gleichen Volumengeschwindigkeit duroh eine 20 ml Amberlite XAD-4 enthaltende Adsorptionasäule geleitet. Danach werden die etwa 700 ml Flüssigkeit eingedampft, bis ihr Festatoffgehalt 25 Gew.-.* betrügt. Diese Lösung wird mit 4 g Aktivkohle geklärt und dann weiter eingedampft, bis ihr Feststoffgehalt 55-60 Gew.-^ betragt. Dann wird das f-CD kristallisiert. Naoh fern Filtrieren und Trocknen erhält man 20,1 g kristallines £~CD.

Erläuterung zu den Tabellen 4 und 5ί

+++ beim Eluieren mit der Lösungsmittslfront entsteht ein Fleck, der größer ist als der Startflsck (der Naphtholfleck ist braun, der des -CD orangegelb)

++ Der Fleck ist genau so gro£ wie der 3tartfleck + Der Fleck ist kleiner als der Startfleck _+ Kaum wahrnehmbarer blasser Fleck

Visuell kein Fleck wahrnehmbar.

Claims

Chinoin Gyogyszer §s Vegy£szeti Term^kek Gyära RT.,
H 1045 Budapest IV, To utca 1-5, Unqarn

Patentansprüche

Verfahren zur Herstellung von hochreinem γ- und X-Cyclodextrin aus mit X-Amylase partiell hydroIysierten Stärkesubstraten geringer Reduktionsfähigkeit unter Verwendung von Cyclodextrin-glucosyl-transferase,
dadurch gekennzeichnet, daß man das mit <L-Fmylase partiell hydrolysierte Stärkesubstrat geringer Reduktionsfähigkeit mit Cyclodextrin-glucosyltransferase nach Zusatz eines aliphatischen Ketons der allgemeinen Formel

R₁COR₂ ,

worin R₁ und R₂ unabhängig voneinander ein gerades oder verzweigtes

C₁ ,--Alkyl bedeuten,
und/oder eines Phenolderivates der allgemeinen Formel

R₃R₄PfIeOH ,

worin R₃ und R₄ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Cj_₄-Alkyl bedeuten oder gemeinsam eine ankondensierte Phenylgruppe bilden und

Phe Phenyl ist,

und/oder eines Benzolderivates der allgemeinen Formel

R₅R₆Phe

worin

und

unabhängig voneinander Wasserstoff oder C₁ »-Alkyl bedeuten oder zusammen eine ankondensierte Phenylqruppe
bilden,

als Fällungsmittel konvertiert und gewünschtenfalls aus dem Konversionsge misch das X- bzw. y-Cyclodextrin in roher Form oder nach weiterer Reini gung in reiner Form isoliert.

344G080
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als aliphatisches Keton Aceton, Diäthylketon, Methylethylketon, Methylisobutylketon oder Methylpropylketon verwendet.
3) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Phenolderivat 2,4-Dirnethylphenol, 2,6-Dimethylphenol, 1-Naphthol oder 2-Naphthol verwendet.
4) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Benzolderivat Toluol, Xylol oder Naphthalin verwendet.
5) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von ^-Cyclodextrin den Überschuß des Fällungsmittels mit einem niederen Alkanol, vorzugsweise Methanol, extrahiert, das y-Cyclodextrin mit einem 50 - 70 %igen wäßrigen niederen Alkanol, vorzugsweise Methanol, herauslöst, den Extrakt an Polymeradsorbentien und Ionenaustauscherharzen reinigt und das ^-Cyclodextrin aus dem Gemisch kristallisiert.
6) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von ^.-Cyclodextrin die in dem Konversionsgemisch neben dem </l-Cyclodextrin-Keton-Komplex entstandenen Dextrine sowie das ß- und das ^-Cyclodextrin hydrolysiert, den Überschuß des Fällungsmittels durch Wasserdampfdestillation entfernt, aus dem .-£_- Cyclodextrin mit Cyclohexan einen Komplex bildet und diesen kristallisiert.
7) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Extraktion des Überschusses des Fällungsmittels Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, insbesondere Methanol, verwendet.
8) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Herauslösen des ^-Cyclodextrins ein Methanol-Wasser- oder Äthanol-Wasser-Gemisch, bevorzugt ein Methanol-Wasser-Gemisch, verwendet.
9) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur ternären Komplexbildung der Cyclodextrine, insbesondere des tf- Cyclodextrins, die als Fällungsmittel einzusetzenden aliphatischen Ketone in Kombination mit den als Fällungsmittel einzusetzenden Phenolderivaten verwendet.