NL8403866A - Werkwijze voor de bereiding van zeer zuiver gamma- en alfa-cyclodextrine. - Google Patents

Description

«' - 1 -

Werkwijze voor de bereiding van zeer zuiver γ- en oc-cyclodextrine.

Deze uitvinding betreft een werkwijze voor de bereiding van zeer zuiver γ- en a-cyclodextrine.

Eet is bekend dat de cyclodextrinen (Schardinger-dextrinen/ cycloamylosen) uit cyclische 5 oligosacchariden zijn die uit anhydroglucopyranose-eenheden bestaan welke door a(1-4)-bindingen met elkaar verbonden zijn. Daaronder hebben de ringen met 6, 7 en 8 eenheden# de a-, 8- en γ-cyclodextrinen (hierna af gekort tot "CD") de meeste betekenis. Wegens hun holle structuur hebben ze 10 de neiging insluitcomplexen te vormen. Daar ze in hun holte de meest uiteenlopende moleculen kunnen insluiten en daardoor tegen ongewenste inwerkingen van buitenaf kunnen beschermen tonen geneesmiddel- en levensmiddelenindustrie een warme belangstelling hiervoor. De cyclodextrinen ontstaan 15 door enzymatische afbraak van zetmeel en het zijn niet toxische verbindingen. Zè worden uit zetmeel bereid met behulp van een bepaald α-glucan-depolymeriserend enzym, het cyelodextrine-glucosyl-transferase (E.C. 24.1.19) (hierna "CCT"). Dit enzym wordt in het algemeen gewonnen uit submer-20 se cultures van Bacillus macerans, Bacillus polymixa. Ba cillus stearothermophilus, Bacillus circuïans, Klebsiella pneumoniae, of alkalofiele Bacillus-soorten no.'s 38-2 en 17-1. CGT werkt op een heel bepaalde, niet hydrolytische wijze op zetmeel in waarbij glucosyl-groepen overgedragen 25 worden. Het enzym kan ieder substraat gebruiken waarin (1-4)-glucanbindingen aanwezig zijn, bijvoorbeeld amylose, amylopectine, glycogeen, enz. CCT maakt uit deze substraten een mengsel van lineaire en cyclische oligosacchariden, waarbij de cyclische oligosacchariden in een volgreactie ont-30 staan en in de reactiemengsels het β-cyclodextrine het grootste aandeel heeft.

8403866

ί A

- 2 -

De verhouding tussen de afzonderlijke cyclo- ·' dextrinen kan ten opzichte van elkaar gevarieerd worden door aan het reactiemengsel met zetmeel en COT reagentia toe te voegen die onoplosbare complexen vormen, het mengsel aan dat 5 cyclodextrine verrijkt wordt dat met de gegeven complexvor mer het stabielste complex vormt.

Het is bekend dat een hoofdzakelijk uit a-CD bestaand reactiemengsel de toevoeging van alifatische alkoholen met 8-18 koolstofatomen bereid kan worden. Volgens 10 het Japanse octrooischrift 51-12941 wordt bijvoorbeeld in een praktisch glucosevrij zetmeel-hydrolysaat dat een reducerend vermogen van 0-2 glucose-equivalenten vertoont, de vorming van α-CD door het toevoegen van decanol-1 of nonanol-1 als neerslagreagens bevordert. In één van de uitvoeringsvoorbeel-15 den is beschreven dat bij 45°C met decanol-1 als complex vormer in 48 uur 36 % α-cyclodextrine verkregen kon worden.

Volgens het Amerikaanse octrooischrift 3.640.847 wordt uit een zetmeel-hydrolysaat waarvan het reducerend vermogen niet boven 20 glucose-equivalenten komt, 20 door toevoegen van toeslagreagentia met alifatische ketens van ten minste 8 koolstofatomen eveneens een reactiemengsel verkregen dat in hoofdzaak uit α-cyclodextrine bestaat. De neerslagmiddelen kunnen bijvoorbeeld alkoholen (octanol-1, nonanol-1, decanol-1, undecanol-1, dodecanol-1, 9-decenol-l, 25 octadecanol-1), aldehydem (decanalr1/ dodecanal-1), ketonen (decanon-2), vetzuren (decaanzuur), ethers (didecylether), esters (methyloctanoaat, methyldecanoaat, methyldodecanoaat), o thioalkoholen (decanthiol-1), nitrillen (undecaannitril-1) of organische halogeniden (1-chloordecaan), dus alifatische 30 koolstofverbindingen met in hun eindgroep zwavel of nog elektronegatiever is. Volgens één der uitvoeringsvoorbeelden ontstaat in een 30 % aardappelzetmeel-hydrolysaat in drie dagen bij 55°C bij aanwezigheid vein het neerslagreagens decanol-1 een mengsel dat (betrokken op het zetmeel) 65 % 35 α-CD bevat.

Er zijn talrijke moleculen bekend die met 8403866 «fr- ♦ - 3 - os-CD oplosbare en onoplosbare insluitcomplexen vormen.

Als gastmoleculen zijn bijvoorbeeld benzeen en benzeenderivaten geschikt, bifenyl, cyclohexaan, 4,4-dihydroxy-bifenyl, terfenyl, o-chloorfenol, aniline, N-methylaniline, 5 p-chlooraniline, ethylbromide, 1,6-dibroomhexaan, 1,4-di- broombutaan, ethylchlooracetaat, propionzuur, boterzuur, capronzuur, dimethylglyoxim, elementair chloor en broom, kaliumjodide, p-cymeen, p-fenyleendiacrolelen, hydrochinon, vinylethylether, o-chloorhydrochinon, butaandithiol-1,4, 10 hexaandithiol-1,6, bis(10-mercaptodécamethyleen)ether en zwavelkoolstof (Ghem. Ber. 90 (1957) 2561).

In het Amerikaanse octrooischrift 3.541.077 is een voor industriële toepassing geschikte werkwijze voor het winnen van α-CD uit zetmeel-omzettingsmengsels beschre-15 ven. De met α-CD onoplosbare insluitcomplexen vormende gast moleculen kunnen cyclohexaan, tetrachloorethaan, trichloor-etheen, benzeen, hexaan, octanol-1, tolueen en zwavelkoolstof zijn. De praktische toepassing van deze methode wordt echter daardoor bemoeilijkt dat het omzettingsmengsel of 20 het bij opwerken verkregen tussenprodukt zich moeilijk verder laten zuiveren. De oorzaken hiervoor zijn aan één kant de slechte filtreerbaarheid, die toe te schrijven is aan de vorming van hydrofobe intramoleculaire adducten met niet-omgezet zetmeel, en aan de andere kant het hoge kook-25 punt van een deel van het neerslagmiddel dat het verwijde ren van dit neerslagmiddel door stoomdestillatie bèmoeilijkt.

Het is bekend dat γ-CD met de volgende moleculen insluitcomplexen vormt: gechloreerde benzeen-deriva-ten, benzeen, cycloalkanen, cyclohexanol, naftaleen, anthra-30 ceen, 9,10-dichlooranthraceen, bifenyl, terfenyl, aniline, N-methylaniline, N,N-dimethylaniline, ethylbromide, 8-oxy-chinoline, o-chloorfenol, joodkaliumjodide, p-cymeen, en Ephedrine (Chem. Ber. 90 (1957) 2561). Voor de industriële bereiding van γ-CD werden deze gastmoleculen echter nog 35 niet toegepast.

Japanse onderzoekers hébben een werkwijze 8403866 # -i - 4 - beschreven waarbij uit de moederloog, verkregen na uitkristalliseren van het β-CD, het dan nog aanwezige γ-CD geïsoleerd kan worden (Horikoshi et al., Proceedings van de le Internationale Conferentie over Cyclodextrinen, Boedapest, 5 1981. Reidel Publ. Co., 1982). Men gebruikte CGT uit de alka-! lofiele soort no. 38-2 en behandelde de moederloog na het uitkristalliseren van β-CD met amyloglucosidase om er de lineaire dextrinen in af te breken, het bij de reactie ontstane glucose werd met een ionenwisselaar (Diaion FRK-01) 10 uit het mengsel verwijderd, het aanwezige γ-CD werd door gelfiltratie (over een kolom Toyo Pearl HW-40) afgescheiden en na indampen en zuiveren van het eluaat werd het γ-CD gekristalliseerd. Deze werkwijze heeft, doordat hij niet op de bereiding van γ-CD gericht is, het bezwaar dat de opbrengst 15 aan γ-CD nogal slecht is: 20 kg per ton ingezet aard appelzetmeel .

Het doel van de uitvinding was het uitwerken van een werkwijze waarmee uit één en hetzelfde uitgangsmateriaal naar wens hoofdzakelijk α-CD respectievelijk hoofd-20 zakelijk γ-CD bereid kan worden.

Verrassenderwijs werd gevonden dat een dergelijke werkwijze mogelijk is als men de nu gevonden opeenvolging bij de CD-vorming benut. Volgens dit reactiemechanis-me ontstaan 8- en γ-CD uit reeds bestaand α-CD, en wel vormt 25 het γ-CD zich in de laatste fase van de reactie als het enzym reeds voor het grootste deel geïnactiveerd is. Daaruit laat zich begrijpen dat in deze reactie-opvolging de hoeveelheid primair gevormd α-CD beperkend op de hoeveelheid γ-CD werkt, d.w.z. dat als de aanvankelijke vormingssnelheid van het 30 α-CD verhoogd wordt dit voordelig is voor de latere γ-CD- vorming.

Zoals bekend bestaat er een groot verschil tussen de diameters van de holle ruimten van a- en γ-CD, en daardoor vormen de neerslagmiddelen voor α-CD in het 35 γ-CD complexen met te lage stabiliteitsconstante, en met

een overmaat aan neerslagmiddel ontstaat helemaal geen γ-CD

8403866 <· > - 5 - of slechts in een te verwaarlozen hoeveelheid.

Nu werd gevonden dat de hoeveelheid γ-CD in het reactiemengsel stijgt als men aan het reactiemengsel een mengsel van a- en γ-neerslagmicidelen toevoegt. De reactie-5 omstandigheden worden dan zo gekozen dat de vorming van het γ-CD zo snel mogelijk verloopt, de werking van het enzym CGT moet dus optimaal ingesteld worden en de disproportio-nerende werking moet men zo goed mogelijk verdringen.

Zoals bij onderzoek bleek kan voor de be-10 reiding van de afzonderlijke cyclodextrinen elke amylose en amylopectine bevattende soort zetmeel gebruikt worden (de zetmelen uit aardappels, mais, waxy-mais, β-amylasevrij tarwezetmeel en glycogeen), als dat aan een beperkte· hydrolyse onderworpen wordt, waarvan het resultaat 15 een een partieel hyifolysaat meteen reducerend vermogen van ten hoogste 8 glucose-equivalenten is (dit reducerend vermogen wordt volgens DIN 1263 bepaald). Het voor de hydrolyse gebruikte a-amylase kan van elke herkomst zijn, bijvoorbeeld uit Bacillus subtilis. Bacillus polymixa, Bacillus licheni-20 formis, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, enz. Reeds in de beginfase van de beperkte hydrolyse zorgt men er voor dat er geen disproportionering kan optreden doordat er geen glycosyl-acceptor aanwezig is.

Nadat het γ-CD uit het reactiemengsel ver-25 wijderd is ontstaat - vooropgezet dat het enzym ondèrtussen zijn activiteit niet.verloren heeft - in het achtergebleven reactiemengsel een aanzienlijke hoeveelheid (3-CD.

Bij de werkwijze volgens de uitvinding voor het winnen van o- resp. γ-CD worden de neerslagmiddelen ge-30 combineerd toegepast. Wil men hoofdzakelijk α-CD winnen dan worden als selectieve α-CD-neerslagmiddelen lagere alifa-tische ketonen gébruikt. Wil men zo veel mogelijk γ-CD verkrijgen dan gebruikt men naast de genoemde ketonen ook met alkyl gesubstitueerde of gecondenseerde fenol-derivaten.

35 Als uitgangsstof voor de werkwijze van de uitvinding kan men bijvoorbeeld maïszetmeel gebruiken, dat 8403366 • * - 6 - partieel gehydrolyseerd is. De gedeeltelijke afbraak kan gebeuren met α-amylase uit bacillen in aanwezigheid van calcium-ionen/ bij een pH van ongeveer 7 en onder verwarming (bij voorkeur tot 80°C). Als het reducerend vermogen van 5 het hydrolysaat beneden 8 glycose-equivalenten gekomen is wordt de enzymatische afbraak door verhitting gestopt (bijv. tot 120°C, 1 atm. overdruk). Op die manier verkrijgt men een ongeveer 10-40 gew.% zetmeel-hydrolysaat dat een mengsel van dextrin en met betrekkelijk lange ketens bevat en een sterke 10 neiging tot retrogradatie vertoont. Daar de retrogradatie-produkten minder goed toegankelijk zijn voor de inwerking van het CGT moet men het CGT direct na de inactivering van het a-amylase toevoegen. Het toegepaste enzym komt bij voorkeur uit Bacillus soort BM 10-68 MNG 00154. Om de snelle 15 vorming van a- en γ-CD te bevorderen worden oplossingen van fenolderivaten in lagere alifatische ketonen toegevoegd.

Als ketonen komen bijvoorbeeld aceton, butanon, pentanon-3, pentanon-2 en 4-methylpentanon-2 in aanmerking, als gecondenseerde fenol-derivaten a- en β-naftol, en als met alkyl 20 gesubstitueerde fenol-derivaten 2,4- en 2,6-dimethylfenol.

Gebruikt men één van de genoemde alifatische ketonen als selectief neerslagmiddel voor α-CD dan krijgt men in 24 uur bij 50-70°C in aanwezigheid van 2-15 vol.% neerslagmiddel opbrengsten van 25-40 % α-CD, betrokken op 25 ingezet zetmeel. Na 24 uur is dan een evenwicht ingesteld.

In het reactiemengsel. vindt men naast wat β-CD in hoofdzaak α-CD. Het evenwicht is onafhankelijk van de toegepaste enzym-concentratie.

Bij toevoegen van met elkaar gecombineerde 30 neerslag middelen kan γ-CD in hoge opbrengsten verkregen wor den. Als voor de bevordering van de γ-CD-vorming bijzonder geschikte neerslagmiddelen kunnen butanon met 2,4-dimethyl-fenol resp. butanon met a-naftol genoemd worden, in beide gevallen in een gewichtsverhouding van 1:1. Met deze combina-35 ties kan bijvoorbeeld uit een 35 gew.% maiszetmeel-hydroly-saat bij 35-45°C in 20-50 uur en met 10 vol.% neerslagmiddel 8403866 * - 7 - een opbrengst van 35 % aan γ-CD bereikt worden.

Uit het reactiemengsel kan het γ-CD op de volgende wijze geïsoleerd worden: de in het reactiemengsel onoplosbare complexen van a- en γ-CD worden afgefiltreerd.

5 De filterkoek wordt ter verwijdering van het neerslagmiddel met methanol uitgetrokken. Dan wordt het γ-CD daaruit selectief opgelost met warm methanol/water 2:1. Het extract wordt met polymere adsorbentia (Amberlite XAD-2 en XAD-4 van Rohm & Haas Comp. te Philadelphia, Diaion HP-20 van de firma 10 Mitsubishi Chem. Ind. Ltd. te Tokio) en met sterke anionen- uitwisselaars (Varion AD en Varion KS of Amberlite IR 120 en IRA 410) van ionen en in neerslag aanwezige niet-ionoge-ne verontreinigingen bevrijd. De doorgelopen vloeistof wordt tot 20 % droge stof ingedampt en verder met actieve kool ge-15 zuiverd. De geklaarde γ-CD-oplossing wordt tot 50 % droge stof ingedampt en het γ-CD wordt uit water gekristalliseerd.

Het α-CD wordt als volgt uit het reactiemengsel geïsoleerd: om de niet omgezette zetmeel af te breken wordt aan het reactiemengsel amyloglucosidase toegevoegd.

20 De overmaat neerslagmiddel wordt met -stoomdestillatie ver wijderd. De achterblijvende oplossing wordt tot een vijfde van zijn volume geconcentreerd en dan afgekoeld. Door toevoegen van cyclohexaan kristalliseert het α-CD-complex, wat af gefiltreerd en gedroogd wordt.

25 Bij de proeven werd het gehalte aan cycla- dextrine door dunlaagchromatografie bepaald (zie J. Szejtli: "Cyclodextrins, Their Inclusion Complexes" biz.

53-54, Akadémia Kiadó, Budapest, 1982). De activiteit van -het enzym CGT werd bepaald met de methode van Kitahata 30 (zie Kitahata, Tsuyama en Okada, Agr. Biol. Chem. 38 (1974) 387, waarin ook een definitie van de Kitahata-eenheid, en het Amerikaanse octrooischrift 3.888.738). De activiteit van het voor de hydrolyse gebruikte α-amylase werd bepaald met de methode van Sandstedt c.s. (zie Cereal Chem. _16 35 (1939) 712).

De uitvinding wordt nu nader toegelicht aan 8403866 - 8 -

de hand van de volgende, niet beperkende voorbeelden. Voorbeeld I

Bereiding van een hoofdzakelijk uit α-CD bestaand reactie- mengsel._ 5 i' In 340 g leidingwater werd 170 g maïszet meel gesuspendeerd en de pH hiervan werd eerst met 10 % zoutzuur op 5-6 en daarna met 10 % Ca(OH)2~suspensie op 7,1-7,4 ingesteld. Nu werden per gram zetmeel 2 SKB-eenhe-den aan a-amylase (van de Novo Industri A.S. te- Kopenhagen, 10 Type BAN 240 L) toegevoegd en werd de zetmeel door 15 minu ten verwannen op 80°C in oplossing gebracht. Vervolgens werd het enzym door 30 minuten verhitten op 120°C geïnactiveerd. Het verkregen hydrolysaat had een reducerend vermogen van 7,4 glucose-equivalenten.

15 Voor de studie van de omzetting werd een "blokreactor" gebruikt (van de Pierce Chemical Comp. te Rockford, Type Reacti-Therm). In vaatjes van 5 ml werden porties van 3 ml hydrolysaat gebracht, en bij 45°C werd hieraan per gram zetmeel 24 Kitahata-eenheden CGT toege-20 voegd. Dit enzym was afkomstig uit de Bacillus-soort BM-10-38, MNG 00154. Bovendien werd in elk vaatje 500 ƒ11 neerslagreagens gebracht en wel octanol-1, decanol-1, octadecanol-1, butanon, pentanon-3, pentanon-2, 4-methyl-pentanon-2, aceton en gedestilleerd water. De-omzetting ge-25 beurde in 5 dagen onder voortdurend roeren en bij 45°C.

Uit elk vaatje werd dagelijks een monster genomen en met dunlaagchromatografie werden daarin de gehalten aan de afzonderlijke CD-componenten bepaald. Hiertoe werden de dunlaagchromatogrammen half kwantitatief door vergelijking 30 van de oppervlakten van de vlekken geëvalueerd. De uitkomsten hiervan waren: 8403866 - 9 -

Tabel 1

Neerslag- Opbrengst (in g/100 ml) aan

TOrmer a-CD S-CD γ-CD

5 123 5 12351235 '_(Aantal dagen)_

Octanol-1 6851 3774 --11 . Decanol^l 6 10 12 3 4766 -11-

Octadecanol-1 8 752 2242 --1- 10 Butanon 8 7 7 4 6 7 -22-

Pentanon-3 887 445 -24

Pentanon-2 687 233 -22 4-Mepentanon-2 53'4 488 -11

Aceton 342 3 3 2 -11 15 Water 332 23 3 -11

Voorbeeld II

Bereiding van een hoofdzakelijk uit γ-CD bestaand reactie- mengsel._

Dezelfde blokreactor als in voorbeeld I 20 werd weer gebruikt/ en ook werden er per gram zetmeel 24

Kitahata-eenheden CGT toegevoegd. In elk vaatje werd aan 3 ml hydrolysaat 500 ƒ11 neerslagvormer toegevoegd, en wel butanon + tolueen, pentanon-3 + tolueen, 4-methylpentanon-2 + tolueen, butanon + xyleen, pentanon-3 + xyleen, 4-methyl-25 pentanon-2 + xyleen (steeds met een volumeverhouding van 1:1) of butanon + α-naftol, butanon + 2,4-dimethylfenol "(in een gewichtsverhouding van 1:1) en tenslotte ook tolueen alleen. Dagelijks werden monsters genomen die door dunlaagchroma-tografie halfkwantitatief onderzocht werden. De uitkomsten 30 hiervan waren: 84 0 ??·!$ - 10 -

'j· V

Tabel 2

Neerslag- Opbrengst in g/100 ml aan

vormer a-CD β-CD γ-CD

5 .123123 123 __(Aantal dagen)_ MEK + Tolueen 321 4 10 16 - - -

Et2CO + Tolueen 474 58 15 -12 ΜΙΒΌΚ + Tolueen 3 1 j 1 3 10 17__- 10 MEK + Xyleen 553 6 10 14 - 21

Et2C0 + Xyleen 543 59 10 - 33 MIBUK + Xyleen 3 2 1 8 12 18__- MEK + a-naftol 431 6 11 15 7 13 10 MEK + 2,4-DMF 4 2 0 5 5 12 6 15 14 15 Tolueen 3 1 2 46 12 - -

Voorbeeld III

Bereiding van een hoofdzakelijk uit γ-CD bestaand reactiemengsel. _' 20 Een volgens voorbeeld I bereid zetmeel-hydro- lysaat werd op de in voorbeeld I beschreven wijze aan enzymatische omzetting onderworpen; alleen bedroeg de reactie-temperatuur 40°C. Als neerslagmiddelen werden de in tabel 3 genoemde combinaties (steeds met een gewichtsverhouding 1:1) 25 gebruikt, steeds in een hoeveelheid van 500 γΧ. De reactie werd 2 dagen voortgezet; en elke dag werden de monsters dunlaagchromatografisch onderzocht. De uitkomsten hiervan waren: 30 8403865 - 11 - •ar Ψ

Tabel 3

Neerslag- Opbrengst in g/100 ml aan vormer α-CD 0-CD γ-CD in 5 1. dag 2. dagen 1. dag 2. dagen 1. dag 2 da- _ gen MEK + 2,4-DMF 4 1 8 10 7 13 2,6-DMF 4 2 8 9 2 10 α-Naf tol 6 1 9 8 5 14 10 S-Naftol 6 4 6 8 7 9

Naftaleen 3 1 9 10 5 5

Fenol 1 12 3 -

Water + 2,4-DMF 1 4 3 11

Water + α-naftol 1 - 5 5 1 2 15 __

Voorbeeld IV Bereiding van ruw et-CD»

Aan 500 ml volgens voorbeeld I bereid mais-zetmeel-hydrolysaat werden per gram zetmeel 50 Kitahata-20 eenheden CGT toegevoegd. Bij 45°C werd 50 minuten lang voort durend geroerd. Daarna werd 50 ml butanon toegevoegd. De temperatuur werd tot 55 °C verhoogd en de omzetting 10 uur lang voortgezet. De pH van het reactiemengsel werd op 4,3 ingesteld en nu werd per gram zetmeel één eenheid amyloglucosi-25 dase toegevoegd (verkregen van de firma Novo Industri A.S.,

Type AMG 150 L). Daarmee werd in 16 uur biy 55°C het dan nog aanwezige hoogmoleculaire zetmeel gehydrolyseerd. Voor het verwijderen van de overmaat butanon werd het reactiemengsel bij gewone druk aan stoomdestillatie onderworpen en tot een 30 vijfde van zijn volume ingedampt. Na afkoelen tot 10°C werd 5 ml cyclohexaan toegevoegd. Men liet het mengsel 16 uur op 5°C staan, waarbij veelvuldig omgeschud werd. Het uitgekristalliseerde α-CD-cyclohexaan-complex werd afgefiltreërd en in een exsiccator gedroogd. Men verkreeg 34 g ruw a-CD-complex.

35 Voorbeeld V

Bereiding van ruw γ-CD-complex.

Aan 500 ml volgens voorbeeld I bereid mais- 84 Q 3 8 S 8 V5 - 12 - zetmeel-hydrolysaat werden per gram zetmeel 25 Kitahata-eenheden CGT toegevoegd. Het mengsel werd 50 minuten lang bij 45°C geroerd. Nu werd 50 ml butanon/a-naftol 1:1 toegevoegd. De omzetting werd 24 uur bij 45®C en een pH van 5,5- 5 6,5 voortgezet. Daarna werd het reactiemengsel gefiltreerd en het neerslag gedroogd. Men verkreeg 120 g ruw γ-CD-complex.

Voorbeeld VI

: Bereiding van g-CD-complex.

10 Het bij voorbeeld V na affiltreren van het γ-CD-complex overgehouden filtraat liet men twee dagen bij 40°C staan. Daarbij kristalliseerde een complex van g-CD met butanon en α-naftol uit. De kristallen werden afgefiltreerd en gedroogd. Men verkreeg 14 g ruw g-CD-complex.

15 Voorbeeld VII

In 150 ml leidingwater werd 50 g van het in voorbeeld V verkregen ruwe γ-CD-complex gesuspendeerd.

De suspensie werd met 2 ml 40 % NaOH alkalisch gemaakt en daarna werd het neerslagmiddel met 160 ml n-butanol ge-20 extraheerd. De overgehouden vloeistof werd door ionenwisse ling verder gezuiverd.

De helft van de waterfase werd over een kolom van 200 ml mengsel van Varion KS (H+) en Varion AD (OH )(van Nitrokémiai Ipartelepel te Füzfó) en dan over een 25 kolom van 100 ml Diaion HP-20 (van de firma Mitsubishi

Chemical Ind. te Tokio) geleid. De andere helft van- de waterfase werd eerst over een gemengde kolom van Amberlite IR 120 (H+) en Amberlite IRA 400 (OH ). (van Rohm & Haas te Philadelphia) en dan over een 100 ml kolom van Amberlite 30 XAD-4 geleid.

Tijdens de chromatografie werd het naftol-gehalte van de eluaten met dunlaagchromatografie gevolgd en conductometrisch werd het gehalte aan ionen uit de schijnbare geleidbaarheid bepaald (met een conductometer type 35 Radelkis OK 102/1). De uitkomsten hiervan waren: 8 A 0 3 8 6 6 - 13 -

Tabel 4

Onderzocht Naftol Schijnbare_geleid- nater-ί^ΐ __baarheid / pSj

Butanol-raffinaat +++ 149 000 5 Eluaat van Varion KS + AD + 180

Eluaat van Diaion HP-20 ± 130

Eluaat van Amberlite IR + IRA 400 ± 115

Eluaat xan Amberlite 10 XAD-4 - 80 +++ bij elueren ontstaan aan het vloeistoffront een vlek die groter is dan de startvlek (de naftol-vlek is bruin, die van het γ-CD oranjegeel).

15 ++ de vlek is net zo groot als de startvlek.

+ de vlek is kleiner dan de startvlek.

± nauwelijks waarneembare, bleke vlek.

- geen vlek met het oog waarneembaar .

Voorbeeld VIII

20 Zuivering van ruw γ-CD.

Van het bij voorbeeld V verkregen ruwe γ-CD-complex werden drie porties van 100 g elk afzonderlijk in 200 ml water gesuspendeerd. Aan de eerste suspensie werd 400 ml methanol toegevoegd, aan de tweede 400 ml ethanol en 25 aan de derde 400 ml isopropanol. De mengsels werden een uur lang onder terugvloeikoeling gekookt. De verdere zuivering gebeurde op de in. voorbeeld VII beschreven wijze door middel van ionenwisseling. De uitkomsten van het onderzoek aan de eluaten waren als volgt: 30 8403866 - 14 -Tabel 5 +)

Onderzocht CH.OH/H.O C Η ΟΗ/Η,Ο C H-OH/H.O

materiaal 2:1 2:1 ''2:1

Uitgangsextract 5 Naftol ++ ++ +++ γ-CD +++ +++ ++

Eluaat van Varion KS + AD

Naftol - - γ-CD +++ +++ ++ 10 Eluaat van Amber- lite IR 120 + IRA 400

Naftol - ± + γ-CD ++ ++ +

Eluaat van Amberlite 15 XAD-4

Naftol - - γ-CD +++ +++ ++

Voor de betekenis van +++, enz. zie tabel 4.

20

Uit de vergelijking blijkt dat het met methanol behandelde γ-CD-extract wegens zijn lage naftol-gehalte ook met de ionenwisselaar Varion gezuiverd kan worden.

Voorbeeld IX

25 Bereiding van zuiver γ-CD en 6-CD-complex.

Van het in voorbeeld V bereide ruwe ..γ-CD-complex werd 50 g een uur lang onder terugvloeikoeling met 250 ml methanol gekookt. De vaste stof werd afgefiltreerd en nogeens een uur opgekookt met een mengsel van 500 ml 30 methanol en 250 ml leidingwater. Na filtreren liet men de vloeistof een nacht staan en het daaruit neergeslagen β-CD-complex werd afgefiltreerd. Opbrengst 26 g.

Het filtraat werd met een debiet van 40 ml/ uur geleid door een kolom van 20 ml die een mengsel was van •J* e 35 Varion KS (H ) en Varian AD (OH ). De doorgelopen vloeistof werd in hetzelfde tempo geleid door een kolom van 20 ml 8403866 4 * - 15 -

Amberlite xad-4. Daarna werd de ongeveer 700 ml vloeistof ingedampt tot ca 25 gew.% droge stof. Deze oplossing werd met 4 g actieve kool geklaard en verder ingedampt tot 55-60 gew.% droge stof. Hieruit kristalliseerde het γ-CD uit. Na 5 af filtreren en drogen had men 20,1 g kristallijn γ-CD.

8403866

Claims (7)

1. Werkwijze voor de bereiding van γ- en a-cyclodextrine uit een met a-amylase gedeeltelijk gehydro- 5 lyseerd zetmeel van laag reducerend vermogen onder toepas sing van cyclodextrine-glucosyl-transferase, met het kenmerk, dat men het met α-amylase gedeeltelijk gehydrolyseerde zetmeel van laag reducerend vermogen met cyclodextrine-glucosyl-transferase omzet in aanwezigheid van een alifatisch keton 10 volgens de algemene formule R^COR^ (waarin R^ en R^ onafhankelijk van elkaar vertakts,of onvertakte alkyl-groepen met 1-6 koolstofatomen zijn) en/of een fenol^derivaat volgens de algemene formule R^R^CgH^OH (waarin en R^ waterstof en/of alkyl-groepen met 1-4 koolstofatomen voorstellen of samen 15 daaraan gecondenseerde benzeenkern vormen) en/of een benzeen-derivaat volgens de algemene formule R^R^CgH^ (waarin Rg en Rg waterstof en/of alkyl-groepen met 1-4 koolstofatomen voorstellen of samen een daaraan gecondenseerde benzeen-kem vormen), waarna men desgewenst uit het reactiemengsel het 20 a- en/of het γ-cyclodextrine in ruwe vorm of na verdere zui vering in zuivere vorm isoleert.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men als alifatisch keton aceton, butanon, penta-non-2, pentanon-3 of 4-methylpentanon-2 gebruikt.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men als fenol-derivaat 2,4-dimethylfenol, 2,6-dimethylfenol, α-naftol of β-naftol gebruikt.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men als benzeen-derivaat tolueen, xyleen of 30 naftaleen gebruikt.

5. Werkwijze volgens een der voorafgaande conclusies, met het kenmerk, dat men voor de bereiding van γ-cyclohextrine de overmaat neerslagmiddel met een lagere alkanol (bij voorkeur methanol) extraheert, het γ-cyclo- 35 dextrine in 50-70 % alkanol/water (bij voorkeur waterig methanol) oplost, het extract met polymere adsorbentia en 8403866 - 2 - r*·· '—r— Λ ί ionenwisselaars zuivert en het γ-cyclodextrine uit de gezuiverde oplossing laat kristalliseren.

6. Werkwijze volgens een der conclusies 1 t/m 4, met het kenmerk, dat men voor de bereiding van a-cyclo-5 dextrine de naast het α-cyclodextrineketon-complex ontstane dextrinen alsmede het β- en γ-cyclodextrine hydrolyseert, het neerslagmiddel door stoomdestillatie verwijdert, men uit α-cyclodextrine en cyclohexaan een complex vormt, en dat laat kristalliseren.

7. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men voor de vorming van een temair complex (vooral van γ-cyclodextrine) de als neerslagmiddel te gebruiken alifatische ketonen in combinatie met de als neerslagmiddel te gebruiken fenol-derivaten gebruikt. 15 8403366