DE3407196A1 - Verfahren zur identifizierung einzelner mitglieder einer spezies von organismen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft einen neuen und verbesserten diagnostischen Test zur Bestimmung der Vaterschaft und zur Festlegung der individuellen genetischen Identität. Zu bemerken ist, daß - auch wenn der Test, wie es auf dem Fachgebiet üblich ist, als Vaterschafts-Test bezeichnet wird - nichtsseine Anwendung iru?ällen von bestrittener Mutterschaft ausschiieSt.

Es gibt zahlreiche ünstände, unter denen die Fähigkeit zur Bestimmung der Identität eines Individuums von Bedeutung ist.

Beispiele dafür sind der Vergleich von physikalischem Beweismaterial, das an Schauplatz eines Verbrechens verblieben ist, mit einem bestimmten Verdächtigen, die Festlegung der Identität eines Individuums in Beziehung mit seiner Mutter oder seinem Vater, wie bei der Bestimmung der Vaterschaft oder allgemeiner bei der Festlegung der genetischen Identität eines Virus-, Bakterien-, Algen-, Pilz-, Pflanzen- oder Tier-Stammes. Einige der für solche Bestimmungen verwendeten Tests beruhen auf der Identifizierung von polymorphen Proteinen, die aus dem Plasma oder von der Oberfläche von Zellen des fraglichen Individuums stammen oder aus dem Inneren der Zellen extrahiert wurden.

Die bekannten menschlichen ABO-Blutgruppenstoff e können zur Veranschaulichung benutzt werden. Die ABO-Blutgruppenstoffe sind ihrer Zusammensetzung nach Kohlenhydrate und werden von Enzymen synthetisiert, welche die Produkte eines einzelnen menschlichen Gens sind. Eine Form des Gens ( das A-Allel) erzeugt ein Enzym, das bei der Synthese des A-Typs Blut Verwendung findet, während eine andere Form des Gens

(das B-Allel) ein Enzym erzeugt, das bei der Synthese des B-Typs Blut verwendet wird. Die Abwesenheit beider Allele

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ergibt die Erzeugung von O-Typ Blut, während die Gegenwart beider Allele zur Herstellung von AB-Typ Blut führt. Die ABO-Stoffe besitzen antigene Eigenschaften und können immunologisch durch Reaktion mit den entsprechenden Antisera bestimmt v/erden. Die unterschiedliche Reaktivität dieser Stoffe mit den genannten Antiseren bildet die Basis für die Typen-Einteilung in A-, B-, 0- und AB-Blut.

Wenn alle Menschen die gleiche Blutgruppe besitzen würden, ware der Stoff ohne Wert für die Unterscheidung von Individuen. Die Tatsache, daß die Blutgruppen-Stoffe in mehreren Forcen vorkommen, d.h. polymorph sind, erlaubt die Unterscheidung» Im Hinblick auf seine Aussagekraft ist jedoch beispielsweise in Fällen von bestrittener Vaterschaft nicht nur die Zahl der unterschiedlichen Allele von Bedeutung, sondern auch die Häufigkeit, mit der diese Allele auftreten. Da die Allel-Häufigkeit innerhalb der Bevölkerung variiert, ist auch die sichere Ausschlußmöglichkeit unterschiedlich. Die Fähigkeit eines Tests zum Ausschluß be-

stimmter Möglichkeiten wird durch seine Ausschlußfähigkeit wiedergegeben, die einen Zahlenwert im Bereich von 0 bis 1,0 darstellt. Die Ausschlußfähigkeit des ABO-Systems ist bei schwarzen Amerikanern 0,177^i dagegen bei Amerikanern kaukasischer Abstammung 0,1342. Die Ausschlußfähigkeit

steigt bei Schweden auf den Wert 0,1830 und bei Japanern auf 0,1917.

Einen Versuch zur Erhöhung der Ausschlußfähigkeit stellt die Ausdehnung der Analyse auf andere polymorphe Stoffe dar.

In Schweden werden 12 polymorphe Stoffe analysiert. Die
Gesamt-Ausschlußfähigkeit dieser Serie von Tests erreicht 0,870. Die Hinzufügung von v/eiteren Systemen zu dem Satz steigert, auch wenn sie hohen informativen Wert hat, die kumulative Wahrscheinlichkeit nicht mehr stark, wenn die Zahl der bereits in Betracht gezogenen Systeme groß ist. Eine Zusammenschau von 25 auf immunologischen Tests

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(Antigen-Antibody-Reaktionen) "beruhenden Systemen ergibt eine kunulative Wahrscheinlichkeit einer nicht vorliegenden Vaterschaft von 0,769^·, während eine ähnliche Analyse von 32 auf biochemischen Tests (Enzymreaktionen oder elektrophoretische Mobilität) beruhenden Systemen einen Wert von 0,95"12 ergibt. Die vereinigten 57 Systeme ergeben auch nur einen Ausschlußwert von 0,9887- Umfangreiche Untersuchungen sind bei einem Vaterschafts-Testprogramm nicht praktikabel, da viele dieser Systeme infolge der Kosten, der geringen Menge an Reagenzien, der technischen Komplexität, der geringen Verläßlichkeit und/oder der unzureichenden Erfahrung als ungeeignet für Routinearbeit angesehen werden müssen.

Die Anwendung von Hehrfach-Te st systemen zur Bestimmung der Identität ist in den forensischen Wissenschaf ten bekannt. Beispielsweise werden zusätzlich zu den ABO-Blutgruppen-Antigenen auch KN- und Rh-Antigene analysiert. Wenn die Testprobe flüssig ±ετ, können auch Le- und Se-Antigene eingeschlossen werden. Drei Enzyme der roten Blutzellen, saure Phosphatase, Phosphoglukomutase und Esterase D werden auf die Anwesenheit von elektrophoretischen Varianten geprüft. Schließlich v/erden Tests für Serumproteine, wie Haptoglobine, angewendet. Wie im Fall der Bestimmung der Vaterschaft ist auch der Umfang dieser gerichtliche^ forensischen) Nachforschungendurch Kosten, technische Komplexität und geringe Verläßlichkeit begrenzt.

Unabhängig von den vorstehend erläuterten praktischen Erwägungen stört ein ernsteres theoretisches Problem alle

existierenden Tests. Da die Tests auf der Analyse eines

Proteins oder seiner Aktivität beruhen, ist das Genprodukt und nicht das Gen selbst Gegenstand der Untersuchung. In Übereinstimmung mit der nachstehend beschriebenen Erfindung ist aber die Analyse den Gens direkt derjenigen des Produktes seiner Expression inabesondere bei der Bestimmung der Vaterschaft vorzuziehen, da dem Verfahren, durch das

genetische Information exprimiert wird, Entartung inhärent ist.

Der Fluß der genetischen Information in Zellen ist bekannt. Die die Biosynthese irgendwelcher Proteine steuernde Information ist in den als Gene bekannten Sequenzen von DNA-Nukleotiden gespeichert. Die DNA der Zelle kann als die Speicherform der genetischen Information betrachtet werden. Die DNA-Moleküle sind groß, chemisch stabil, leicht zu replizieren und enthalten viele Gensequenzen. Beispielsweise ist die gesamte genetische Information des Bakteriums E. coli in einem einzigen DNA-Molekül enthalten, das sich aus etwa 4,2 χ 10 Nukleotid-Basenpaaren zusammensetzt.

Transkription heißt das Verfahren, mit dem die Umsetzung der Information beginnt. Die Transkription beinhaltet die erneute Synthese der Information in Form einer Nukleinsäure, die RITA genannt wird. Eine Art von RNA, die Messenger -RNA (mRNA) transportiert die Information an die Stelle der Proteinsynthese, die Ribosom genannt wird.

Nach der Synthese der mRNA aus dem Gen kann das Verfahren der Proteinsynthese beginnen. Dieses Verfahren besteht im wesentlichen aus der molekularen Entschlüsselung, bei der die Nukleotidsequenz der mRNA eine Schablone für die Synthese eines bestimmten Proteins darstellt. Da ein Wechsel von der Nukleinsäure-Sprache in die Protein-Sprache stattfindet, wird das Verfahren der Proteinsynthese in geeigneter Weise als Translation bezeichnet. Um die Analogie noch etwas weiter zu treiben, erscheint es angemessen, die Bestandteile der Nukleinsäuren, die Nukleotide als Darstellung des Alphabets der Nukleinsäure-Sprache und die Aminosäuren, die Aufbausteine der Proteine, als Darstellung des Alphabets der Protein-Sprache zu betrachten. Im Verlauf des Translationsveriahrens wechseln nicht nur die Sprachen, sondern auch die Buchstaben. Dies ist ein besonders komplexes

Verfahren, bei dem bekanntermaßen über hundert Arten von Molekülen eine Rolle spielen. Beim Durchgang der mRNA durch das Eibosom, der demjenigen des Magnetbandes durch ein Tonbandgerät ähnlich ist, begeben sich Gruppen von drei Nukleotiden (Codons) in eine derartige Stellung, daß hinzukommende ΕΝΑ-Moleküle, die als Transfer-ΕΝΑ (tENA) bekannt sind und eine einzelne Aminosäure tragen, in die richtige Ausrichtung für die Addition der Aminosäure an die wachsende Proteinkette orientiert werden.

Von besonderem Interesse im Hinblick auf die vorliegende Erfindung ist das Godierungsverhältnis von Nukleotiden zu Aminosäuren. Wie vorstehend erwähnt, beträgt dieses Verhältnis drei Nucleotide, die für eine Aminosäure codieren. Da eine Codierung für zwanzig verschiedene Aminosäuren ausschließlich mit den verfügbaren vier Arten von Nukleotiden (A, U, G, C) erforderlich ist, stellt drei das geringste mögliche Verhältnis dar. 3ei einem Codierungsverhältnis von einem Nukleotid zu einer Aminosäure würden sich nur vier der zwanzig für die Proteinsynthese erforderlichen Aminosäuren er-

geben. Ein Codierungsverhältnis von zwei, das sechzehn (4- ) Kombinationen ergibt, ist ebenfalls für die erforderliche Komplexität zu gering. Dagegen sind mit einem Codierungsverhältnis von drei vierundsechzig (4-^) verschiedene Kombinationen möglich. Dieser Überschuß über die zwanzig Codeworte führt beim genetischen Code zu einem Zustand, der als Entartung bezeichnet wird. Ein entarteter Code enthält verschiedene unterschiedliche Codeworte für die gleiche Aminosäure. Jedoch existiert nicht die Situation, daß ein Codewort zwei unterschiedliche Aminosäuren bedeuten kann. Der Code kann entartet sein, er ist jedoch nicht mehrdeutig.

Wenn die Nukleotidsequenz einer Messenger- RNA bekannt ist, kann die Aminosäuresequenz, die darin codiert ist, genau niedergeschrieben werden. Der umgekehrte Vorgang ist jedoch nicht möglich. Wegen der Entartung des genetischen Codes

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Γ - AO - -''-- -■' -'--■ '■■' Π

würde eine Anzahl von Nukleotidsequenaen mit einer gegebenen Aminosäuresequenz konsistent sein. Als Beispiel sind die Fragmente einer mRNA aus dem gleichen Gen von zwei verschiedenen Individuen "A" und "B" zu betrachten.

Individuum "A" Individuum "B"

mRNA [UUC CCC CGA GUU CUA AAG] [UUU CCG AGG GÜC CUU AAG]

Protein [phe-pro-arg-val-leu,lys] [phe-pro-arg-val-leu-lys]

Eine Analyse des Proteins würde Identität der beiden Individuen anzeigen, während eine Analyse der mSNA-Sequeßz klare Unterschiede anzeigt. Kein auf einer Proteinanalyse beruhender Vaterschafts-Test, sei er immunologisch oder biochemisch, kann sorbit zwischen den beiden Individuen unterscheiden. Ein auf der Analyse des genetischen Materials beruhender Test, entweder der EITA oder vorzugsweise der DNA, würde dagegen

eine solche Unterscheidung möglich machen. 20

Obwohl sich die vorstehende Erörterung auf die Bestimmung der Vaterschaft beim Menschen konzentriert hat, ist zu beachten, daß solche Tests mit den geeigneten Reagenzien auch auf andere Tierarten, wie Pferde, Kühe oder Hunde ausgedehnt werden können. Infolge des beschrittenen einzigartigen Weges ist das Testverfahren der Erfindung auf die Bestimmung der Elternschaft aller sich geschlechtlich vermehrenden Organismen einschließlich Pflanzen und Tiere anwendbar.

In einer weiteren Anwendung der Erfindung kann die genetische Identität von Individuen bestimmt werden. Diese Anwendung ist besonders wertvoll auf dem Gebiet der forensischen Wissenschaften oder bei der Bestimmung von Mikroorganismen-,

Pflanzen- und Tierstämmen.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen neuen und verbesserten Test für die Bestimmung der Vaterschaft bei sich geschlechtlich vermehrenden Organismen und zur Peststellung der individuellen genetischen Identität zu schaffen. Diese Aufgabe wird durch Analyse der DNA des Organismus im Hinblick auf eine oder mehrere polymorphe genetische Bereiche, Unterscheidung der polymorphen Teile im Hinblick auf die relative Größe der genetischen Bereiche und damit Charakterisierung eines individuellen Gliedes der Art gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Identifizierung einzelner Mitglieder einer Spezies von Organismen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die DNA des Organismus im Hinblick auf mindestens einen polymorphen genetisehen Bereich analysiert, alle Polymorphismen im Hinblick auf die relative Grö2e des genetischen Bereichs unterschieden und so ein einzelnes Mitglied der Spezies charakterisiert wird.

In einer Aus führung s form der Erfindung v/erden DNA-Proben des Abkömmlings, der Mutter und beispielsweise des vermuteten Vaters getrennt mit mindestens einem Restriktionsenzym verdaut und die erhaltenen Fragmente werden aufgrund ihrer Größe getrennt, indem man sie unter dem Einfluß eines elektrischen Stroms durch eine Gel-Matrix wandern läßt. Die polymorphen Teile werden durch Hybridisierung der vorstehend behandelten DNAs mit markierten, beispielsweise radioaktiven, "Probe "-DNAs bestimmt. Die Probe -DNAs sind variable DNA-Fragmente, die mit einer Vektor-DNA verbunden wurden, die zur Replikation in .einer Wirtszelle, beispielsweise Plasmid pBR 322, Bakteriophage A. oder M 13 in Escherichia coli oder SV 40 in Affenzellen befähigt sind, und die dann aus den Wirtszellen gereinigt wurden.

Die umgesetzten Probe-DNAs erlauben die Sichtbarmachung der Lage und damit der Größe der DNA-Fragmente des Abkömmlings, der Mutter und des vermuteten Vaters, deren Sequenzen zu

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denjenigen der Probe-DNAs· homolog sind. Da die Probe-DNAs unter dem Gesichtspunkt ausgewählt wurden, daß sie ein 'AlIeI von einer polymorphen Stelle darstellen, variieren die Größen der DNA-Fragmente, die zu denjenigen der Probe-DNAs ' homolog sind, von Individuum zu Individuum.

Alle im Abkömmling vorhandenen DNA-Fragmente stammen entweder von der Mutter oder dem Vater des Abkömmlings, wenn man von Mutationen oder bestimmten anderen seltenen Ereignissen absieht- Ein Vergleich der Größen der mit Hilfe der Probe-DNAs bestimmten DNA-Fragmente erlaubt somit die Feststellung, .ob der vermutete Vater der biologische Vater sein kann oder nicht. Wenn beispielsweise die DNA des Abkömmlings ein S600 Basenpaar-Fragment ergibt, das zu einer der Probe-DNAs homolog ist und wenn die DNA der Mutter dieses Fragment nicht aufweist, dann muß es in der DNA des biologischen Vaters enthalten sein. Wenn die DNA des vermuteten Vaters dieses Fragment nicht enthält, kann er als biologischer Vater ausgeschlossen v/erden.

In einer weiteren Ausführungsform können DNA-Proben von einem Verdächtigen und von physikalischen Spuren (Blut, Haut, Sperma usw.) am Ort eines Verbrechens unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Probe-DNAs verglichen werden, um die Identität zwischen den Proben und dem Verdächtigen festzustellen. So schafft die DNA-Polymorphie im Hinblick auf den Hybridisierungs-Essay dem Gerichtswissenschaftler einen "molekularen Fingerabdruck", der sich in den Rest der Analysen der physikalischen Spuren einfügt.

In einer weiteren Ausführungsform wird eine DNA-Probe eines Individuums mit der von anderen Gliedern eines Organismen-Stamms abgeleiteten DNA im Hinblick auf die relative Größe verglichen, um die Stamm-Identität des Individuums festzustellen.

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Die Erfindung wird anhand der Zeichnung weiter erläutert, in der

Fig. 1 das in Beispiel 7 beschriebene Autoradiogramm,

Fig. 2 das in Beispiel 8 beschriebene Autoradiogramm, und

. 3 ^das- in Beispiel 9 beschriebene Autoradiogramm darstellt.

In einer ihrer Ausführungsf orinen besteht die vorliegende Erfindung aus vier aufeinander abgestimmten Stufen: DNA-Isolierung und -Restriktion, Gel-Elektrophorese und . DNA-Übertragung, Hybridisierung und Waschen, und schließlich Autoradiographie.

DNA-Isolierung und -Restriktion

Die Isolierung von DNA aus Zellproben wird nach auf dem Fachgebiet üblichen Verfahren durchgeführt. Die Gewinnung von DNA umfaßt Zell-Lyse, Extraktionen mit Natriumdodeeylsulfat und Natriumperchlorat und Ghloroform/Isoamylalkohol sowie Fällung mit Äthanol.

Nach der Gewinnung wird jede DNA-Probe einer Analyse mit mindestens einer Restriktionsendonuklease unterzogen. Restriktionsendonukleasen sind Enzyme, die bestimmte kurze Sequenzen von etwa 4 bis 7 Nukleotidbasenpaaren erkennen und die DNA an oder in der Nähe dieser Stellen schneiden. Zur Zeit stehen mehr als 200 Restriktionsenzyme zur Auswahl. Die Wahl eines bestimmten Enzyms zur Anwendung in dem Test hängt von der Art der DNA-Probe,der Anzahl der gewünschten Fragmente und der Verfügbarkeit und dem Preis des Reagens ab.

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Γ - 14 - ' Π

Das menschliche Genom, das aus etwa 6 χ ΙΟ·' DNA-Basenpaaren besteht, würde von einer einzigen Rectriktionsendonuklease in 10 bis 10' einzelne Fragmente mit einer Größe im Bereich 10*" bis Λ Cr Basenpaare geschnitten werden. Die Komplexität eines solchen Verdaus spiegelt die Anzahl und Lage der endonukleasespezifischen Schnittpunkte innerhalb der DNA-Probe wieder. Eine umfassende Identifizierung aller Bruchstücke von parallelen Behandlungen mit einer Anzahl verschiedener Endonukleasen würde theoretisch einen "molekilaren Fingerabdruck" ergeben, der für jeden Menschen einzigartig wäre. Obwohl theoretisch möglich,ist eine solche detaillierte Analyse praktisch kaum durchführbar. Die vorliegende Erfindung überwindet diese Schwierigkeit, indem sie die Analyse einer Untergruppe der vorliegenden Spaltprodulrte ermöglicht. In der Ausdrucksweise der Gen-Technologie bedeutet das die Prüfung der vorliegenden Spaltprodukte auf die Anwesenheit einer einzigartigen, interessierenden Nukleotidsequenz. Ein bekanntes Verfahren zur Durchführung dieser Analyse ist die Technik des Southern Transfers (=übertragung)

Gelelektrophorese und übertragung

Nach dem Verfahren von Southern (J.Mol.Biol.Bd. 98 (1975),

S. 505-5^7) werden die bei der Behandlung mit der Restrik- · tionsendonuklease erhaltenen doppelsträngigen DNA-Fragmente durch Elektrophorese in Agarose-Gel nach ihrer Größe getrennt und die DNA durch Einweichen des Gels in Alkali einzelsträngig gemacht. Das Gel v/ird flach auf einen "Docht" aus Filterpapier gebracht, der es mit einer konzentrierte Salzlösung enthaltenden Schale verbindet.

Dann wird eine einzelne Schicht Cellulosenitrat auf die Oberseite des Gels und dann ein großer Stapel trockenes saugfähiges Papier flach oben auf das Cellulosenitrat gelegt. Die Salzlösung wird von den saugfähigen Papiertüchern nach oben gezogen und dabei durch das Gel und die Cellulose-

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nitratschicht geführt. Beim Durchgang der Lösung durch das Gel wird die einzelsträngige DNA aus dem Gel ausgelaugt und zu dem Cellulosenitrat-Filter geführt. Cellulosenitrat hat die Eigenschaft, einzelsträngige DNA zu binden. Daher wird die gesamte DNA aus dem Gel ausgelaugt und auf das Cellulosenitrat-Filter geführt. Infolge der Bindungsfähigkeit des Cellulosenitrats für die einzelsträngige DNA haftet die gesamte DNA an diesem Träger. Das Endergebnis dieses Verfahrens ist eine vollkommene Abbildung der DNA aus dem ursprünglichen Agarose-Gel. Die DNA ist jedoch nun einzelsträngig und an der Cellulosenitrat-Filterschicht immobilisiert. £as DNA-Größeninuster aus dem ursprünglichen Agarose-Gel ist trctsden zuverlässig bewahrt. Fragmentgrößen können durch Vergleich mit Marker-DNA bekannter Größe kalibriert werden.

Hybridisierung und Waschen

Eine Hybridisierungsreaktion tritt dann auf, wenn zwei einzelsträngige DNAs aus unterschiedlichen Quellen sich wieder zu einer doppelsträngigen DNA verbinden. Dies geschieht infolge der komplementären Basenpaarung zwischen den zwei wechselwirkenden Strängen. Über analoge Verbindungen können auch DNA/RNA Hybride hergestellt werden.

Gemäß vorliegender Erfindung wird eine DNA/DNA Hybridisierung durchgeführt. Ein Teil des für die Hybridisierungsreaktion vorgesehenen Materials ist die einzelsträngige DNA im Cellulosenitrat des Übertragungsschrittes. QLe anderen Hybridisierungsstränge stammen von den "Probe "-DNA.s . Diese DNAs stellen verschiedene DNA-Fragmente dar, die unter dem Gesichtspunkt ausgewählt v/erden, daß sie Sequenzen enthalten, die einem Allel eines polymorphen Genbereichs entsprechen. Eine vollständige Beschrei- ' bung der Isolierung und Charakterisierung der "Probe"-DNAs det sich im nachstehenden Abschnitt.

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Auf dem Fachgebiet sind verschiedene Hybridisierungsbedingungen beschrieben. Dazu gehört beispielsweise die Behandlung in 50$ Formamidlösung bei 40 bis 5O°C oder in mittelstarker Salzlösung bei 65 bis 68⁰C. Zur Erhöhung der Reassoziationsrate kann Dextransulfat verwendet v;erden. Nach der Hybridisierung werden die Filter zur Entfernung von nichthybridisierten Hintergrundproben sorgfältig gewaschen. Das Waschen wird bei erhöhter Temperatur und verminderten Salzkonzentrationen durchgeführt, um nichtspezifische DNA/ DNA-Hybride ebenso zu entfernen.

Herstellung von Probe-DNAs

Wir vorstehend erwähnt, stellen die Probe-DNAs unterschiedliche DNA-Fragmente dar, die unter dem Gesichtspunkt ausgewählt werden, daß sie ein Allel eines polymorphen genetischen Bereichs darstellen. In diesem Zusammenhang handelt es sich um eine Polymorphie in Bezug auf die Länge. Die unterschiedliche Fragmentlänge ist ein Ergebnis eines Unterschiedes in der Zahl und/oder der Lage von Endonuklease-Restriktionsstellen, die bei der Herstellung der Fragmente angegriffen wurden. Wenn alle Individuen ein DNA-Fragment ähnlicher Größe aufweisen würden, das mit der Proben-DNA hybridisiert, dann wäre dieser Bereich als monomorph zu betrachten und im Hinblick auf die Erfindung von geringem Nutzen. Wenn die Individuen jedoch DNA-Fragmente unterschiedlicher Größe besitzen, die mit dem Proben-DNA-Fragment hybridisieren, dann kann man das Fragment als Allel eines genetischen Bereichs bezeichnen, der Größenpolymorphie zeigt. Die Auswertung der Proben ist dann von kritischer Bedeutung. Sie besteht aus den zwei miteinander verbundenen Stufen der Probe-Herstellung und Probe-identifizierung.

Probe-Herstellung

Die Herstellung der Probe-DNAs nach dem auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren für die Herstellung einer Sammlung

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clonierter DNA-Fragmente durchgeführt werden. Diese umfaßt normalerweise folgende Stufen: Verdauen einer DNA-Probe mit einer bestimmten Endonuklease; Abtrennung von DNiL-Fraktionen mit entsprechender Größe aus dem Verdau; Ausfällung der Fragmente; Einbau der Fragmente in einen geeigneten Klonierungsvektor; Transformation eines kompetenten WirtsOrganismus mit dem Vektor; und Gewinnung von Kolonien, die die Klonierte Probe -DNA enthalten. Für die Herstellung der Proben kann eine Vielzahl von Endonukleasen und Vektoren verwendet werden. Die Verfahren zur Durchführung der Klonierung sind auf dem Fachgebiet bekannt; vgl. beispielsweise Molecular Cloning: A Laboratory Manual, T. Maniatis u.Mitarb., Cold Spring Harbor Lab 1932. Zwei auf diese Weise erzeugte Proben menschlicher DNA sind pAW 101 und pLM 0.8. Proben von E. coli, die pAvV 101 ur.d pLM 0.S enthalten, wurden bei The American Type Culture Collection unter den Hinterlegungs-Nr. ATCC 39605 und ATCC 59504 hinterlegt.

In einer anderen Ausführungsform können auch cDNA-Proben verwendet werden. Diese Proben v/erden ausgehend von RNA durch ein umgekehrtes Kopierverfahren hergestellt, das im nachstehenden Beispiel 2 und in der EPO-O 084 796 beschrieben ist.

Unabhängig von der Methode, mit der die Proben gewonnen wurden, muß jede Probe auf ihre Brauchbarkeit im Testverfahren hin beurteilt werden.

Identifizierung brauchbarer Proben

Um die Wirksamkeit einer bestimmten Probe aus der Probensammlung zu beurteilen, die nach obigem Verfahren erhalten wurde, wird die DNA von vier verschiedenen Individuen isoliert und getrennt mit einer Restriktionsnuklease gespalten. Diese DNAs v/erden in einem Agarosegel elektrophoretisiert, wobei eine Mischung eier DNAs von dreien der Indivuduen in einer üpur und ein Aliquot der DNA des vierten

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Individuums in einer benachbarten Spur laufen. Die elektrophoretisierten DNAs werden wie vorher beschrieben auf Nitrocellulose übertragen. Einzelsträngige DNA wird von einem einseinen Klon isoliert, der aus der Gruppe von Klonen ausgewählt wurde, die mögliche Probe-DNA enthalten, und die nach obigem Verfahren gewonnen wurden. Die Probe-DNA wird markiert und mit der elektrophoretisierten DNA der vier Individuen hybridisiert. Wenn die getestete Probe mehr Banden in der Spur mit den DNAs der drei Individuen ergibt als in der Spur mit der DNA des einen Individuums, ist sie ein Kandidat für das Aufspüren von Polymorphismen. Prober., die nach dem eben beschriebenen Verfahren identifiziert wurden, werden weiter geprüft durch Hybridisierung gegen eine ausreichend große Population von TestIndividuen, um das Ausmaß des Polymorphismus sicher festzustellen. Proben, die Regionen mit mindestens vier Allelen entsprechen, welche in der Population mit Häufigkeiten von jeweils mehr als 10$ vertreten sind, werden in den Test einbezogen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird

eine Sammlung von polymorphen Proben eingesetzt anstatt sich auf eine einzelne polymorphe Probe zu verlassen. Dieser Gebrauch vielfacher Proben erhöht die Sensitivität des Tests beachtlich. Wenn z.B. 10 Proben eingesetzt werden und jede Probe identifiziert eine polymorphe Hegion, die aus acht gleich häufigen Allelen besteht, können etwa 1 Mil lion Individuen sicher identifiziert werden.

Zu den Parametern, die beurteilt uerden, ivenn eine bestimmte Probe für die Aufnahme in die Sammlung ausgewählt wird, gehört der Grad des Polymorphismus. Darunter versteht man die Anzahl der Allele und die Häufigkeit, mit der die AlIe-Ie in der zu prüfenden Population vorkommen. Die bloße Existenz einer großen Allelzahl, z.B. 60, auf einem bestimmten Proben-Locus allein recht nicht aus, um sicherzustellen, daß eine Probe brauchbar ist, wenn z.B. 99,9^ der

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zu prüfenden Population ein Allel aufweisen und die übrigen 0,1$ sich in die restlichen 59 Allele teilen. Daher verdient die Häufigkeit des Auftretens der verschiedenen Allele wesentliche Beachtung.

Die Anzahl individueller Proben in einem Probensatz kann sehr groß sein (100 oder mehr) ,-praktische Grenzen schränken die Zahl auf 1 bis etwa 40, besser, noch 1 bis etwa 20 ein.

Die Allelzahl pro polymorphen Genlocus kann groß sein, von 2 bis etwa 60 oder mehr, besser jedoch 2 bis ungefähr 40. Günstigenfalls kommen die Allele mit ungefähr gleicher Häufigkeit vor.

Autoradiorrraiphie

Das Hybrid wird durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Probe-DNAs werden vor der Hybridisierung mit einem radioaktiven Isotop markiert, gewöhnlich mit ^ p. Eine spezifi-

sehe Aktivität von etwa 10 Impulsen pro min pro ug DNA ist nötig und das erfordert normalerweise die Markierung mit mindestens zwei radioaktiven Nucleotiden (dTTP und dCTP 400 Ci/ mM). Die Position der radioaktiven, hybridisierten Probe wird durch bekannte Verfahren festgestellt, bei denen ein Film der radioaktiven Strahlung ausgesetzt wird. Die radioaktiven Hybride bilden sich somit selbst ab; daher der Ausdruck Autoradiographie.

Obwohl Autoradiographie ein bekanntes Verfahren zur Positionsbestimmung radioaktiver Hybridmoleküle ist, wird die Erfindung nicht beschränkt auf diese besondere analytische Methode. Die interessierenden Hybride können mittels Q^e(ies geeigneten, analytisch nachweisbaren Reagens aufgespürt v/erden. So eignen sich z.B. Eluoreszenznachweis, kolorimetrische Reaktionen, immunologische Reaktionen, oder Enzyme oder andere protein-markierte Reagenzien ebenfalls für den Nachweis hybridisierter Proben.

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Beispiel 1

Dieses Beispiel beschreibt die DNA-Isolierung aus peripherem menschlichem Blut. Auf diese V/eise isolierte DM eignet sich für die Beurteilung von Probe-DNA.

10 bis 20 ml peripheres Blut v/erden gesammelt, wobei EDTA als Antikoagulans verwendet wird (Blut kann gleich weiterverarbeitet oder bei -70⁰C eingefroren v/erden).

Das Blut wird in ein 50 ml Gefäß gefüllt und ein gleiches Volumen Lysis-Puffer (1 mM MgCl₂; 1 mM NaH₂PO₄, pH 6,5; 0,8$ Konidet P-4-0; 0,4$ Na-Desoxycholat) zugefügt. Das Röhrchen wird 25 bis 50 njal gewendet, um gut zu mischen.

Die Mischung wird in ein 50 ml Sorvall-Röhrchen aus Kunststoff gegossen und in einem SW 34 Rotor mit 10.00 üpm (12.000 xg) 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Pellet in 10 ml TNE suspendiert (10 mM Tris, pH 8,3; I50 mM NaCl; 5 mM EDTA). Durch kräftiges Schütteln des Röhrchens löst man das Pellet auf* Man fügt 1,5 ml 10$ SDS (Endkonz. 1$) zu und wendet das Gefäß mehrmals. Man versetzt mit 3 ml 5 M NaClO^ (Endkonz. 1,0 M) und mischt. Dann fügt man ein gleiches Volumen eines ChIoroform-Isoamylalkohl-Gemisches (24:1) dazu und schüttelt das Röhrchen 15 Minuten mit .350 Upm in einem New Brunswick Rundschüttler. Durch 10 Minuten Zentrifugieren mit 3-000 Upm in einer Damon Zentrifuge trennt man die Phasen.

Die wäßrige (obere) Phase wird mit einer umgedrehten 10 ml Pipette (ohne Watte) abgehebert (man kann auch eine siliconisierte Pasteur-Pipette verwenden) und in ein neues 50 ml Röhrchen übergeführt. Die organische (unter^ Phase wird verworfen, ein gleiches Volumen Chi:IAA (24:1) wird zugefügt, und wie vorher extrahiert und getrennt. Die Extraktion wird so oft wiederholt, bis die Grenzschicht nach der Phasentrennung klar ist. Dies erfordert gewöhnlich 3 bis 5 Extraktionen.

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Die wäßrige Phase der letzten Extraktion wird in einen Kunststoff becher überführt. 2 bis 2,5 Vol. 95% Äthanol von -2O°C werden zugegeben, indem man es langsam an der Wand ablaufen läßt, wodurch sich zwei Phasen ausbilden; die wäßrige DNA-Phase unten und Äthanol oben. In dieser Lösung dreht man einen sauberen, trockenen Glasstab, bis die beiden Phasen vermischt sind. Die DNA fällt an der Grenzschicht zwischen wäßriger Phase und Äthanol aus und sammelt sich am Stab. Nachdem sich die beiden Phasen vermischt haben, wird der Glasstab entfernt und 10 Minuten an der Luft getrocknet.

Der Stab wird in ein 15 ml-Röhrchen gesteckt und mit Parafilm verschlossen. Kit einer 18 gauge-Nadel werden drei Löcher in den rarafilm gestochen und die Probe 20 Minuten lang ge-trocknet. Man entfernt den Parafilm und fügt 0,5 bis 1,0 ml 0,01x333 (1,5 iM JIaCl; 0,15 mM EDTA, pH 7,0) hinzu. Das Material wird verschlossen und über Nacht bei 4°C auf einem Arnes-Schüttler suspendiert.

Die DNA-Menge in der Suspension wird ermittelt, indem man die O.D. einer 1/20-Verdünnung des Materials mißt. 25 jul der DNA-Suspension werden in 4-75 jul destilliertes V/asser pipettiert, in eine Küvette überführt und die O.D. bei 260, 270 und 280 bestimmt, wobei eine mit 0,01xSSE gefüllte Küvette als Referenz verwendet wird, die bei ^eder Wellenlänge auf Null gestellt wird. Die DNA-Konzentration in der Suspension in mg/ml Qug/jul) ist gleich dem Meßwert einer 1/20-Verdünnung bei O.D. 260, da die O.D. 260 von 1,000 einer Konzentration von 50 jug/ml entspricht. Eine Verdünnung wird hergestellt, um die O.D. 260 zwischen 0,100 und 1,000 zu halten; in diesem Bereich besteht eine lineare Korrelation zwischen DNA-Konzentration und O.D. 0.D-Meßwerte über 1,500 sind ungenau. Der Quotient O.D. 260/280 sollte 1,8 oder größer sein und gibt die Menge an Proteinverunreinigung an.

Die folgenden O.D.-Werte wurden z.B. von 0,5 ml einer 1/20-Verdünnung einer DNA-Suspension von peripherem Blut ermittelt:

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Γ - 22 -

260 270 280 260 260 Konzentration

"ΊΤΰ T8U

0,550 0,280 0,190 T,25 1,84 0,35 με/jul

0,350 χ 50 ,us/ml χ 20 = 350 jug/ml = 0,35 /Ug/μΐ

Beispiel 2

Dieses Beispiel beschreibt eine Methode zur Gewinnung von menschlichen DNA-Proben.

A. Mes'senger-RNA-Isolierung

1. Zwischen 10'-10 menschliche.. Zellen werden in 2 ml eiskalter Ringer-Lösung suspendiert und bei 2.000xg 5 Minuten

lang bei 4-⁰C zentrifugiert.

2. Der überstand wird abgehebert und die Zellen in eiskaltem Lysispuffer suspendiert. Der Puffer besteht aus:

0,14 M NaCl
1,5 mM HgCl₂ 10 mM Tris-Cl pH 8,6 0,5$ NP-40
1,000 units/ml RNasin (Biotec)

3- Die Suspension wird 10 Sekunden lang mit einem Vortex-Mixer gemischt, dann mit einem gleichen Volumen Lysispuffer unterschichtet, welcher Sucrose (24% w/v) und Λ% NP-40 enthält, und 5 Minuten auf Eis gehalten.

4.'Die Suspension wird bei 10.000xg 20 Minuten bei 4°0 in einem Schwingbecherrotor zentrifugiert.

5. Die trübe obere (zytoplasmatische) Schicht wird gewonnen und ein gleiches Volumen 2xPK-Puffer zugefügt. 2XPK-Puffer: 0,2 M Tris-Cl pH 7,5

25 mM EDTA 0,3 M NaCl 2# S.D.S.

Anschließend wird Proteinase K in einer Endkonzentration von 200 ,ug/ml

inkubiert.

200 ,ug/ml zugefügt und die Suspension 30 Minuten bei 37°C

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6. Die Schicht wird dann einmal mit Phenol/Chloroform extrahiert und die wäßrige Phase gewonnen. Diese versetzt man mit 2,5 Volumen Äthanol und hält sie für mindestens 2 Stunden bei -2O⁰C.

7. Die Fraktion wird 10 Minuten mit 5.000xg "bei 0⁰C zentrifugiert und das Pellet mit 75$ Äthanol gewaschen, welches 0,1 M Natriumacetat enthält.

8. Die Nukleinsäuren werden in einem kleinen Volumen (ca. 50 μΐ) des folgenden Puffers gelöst:

50 mM Tris-Cl pH 7,5

1 · iM EDTA

9. Zu der resuspendierten Fraktion fügt man MgCl₂ (Endkonz. 10 πΙΊ) und 2.OCO Einheiten/ml RNasin (Biotec). Die Suspension wird dann 50 Minuten bei 37°C inkubiert.

10. Nach der Inkubation werden EDTA (Endkonz. 10 mM) und SDS (Endkonz. 0,25») zugefügt.

11. Die Suspension wird mit Phenol/Chloroform extrahiert, Natriumacetat (pH 5,2) zugefügt (Endkonz. 0,3 M) und die Nukleinsäuren mit Vol. Äthanol gefällt.

12. Die RNA wird in 70$ Äthanol bei -70⁰C aufbewahrt.

B. Selektion von pol?;· A⁺-RNA

1. Oligo (dT)-Cellulose wird in sterilem 2x Auftragungspuffer equilibriert. Der Puffer besteht aus 40 mM Tris-Cl pH 7,6

1 M NaCl

2 mM EDTA
0,2% SDS

2. Die Oligo (dT)-Cellulose wird in eine 1 ml-Säule gefüllt und mit jeweils drei Säulenvolumen folgender Lösungen gewaschen:

a) steriles Wasser

b) 0,1 M NaOH/5 mM EDTA

c) steriles Wasser

3. Der pH-Wert des Durchlaufs sollte kleiner als 8,0 sein.

L J

4. Die Säule wird dann mit 5 Vol. Auftragungspuffer gewaschen.

5. Die in Schritt A isolierte RNA wird in sterilem E^O gelöst und 5 Minuten bei 65°C erhitzt. Ein gleiches Volumen von 2 χ Auftragungspuffer wird dann zugefügt und die Lösung auf Zimmertemperatur (ca. 25°C) abgekühlt.

6. Das Material wird auf die Säule aufgetragen und der Durchfluß gesammelt. Der Durchfluß wird dann auf 65°C erhitzt, abgekühlt und erneut auf die Säule aufgetragen.

7· Die Säule wird dann mit 5-10 Vol. Auftragungspuffer gewaschen, anschließend mit 4- Vol. Auftragungspuffer, der 0,1 M NaCl enthält.

8. Fraktionen werden gesammelt und die O.D. 260 bestimmt. Die Anfangsfraktion wird poly(A)~RNA in hoher Konzentration enthalten, während spätere Fraktionen nur geringe Mengen, oder gar kein Material enthalten, welches bei 260 absorbiert.

9. Die poly(A) ' Elia, wird aus der Säule mit 2-3 Vol. folgender steriler Lösung eluiert:

10 mM Tris-Cl pH 7,5 1 mM EDTA

0,05$ SDS

10. Dem Eluat werden Na-acetat (3 M, pH 5,2) in einer Endkonzentration von 0,3 M und 2,2 Vol. Äthanol zugefügt.

11. Die RAN wird bei 0⁰G mit 5.000xg 10 Minuten zentrifugiert.

12. Das Pellet wird in Wasser gelöst. (10' Zellen ergeben 1-5/-ug PoIy(A)⁺RNA).

C. Synthese des ersten DNA-Stranges 1. Die unten genannten Reaktionsbedingungen gehen von einer Anfangsmenge von 50 /ug poly(A) mRNA aus. Für Mengen, die größer oder kleiner als 50 /Ug sind, muß die Reaktionsmischung proportional verändert werden.

2. Die Reaktionsmischung besteht aus: 35

L j

- 25 -

10 15 20 25 30 35

Reagens	zuzufügende Menge	Endkonzentration
1o mM dATP	25 ul	500 ,uM
10 mM dGTP	25 ,ul	500 /uM
10 mM dTTP	25 /ul	500 /uM
2 mM dCTP	25 μΐ	100 juM
5 X Reverse Trans-
criptase Puffer
250 mM Tris 8,2;		50 mM Tris
250 mM KGl; 30 mM		50 mM KCl;
MgCi2	100 μΐ
200 ZLbI DT1Z?	25/ul	10 mM
PoIy(A) πΞ2ίΑ	(50 /Ug)
RNasin (Biotec)
Placenta- RNase
Hemmstoff	5 ./ul
Avian mjleoblastosis
Virus reverse
Transcriptase	20 /ul	300 μ/ml
Oligo(dT) 12-18
600 /ug/ml	37,5 /ul	45 ug/ml

32

p-dGTP

dest

1-10 uGi/500 μΐ

Reaktion bis zum Endvolumen: 500 μΐ

3. Die Reaktion wird in einem siliconisierten 1,5 ml Eppendorf-Gefäß durchgeführt und durch Zugabe der mRNA gestartet.

4. Die Reaktionsmischung wird bei 42⁰C 60 Minuten inkubiert, dann werden 10 pil 5OO mM EDTA zugefügt, um die Reaktion zu stoppen.

5. 1 ,ul der Reaktionsmischung v/ird mit TCA gefällt und die Radioaktivität gemessen, um die Ergiebigkeit der Synthese des ersten Stranges zu bestimmen. Im allgemeinen wird eine Ausbeute von 17-25# erreicht, selten kommt man auf 4-0$.

6. lOjiCi von '^il"p-dCTP/500 .ul ergeben eine spezifische Aktivität von 2,2x10 Ipm/jug einzelsträngiger DNA. Diese

spezifische Aktivität erlaubt den Umgang mit dem Produkt im folgenden Schritt, ohne zu viel von der cüNA zu vergeuden. 7. Die Probe wird zweimal mit einem gleichen Volumen Phenol extrahiert, welches mit 50 mM Tris pH 8,0 gesättigt ist. 8. Das Phenol wird zweimal mit gleichem Volumen Äther extrahiert. Danach wird 3 M Na-Acetat zugefügt (Endlconz. 0,3 M)· 9· Drei Vol. 95$ Äthanol werden zugefügt, die Mischung für 5-10 Minuten auf Trockeneis-Äthanol gestellt und dann auf Zimmertemperatur erwärmt.

10. Die Mischung wird in einer Microfuge 15 Minuten zentrifugiert. Danach wird der Überstand verworfen und das Pellet mit 75£ Ethanol gewaschen.

11. Die DiJA wird in 0,5 ml 300 mM Na-Acetat gelöst. Die Schritte 9 und 10 v/erden wiederholt.

12. Die DNA wird in 200 μΐ dest. Wasser suspendiert, auf einen 5-20$ alkalischen Sucrosegradienten (30 mM NaOH, 2 mM EDTA) geschichtet und 40 Minuten in einem SW-4-0 Rotor mit 37.000 Upm bei 4⁰C zentrifugiert. 13· 0,5 inl-Frakt ionen des Gradienten werden von oben her gesammelt und jede Fraktion mit 25 /ul 1 M Tris pH 6,8 versetzt und die Impulse gezählt.
14. Von jeder Fraktion wird ein Quantum entnommen, das 5.000 bis 10.000 Impulsen/min entspricht, und auf einem alkalischen Agarosegel elektrophoretisiert. Das erlaubt die Abschätzung der Größenverteilung, Im allgemeinen werden Fraktionen, welche cDNA von weniger als 500 Nukleotiden haben, verworfen. Fraktionen, welche besonders nützlich sind (d.h. mindestens 500 Nukleotide lang), erhält man gewöhnlich bei Fraktion 12 vom Boden des Zentrifugenröhrchens aus. Daher werden, während die Gelelektrophorese läuft, die Fraktionen 1-10 (einschließlich des Pellets) vereinigt und gegen 2 Liter Wasser dialysiert. Die Fraktionen 11, 12, 13 und 14 werden ebenfalls', jedoch getrennt, dialysiert. Das Gelmuster zeigt an, ob weiteres Vereinigen von Fraktionen notwendig

ist oder nicht. Im allgemeinen macht das Material, welches größer als 500 Jiukleotide ist, 60$ der TCA-fällbaren Impulse aus.

L J

Die SS cDNA wird mit sec-Butanol auf ein Volumen von 400 _;ul eingeengt. Anschließend wird das Butanol mit Äther extrahiert.
16. Dem Extrakt werden 40 ₍ul 3 M Na-Acetat zugefügt und das restliche Volumen des Röhrchens mit 95$ Äthanol aufgefüllt. Dann wird 5 Minuten auf Äthanol-Trockeneis gefällt, anschließend das Röhrchen in einen wassergefüllten Schwingbecher des SW-27 Rotors gestellt und mit 25.000 Upm 60 Minuten zentrifugiert.

17· Das Äthanol wird dekantiert und gezählt. Das Äthanol soll weniger als 1$ der Impulse enthalten. Das Pellet wird mit Äthanol gewaschen und die Waschflüssigkeit ebenfalls gezählt; diese soll weniger als Λ% der Impulse enthalten. Alle Inipulse sollen im Pellet verbleiben, welches 10 bis 20 Minuten lyophilisiert und dann in 100 al Wasser suspendiert wird.

D. Synthese des zweiten DNA-Stranges mit Klenow-IPragment 1. Die unten aufgeführte Reaktionsmischung ist für 1 ml Reaktionsansatz bei einer Konzentration von 2 bis 5 jUg/ml ss cDEA. berechnet.

Reagens

zuzufügende Menge	Endkonzen tration
50 /ul	500 juM
100 /ul	70 mM
100 /ul	0,5 mM

25 10 mM dATP, TTP, CTP, GTP 700 mM KCl

5 mM Mercaptoäthanol (1,8 μΐ der Stammlösung Eastman (14 M) zu 5 ml 30 H₂O um 5 mM zu erhalten)

10 χ Klenow Puffer 100 /ul 30 mM Tns

300 mM Tris pH 7,5 ^ mM MgCl₂

40 mM MgCl₂ Klenow Polymerase

Boehringer-Mannheim 150-200 Einh./ml

SS cDNA 2,5 .ug

dest. HpO Endvolumen

1000 /ul L J

2. Die Reaktion wird 5-6 Stunden bei 18-20⁰G inkubiert.

3. Die Mischung wird zweimal mit Phenol-Tris pH 8 und Äther extrahiert.

4. Ein Aliquot (2-10.000 Ipm) wird für die Gelanalyse aufbewahrt.

5. Der restliche Extrakt wird über Nacht in einer Kollodiumhülse gegen Wasser dialysiert.

E. S1-Reaktion

1. Das Volumen der Klenow-Reaktion des Schritts D vergrößert sich während der Dialyse auf 5-6 ml. Das Volumen wird auf den nächsthöheren ganzen Milliliter mit destilliertem Wasser eingestellt und ein 1/10 Vol. 10x31-Puffer zugefügt:

3 M NaCl

0,3 H Ka-Acetat pH 4,5
100 mM ZnCl₀

2. S1-Nuklease (Sigma) wird zugefügt (Endkonzentration 10 Einheiten/ml) und bei 37°C 30 Minuten inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 500 mM EDTA zu einer Endkonzentration von 100 mM gestoppt. Ein Aliquot wird für die Gelanalyse aufbewahrt.

3. Die Reaktionsmischung wird zweimal mit Phenol und zweimal mit Äther extrahiert. Anschließend wird der Extrakt 5-6 Stunden bei Zimmertemperatur gegen Wasser mit mindestens einem Wasserwechsel dialysiert und dann mit sec-Butanol auf 400 /ul eingeengt.

4. Das Material wird auf einen neutralen 5-20% Sucrosegradienten (0,1 M NaCl, 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA) aufgetragen und mit 37.000 Upm im SW-40 Rotor 20 Stunden bei 4°C zentrifugiert.

5. 0,5 ml-Fraktionen werden von oben gesammelt. Die Fraktionen 1-14 enthalten ds cDNA von ca. 5OO Basenpaaren Länge. Die Größenverteilung wird durch Gelelektrophorese bestimmt.

6. Die Fraktionen werden ausgiebig über Nacht gegen destilliertes Wasser dialysiert.

L j

- 29 -

7· Das Material wird mit sec-Butanol auf ca. 400 ul eingeengt und mit Na-Acetat und Äthanol zweimal gefällt. Bas Pellet wird jedesmal mit 75$ Äthanol gewaschen. Die DNA muß frei von Kontaminationen sein.

8. Die ds cDNA wird nun lyophilisiert.

ff. Tailing-Reaktion

1. Die unten genannten Reaktionsbedingungen gelten für 1 /Ug ds cDNA und können nach oben und unten entsprechend angepaßt werden.

Stannicsungen: 50 uM dCTP 10 mM CoCl₂

£;cCacodvlat-Puffer: 250 ul

Reagens

2X Cacodylat-Füffer cDHA (50 ng/ul) ₂₀ 50 μΜ dCTP 20 pM CoCl₂*

250	ul	1,2	M Na-cacodylat, pH 7,19	ul
		mit	HCl	μΐ (lug)
250	/ul	1 mli DDT	iul
750	/ul	H2O	/ul
			ul
		zuzufügende Men~?e	μΐ
		200	μΐ (760 n/ml Sadkonz.)
		20
		4-0
'.Tel-	es B3A	20
		8
		68
44

TdT (Bethesda Res.Lab)

^M~ CoCl wird kurz vor dem BSA zugefügt, ansonsten fällt es aus.

2. Die Reaktionsmischung (-TdT) wird 20 Minuten bei 2Q⁰C inkubiert.

3. Dann wird TdT zugefügt und die Inkubation für weitere 20 Minuten fortgesetzt.

4. Die Reaktion wird durch Zugabe von 8 /ul 500 mM EDlA gestoppt und dann jeweils zweimal mit Phenol und anschließend Äther extrahiert.

5. Das Material wird wie oben mit Na-Acetat und Äthanol im SW-27 Rotor gefällt.

6. Das Pellet wird mit 75% Äthanol gewaschen, lyophilisiert und in 50 ul destilliertes Wasser gelöst.

G. Verknüpfung der terminal verlängerten cDNA mit Plasmid-dG

1. Die Verknüpfungsreaktion, wird in verschlossenen 10 jul-Kapilarröhrchen durchgeführt.

2. Die Reaktionsmischimg enthält:
ds cDM 1 jul (5 ng)

Plasinid 1 μΐ (20 ng)

1OxVerknüpfungspuffer:

1 Μ NaCl

100 ml«! Tris pH 7,5

10 mM SDO)A
dest. V/asser 7 ul

3. Die Mischung wird 8 Minuten bei 68⁰G, dann 2 Stunden bei 42°C inkubiert. Nach dieser Zeit wird das Wasserbad abgeschaltet, damit sich das Reaktionsgemisch auf Zimmertemperatur einstellt (5 Stunden - über Nacht).

Beispiel3

Dieses Beispiel beschreibt die Methoden der Identifizierung von Proben, welche für den Nachweis von Polymorphismen beim ²^ Menschen geeignet sind.

1. DNA wird vom peripheren Blut von vier verschiedenen Menschen, wie im Beispiel 1 beschrieben, isoliert.

2. Die vier DNA-Proben werden getrennt mit dem Restriktionsenzy. EcoRI nach folgender Vorschrift gespaltet.

a) Die folgenden Komponenten werden in ein 1,5 ml Eppendorf-Gefäß pipettiert:

(1) 10 jug DNA (gewöhnlich zwischen 10 ul und 50 /ul der Lösung).

(2) Destilliertes Wasser, falls nötig, um das Endreaktionsvolumen einzustellen.

(3) Die entsprechende Menge des speziellen 5x Endonuklease-Puffers, der nach der Vorschrift des Herstellers angesetzt ist.

Restriktionsnuklease in 1,5 "bis 2,5-fachem Überschuß, d.h. 15-25 Einheiten für eine 10 jug-Spaltung.

"b) Die Mischung wird 1-2 Sekunden auf dem V ort ex-Mi scher behandelt oder man schnippt das Gefäß mehrmals mit dem Finger, um zu mischen.

c) Die Mischung wird 10-15 Skunden in einer Eppendorf-Mikrosentrifuge zentrifugiert, um Reaktionsprodukte zu pelletieren.

d) Bas Feilet wird 2-16 Stunden bei 37°C inkubiert.

e) Die Reaktion wird, um sie für künftige Elektrophorese aufzubewahren, gestoppt durch Zugabe von

(1) 1/10 VoI. 0,1 M EDTA, pH 7,0; Endkonz. 10 mM

(2) 1/10 Vol. 5:i SDS; Endkonz. 0,556.

(5) 1/10 Vol. 3 M NaCl oder 3 M Na-Acetat; Endkonz. 0,3 M. W 2-2,5 Vol. kaltes 95# Äthanol; Endkonz. etwa 70$. 20

Die Probe kann bei -20⁰C bis zu mehreren Monaten aufbewahrt v/erden.

Die Proben können schnell gefällt werden, indem man das Eppendorf-Gefäß mit der verdauten DNA, den Stoppreagenzien und dem Äthanol in ein Trockeneis-Äthanol-Bad stellt. Dies geschieht für 2-5 Minuten je nach Volumen, bis das Äthanol viskos wird. Die Proben sollten jedoch nicht gefrieren. Die Probe wird

zum Pelletieren in der Mikrofuge zentrifugiert. 30

f) Um die Reaktion zu stoppen, fügt man 5x Ficoll-Markierungsfarblösung zu einer Endkonzentration von 1x zu. Dies geschieht mit Proben, deren Endvolumen kleiner als 75 sind. Die Proben sollen unmittelbar nach der Verdauung auf ein Gel aufgetragen werden.

L J

Γ - 32 - ::.---;■■ "I

g) Eine typische Reaktionsmischung wird wie folgt angesetzt:

lQmqDNÄ H₃O 5x buffer EcoRI 0.IM 5% 3M 95% 5p/ul EDTA SDS NaCl EtOH 2Q/al 16/al ΙΟμΙ 4μ1 6.25μ1 6.25μ1 7.0ul 14.0ul

und für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. EDTA, SDS₁NaCl und Äthanol werden wie angegeben zugefügt. Das Gemisch kann bei -20⁰C aufbewahrt werden, oder man fügt 12,5 iul 5x Mcoll-Markierungsfarbstoff zu und trägt auf ein Gel auf.

3. Die DHAs werden wie im Beispiel 2 elektrophoretisiert, indem je 5 ^g der DNAs von dreien der Probanden in einer Spur und 5 Mg der DNA des vierten Individuums in einer benachbarten Spur aufgetragen werden.

4·. Die elektrophoretisierten DNAs werden dann nach dem folgenden Verfahren übertragen:

a) Die DNA wird im Gel denaturiert, indem man das Gel in eine flache Schale (runde Pyrex, 190x100 mm) überträgt, welche 250 ml 1M KOH, 0,5 M NaCl enthält, und mit 2 00 Upm bei Zimmertemperatur auf einem New Brunswick Kreisschüttler schüttelt. Dies dauert von 25 Minuten für ein 0,8$ Gel bis 30 Minuten für ein 1,2$ Gel.'

b) Vorgeschnittene Nitrocelluloseblätter (9,5x15 cm) werden in 2ÖO-3OO ml Wasser gelegt und gründlich angefeuchtet.

c) Die Lösung wird dekantiert und aufbewahrt (die KOH-NaCl-Lösung kann benutzt werden, um bis zu 10 Gele zu denaturieren). Das Geld wird mit destilliertem Wasser (200-300 ml) gespült. Das Spülwasser wird mit einer Pasteur-Pipette entfernt. 250-300 ml 1 M Tris, pH, 7,0 werden zugefügt und das Schütteln bei Zimmertemperatur mit 50 Upm 35 Minuten fortgesetzt.

L J

d) Das Gel wird neutralisiert, indem man abgießt, 250-300 ml 1M Tris pH 7,0 zufügt und 30 Minuten weiterschüttelt. Die Tris-Lösungen v/erden aufbewahrt und mit konzentrierter HCl bis zu 10 mal wieder auf pH 7,0 eingestellt.

e) Wahlweise wird das Gel dekantiert, 250-300 ml 1 M Tris, pH 7,0 zugefügt und weitere 25 Minuten geschüttelt.

f) Das gesamte Tris wird abgegossen und mit einer Pasteur-Pipette entfernt. Das Gel wird equilibriert, indem man

6xS3C (Ix = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na-Citrat) zufügt und 20 Minuten schüttelt.

g) Das destillierte V/asser wird von der Nitrocellulose abgegossen und 100-200 ml 6xSSC zugefügt.

h) Man gießt 600-700 ml 6xSSC in eine Pyrex-Schale (28x18x4) cm). Ein Docht aus zwei Streifen Whatman 3 M-Papier (15,5^38 cm) wird in der 6xSSC-Lösung angefeuchtet. Ein Plastikträger (18,5x19x1 cm) wird in die Mitte der Schale gelegt und der Whatman 3 M-Docht wird so über die Mitte des Trägers gelegt, daß jedes Ende in die 6xSSC-Lösung eintaucht.

i) Das Gel wird von seinem Gefäß auf den Docht übertragen, wobei man Handschuhe benutzt. Das Gel wird mit handschuhgeschützten Fingern gestrichen, um sicheren Kontakt zwischen Docht und Gel zu gewährleisten.

ö) Die vollgesogene Nitrocellulose (Schleicher & Schüll, Keene, N.H.) wird auf das Gel gelegt und über den Spuren zentriert, welche übertragen werden sollen. Durch Reiben mit den geschützten Pingern stellt man den Kontakt zwischen Gel und Nitrocellulose her und vermeidet das Auftreten von Luftblasen. Gelpartien, die nicht übertragen werden sollen, werden abgeschnitten und verxvorfen. Drei

L J

Γ - 34 - ^π

1 ml-Pipetten werden an jede Seite des Gels gelegt, um Kurzschlüsse zu vermeiden. Ein Blatt Whatman 3 M (15?5x 9,5) wird angefeuchtet und auf die Nitrocellulose gelegt. Ein weiteres trockenes Blatt Whatman 3 M von ähnlichem Format wird darübergelegt. Etwa 10 cm von 10,5x12 cm

großen, braunen Tüchern . (Nr. 237 Singlefold

Garland Sof-Knit Towels; Fort Hov/ard Paper Company, Green Bay, Wis. 54035) werden auf das Gel gestapelt. Das Ganze wird mit Plastikfolie bedeckt, die eng um die Schale gezoger, wird. Die Vorrichtung wird 12-20 Stunden bei Zimmertemperatur belassen* Dei* Plastikträger wird wegen des Gewichts nach oben gelegt.-

k) Pie 'Tücher (einige der oberen können noch trocken sein) werden zusammen mit den beiden Blättern Whatman 3 M entfernt, wodurch die Nitrocellulose-Folie freigelegt wird. Mit einer neuen Rasierklinge schneidet man das Nitricellu lose-Blatt in drei Streifen, welche 2 oder 3 Spuren mit DNA tragen (2 Spuren, wenn ein 8-Spuren-Tragformer verv/endet wurde, und 3 Spuren mit dem 10-Spuren-Tragformer). Die untere linke Ecke von jedem Streifen wird zur Kennzeichnung der Orientierung,eingekerbt. Dann markiert man die richtigen Streifen am Boden durch ein, zwei oder drei löcher zur Identifizierung. Nach dem Trocknen der Strei-' fen können sie mit einem Markierungsstift gekennzeichnet werden.

1) Man legt die Streifen in 250 ml 2xSSC in eine Schale. Jede Seite der Streifen wird mit handschuhgeschützten Fingern gerieben, um Agarosereste zu entfernen. Die Strei fen werden auf Whatman No. ;1 Filterpapier gelegt und für 10 bis 20 Minuten luftgetrocknet. Dann werden die Streifen zwischen zwei Blätter Whatman 3 Μ—Papier gelegt und in Aluminiumfolie eingewickelt. Die Außenseite wird mit einem Markierungsstift gekennzeichnet und kann unter Vakuum im Exsiccator bis zu 6 Monate aufbewahrt werden.

L J

5- Der Stamm E. coli MC 1061 mit rekombinanten Plasmiden wird in 100 ml L-Broth aus einer Einzelkolonie der nach Beispiel II hergestellten Genbank angezüchtet und die Plasniid-DNA nach folgender Methode isoliert:

a) Die Zellen werden mit 5-000 Upm 5 Minuten bei O⁰C zentrifugiert.

b) Die Zellen werden mit 1/4- Vol. TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EIXDA pH 8) bei O⁰C gewaschen.

c) Die Seilen werden in 3 ml 25$ Sucrose, 0,05 M Tris-HCl pH 7,5 bei 0 C resuspendiert, dann werden 0,3 ml Lysozym (IG ng/sl in 0,25 H Tris-HCL, pH 7,5) zugefügt. Anschließend inkubiert man unter gelegentlichem sanftem Aufwirbeln 5 Minuten auf Eis.

d) 1,2 ml von 250 mM EDTA pH 8 werden zugefügt und die Inkubation auf Eis für 5 Minuten fortgesetzt.

e) Man fügt ²J-S ml Triton-Lösung zu:
2 ml 10$ Triton X100 (Sigma)

50 ml 250 mM EDTA pH : 8
135 ml H₂O
und inkubiert für v/eitere 10 Minuten auf Eis.

f) Die Mischung wird 30 Minuten mit 25.000 Upm bei O⁰C zentrifugiert.

g) Der Überstand wird entfernt und das Volumen auf 8,7 ml eingestellt. Dann fügt man 8,3 g CsCl und 0,9 ml einer Ethidiumbromid-Lösung zu (10 mg/ml; Sigma Ε-815Ό- Der Brechungsindex sollte zwischen 1,390 und 1,396 liegen.

h) Die Probe wird mit 35-38.000 Upm bei 20°C 48 bis 72 Stunden lang zentrifugiert. Die Banden v/erden durch

L J

Γ - 36 - ^: Π

1 Beleuchtung des Zentrifugenröhrchenn mit langwelligem ultraviolettem Licht sichtbar gemacht.

~) Die untere Bande, welche die "supercoiled" DNA enthält, 5 wird entnommen, indem man das Röhrchen seitlich mit einer 21-gauge-Nadel ansticht. ;

6. Die rekombinanten Plasmide, bestehend aus pAT153 und menschlicher DNA,werden durch Nick-Translation mit * ^p nach 10 bekannten Methoden markiert ("A Manual for Genetic engineering. Advanced Bacterial Genetics" von Davis, R.W., Botstein, D. andRoth, J.R., 1980 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Ν.Ϊ., S. 168-170).

15 a) 20 /ill Wasser abzüglich dem Volumen der DNA-Lösung, die zugefügt werden soll, v/erden in ein Mikrofugen-Röhrchen pipettiert.

b) Dann werden 2,5 ml 0,5 M Tris pH 7,5, 0,1 M MgSO^, 10 mM 20 pTT, 500 ug/ml BSA zugefügt.

c) Nach Zugabe von 2,5 pl einer Lösung mit 0,2 mM von jedem dNTP werden 100 ng rekombinante pAT 153-menschliche DM aus Schritt 5 (siehe oben) "zugefügt.

d) Folgende DNase-Stammlösung wurde vorher hergestellt und bei -20⁰C aufbewahrt:

DNase 1 mg/ml in
50 mM Tris pH 7,5
30 10 mM MgSO₄

1 mM DTT und
50$ Glycerin.

e) Die DNase-Stammlösung von (d) wird bei O⁰C 1/40.000 in 35 50 mM Tris pH 7,5,10 mM MgSO^, 1 mM DTT und 50 /ug/ml BSA verdünnt. 0,5 ml der verdünnten DNase werden der Reaktionsmischung zugesetzt.

L -I

-52

f) 10 /ul von jedem ^J P-dNTP in wäßriger Lösung werden zugefügt.

g) Die gesamte Reaktion wird dadurch gestartet, daß man 0,1 /ul einer E. coli DNA-Polymerase I-Lösung (2 mg/ml) zusetzt und 3 Stunden bei 14⁰C inkubiert.

h) Durch Zugabe von 25 /ul 0,02 M Na^ EDTA, 2 mg/ml Träger-DNA

und 0,2$ SDS wird die Reaktion gestoppt. 10

i) Man trägt das Reaktionsgemisch auf eine 0,7x20 cm große Sephadex G-50 (mittel)-Säule auf, welche vorher mit 10 mM . iris, !Ta₃,-EDiDA bei pH 7₅5 (ΈΞ) equilibriert und damit gewaschen v/orden v;ar.
15

Ö) 0,5 ml-Proben des Eluats werden in Polypropylenröhrchen gesammelt. Die DNA erscheint nach 2 ml beim Waschen. Die Position der ^J P-markierten DNA wird mit einem Handmonitor festgestellt und der erste Peak wird gesammelt. Die nachschleppende Aktivität vernachlässigt man.

7- Die markierte Probe aus Schritt 6 wird gegen die auf Nitrocellulose übertragene Genom-DNA aus Schritt 4 nach folgendem Verfahren hybridisiert:

a) Man stellt 300 ml Prähybridisierungslösung folgendermaßen her:

1) 100 ml 3x PO₄ (0,75 H Na₃PO₄, 0,75 M NaH₃PO₄, 0,01 M Na-Pyrophosphat)

2) 90 ml 2Ox SSC (3 M NaCl, 0,3 M Na-Citrat) 3) 92 ml destilliertes Wasser

4) 15 ml 0,5$ BFP (je 0,5 g auf 100 ml von Rinderserumalbumin (BSA), Ficoll und Polyvinylpyrrolidon-360).

5) 3 ml ssDNA (5 ug/ul-Lösung von denaturierter Lachssperma-DNA). Die Lösung wird in einen Kunststoffbehälter (20x14,5x10,5 cm) mit Deckel gegeben und im Wasserbad auf 68⁰C erhitzt. Die Filter mit der zu hybridisie-

Γ - 38 - - - · Π

rencLen DNA werden hineingelegt und 4—6 Stunden bei 68⁰C inkubiert.

b) Zur Hybridisierung werden 3-4 Streifen um ein siliconi-

siertes Glasgefäß gewickelt und in ein Plastik-Szintillationsgläschen gesteckt, welches 2 ml der Hybridisierungslösung enthält. Um Nitrocelluloseblätter in Beuteln zu hybridisieren, füllt man eine geeignete Menge der Hybridisierungslösung ein und verschweißt den Beutel durch Erhitsen mit· einer Sears Versiegelungsvorrichtung (Folienschweißgerät). :

Die Hybriaisiertmgslösung für die Hybridisierung in einem Schraubgläschen (Szintillationsgläschen) wird folgendermaßen angesetzt:

(1) 80 ,ul 0,5p PS¹P

(2) 20 iul 0,1 M EDTA, pH 7,0

(5) 20 ,ul 10# SDS

(4) 20 ul 5 jug//ul ssDNA

(5) unterschiedliches Volumen ^ p-nick-translatierter Probe-DNA, so daß 2-4x10 Impulse/ml vorliegen.

(6) Unterschiedliches Volumen destilliertes Wasser, um auf 1900 ul einzustellen.

Man kocht die Lösung 12 Minuten und kühlt 7 Minuten lang auf Eis wieder ab.

(7) 100 μΐ 20x SSG
Gesamtvolumen 2.000 jul.

c) Pur die folgenden Tätigkeiten trägt man Handschuhe. Man entfernt die Streifen aus der Prähybridisierungslösung und wickelt die geeigneten 3-4 Streifen um ein siliconisiertes Glasgefäß (19x48 mm mit Verschluß) und führt es in ein Plastik-Szintillationsgläschen (28 mm Durchmesser) ein, welches die vorbereitete Hybridisierungslösung enthält.

Um den verschlossenen Deckel wickelt man Parafilm.

L ' J

Mehrmaliges leichtes Klopfen sorgt dafür, daß sich alle Filter am Boden des Gefäßes befinden. Man inkubiert die Filter 20-24 Stunden bei 68°C unter leichtem Schütteln (Stellung 3) in einem New Brunswick Rundschüttel-Wasserbad.

Zu beachten: Falls weniger als 3 Streifen vorhanden sind, um sie um das Gefäß zu wickeln, können noch ein oder zwei leere Streifen, welche prähybridisiert wurden, dazugenommen v/erden.

d) Die Filter werden in 2x SSG, 0,55» SDS folgendermaßen gewaschen: entsprechend der Zahl der zu waschenden filter werden 5-9 Liter V/aschlösung angesetzt. In einen gläsernen Säureballon sit einem Hahn am Boden füllt man (1) 500-9CC ±L 2Ox SSC

(2) $00-^50 nl 10# SDS

(3) 5-10G-7.650 destilliertes Wasser.

Man legt einer. Rührstab auf den Boden und taucht ein Thermometer von oben ein. Die Lösung wird unter Rühren auf einer Heizplatte auf 68°C erhitzt.

1-1,5 Liter Waschlösung werden in einem Kunststoffbehälter gesammelt. Die Filter werden nach der Hybridisierung (mit Handschuhen) entnommen und sofort in V/aschlösung gelegt. Mit Millipore Pinzetten rollt man die Filter auf und transportiert sie.

e) Die Filter v/erden in 1-1,5 Liter frische Waschlösung gelegt und 7-12 Minuten bei 68°C inkubiert. Die erste Waschlösung wird vorsichtig in den Ausguß geschüttet und mit

viel V/asser nachgespült.
30

f) Die Filter werden erneut in 1-1,5 Liter frische Waschlösung gelegt. Dies wird alle 7-12 Minuten wiederholt und die Inkubation bei 68°C fortgesetzt bis die gesamte Waschlösung verbraucht ist (^λΙ—7 Waschvorgänge).

g) Das letzte Mal wird in 1 Liter Waschlösung übertragen, die 0,1x SoC, 0,595 GD3 (945 ml dest. Wasser, 50 ml 1050 SDS, 5 ml 2Ox SSC) enthält und auf 68⁰G erhitzt wurde. Es wird 10 Minuten bei 68 C inkubiert.

h) Die Filter werden entnommen und in 500 ml 2x SSC bei Zimmertemperatur gespült. Man legt die Filter auf ein Blatt Whatman No.- 1 und trocknet sie 15-30 Minuten an der Luft.

i) Die 6 Streifen von zwei Gelen werden auf gelbes Papier einer Röntgenfilmpackung aufgezogen, gekennzeichnet, mit Plastikfolie bedeckt und in eine Kassette mit eingebauter Verstärkerfolie gelegt. In der Dunkelkammer wird die Kassette mit einen 8x10 inch X-Omat APl Röntgenfilm beschickt, Inders nan den Film zwischen die Nitrocellulose-Streifen und die Verstärkerfolie legt. Die Kassette wird verschlossen und in einen Tiefkühlschrank mit -70°C gelegt.

j) Der Röntgenfilm wird nach 24-48 Stunden entwickelt. Man ent-. . nimmt den Film aus der Kassette und entwickelt ihn in der Dunkelkammer bei Gelblicht. Die Kassette kann erneut beladen werden, wenn eine weitere Belichtung notwendig ist.

8. Wenn die getestete Probe in der Spur mit den DNAen der drei Individuen mehr Banden zeigt als in der Spur mit der DNA des einzelnen Individuums, kommt sie für den Nachweis von Polymorphismen in Frage.

9· Proben, die in Schritt 8 identifiziert wurden, werden weiter geprüft, indem man sie gegen eine größere Serie menschlicher DNAen hybridisiert, um zu bestimmen, in welchem Ausmaß die geklonte Region polymorph ist. Proben von Regionen mit mindestens vier verschiedenen Allelen, welche in der Population jeweils mit einer Häufigkeit von mehr als 10$ vorkommen, werden in den Vaterschaftstest oder den Test zur individuellen Identifizierung ■ einbezogen.

.... .. ..34Q7196

Beispiel4

Dieses Beispiel beschreibt die Durchführung und Auswertung eines Vaterschaftstests, bei dem die vorliegende Erfindung eingesetzt wird.

Λ. Von der Mutter, dem Kind und dem mußmaßlichen Vater werden Blutproben genommen und die DNA gereinigt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.

2. Diese DIiAs werden getrennt mit dem Restriktionsenzym EcoHI entsprechend Beispiel 3 gespalten.

3. Diese DiTAs v/erden, wie in Beispiel 2 beschrieben, elektropiicretisiert. Dazu werden ^e 5 /ug der DNAs der Mutter und des nutrüa.21icier Vaters in der einen Gelspur und 5 pg der DNA von .jedezi der drei Individuen in einer Nachbarspur aufgetragen.

4-, Die elektrophoretisierten DNAs werden auf Nitrocellulose übertragen, wie in Beispiel 3 beschrieben ist.

5. Ein Satz von "Vaterschafts-Probe"-DNAs wird gemäß Beispiel 3 mit ^ P markiert.

6. Die markierten Probe-DNAs von Schritt 5 werden mit den Genom-DNAs auf der Nitrocellulose aus dem Schritt 4 hybridisiert, wie in Beispiel 3 beschrieben.

Alle Gene des Kindes stammen entweder von der Mutter oder vom Vater. Falls daher der mutmaßliche Vater der biologische Vater ist, werden alle Banden der Spur, welche die DNA des Kindes enthält, auch in der Spur ohne diese DNA des Kindes auftreten. Pail andererseits der mutmaßliche Vater nicht der biologische Vater ist, werden in der Spur mit der DNA des Kindes neue Banden auftreten.

- 42 - - ■ -

Beispiel 5

Dieses Beispiel beschreibt spezielle Techniken für einen Vaterschaftsnachv/eis vnd seine Auswertung.

A. DNA-Reinigung; aus Blut

1. Blutproben (5-10 ml) werden in Röhrchen gesammelt, welche EDTA oder Citrat als Antikoagulans enthalten, und bis zur Weiterverarbeitung bei 4 C aufbewahrt.

2.. Man suspendiert die Zellen durch Wenden des Röhrchens und zentrifugiert mit 200 Upra 10 Minuten bei 4-⁰C. Man entfernt das barun (oben) ohne die blaßgelbe Haut zu zerstören.

3. Dazu fügt man ein gleiches Volumen Blut-Lysis-Puffer

(0,52 M Sucrose, 10 aiii Tris pH 7,6, 5 mM MgCl₂, Λ°/ο Triton X-100), der 4°C hat, und mischt gut durch Wenden. Dann überführt man das Material in ein konisches Polypropylen-Röhrchen (z.B. Coming, Falcon), spült das Biutröhrchen und stellt ein Endvolumen ein, welches das Vierfache des ursprünglichen Blutvolumens ist. Nach guter Durchmischung zentrifugiert man 10 Minuten mit 2000 Upm bei 4°C.

4. Der Überstand wird dekantiert. Falls das Pellet nicht sauber ist (d.h. mit zu vielen roten Zellen verunreinigt ist), suspendiert man das Pellet in 3 ml Lysispuffer und zentrifugiert erneut.

5. Das weißlich-rosa Pellet suspendiert man in 2,5-5 ml DNA-Lysispuffer (10 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 10 mM NaCl, 100 jug/ml Proteinase K). Man mischt gut, nötigenfalls mit dem Vortex-Mixer. SDS (Stammlösung: 20$) wird zu einer Endkonsentration von Λ% zugefügt. Durch sanftes 'Wenden des Röhrchens mischt man. Das Material wird sehr viskos. Man mischt vorsichtig über Nacht bei 37°C in einem Schüttler oder bei 6O⁰C 3 Stunden lang unter gelegentlichem Mischen.

I- J

6. Dazu fügt man NaClCL aus einer 6 M Stammlösung zur Endkonzentration von 1 M (d.h. man verdünnt 1:5)· Man mischt vorsichtig mit der Hand oder im Schüttler. An diesem Punkt kann das Material gekühlt unbegrenzt aufbewahrt werden.

7- Nach Zugabe des gleichen Volumens eines Phenol-Chloroform-Gemisches (1 Teil 9C$ Phenol, 10$ 1 m Tris pH 8,0 : 1 Teil CHCl-) schüttelt man leicht 15-30 Minuten bei Zimmertemperatur.

8. Man überführt das Material in ein 15 ml Corex-Röhrchen aus Glas und zentrifugiert mit 4000 Upm 15 Minuten lang (Becknan) oder mit 10.000 Upm 5 Minuten (Sorvall), um die Phasen zu trennen.

9- Die obere, v;s£rige Phase entnimmt man mit einer weit lumigen Pipette und bringt sie in das ursprüngliche Kunststoff röhrchen. Dieser Extraktionsvorgang wird noch zweimal wiederholt.

10. Man gibt das DNA-Material in einen entsprechend gekennzeichneten Dialysesack und dialysiert gegen einen 100-fachen Überschuß von TS-Puffer (10 mM Tris pH 7,4, 1 mM EDTA).

11. Von einer geeigneten Probenverdünnung (z.B. 1/20) mißt man die O.D. gegen die gleiche, reine Lösung bei: 240 nm (für EDTA); 260 nm (Maximum für DNA); 270 nm (Maximum für Phenol); 280 nm (Maximum für Proteine); 340 nm (Trübung). Die Quotienten 260/270 sollten bei etwa 1,2 und 260/ 280 bei etv/a 1,8 liegen.

B. Verdauung von Genom-DMA mit Restriktionsendonuklease 1. Folgende Komponenten werden in ein 1,5 ml Eppendorf-Gefäß pipettiert:

a) etwa 10 Mg DNA pro Test (gewöhnlich zwischen 10 /ul und 50 /ul),

Γ - 44 - ' ■

b) die entsprechende Menge des spezifischen 1Ox Endonukleaso-Verdauungspuffers, der nach den Empfehlungen des Herstellers angesetzt wurde,
c) Restriktionsnuklease in dreifachem Überschuß.

2. Man mischt das Gefäß 1-2 Sekunden mit dem Vortex-Mixer

oder schnippt es mehrmals mit dem Finger.

3. Dann zentrifugiert man 10-15 Sekunden in der Eppendorf-Mikrozentrifuge, um die Reaktionsprodukte zu pelletieren.

4. Man inkubiert 2 Stunden bei 37⁰C mit EcoRI oder bei 65⁰C

mit Saal.

5. a) Kan gibt 1/10 Vol. 3 M NH^-Acetat zu,

b) dann 2-2,5 Vol. kaltes ^% Äthanol.

c) Nachdem can den Ansatz über Nacht bei -20⁰C aufbewahrt hat, zentrifugiert man ihn in der Mikrofuge zum Pelletieren (15 Minuten bei 4°C).

*

6. a) Das Pellet löst man in 15 /u.1 B^O.

b) Man pipettiert den für das Restriktionsenzym geeigneten 10x Puffer dazu sowie einen dreifachen Überschuß an Restriktionsnuklease und wiederholt die Schritte 2, 3 und 4.

7· Wen fügt 5x Ficoll-Markierungs-Farblösung hinzu (Endkonzentration 1x),um die Reaktion zu stoppen. So kann man mit Proben verfahren, deren Endvolumen kleiner als 20 /ul ist. Das Material sollte unmittelbar nach der Verdauung auf ein Gel aufgetragen werden.

C. Elektrophorese

1. Man stellt ein Agarose-Gel her, indem man Agarose in 1x TAN kocht (40 mM Tris, pH 7,9; 4 mM Na-Acetat, 1 mM EDTA), Die Endkonzentration der Agarose sollte zwischen 0,4$ und

1,2$ liegen, je nach Größe der zu trennenden Fragmente. DNAs, die mit pAW-101 hybridisiert werden sollen, werden in 0,4$ Agarose elektrophoretisiert, zur Hybridisierung mit pLM 0,8 benutzt man 1,2$ Agarose.

2. Wenn die Agaroselösung etwa 75 C erreicht, fügt man EtBr (2,7-Diamino-1O-äthyl-9-phenyl-phenanthridinium-bromid) zu (Endkonzentration von 500 ng/ml bis 12,5 ng/ml).

J. Man gießt die Agarose sofort in eine Horizontalgel-Elektrophoresewanne, um ein Gel von etwa 4 mm Dicke herzustellen. Man steckt einen Taschenformer an eine der Kammer. Man läßt bei Zimmertemperatur abkühlen, bis die Agarose erstarrt. Dann entfernt man den Taschenformer und bedeckt das Gel mit 1x TAN.

4. Man füllt die Proben in die Taschen des Gels. Man verbindet die Gelkasrier niit dem Spannungsgerät, schaltet das Gerät an und stellt den Strom auf einen geeigneten Wert ein. Um z.B. Fragmente von mehr als 10 kb zu trennen, elektrophoretisiert man 3 Tage mit 20 V. Für Fragmente von 1,5 kb elektrophoretisiert nan mit 40 V über Nacht (16-20 Stunden). Nach der Elektrophorese trennt man die Gelkammer vom Spannungsgerät. Man entnimmt das Gel mit einer Gelschaufel, wobei man Handschuhe benutzt, legt es auf einen UV-Leuchtkasten und daneben ein sauberes Lineal an die Seite der Spur mit der Marker-DNA. Das Gel fotographiert man mit einem geeigneten fotographischen Film, um das Bild als Beleg der Elektrophorese aufzubewahren.

D. Schnellmethode zur Plasmidpräparation

1. Man benötigt 15 ml einer Kultur des Stammes E. coli HB101, der entweder das Plasmid pAV/101 oder das Plasmid pLM 0.8

trägt.
35

2. Die Kultur wird 10 Minuten mit 8000 Upm zentrifugiert und

der Überstand dekantiert und verworfen.

3. Zum Pellet pipettiert man 500 jxL 2% Sucrose; 50 mM Tris pH 8,0; 0,1 mM EDTA; 0,2 mg/ml RNase; 1 mg/ml Lysozym. 5

4·. Das Pellet suspendiert man mit dem Vortex-Mixer.

5. Man stellt den Ansatz 15 Minuten auf Eis.

6. Es werden 250 μΐ 0,5# Triton X-IOO; 50 mM EDTA; 50 mM Tris, pH 8,0 zugefügt.

7. Der Ansatz verbleibt für v/eitere 5 Minuten auf Eis.

8. Man sentrifugiert bei A-⁰C 30 Minuten mit 25.000 Upm im SW-25-, 27- oder ΟΛ-Rotor.

9. Man trennt das Pellet vom Überstand (das Pellet besteht aus bakterieller DNA).

10. Zu dem Überstand pipettiert man 10 ul Proteinase K (5 mg/ml).

11. Den Ansatz beläßt man 5 Minuten bei Zimmertemperatur. 25

12. Nun wird einmal mit einem 1:1-Gemisch aus Phenol und

GHCl-. und zweimal mit CHCl-, extrahiert. 3 3

13. Die wäßrige Phase versetzt man mit NH^,-Acetat (Endkonzentration 0,3 M).

14. Dazu gibt man 2,5 Vol. Äthanol.

15. Man bewahrt den Ansatz über Rächt im Tiefkühlschrank bei -20⁰C auf.

16. Dann zentrifugiert man ab und löst den Niederschlag in 20 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTa.

17. Schließlich wird CsCl zugesetzt für die Dichtegradientenzentrifugation.

E. Nick-Translation

1. Für jede Hybridisierungsreaktion mischt man:

a) 50 Hanogramm der nativen (doppelsträngigen) Probe-DNA, b) 0,7 ul des 10p Nick-Translationspuffers (1x = 25 mM Tris-HCl, pH 7,9, 2,5 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 100/ug/ml Hinderserumalbumin).

c) 2,5 μΐ alpha-^^P-Desoxynukleotid-Triphosphat (25 tiCi)

d) 0,5 ul Dl'Jase I zu 20 Picogramm/ul

e) 0,5 ul DKA-PolTSierase I (3 Einheiten) Das Endvolusen wird auf 5 pl eingestellt.

2. Es wird 2 Stunden bei 16⁰C inkubiert.

3· Man stoppt die Reaktion, indem man EDTA zur Endkonzentration von 10 η!·! und SDS zu 0,5% (Endkonzentration) zusetzt. Das Endvoiumen beträgt 100 ul.

4. Man trennt die markierte DNA von den nichtverbrauchten Triphosphaten, indem man das Reaktionsgemisch durch 0,6 ml Sepharose 6B-CL in einem durchbohrten Mikroζentrifugenröhrchen 2 Minuten mit I5OO Upm zentrifugiert.

5- Man entnimmt 1 ul des durchgelaufenen Materials (es enthält die markierte DNA) und zählt die Impulse in einem Beta-Szintillations-Spektrometer.

F. Southern-Transfer-Vorschrift für Zetabind 1. Man elektrophoretisiert die DNA in einem Agarose-Gel und färbt sie 15-30 Minuten mit Ethidiumbromid (10/ug/ml). Dann entfernt man dsn Überschuß an Färbelösung durch 15 bis 30 Minuten Einweichen in

Puffer und fotographiert.

2. Das Gel legt man für 30 Minuten in 0,5 M NaOH, 1,0 M NaCl und bewegt es leicht.

3. Dann spült man das Gel mit Wasser und wiederholt den Schritt 2 mit 0,5 M Tris-HCl pH 7,5, 0,3 M NaCl.

4-. Zetabind wird mit Wasser angefeuchtet. Dann weicht man es 30 Minuten in Na-Phosphatpuffer (0,025 M pH 6,5) ein.

5. Man tränkt das Gel 15 Minuten mit demselben Phosphatpuffer wie in Schritt 4·.

6. Man legt zwei Streifen feuchtes Whatman 3 MM-Papier von der Größe des Gels in Phosphatpuffer, so daß keine Luftblasen dazwischen eingeschlossen sind. Das Gel legt man (die Filter sind, unten) über eine Unterlage mit einem Docht aus 3 MM-Papier, der in den Phosphatpuffer eintaucht. Man legt Zetabind auf das Gel, darüber zwei 3 Mf-1-Papierstreifen und schließlich Papiertücher (7,5-10 cm. hoch). Obenauf legt man ein flaches Brett und ein Gewicht (z.B. eine 100 ml-Plasche), um gleichmäßigen Kontakt zwischen dem Gel und den Papieren

zu gewährleisten.
25

7. Der Transfer der DNA erfolgt über Nacht mittels Phosphatpuffer (0,025 M pH 6,5)·

8. Die Membran wird 15 Minuten mit Phosphatpuffer gewaschen (die Seite, welche mit dem Gel in Kontakt war, wird leicht abgerieben).

9. Dann bäckt man die Folie im Vakuumofen 2 Stunden bei 80⁰C.

10. Man legt sie in einen Frühstücksbeutel und wäscht 30-60 Minuten bei 60⁰C in 0,IxSSC, Ö,5# (etwa 15 ml).

L J

11. Man gießt den Puffer von Schritt 10 ab und ersetzt ihn durch Prähybridisierungspuffer (4x 8SC, 50 mM Na-Phösphat pH 6,7, 5x Denhardt, 200 jug/ml denaturierte Lachssperma-DNA und 50$ Formamid). Man inkubiert 3-16 Stunden bei 37°C.

12. Die Probe wird denaturiert, indem man sie in 1 al Hybridisierungspuffer 10 Minuten auf 70⁰C erhitzt. Die Hybridisierung mit der denaturierten radioaktiven DNA erfolgt während 4-0-72 Stunden bei 37°C (.2x107 dpm/3eutel).

13. Man wäscht mit 2x SSCP, 0,1$ SLS, indem man 20 Minuten bei c5°C schüttelt, bis ein 10 nil-Aliquot der Waschflüssigkeit weniger als 100 Cherenkov --Impulse/Minute hat (etwa 6 Y/aschvorgänge). Dann wäscht man zweimal mit 0,4x SSCP, 0,022 SLS bei 65⁰C und zweimal mit 0,1x SSCP. Man gibt jedesmal ausreichend Puffer dazu,um den Filter zu bedecken.

14. Man saugt das Letabind ab und läßt es an der Luft trocknen, bevor man es mit Cellophan bedeckt und zur Autoradiographie in die Kassette steckt.

Yor Wiederverwendung entfernt man die Probe-DNA durcfa Erhitzen in Prähybridisierungspuffer für 10 Minuten auf 7® C. Prähybridisierung (für 15 ml Gesamtvolumen) 1,5 ml denaturierte Lachssperma-DNA (5 mg/ml) 3,0 ml 2Ox SSC

1,5 ml 5Ox Denhardt
1,5 ml 0,5 M Phosphat
7,5 ml 100# SOrmamid
0,15 ml 20$ SLS

32

P-markierte denaturierte DNA
1,5 ml zusätzlich 2Ox SSC

Hybridisierung (für 15 ml Gesamtvolumen)

15. Die 6 Streifen von zwei Gelen werden auf gelbes Papier einer Röntgenfilm-Packung aufgezogen, gekennzeichnet, mit Plastikfolie bedeckt und in eine Kassette mit eingebauter Verstärkerfolie gelegt. Die Kassette wird in der Dunkelkammer mit 20x25 cm X-Omat AR Röntgenfilm beschickt, indem der I¹Um zwischen die Nitrocellulosestreifen und die Verstärkerfolie gelegt wird. Die Kassette wird verschlossen und in einen Tiefkühlschrank mit -70⁰C gelegt.

16. Der Röntgenfilm wird nach 24-48 Stunden entwickelt. Dazu wird der Film aus der Kassette entnommen und in der Dunkelkammer bei Gelblicht entwickelt. Die Kassette kann wieder geladen werden, wenn eine v/eitere Belichtung nötig ist.

Beispiel^

Dieses Beispiel "beschreibt die spezielle Durchführung und Auswertung eines Vaterschaftstests unter Verwendung der vorliegenden Erfindung.

1. Von der Mutter, dem Kind und dem' mutmaßlichen Vater werden Blutproben genommen und die DNA gereinigt, wie in Beispiel 5 Ά beschrieben.

2. Diese DNAen werden getrennt entweder mit dem Restriktionsenzym EcoRI oder mit Taql gespaltet, wie in Beispiels' B beschrieben.

3. Diese DNAen werden, wie in Beispiel 5 C' beschrieben elektrophoretisiert, indem 5 /ul von jeder der drei DNAen in jeweils eine von drei benachbarten Gelspuren aufgetragen wird, und zwar in der Reihenfolge (von links nach rechts) Mutter, Kind, mutmaßlicher Vater.

4. "Vaterschafts-Probe"-DNAs werden hergestellt und wie in ³^ Beispiel 5 d und 5 E beschrieben markiert.

5· Die elektrophoretisch getrennten DNAen werden auf Nitrocellulose übertragen wie in Beispiel 5 F beschrieben.

6. Die markierten Probe-DNAen von Schritt 4· werden mit den auf Nitrocellulose übertragenen Genom-DNAen aus Schritt 5

hybridisiert, wie es in Beispiel 5 Ξ beschrieben ist. pAW 101-DNA wird mit der EcoRI-gespaltenen Genom-DNA hybridisiert, pLM 0.8 hingegen wird gegen Taq I-gespaltene Genom-DNA hybridisiert.
10

7. Autoradiogramme werden angefertigt, wie in Beispiel 5 F

8. !lach der Autcradiographie wird die Größe der Banden bestirbst, welche den polymorphen DNA-Fragmenten entsprechen. Dies geschieht durch Kessen der Strecke, welche diese Banden im Gel gewandert sind, im Vergleich zu denen einer Kollektion von DNA-EoIeirüien als Molekulargewichts-Standards (Southern Ξ.M., (1984) Anal. Biochem. 100, 319-323).

Die Größen der DNA-Fragmente von jedem der Individuen einer Familie werden verglichen, um festzustellen, ob die beobachteten Muster beim Kind mit denen des mutmaßlichen Vaters übereinstimmen. Falls die Größe der DNA-Fragmente des Kindes von denen des mutmaßlichen Vaters verschieden sind, wird daraus geschlossen, daß er nicht der biologische Vater ist (d.h. ein Fall von Nicht-Vaterschaft). Falls das Kind nur ein AUeI mit der Mutter gemeinsam hat, kann geschlossen werden, daß das andere Allel vom Vater geerbt wurde. Wenn der mutmaßliche Vater dieses Allel nicht besitzt, kann geschlossen v/erden, daß er nicht der Vater ist.

Andererseits, wenn die beiden wenigstens ein Paar von DNA-Fragmenten gemeinsam haben, die nicht von der Mutter stam- °⁵ men, dann beruht die Entscheidung, ob dieses Individuum der Va.ter sein könnte oder nicht, auf der Wahrscheinlichkeit,

L J

mit der ein zufällig ausgewähltes Individuum aus der Population dieselbe DNA-Fragmentgröße aufweist (d.h. Vaterschaftsindex; in: Inclusion Probabilities in Parentage Testing (1983), ed. R.H. Walker, American Association of Blood Banks).

In letzterem Fall ist es notwendig, die Häufigkeit der Allele zu kennen, welche mit der bestimmten DNA-Probe nachgewiesen wurden. Die beobachteten Häufigkeiten für die Proben pAW-101 und pLW-0.8 sind in den Tabellen 1 und 2 wiedergegeben.

Beispiel7

Testfall 1

Unter Verwendung der Verfahren des Beispiels 6 wurden eine Mutter, ein Kind und ein mutmaßlicher Vater getestet, wobei die vorliegende Erfindung eingesetzt wurde. Fig. 1 zeigt ein Bild des Autoradiogramms, welches gewonnen wurde, als pAW 101 als Probe gegen die EcoRI-gespaltenen DNAs von Mutter, Kind und Vater eingesetzt wurde. Die Messung der Wanderungsstrecken und der Vergleich mit bekannten Standards ergaben, daß die Kutter die pAV/101 -Allele Nummer 2 und 5 trägt, das Kind die pAW101-Allele Nummer 5 und 10, wohingegen der mutmaßliche Vater die pAV/101-Allele Nummer 10 und 11 trägt. Da die Mutter das pAW101-Allel Nummer 5 auf das Kind übertragen haben muß, hat der Vater das Allel Nummer 10 beigetragen. Man kann nun die Wahrscheinlichkeit, daß der mutmaßliehe Vater das pAW101-Allel Nummer 10 auf ein Kind überträgt, vergleichen mit der Wahrscheinlichkeit, daß ein Zufallsmann das Allel Nummer 10 überträgt. In diesem Fall ist das Wahrscheinlichkeit sverhältnis 16,6?, woraus sich eine Wahrscheinlichkeit der Vaterschaft von 94$ errechnet.

Beispiel 8-Testfall 2

Nach dem Verfahren des Beispiels 6 wurden eine Mutter, ein Kind und ein mutmaßlicher Vater getestet, wobei die vorliegende Erfindung, eingesetzt wurde. Figur 2 zeigt das Bild eines Autoradiogramms, welches erhalten wurde, als pAW1O1

L J

als Probe gegen die EcoRI-geschnittene DNAs von Mutter, Kind und Vater eingesetzt wurde. Die Messung der Wanderungsstrekken und der Vergleich mit bekannten Standards ergaben, daß die Mutter die pAW101-Allele Nummer 5 und 9 trägt, das Kind trägt die pAV/101-Allele Nummer 5 und 7» der mutmaßliche Vater hingegen trägt die pAW101-Allele Nummer 4· und 6. Da der Vater dieses Kindes das Allel 7 auf das Kind übertragen haben muß und der mutmaßliche Vater dieses Allel nicht trägt, wird er als möglicher Vater ausgeschlossen.

Beispiel 9 Testfall 5

Unter Verwendung der Verfahren des Beispiels 6 wurden eine Mutter, ein Kind und ein mutmaßlicher Vater getestet, wobei die vorliegende Erfindung eingesetzt wurde. Die Figur 3 zeigt ein Bild des Autoradiogramms, welches erhalten wurde, als pLM 0.8 als Probe gegen die Taq I-gespaltenen DNAen der Mutter, des Kindes und des Vaters eingesetzt wurde. Die Messung der Wanderungsstrecken und der Vergleich mit bekannten Standards ergaben, daß die Mutter die pLM 0.8-Allele Nummer 7 und 8 trägt, das Kind trägt die pLM 0.8-Allele Nummer 7 und 8, der mutmaßliche Vater hingegen trägt die pLM 0.8-Allele Nummer 2 und 8. Da die Mutter jedes der beiden pLM 0.8-Allele, Nummer 7 und 8, auf das Kind übertragen haben konnte, kann man nur schließen, daß der Vater eines der beiden Allele 7 oder 8 übertragen haben muß. Man kann die Wahrscheinlichkeit, daß der mutmaßliche Vater eines der beiden pLM 0.8-Allele 7 oder 8 auf das Kind übertragen hat, mit der Wahrscheinlichkeit vergleichen, mit der ein Zufallsmann eines dieser beiden Allele übertragen würde. In diesem Fall ist das Wahrscheinlichkeitsverhältnis 3,55, was einer Wahrscheinlichkeit der Vaterschaft von 71,8# entspricht.

35

Tabelle 1

Häufigkeit des Auftretens von Allelen bei Verwendung von pWA1O1 als Probe und EcoRI-gespaltener menschliche Genom-DNA in einer Population von 298 ZufallsIndividuen.

Allel

1 ²

10

4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Größe (in Kilobasenpaaren)	Häufigkeit
14.0	0.013
14.5	0.052
14.9	0.077
15.4	0.117
16.0	0.146
16.6	0.117
17.2	0.064
17.7	0.040
18.3	0.035
19.0	0.030
19.6	0.035
20.2	0.040
20.8	0.064
21.6	0.069
22.2	0.023
22.7	0.018
23.6	0.020
24.3	0.003
24.6	0.008
25.3	0.013
26.1	0.008
27.1	0.002
28.1	0.002

1 Tabelle

Häufigkeit des Auftretens τοη Allelen bei Verwendung von pLH 0.8 als Probe und Tag.i-gespaltener menschlicher Genom-DNA in einer Population von 268 Zufallsindividuen.

Allel Nr.	Größe (in Kilobasenpaaren)	Häufigkeit
1	2.35	0.089
2	2.65	0.580
3	2.75	0.041
4	2.95	0.009
5	3.08	0.123
6	3.40	0.007
7	3.70	0.123
8	4.09	0.018
9	4.30	0.007

L J

1 Probe, Probe-DNA:

ss DNA

ds DNA

C DNA

bp

Kilobasenpaar

Tailing

Begriffserläuterung

DNA, die zur Hybridisierung vorgesehen ist, um Sequenzen aufzuspüren, die zur Probe homolog sind

einzelstrangxge (single-stranded) DNA

doppelsträngige (double-stranded) DNA

Komplemetäre DNA, die durch reverse Transkription von mRNA entstanden ist

base pairs, Basenpaare als Längenangabe für DNA-Fragmente

inzwischen gängige Bezeichnung für 1000 Basenpaare

Anfügen von Nukleotiden an 3'-Enden eines DNA-Fragments durch terminale Transferase, wobei überstehende Einzelstrangenden geschaffen werden.

Claims (1)

1. VOSSIUS · VOSSIUS · TAUCH N E Β;λ H-E lijvf E]Vl ΑΡΝ:^:·" RAU H

   PATENTANWÄLTE

   SIEBERTSTRASSE 4 · 8OOO MÜNCHEN 86 · PHONE: (O89) 474Ο75 CABLE: BENZOLPATENT MÜNCHEN · TELEX 5-529 4-53 VOPAT D

   u.Z.: S 883 (Ra/H) - 28". Februar 1984

   Case: 4-214-

   Actagen, Ine.

   Elmsford, New York, V.St.A.

   "Verfahren zur Identifizierung einzelner Mitglieder einer Spezies von Organismen"

   Patentansprüche

   Verfahren zur Identifizierung einzelner Mitglieder einer Spezies von Organismen,

   dadurch gekennzeichnet, daß die DKA des Organismus im Hinblick auf mindestens einen polymorphen genetischen Bereich analysiert, alle Polymorphismen im Hinblick auf die relative Größe des genetischen Bereichs unterschieden und so ein einzelnes Mitglied der Spezies charakterisiert wird.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten Bereiche durch ein Verfahren nachgewiesen werden, das umfaßt

   a) Isolierung der zu analysierenden DNA des Individuums,

   b) Behandlung der DNA mit Restriktionsendonukleasen, Trennung der entstandenen Fragmente nach der Größe itnd Umwandlung der erhaltenen. DNA-Fragmente in einzelsträngige Moleküle,

   c) Hybridisierung der nach der Größe getrennten einsträngigen Moleküle mit Probe -DNA-Molekülen und

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   d) Identifizierung der Anzahl und Lage der Hybridfragmente ,

   mit der Maßgabe, daß als Probe -DNA nicht cDNA von mensch lichem HLA-Genlocus verwendet wird. 5

   3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das analysierte Individuum ein Virus, Bakterium, Alge, Pilz, Pflanze oder Tier ist.

   4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Probe aus Zellen von erwachsenem, jugendlichem, fötalem oder embryonischem Gewebe erhalten wird.

   5- Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe -DNA einen Proben-Satz umfaßt, in dem jede einzelne Probe innerhalb des Satzes derart ausgewählt ist, daß sie ein einzelnes Allel eines unterschiedlichen polymorphen genetischen Bereiches darstellt.

   6. Verfahren nach Anspruch 5> dadurch gekennzeichnet, daß der Probensatz 1 bis etwa 20 einzelne Proben umfaßt.

   7- Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die in dem polymorphen genetischen Bereich enthaltene Anzahl von Allelen etwa 2 bis 4-0 beträgt.

   8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe -DNAs pAW 101 (ATCC 39605) und pLM 0.8

   (ATCC 39604) sind.
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   9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner die Stufe des Vergleichs der relativen Größen der polymorphen genetischen Bereiche des Individuums mit denjenigen einer vermuteten Mutter oder Vater zur Bestimmung der Elternschaft umfaßt.

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   ΊΟ. Verfahren zur forensischen Analyse gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es den weiteren Schritt des Vergleichs der relativen Größen der polymorphen Bereiche von einer ersten Probe eines Individuums mit den polymorphen Bereichen aus einer zweiten Probe aus einer anderen Quelle zum Zweck der Feststellung möglicher Identität zwischen den beiden Proben umfaßt.

   11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es den weiteren Schritt des Vergleichs der relativen

   GröSe des polymorphen Bereichs des Individuums mit demjenigen von eines anderen Glied eines Stamms oder Organismus zun Zweck der Peststellung möglicher Stammidentität der Individuen umfaßt.
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   12. Verfahren zur Identifizierung einzelner Mitglieder einer

   Spezies von Organismen durch Analyse von

   DNA des Organismus im Hinblick auf mindestens einen polymorphen genetischen Bereich, Differenzierung aller Polymorphismen im Hinblick auf die relative Größe des genetischen Bereichs und somit Charakterisierung eines .einzelnen Mitglieds der Spezies, dadurch gekennzeichnet, daß diese Bereiche durch ein Verfahren nachgewiesen werden, das folgende Stufen umfaßt:

   a) Isolierung der zu analysierenden DNA des Individuums, b) Behandlung, der DNA mit Restriktionsendonukleasen, Trennung der entstandenen Fragmente nach der Größe und Umwandlung der erhaltenen. DNA-Fragmente in einzelsträngige Moleküle,

   c) Eybridisierung der nach der Größe getrennten, einzelsträngigen Moleküle mit Probe -DNA-Molekülen, wobei diese Probe -Moleküle ferner dadurch gekennzeichnet sind, daß sie durch Endonukleaseverdau von genomischer DHA erzeugt wurden, und

   d) Identifizierung der Anzahl und Lage der Hybridfragment e.

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   13. Verfahren zur Identifizierung einzelner Mitglieder einer Spezies von Organismen,dadurch gekennzeichnet, daß die DNA des Organismus im Hinblick auf mindestens zwei polymorphe genetische Bereiche analysiert, alle Polymorphisinen im Hinblick auf die relative Größe des genetischen Bereiches differenziert und so ein einzelnes Mitgleid der Spezies charakterisiert wird.

   14·. Verfahren zur Identifizierung einzelner Mitglieder einer Spezies von Organismen,dadurch gekennzeichnet, daß die DNA des Organismus im Hinblick auf mindestens einen polymorphen genetischen Bereich analysiert, alle Polymorphismen im Hinblick auf die relative Größe des genetischen Bereiches differenziert und so ein einzelnes Mitglied der Spezies charakterisiert wird, wobei die Bereiche durch ein Verfahren nachgewiesen werden, das folgende Stufen umfaßt:

   a) Isolierung der zu analysierenden DNA des Individuums,

   b) Behandlung der DNA mit Restriktionsendonukleasen, Trennung der entstandenen Fragmente nach der Größe und Umwandlung der DNA-Fragmente in einzelsträngige Moleküle,

   c) Hybridisierung der nach der Größe getrennten, einzelsträngigen Moleküle mit Probe -DNA-Molekülen, und

   d) Identifizierung der Anzahl und Lage der Hybridfragmente,

   mit der Maßgabe, daß die Probe nicht mit menschlichem HLA-Genlocus hybridisiert.

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