FR2541774A1 - Essai pour la determination de la paternite et pour l'etablissement de l'identite genetique individuelle - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENTION CONCERNE UN PROCEDE D'IDENTIFICATION D'ELEMENTS INDIVIDUELS D'UNE ESPECE D'ORGANISME. L'IDENTIFICATION EST BASEE SUR UNE ANALYSE DES POLYMORPHISMES DE LONGUEUR DE L'ADN PRODUITS PAR L'ACTION D'ENDONUCLEASES DE RESTRICTION.

Description

ESSAI POUR LA DETERMINATION DE LA PATERNITE ET POUR

L'ETABLISSEMENT DE L'IDENTITE GENETIQUE INDIVIDUELLE

La présente invention concerne un essai diagnostique nouveau et amélioré appliqué à la détermination de la paternité et pour l'établissement de l'identité génétique individuelle Il est à noter que bien que dans la pratique de la technique, l'essai soit désigné sous le-

nom d'essai de paternité, rien ne s'oppose à son utilisa-

tion dans des cas de maternité controversée.

Il existe de nombreux cas o le fait de pouvoir déterminer l'identité d'un individu est important; par exemple, l'assignation d'indices physiques laissés sur

les lieux d'un crime à un suspect particulier, l'établis-

sement de l'identité d'un individu en relation avec sa mère ou son père comme dans la détermination de la paternité ou plus généralement lorsqu'on établit l'identité génétique d'une souche d'un virus, d'une bactérie, d'une

algue, d'un champignon, d'une plante ou d'un animal.

Certains des essais utilisés pour ces déterminations reposent sur l'identification de protéines polymorphes dans le plasma provenant de la surface ou extraites

de l'intérieur des cellules des individus en question.

Les substances du groupe sanguin ABO bien connu

peuvent être utilisées à titre d'explication Les subs-

tances du groupe sanguin ABO sont des hydrates de carbone et elles sont synthétisées par des enzymes qui sont les produits d'un gène humain unique Une forme du gène (l'allèle A) produit une enzyme utilisée dans la synthèse d'un sang du type A, tandis qu'une autre forme du gène (l'allèle B) produit une enzyme utilisée dans la synthèse de sang du type B L'absence des deux allèles conduit à la production d'un sang du type 0, tandis que la présence des deux allèles conduit à la production d'un sang du type AB Les substances ABO possèdent des

propriétés antigéniques et peuvent être détectées immuno-

logiquement par réaction avec les anti-sérums appropriés.

C'est la réactivité différentielle de ces substances avec ces anti-sérums qui constitue la base des groupes des

types sanguins A, B, O et AB.

Si tout le monde possédait le même type de sang, la

substance serait inutile pour distinguer parmi les indi-

vidus Le fait que les substances des groupes sanguins existent sous plusieurs formes (c'est-à-dire sont polymorphes) permet la discrimination Cependant, en ce qui concerne son pouvoir d'exclure, comme dans les cas de paternité discutée, le nombre d'allèles différents est important, mais la fréquence avec laquelle ces allèles-apparaissent l'est également Comme ces fréquences des allèles varient parmi les populations,

l'efficacité de l'exclusion varie également Le pouvoir-

que possède un essai d'exclure est représenté par sa capacité d'exclusion, une valeur numérique allant de 0 à 1,0 La capacité d'exclusion du système ABO parmi les noirs américains est de 0,1774, tandis que parmi les Américains de race blanche, elle est de 0,1342 La capacité d'exclusion s'élève à 0,1830 pour les Suédois, et à 0,1917 pour les Japonais O Un moyen d'augmenter la capacité d'exclusion est

d'étendre l'analyse à d'autres substances polymorphes.

En Suède, douze substances polymorphes sont analysées.

La capacité d'exclusion globale de cette batterie d'essais se rapproche de 0,870 L'addition de systèmes supplémentaires à la série, même si elle est hautement informative, n'augmente pas fortement la probabilité cumulative, dès que le nombre des systèmes déjà mis en jeu est important Une étude de 25 systèmes basés sur des essais immunologiques (réactions antigène-anticorps) révèle une probabilité cumulative de non paternité de * 0,7694, tandis qu'une analyse similaire de 32 systèmes basés sur des essais biochimiques (réactions enzymatiques ou mobilité électrophorétique) donne une-valeur de 0,9512 Les 57 systèmes combinés ne donnent-toujours qu'une valeur d'exclusion de 0,9887 Des études poussées ne sont pas praticables en termes de programme d'essai de la paternité, car un grand nombre des systèmes, du fait de leur coût, de la rareté des réactifs, de leur complexité technique, de leur faible fiabilité et/ou d'une expérience insuffisante ne sont pas considérées

comme convenant pour un travail de routine.

rl est bien connu que les sciences légales utilisent des systèmes d'essais multiples pour la détermination de l'identité Par exemple, en plus des antigènes des groupes sanguins ABO, on analyse également les antigènes MN et Rh Si l'échantillon d'essai est liquide, on peut aussi inclure des antigènes Le et Se Trois enzymes des

erythrocytes, la phosphatase acide, la phosphogluco-

mutase et l'esterase D sont soumises à un examen de la présence de variantes électrophorétiques Enfin, on utilise également des essais pour rechercher des protéines sériques telles que des haptoglobines Comme c'était le cas pour la détermination de la paternité, l'étendue de ces recherches légales est également limitée par leur coût, leur complexité technique et leur faible fiabilité. En dépit des considérations pratiques ci-dessus, un problème théorique plus grave affecte tous les essais existants Comme les essais sont basés sur l'analyse d'une protéine ou de son activité, c'est le produit du

gène et non le gène lui-même qui fait l'objet de l'étude.

Conformément aux présentes inventions décrites ci-après, il est préférable d'analyser le gène directement plutôt que le produit de son expression, dans les cas o la paternité est intéressante, en raison de la dégénérescence qui est inhérente au procédé par lequel l'information

génétique est exprimée.

L'écoulement de l'information génétique dans les cellules est bien connu L'information dirigeant la biosynthèse de toute protéine est codée dans les séquences de nucléotides de 1 'ADN connu sous le nom de gène L'ADN de la cellule peut être considéré comme la forme de stockage de l'information génétique Les molécules d'ADN sont grandes, chimiquement stables, aisément répliquées et elles contiennent de nombreuses séquences de gène Par exemple, le répertoire génétique entier de la bactérie E coli est contenu dans une molécule d'ADN unique composée d'environ 4,2 x 106 paires de

base-de nucléotide.

La transcription est l'opération par laquelle

commence-la récupération de -l'information La transcrip-

tion met en jeu la synthèse de-l'information sous la forme d'un acide nucléique appelé ARN Un type d'ARN, l'ARN messager (m ARN), transporte l'information vers

le site de la synthèse des protéines appelé ribosome.

Dès que le m ARN est synthétisé à partir du gène,

le processus de synthèse des protéines peut commencer.

Ce processus est essentiellement un processus de décodage moléculaire, dans lequel la séquence de nucléotide du m ARN fournit un modèle pour la synthèse d'une protéine

particulière Comme il se produit un passage d'un.

langage d'acide nucléique dans un langage de protéine, ce processus de synthèse des protéines est désigné de manière appropriée comme une traduction En poursuivant l'analogie un peu plus avant, il serait approprié de considérer les constituants des acides nucléiques, les nucléotides, comme représentant l'alphabet du langage de l'acide nucléique et les aminoacides, qui sont les éléments de construction des protéines, comme représentant l'alphabet du langage des protéines Au cours du processus dé traduction, non seulement les langages changent, mais encore les alphabets changent également Il s'agit d'un processus particulièrement complexe qui est connu pour mettre en jeu plus de 100 types de molécules Lorsque le m ARN traverse le ribosome (tout à fait comme la bande magnétique traverse un enregistreur sur bande) des groupes de trois nucléotides (codons) sont positionnés de façon à orienter des molécules d'ARN accessoires, connues sous le nom de ARN de transfert (t ARN), transportant un aminoacide unique dans l'alignement approprié pour l'addition de l'aminoacide à la chaîne protéinique

en cours d'accroissement.

Le rapport de codage des nucléotides aux aminoacides présente un intérêt particulier en ce qui concerne la présente invention Comme il a été indiqué ci-dessus,

ce rapport est de trois nucléotides codants pour un amino-

acide Comme il est nécessaire de coder pour vingt amino-

acides différents avec seulement les quatre types de nucléotides disponibles (A, U, G, C), trois représentent le rapport minimum acceptable Un rapport de codage d'un nucléotide pour un aminoacide ne permettrait d'obtenir que quatre des vingt aminoacides nécessaires pour la synthèse des protéines Un rapport de codage de deux donnant 16 ( 42) combinaisons n'atteint pas lui non plus la complexité nécessaire Cependant, avec un rapport de codage de trois, 64 ( 44) combinaisons différentes sont possibles Cet excès de vingt mots de code confère au

code génétique un état connu sous le nom de dégénérescence.

Un code dégénéré contient plusieurs mots de code diffé-

rents pour le même aminoacide Il n'existe cependant

pas de cas o un mot de code spécifierait deux amino-

acides différents Le code peut être dégénéré, mais il

n'est pas ambigu.

Connaissant la séquence des nucléotides d'un ARN messager, il est possible d'écrire explicitement la séquence des aminoacides qui y sont codés, mais l'inverse n'est pas vrai En raison de la dégénérescence du code génétique, un certain nombre de séquences de nucléotides seraient compatibles avec une séquence d'aminoacide donnée Considérons par exemple les fragments de m ARN provenant du même gène chez deux individus différents

"Al" et "B".

INDIVIDU "A" INDIVIDU "B"

m ARN (UUC CCC CGA GUU CUA AAG) (UUU CCG AGG GUC CUU AAG) protéine (phepro-arg-val-leu (phe-pro-arg-val-leu-lys) lys) L'analyse de la protéine indiquerait que les deux individus sont identiques, tandis que l'analyse de la séquence de m ARN indiquerait de nettes différences Tout essai de paternité basé sur une analyse des protéines

qu'elle soit immunologique ou biochimique, ne parvien-

drait pas à distinguer entre les deux individus Un essai basé sur l'analyse de la matière-génétique, soit i'ARN, soit de préférence l'ADN, permettrait de faire

une telle distinction.

Bien que la discussion ci-dessus se soit concentrée sur la détermination de la paternité chez l'homme, il doit être maintenu présent à l'esprit que ces essais, moyennant les réactifs appropriés, peuvent être étendus pour inclure certaines autres espèces animales (par

exemple, des chevaux, des vaches, des chiens, etc).

En ce qui concerne la présente invention, en raison de la démarche originale qui est adoptée, le mode opératoire d'essai est applicable à la détermination d'une filiation dans tout groupe d'organismes à reproduction sexuée y

compris des plantes ainsi que des animaux.

Dans une application supplémentaire de la présente invention, l'identité génétique des individus peut être établie Cette application est particulièrement utile

dans le domaine de la science légale o pour l'identifi-

cation de souches de microorganismes, de plantes ou d'animaux. Le but de la présente invention est de fournir un essai nouveau et amélioré pour la détermination de la paternité dans des organismes à reproduction sexuée et d'établir l'identité génétique individuelle Ces objectifs sont atteints en analysant l'ADN de cet organisme en ce

qui concerne une ou plusieurs régions génétiques poly-

morphes, en différenciant les polymorphismes par la

taille relative-des régions génétiques, et en caractéri-

sant ainsi un membre individuel de l'espèce.

Dans un mode de réalisation, les ADN dérivant du descendant, de la mère et par exemple du père putatif, sont digérés séparément avec une ou plusieurs enzymes de restriction et les fragments obtenus sont séparés par taille en les faisant migrer à travers une matrice de gel sous l'influence d'un courant électrique Les polymorphismes sont détectés en hybridant les ADN traités ci-dessus avec des ADN "sondes" marqués (par exemple radioactifs). Les ADN sondes sont des fragments d'ADN variables qui ont été réunisà un ADN vecteur qui est capable de se répliquer dans une cellule hôte (par exemple, le plasmide p BR 322, le bactériophage lambda ou M 13 dans Escherichia coli, ou SV 40 dans les cellules du

singe), puis débarrassés des cellules hôtes.

Les ADN sondes ayant réagi permettent de visualiser la position, et par conséquent les tailles, des-fragments d'ADN du descendant, de la mère, et du père putatif, dont les séquences sont homologues à celles des ADN sondes Comme les ADN sondes ont été choisis parce qu'ils sont un allèle provenant d'un locus polymorphe, les tailles des fragments d'ADN homologues à ceux des

sondes varieront entre les individus.

Tous les fragments d'ADN que possède le descendant dériveront soit de la mère soit du père du descendant, sauf mutation et certains autres événements rares Une comparaison des tailles des fragments d'ADN détectés par les ADN sondes permet ainsi de déterminer si oui ou non le père putatif peut être le père biologique Par exemple, l'ADN du descendant donne un fragment de paire de base 8600 homologue à un fragment de l'ADN sonde, et si l'ADN de la mère est dépourvu de ce fragment, 1 'ADN du père biologique doit alors le contenir Si l'ADN du père putatif est dépourvu de ce fragment,

il peut être exclu en tant que père biologique.

Dans un autre mode de réalisation, on peut comparer des échantillons d'ADN provenant d'un suspect et d'indices physiques (sang, peau, sperme, etc) sur les

lieux d'un crime, en utilisant les sondes décrites ci-

dessus, pour établir l'identité entre les échantillons et le suspect Ainsi, le polymorphisme de l'ADN en ce qui concerne l'essai d'hybridation fournit au scientifique légal une "empreinte moléculaire" à faire figurer avec

le reste de l'analyse des indices physiques.

Dans un autre mode de réalisation, on compare un échantillon-d'ADN provenant d'un individu avec l'ADN provenant d'autres membres d'une souche d'organisme sur la base de la taille relative en vue d'établir l'identité

de la souche de cet individu.

La figure 1 représente l'autoradiographie décrite dans l'exemple VII, -la figure 2 représente l'autoradiographie décrite dans l'exemple VIII; et la figure 3 représente l'autoradiographie décrite

dans l'exemple IX.

Dans un de ces modes de réalisation, la présente invention se compose de quatre stades reliés entre eux isolement et restriction de l'ADN; électrophorèse sur gel et séchage de l'ADN; hybridation et lavage; et

finalement autoradiographie.

Isolement et restriction de l'ADN

L'isolement de l'ADN des échantillons de cellules-

est effectué par les modes opératoires reconnus dans la technique La préparation de l'ADN met en jeu une lyse des cellules, des extractionspar le dodécyl sulfate de sodium et le perchlorate de sodium, par le chloroforme/

alcool isoamylique, et une précipitation par l'éthanol.

Après sa préparation, chaque échantillon d'ADN est

soumis à une analyse avec une ou ou plusieurs endo-

nucléases de restriction Les endonucléases de restriction sont des enzymes qui reconnaissent des séquences spécifiques courtes d'environ 4 à 7 paires de bases nucléotides et qui clivent l'ADN ou ces emplacements ou à proximité de ces emplacements Bien qu'il existe plus de deux cents enzymes de restriction entre lesquelles on peut choisir, le choix d'une enzyme particulière à utiliser dans l'essai dépendra du type d'ADN échantillon,

du nombre de fragments nécessaires et de la disponibi-

lité et du coût des réactifs.

Le genome humain, qui se compose d'environ 6 xl O 9 paires de bases d'ADN, sera clivé en 106 à 10 fragments discontinus dont la taille va de 102 à 105 paires de bases par une endonucléase de restriction unique La complexité d'un tel produit de digestion reflète le nombre et l'emplacement des points de clivage spécifiques

de l'endonucléase dans l'échantillon d'ADN Une iden-

tification exhaustive de chaque fragment à partir de traitements parallèles mettant en jeu un certain nombre d'endonucléases différentes conduirait en théorie à une "empreinte moléculaire" qui serait unique pour chaque être humain Bien que théoriquement possible,

une telle analyse détaillée est impraticable La pré-

sente invention surmonte ce problème en permettant

l'analyse d'une sous-série des produits de clivage-

existants Pour utiliser le jargon de la technique de l'ingénierie génétique, on dit que l'on "sonde" les produits de clivage existants pour y chercher l'existence d'une séquence de nucléotide unique présentant de l'intérêt Un procédé bien connu pour effectuer cette

analyse est la technique de séchage de Southern.

Electrophorêse sur gel et séchage-

Conformément au procédé de Southern (J Mol Biol.

98:503-17) ( 1 '975)), les fragments d'ADN à-deux brins

obtenus par le traitement par l'endonucléase de restric-

tion sont séparés par taille par électrophorèse dans un gel d'agarose, et l'ADN est tranformé en ADN à brin unique en plongeant le gel dans un alcali Le gel est placé à plat sur une "mèche" de papier filtre reliée à une cuvette allongée contenant une solution de sel concentrée. Une feuille unique de nitrate de cellulose est alors placée sur les gels et une pile importante de serviettes de papier absorbant sèches sont placées à plat au-dessus du nitrate de cellulose La solution de sel est aspirée par les serviettes de papier absorbant,

traversant le gel et la feuille de nitrate de cellulose.

Au fur et à mesure que la solution traverse le gel, l'ADN à brin unique est extrait du gel et passe sur le filtre de nitrate de cellulose Le nitrate de cellulose a la propriété de lier l'ADN à brin unique, de sorte quel 'ADN est extrait du gel et passe sur le filtre de nitrate de cellulose Le nitrate de cellulose a la propriété de lier l'ADN à brin unique, de sorte que tout l'ADN adhère à ce support Le résultat final de

cette opération est une réplique parfaite de l'ADN -

provenant du gel d'agarose initial, mais l'ADN est à présent à brin unique et il est immobilisé sur la feuille filtrante de nitrate de cellulose La répartition des tailles de l'ADN provenant du gel d'agarose- initial est cependant fidèlement conservée Les tailles'de fragments peuvent être calibrées en comparaison avec des ADN marqueurs de tailles connues ll Hybridation et lavage On dit qu'une réaction d'hybridation se produit lorsque deux ADN à brin unique provenant de sources différentes se réassocient pour former un ADN à double brin grâce à l'appariement des bases complémentaires entre les deux brins inter-agissant Des hybrides ADN/ ARN peuvent aussi se former par des associations analogues. En ce qui concerne la présente invention, on effectue une hybridation ADN/ADN Une source de matière contribuante pour la réaction d'hybridation est l'ADN à brin unique présent dans les séchages de Southern des fragments de restriction Les autres sources de brins d'hybridation sont les ADN "sondes" Ces ADN représentent

des fragments d'ADN variables choisis parce qu'ils repré-

sentent des séquences correspondant à un allèle d'un

locus de gène polymorphe Une description complète de

l'isolement et de la caractérisation des "sondes" est

présentée dans une section ultérieure de ce mémoire.

On utilise dans la technique diverses conditions d'hybridation, parmi lesquelles le formamide à 50 pour cent à 40-50 C ou un sel modéré à 6568 C Du sulfate de dextranne peut être utilisé pour augmenter la vitesse de réassociationo Après hybridation, les filtres sont lavés de manière poussée pour éliminer les sondes de fond (non hybrides) L'opération de lavage est effectuée à chaud et avec des concentrations en sel réduites pour

éliminer également les hybrides ADN/ADN non spécifiques.

Préparation des ADN sondes Comme il a été indiqué précédemment, les ADN sondes représentent des fragments d'ADN variables choisis parce qu'ils constituent un allèle d'une région génétique polymorphe Dans ce contexte, le polymorphisme est un polymorphisme de longueur La variabilité de longueur des fragments résulte d'une différence dans le nombre et/ou

la situation des emplacements de restriction de l'endo-

nucléase qui ont été attaqués pendant la formation des fragments Ainsi, si tous les individus possédaient un fragment d'ADN de taille similaire qui s'hybride avec l'ADN sonde, la région serait considérée comme monomorphe et de peu d'utilité en ce qui concerne la présente

invention Au contraire Les individus possèdent des frag-

ments d'ADN de tailles différentes qui s'hybrident avec les fragments d'ADN sonde; par conséquent ce fragment peut être considéré comme représentant un allèle d'une région génétique qui présente un polymorphisme de taille L'évaluation des sondes est alors d'une importance déterminante et peut être considérée comme consistant en deux opérations reliées entre elles de génération de la

sonde et d'identification de la sonde.

Génération de la sonde La génération des sondes peut s'effectuer par des modes opératoires admis dans la technique pour la

construction d'une collection de fragments d'ADN clonés.

Les opérations comprennent normalement: la digestion d'un échantillon d'ADN avec une endonucléase spécifique, la récupération de fractions d'ADN de taille appropriée à partir du produit de la digestion,-la précipitation des fragments, l'introduction des-fragments dans un vecteur de clonage approprié, la transformation d'un

organisme hôte compétent avec le vecteur, et la récupé-

ration de colonies contenant l'ADN sonde cloné Il existe des endonucléases et des vecteurs très divers

qui peuvent être utilisés dans la génération des sondes.

Les procédés pour effectuer le clonage sont bien connus dans la technique (voir par exemple, Nolecular Cloning A Laboratory Manual, T Maniatis, et coll, Cold Spring Harbor lab 1982) Deux sondes d'ADN humain générées de cette manière sont les p AW 101 et p LM 0,8 Des échantillons de E coli abritant p AW 101 et p LM 0,8 ont été déposés à l'American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland le 8 fvrier 1984 o elles ont reçu les numéros ATCC 39605 et ATCC 39604 respectivement, et les droits nécessaires ont été payés L'accès aux cultures sera possiblependant que la demande de brevet est en cours d'examen aux personnes autorisées par le Commissaire en vertu de 27 C F R 1 14 et 35 U S C. 122 Toutes les restrictions sur la disponibilité de cette culture au public seront irrévocablement levées lors de la délivrance de la présente demande et cette culture restera en permanence disponible pendant la durée de ce brevet Si la culture devenait non viable ou était détruite par inadvertance, elle serait remplacée par une ou plusieurs cultures viables ayant la même

description taxonomique.

On peut aussi utiliser des sondes de c ADN Ces sondes sont initialement générées à partir de l'ARN par une opération de copiage inverse détaillée dans l'exemple II ci-après ou dans la publication EPO

No 0 084 796.

Quel que soit le procédé utilisé pour générer les sondes, dès qu'elles sont obtenues, chaque-sonde doit être soumise à un examen de son utilité dans le

-mode opératoire d'essai.

Identification des sondes utiles Pour évaluer l'efficacité d'une sonde particulière

provenant d'une collection de sondes générées ci-

dessus, de l'ADN est isolé de quatre individus différents et mis à digéré séparément avec une endonucléase de restriction Ces ADN sont soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose, en faisant passer un-mélange de trois des ADN des individus dans un chemin et-un échantillon

du quatrième individu dans un chemin ad-jadent.

Les ADN soumis à l'électrophorèse sont séchés comme il a été décrit précédemment Un ADN à brin unique est isolé d'un clone individuel choisi dans le groupe de sondes potentielles contenant des clones générés cidessus L'ADN sonde est marqué et utilisé pour l'hybridation avec l'ADN soumis à l'électrophorèse *des quatre individus Si la sonde essayée donne davantage de bandes dans le chemin avec les trois ADN des individus que dans le chemin avec l'ADN d'un individu, elle devient-un candidat pour la détection des polymorphismes Des sondes identifiées par le mode

opératoire précédent sont en outre essayées par hybrida-

tion contre une population suffisamment importante d'individus d'essai pour déterminer effectivement le degré de polymorphisme Des sondes correspondant à des régions comportant au moins quatre allèles différents présentes dans la population avec des fréquences supérieures à 10 %

chacune sont incorporées dans l'essai.

Conformément à un mode de réalisation préféré de l'invention, une collection de sondes polymorphes sont utilisées plutôt que de se baser sur une sonde polymorphe unique Cette utilisation de sondes multiples augmente

la sensibilité de l'essai-d'une manière spectaculaire.

Par exemple, si l'on utilise dix sondes différentes, et que chaque sonde identifie une région polymorphe

constituée de huit allèles apparaissant avec des fré-

quences égales, environ un million d'individus pourraient

être identifiés d'une manière unique.

Les paramètres à évaluer lorsqu'on choisit une sonde particulière pour l'inclusion dans la collection comprennent le degré de polymorphisme, c'est-à-dire le nombre d'allèles et les fréquences avec lesquelles

les -allèles sont présents dans la population à essayer.

La simple existence d'un grand nombre d'allèles, par exemple 60 en unlocus de sonde particulier ne garantirait pas en soi qu'une sonde est utile si, par exemple, 99,9 pour cent de la population à essayer possédaient un allèle et les 0,1 % restants étaient répartis parmi les 59 autres allèles Ainsi, la fréquence d'apparition des

divers allèles est une considération importante.

Le nombre de sondes individuelles dans une série de sondes peut être très important, 100 ou davantage, des limitations pratiques restreindraient le nombre à une valeur de 1 à environ 40, et de préférence de 1 à

environ 20.

Le nombre d'allèles par locus génétique polymorphe peut être important, de 2 à environ 60 ou davantage, mais de préférence de 2 à environ 40 On préfère que

les allèles apparaissent avec une fréquence approxima-

tivement égale.

Autoradiographie L'hybride est visualisé par autoradiographie Avant l'hybridation, les ADN sondes sont marqués avec un isotope radioactif, habituellement 32 P L'activité spécifique

d'environ 108 comptages par minute par pg d'ADN est néces-

saire et met normalement en jeu le marquage avec au

moins deux nucléotides marqués (TTP et d CTP, 400 Ci/mmole).

La sonde hybridée radioactive est localisée en utilisant

des modes opératoires reconnus dans la technique consis-

tant à exposer une pellicule aux émissions radioactives.

Les hybrides radioactifs prennent essentiellement leur

image, d'o le terme d'autoradiographie Bien que l'auto- radiographie soit un mode opératoire reconnu dans la technique pour la

localisation des molécules hybrides, l'invention n'est pas limitée à ce mode d'analyse particulier Les hybrides intéressants peuvent être détectés par n'importe quel réactif analytiquement détectable approprié Par exemple, la détection par

fluorescence, des réactions colorimétriques, des-

réactions immunologiques ou des enzymes ou d'autres.

réactifs marqués par les protéines sont également

utilisables dans la détection des sondes hybridées.

EXEMPLE I

Cet exemple illustre l'isolement de l'ADN de sang périphérique humain L'ADN ainsi isolé est utile pour

l'évaluation de l'ADN sonde.

10 à 20 ml de sang périphérique sont recueillis en utilisant de l'EDTA (acide éthylène-diamino-têtra acétique disodique) comme anticoagulant (le sang peut être traité immédiatement ou congelé à 70 C) On fait passer le sang dans un tube de 50 ml et on ajoute un volume égal de tampon à lyse (Mg C 12 lm M;

Na H 2 PO 4 1 m M, p H 6,5; Nonidet P-40 0,8 %; acide -

désoxycholique, sel de sodium 0,4 %) On retourne le tube

à 50 fois pour mélanger soigneusement.

On fait passer le mélange dans un tube en matière plastique Sorvall de 50 ml et on le fait tourner dans

un rotor SW 34 à 10 000 t/mn ( 12 000 g) pendant 30 minutes.

On jette le liquide surnageant et on met le culot de centrifugation en suspension dans 10 ml de TNE ( Tris m M, p H 8,3; Na Cl 150 m M; EDTA 5 m M) Le culot est désagrégé en agitant violemment le tube On ajoute 1,5 ml de SDS à 10 % (concentration finale 1,0 %) et on retourne plusieurs fois On ajoute 3 ml de:Na Cl O 4 5 M (concentration finale 1,0 M) et on mélange On ajoute ensuite un égal volume de chloroforme:alcool isoamylique ( 24:1) et on place le tube dans un agitateur "gyrotory" New Brunswick à 3500 t/mn pendant 15 minutes Les phases sont séparées par rotation pendant 10 minutes à 3000 t/

mn dans une centrifugeuse Damon.

La phase aqueuse (supérieure) est éliminée avec une pipette de 10 ml retournée, sans coton (une pipette de Pasteur siliconée peut également être utilisée) et transférée dans un tube de 50 ml frais La phase organique (inférieure) est jetée, un volume égal de Chl:IAA ( 24:1)

est ajouté et extrait et séparé comme précédemment.

L'extraction est répétée jusqu'à-ce que l'interphase après séparation des phases soit limpide Ceci exige

habituellement 3 à 5 extractions.

La phase aqueuse provenant de l'extraction finale est transférée dans un bécher en matière plastique On ajoute 2 à 2,5 volumes d'Et OH à 95 % à 20 C en le versant lentement le long du bord, ce qui produit deux phases; une phase d'ADN aqueux au fond et une phase de Et OH au-dessus On fait tourner un agitateur de verre propre et sec dans cette solution jusqu'à ce que les deux phases se mélangent L'ADN précipite à l'interface aqueux - Et OH et il est recueilli sur l'agitateur Lorsque les deux-phases se sont mélangées, l'agitateur est retiré

et séché à l'air pendant 10 minutes.

L'agitateur est placé dans un tube de 15 mi et recouvert de parafilm Trois trous sont percés dans le parafilm avec une aiguille de calibre 18 et l'échantillon est desséché pendant 20 minutes Le parafilm est retiré et l'on ajoute 0,5 à 1,0 ml de SSE 0,01 X (Na Cl 1,5 m M; EDTA 0,15 m M; p H 7,0) L'échantillon est bouché et mis

en suspension une nuit à 4 C sur un agitateur Ames.

La quantité d'ADN en suspension est déterminée-en enregistrant la densité optique d'une dilution à 1/20 de l'échantillon On ajoute 25 p 1 de la suspension d'ADN à 475 1 pl d'eau distillée, on les fait passer dans une cuvette et on enregistre la densité optique à 260, 270 et 280 en utilisant une cuvette remplie de SSE 0,01 X pour la mise à zéro de chaque lecture La concentration en ADN dans la suspension en mg/ml (pg/pl) est égale à la lecture d'une dilution à 1/20 à la densité optique

260, car la densité optique 260 de 1 000 = 50 pg/ml.

On effectue une dilution pour maintenir la densité -

optique 260 entre 0,100 et 1000, région o la corrélation entre la concentration d'ADN et la densité optique est linéaire Les lectures de densité optique au-dessus de 1500 ne sont pas précises La densité optique 260/280 doit être de 1,8 ou davantage et mesure la quantité de contamination par les protéines Par exemple les densités optiques suivantes ont-été enregistrées à partir de 0,5 ml d'une dilution à 1/20 de suspension de l'ADN à partir de-sang périphérique: 260 270 280 260 260 concentration

270 280

0,350 0,280 0,190 1,25 1,84 0,35 pg/pl 0,350 x 50 pg/ml x 20 = 350 pg/ml = 0,35 pg/pl

EXEMPLE II

Cet exemple illustre un procédé de génération de

sondes d'ADN humain.

A Isolement de l'ARN messager 1 On met en suspension entre 107 et 108 cellules humaines dans 2 ml de Ringer refroidi à la glace et on

les centrifuge à 2000 X g pendant 5 minutes à 4 C.

2 Après aspiration du liquide surnageant, on met les cellules en suspension dans du tampon à lyse refroidi à la glace Le tampon étant constitué de: Na Cl 0,14 M Mg C 12 1,5 m M Tris-Cl 10 m M, p H 8,6 Np-40 0,5 % 1000 unités/ml de R Nasin (Biotec) 3 On soumet la suspension à un vortex pendant secondes puis on fait passer par en dessous une couche d'un volume égal de tampon à lyse contenant du sucrose ( 24 % p/V) et NP- 40 1 % et on la stocke sur

de la glace pendant 5 minutes.

4 On centrifuge la suspension à 10000 QOX g pendant

minutes à 4 C dans un rotor à godet basculant.

On récupère la couche supérieure (cytoplasmique)

trouble et on ajoute un volume égal de tampon 2 X PK.

Tampon 2 X PK: Tris-Cl 0,2 M, p H 7,5 EDTA 25 m M Na Ci 0,3 M

S.D S 2 %

Après quoi on ajoute de la protéinase K à une concentration finale de 200 pg/ml et on fait incuber à 37 C pendant 30 minutes. 6 On extrait ensuite la couche une fois avec du phénol/chloroforme et on récupère la couche aqueuse, à laquelle on ajoute 2,5 volumes d'éthanol et on la

conserve à -20 C pendant au moins deux heures.

7 On centrifuge la fraction pendant 10 minutes à 5000 X g à O C et on lave le culot de centrifugation obtenu avec de l'éthanol à 75 % contenant de l'acétate de sodium 0,1 M. 8 On redissout les acides nucléiques dans un faible volume (environ 50 p 1) de: Tris-Cl 50 m M, p H 7,5 EDTA 1 m M 9 A la fraction remise en suspension, on ajoute Mg C 12 jusqu'à une concentration finale de 10 m M et du R Nasin (Biotec) jusqu'à 2000 unités/ml On fait ensuite

incuber la suspension pendant 30 minutes à 37 C.

Après incubation, on ajoute de l'EDTA et du SDS jusqu'à une concentration finale de 10 m M et de

0,2 %, respectivement.

11 On extrait la suspension avec du phénol/chloro-

forme et on ajoute de l'acétate de Na p H 5,2 jusqu'à 0,3 M et on fait précipiter les acides nucléiques avec

2 volumes d'éthanol.

12 o On conserve 'ARN dans de l'éthanol à 70 %

à 70 C.

B Choix de 'ARN poly A+ 1 On met en équilibre de l'oligo (d T)-cellulose dans un tampon de charge 2 x stérile Le tampon est

composé de Tris-Cl 40 m M, p H 7,6.

Na Cl 1,0 M EDTA 2 m M

SDS 0,2 %

2 On utilise l'oligo-(d T)-cellulose pour former une colonne de 1 ml et on la lave avec 3 volumes de colonne constitués chacun de: a) eau stérile b) Na OH 0,1 M/EDTA 5 m M c) eau stérile

3 Le p H de l'effluent doit être inférieur à 8,0.

4 La colonne est ensuite lavée avec 5 volumes de

tampon de charge.

L'ARN isolé au stade A est dissous dans de l'eau stérile et chauffé à 650 C pendant 5 minutes On ajoute ensuite un volume égal de tampon de charge 2 x et on

refroidit l'échantillon à la température ambiante.

(environ 25 C).

6 On applique ensuite l'échantillon à la colonne

et on recueille le liquide traversant Le liquide traver-

sant est ensuite chauffé à 65 C, refroidi et réappliqué

sur la colonne.

7 On lave ensuite la colonne avec 5 à 10 volumes de tampon de charge puis avec 4 volumes de tampon de charge contenant Na Cl 0,1 M.

* 8.: On recueille les fractions et on lit la D O 260.

La fraction initiale contiendra du poly(A) ARN à concen-

tration élevée tandis que les dernières fractions ne

contiendront que peu ou pas du tout de matière absor-

bante à la D O 260.

9 On élue le poly(A) ARN de la colonne avec 2 à 3 volumes de mélange stérile Tris-C 1 10 m M, p H 7,5 EDTA i m M

S.D S 0,05 %

On ajoute de l'acétate de Na ( 3 M, p H 5,2) à l'éluant-jusqu'à une concentration finale de 0,3 M

et on ajoute ensuite 2,2 volumes d'éthanol.

11 On centrifuge l'ARN à O C à 5000 X g pendant

minutes.

12 On redissout le culot de centrifugation dans de l'eau ( 10 cellules donnent 1-5 pg de poly(A) ARN) C Synthèse du premier brin d'ADN 1 Les conditions de réaction ci-dessous supposent une quantité de départ de 50 pg de poly A+m ARN Pour des quantités supérieures ou inférieures à 50 pg,, le mélange

réactionnel peut être dimensionné proportionnellement.

2 Mélange de réaction comprenant: Réactif Quantité à Concentration ajouter finale d.'r P r MY 25 1 500 PM d GTP 10 m M 25 p 1 500 1 M d TTP 10 m M 25 1 500 PM d CTP 2 MM 25 1 100 p M Tampon transcriptase inverse 5 X Tris 250 m M p H 8,2 K Cl 250 m M, 30 m M Mg C 12 DTT 200 m M Poly(A) m ARN R Nasin (Biotec) Inhibiteur de la R Nase placentaire Transcriptase inverse

du virus de la myléo-

blastose aviaire Oligo(d T) 12-18 600 kg/ml 32 p-d CTP Eau distallêe H 20 tris 50 m M KC 1 50 m M Mg C 12 6 m M ( 50 pl pg 1 pg) m M p 1 pl 300 I/ml 37,-5 i 11 45 pg/ml 1-10 p Ci/500 p 1 de mélange réactionnel jusqu'au volume final: 500 p 1 3 La réaction est effectuée dans un tube d'Eppendorf

silicone de 1,5 ml et amorcée par l'addition du m ARN.

4 Le mélange réactionnel est mis à incuber à 42 C pendant 60 minutes, puis on ajoute 10 pl de EDTA 500 m M pour arrêter la réaction. On précipite 1 pi du mélange réactionnel avec du T C A et on le compte pour déterminer le rendement de la synthèse du premier brin En général, on obtient

un rendement de 17 à 25,%, atteignant rarement 40 %.

6 10 p Ci de 32 P-d CTP/500 1 pl donnera une activité

spécifique de 2,2 x 106 cpm/pg de l'ADN à un seul brin.

L'activité spécifique permet de maintenir le produit

au stade ultérieur sans perdre trop du c ADN.

7 L'échantillon est extrait deux fois avec un

égal volume de phénol saturé de Tris 50 m M, p H 8,0.

8 Le phénol est extrait deux fois avec des volumes d'éther Apres quoi on ajoute de l'acétate de Na 3 M pour faire 0,3 M. 9 On ajoute trois volumes d'éthanol à 95 % et on place le mélange sur de la glace sèche-éthanol

pendant 5 à 10 minutes puis on le réchauffe à la tempéra-

ture ambiante.

On fait tourner le mélange dans-une micro-

centrifugeuse pendant 15 minutes, après quoi on jette

le liquide surnageant et on lave le culot de centrifuga-

tion avec de l'éthanol à 75 %.

11 On redissout l'ADN dans 0,5 ml d'acétate de Na

300 m M et on répète les stades 9 et 10.

12 On remet l'ADN en suspension dans 200 ml d'eau distillée, on l'étale en couche sur un gradient de

sucrose alcalin à 5-20 % (Na OH 30 mn M, EDTA 2 m M) et on.

le fait tourner pendant 40 minutes dans un rotor SW-40

-à 37 000 t/mn à 4 C.

13 On recueille des fractions de 0,5 ml du haut du gradient et on les place dans 25 pl de Tris 1 M, p H 6,8

et on compte chaque fraction.

14 On élimine 5 000 à 10000 comptages par minute de chacune des autres fractions et on les fait passer sur un gel d'agarose alcalin Ceci permet d'effectuer une estimation de la répartition des tailles En général, on jette les fractions qui ont du c ADN de moins de 500 nucléotides Des fractions particulièrement utiles (c'est-à-dire d'au moins 500 nucléotides de long) apparaissent habituellement à la fraction 12 à partir du bas du tube Par conséquent, pendant que le gel chemine et se développe, les fractions 1 à 10 (y compris le culot de centrifugation) sont réunies et dialysées contre 2 litres d'eau,les fractions 11, 12, i 3 et 14 sont également dialysées, mais individuellement Le diagramme de gel indique si une réunion de fractions supplémentaires est nécessaire ou non En général, la matière supérieure à 500 nucléotides représentera % des comptages précipitables par le TC Ao Le ss c ADN est alors concentré avec du butanol secondaire jusqu'à un volume d'environ 400 pl, puis

on extrait le butanol par de l'éther.

16 On ajoute à l'extrait 40 pl d'acétate de Na 3 M et on remplit le reste du tube avec de l'éthanol à 95 % On précipite sur de l'éthanol glace sèche pendant 5 minutes puis on place le tube dans un godet rempli d'eau d'un rotor SW-27 et on centrifuge à

25.000 tours/minute pendant 60 minutes.

17 On décante liéthanol et on le compte L'éthanol doit contenir moins de 1 % des comptages On lave le culot de centrifugation à l'éthanol et on compte à nouveau la solution de lavage Moins de 1 % des comptages doivent être éliminés Tous les comptages doivent rester dans le culot de centrifugation qui est liophylisé pendant 10 à 20 minutes, puis remis en suspension dans

100 pi d'eau.

D Synthèse du second brin avec du klenow 1 Le mélange réactionnel cidessous est destiné à un mélange-réactionnel de 1 ml à une concentration

de ss c ADN de 2 à 5 pg/ml.

Réactif Quantité Concentration à ajouter finale d ATP,10 m M, TTP, CTP, GTP RKC 1 700 m M mercaptoéthanol 5 m M

(ajouter 1,8 pl de solu-

tion de réserve Eastman ( 14 M) à 5 ml de H 20 pour donner 5 m M)

Tampon Klenow 10 x -

Tris 300 m M, p H 7,5 Mg Cl 2 40 m M Polymérase de Klenow BoehringerMannheim SS c ADN eau distillée pi pi i 1 pl 500 pi: m M 0,5 m M Tns 30 m M Mg C 12 4 m M -200 unités/ml 2,5 pgg pour un volume final de 1000 pil 2 On fait incuber le mélange réactionnel à 18-20 C

pendant 5 à 6 heures.

3 On extrait le mélange deux fois avec du phénol-

Tris p H 8 et de l'éther.

4 On met de côté une partie aliquote ( 2-10 000 cpm)

pour l'analyse sur gel.

Le reste de l'extrait est dialysé une nuit contre-

de l'eau dans un sac de collodion.

E Réaction 51 1 Le volume du mélange réactionnel de Klenow du stade D augmentera à 5-6 ml au cours de la dialyse Le volume est ajusté jusqu'au ml supérieur suivant avec d H 20 et on ajoute un dixième de volume de tampon 10 x 51 Na Cl 3 M Acétate de Na 0,3 M, p H 4,5 Zn C 12 100 m M 2 On ajoute de la 51 nucléase (Sigma) à une concentration finale de 10 unités/ml et on la fait incuber à 37 C pendant 30 minutes, et on arrête la réaction par addition de EDTA 500 m M jusqu'à une concentration finale de 100 m M On met de côté une

partie aliquote pour l'analyse sur gel.

3 On extrait le mélange réactionnel deux fois avec du phénol et deux fois avec de l'éther L'extrait est ensuite dialysé pendant 5 à 6 heures à température ambiante contre de l'eau avec au moins un changement d'eau, et concentré avec du butanol secondaire jusqu'à

400 pl environ.

4 L'échantillon est chargé sur un gradient de sucrose à 5-20 % neutre (Na Cl 0,1 M, Tris 10 m M, p H 7,5, EDTA 1 m M) et centrifugé à 37 000 tours/minute dans un

rotor SW-40 pendant 20 heures à 4 C.

5 On recueille des fractions de 0,5 ml du haut du tube Les fractions 1-14 contiendront environ 500 bps de ds c ADN On effectue des essais sur gel pour vérifier

la répartition des tailles.

6 Les fractions sont dialysées de manière poussée

pendant une nuit contre de l'eau distillée.

7 L'échantillon est concentré à 400 p 1 environ avec du butanol secondaire et précipité avec de l'acétate

de Na et de l'éthanol, deux fois Le culot de centrifu-

gation est lavé à chaque fois avec de l'éthanol à 75 %.

L'ADN doit être exempt de contaminant.

8 Le ds c ADN est alors lyophilisé.

F Réaction de traînée 1 Les conditions de réaction ci-dessous sont prévues pour 1 pg de ds c ADN et peuvent être dimensionnées

en conséquence.

Solutions de réserve: d( Tampon cacodylate 2 X: 250 pi 250 p 1 750 pi 1 Réactif Tampon de cacodylate 2 X c ADN ( 50 ng/ pi d CTP 50 p M Co C 12 20 p M* mg/ml de BSA exempt de BRL nucléase TP 50 p M Co C 12 10 m M Gacodylate de Na 1,2 M p H 7,19 avec H Cl DDT 1 m M H 20 2 Quantité à ajouter pl pi ( 1 ig)

pi 1-

1 pi 8 p 1 d H 2 O 68 pi Td T (Bethesda Res Lab) 44 pl (concentration finale 760 P/ml)

Ajouter Co C 12 juste avant le BSA sinon il précipitera.

2 On met à incuber le mélange réactionnel (-Td T)

à 20 C pendant 20 minutes.

3 On ajoute ensuite le Td T et on poursuit l'incuba-

tion pendant 20 minutes supplémentaires.

4 On arrête la réaction par addition de 8 pl d'EDTA 500 m M puis on extrait deux fois au phénol et

deux fois à l'éther.

On précipite l'échantillon comme ci-dessus avec

de l'acétate de sodium, de l'éthanol dans le rotor SW-27.

6 On lave le culot de centrifugation avec de l'éthanol à 7,5 %, on le lyophilise et on le remet en

suspension dans 50 pi d'eau distillée.

G Accolement du c ADN à queue au plasmide -d G 1 La réaction d'accolement est effectuée dans

des tubes capillaires scellés de 10 Pi -

2 Le mélange réactionnel comprend ds c ADN 1 pi ( 15 ng) plasmide 1 p 1 ( 20 ng) Tampon d'accolement 10 X Na Cl 1 M Tris 100 Mm, p H 7,5 EDTA 10 m M eau distillée 7 p 1 3 On fait incuber le mélange à 68 pendant 8 minutes puis à 42 C pendant 2 heures après quoi on arrête le bain-marie et on laisse le mélange réactionnel venir en équilibre avec la température ambiante ( 5 heures une nuit).

EXEMPLE III

Cet exemple illustre les procédés d'identification

de sondes qui sont utiles pour la détection de polymor-

phismes chez l'homme.

1 L'ADN est isolé du sang périphérique de quatre sujets humains différents comme il est décrit dans

l'exemple I.

2 Les quatre échantillons d'ADN sont restreints

séparément avec l'enzyme de restriction Eco RI conformé-

ment au mode opératoire suivant.

a) On ajoute les constituants suivants dans un tube d'Eppendorf de 1,5 ml: 1) Suffisamment de la solution d'ADN pour 10 pg

(habituellement entre 10 il et 50 l).

2) Eau distillée, si nécessaire pour ajuster le volume réactionnel final 3) La quantité appropriée du tampon de digestion de l'endonucléase 5 X spécifique préparé selon

les recommandations du fabricant.

4) Endonucléase de restriction dans un excès de 1,5 à 2,5 fois, c'est-àdire 15 unités à

unités pour une digestion de 10 Wg.

b) On soumet le mélange à un vortex pendant 1 à 2 secondes ou on donne quelques chiquenaudes au tube

pour effectuer le mélange.

c) On fait tourner le mélange dans une micro-

centrifugeuse Eppendorf pendant 10 à 15 secondes pour

transformer les réactifs en culot de centrifugation.

d) On-fait incuber le culot pendant 2 à 16 heures

à 37 C.

e) On-arrête la réaction pour la stocker en vue d'une électrophorèse future en ajoutant:

1) 1/10 volume de EDTA 0,1 M, p H 7,0, concentra-

tion finale 10 m M 2) 1/10 volume de SLS 5 %, concentration finale

0,5 %

3) 1/10 volume de Na Cl 3-M ou d'acétate de Na 3 M, concentration finale 0,3 M 4) 2 à 2,5 volumes de Et OH froid à 95 %,

concentration finale environ 70 % -

L'échantillon peut être stocké à -20 C pour une

durée pouvant atteindre plusieurs mois.

Les échantillons peuvent être précipités rapidement en plaçant un tube d'Eppendorf contenant l'ADN digéré, les réactifs d'arrêt et Et OH dans un bain de glace sèche-Et OH pendant 2 à 5 minutes suivant le volume jusqu'à ce que le Et OH soit visqueux, -Les échantillons

ne doivent pas être congelés On fait tourner l'échan-

tillon dans une microcentrifugeuse pour le transformer

en culot de centrifugation.

f) Pour arrêter la réaction, qui doit être chargée sur le gel aussitôt après digestion, ajouter une solution de colorant marqueur Ficoll 5 X à une concentration finale de 1 X Ceci est effectué avec des échantillons dans lesquels les volumes finaux sont inférieurs à

75 111.

g) Un mélange réactionnel typique est préparé comme suit: mg ADNH 20 Tampon 5 X Eco RI0,1 M 5 % 3 M 95 % / 1 EDTA SDS Na Cl Et O H 20 Pl 16 Pl 10 44 Pl 6,25 1 6,25 pl 7,0 Pl14,0 Pl et mis à incuber à 37 QC pendant 2 heures L'EDTA, le SDS, le Na Cl et l'Et OH sont ajoutés comme il est indiqué et on stocke à -20 C ou on ajoute 12,5 i 1 de colorant

marqueur Ficoll 5 X et on charge sur-gel.

3 On soumet les ADN à une électrophorèse comme il est décrit dans l'exemple II, en faisant passer 5 pg de chacun des trois ADN individuels suivant un chemin et 5 Pg d'ADN du quatrième individu dans un chemin adjacent. 4 Les ADN soumis à l'électrophorèse sont ensuite séchés conformément au procédé suivant a) L'ADN est dénaturé dans le gel en faisant passer le gel dans une capsule de séchage (pyrex ronde, x 100 mm) contenant 250 ml de KOH 1 M, Na Cl 0,5 14 et il est agité à 200 tours/minute à la température ambiante sur un agitateur "gyrotory" New Brunswick pendant 25 minutes pour un gel à 0,8 % à 30 minutes

pour un gel à 1,2 %.

b) Des feuilles de nitrocellulose prédécoupées

( 9,5 x 15 cm) sont placées dans 200-300 ml d'eau dis-

tillée pour les mouiller complètement.

c) La solution est décantée et est mise de côté (la solution KOH-Na Cl peut être utilisée pour dénaturer

jusqu'à 10 gels) Le gel est rincé à l'eau distillée-

( 200-300 ml) Toute l'eau de rinçage est éliminée avec une pipette de Pasteur On ajoute 250 à 300 ml de Tris 1 M, p H 7,0, et on poursuit l'agitation à la température

ambiante à 50 tours/minute pendant 35 minutes.

d) On neutralise le gel par décantation et on ajoute 250 à 300 ml de Tris 1 M, p H 7,0 et on continue à agiter pendant 30-minutes On met de côté les solutions de Tris et on les réajuste à p H 7,0 avec H Cl concentré

jusqu'à 10 fois.

e) Si on le désire on décante le gel, on ajoute 250-300 ml de Tris 1 M, p H 7,0 et on poursuit l'agitation

pendant 25 minutes.

f) On décante tout le Tris et on l'élimine avec une pipette de Pasteur On met le gel en équilibre en ajoutant 250-300 ml de 6 SSC (l X = Na Cl 0,15 M, Citrate de Na 0,015 M) et on agite pendant 20 minutes. g) On décante l'eau distillée de la nitrocellulose et on ajoute 100-200 ml de SSC 6 X. h) En utilisant un plateau de pyrex de 28 x 18 x 4 cm ajouter 600 à 700 ml de SSC 6 X On mouille une mèche de deux bandes de Whatman 3 M ( 15,5 x 38 cm) dans la solution de SSC 6 X On place une plate-forme de séchage en matière plastique ( 18,5 x 19, x t cm) au miiieu du plateau et on centre la mèche de Whatman 3 M sur la plate-forme de telle sorte que chaque extrémité soit immergée dans la solution de SSC 6 X. i) En portant des gants, on fait passer le gel de la capsule sur la mèche On frotte le gel avec les doigts

gantés pour assurer le contact entre le gel et la mèche.

j) La nitrocellulose pré-imprégnée (Schleicher et Schuell, Keene, N H) est placée sur le gel et disposée sur les chemins à sécher En frottant avec les doigts

gantés, on assure le contact du gel et de la nitrocellu-

lose et on évite l'apparition de bulles d'air Le gel qui ne doit pas être séché est découpé et jeté Trois morceaux d'une pipette d'un ml sont placés le long de chaque côté du gel pour éviter les courts-circuits Un morceau de Whatman 3 M ( 15,5 x 9,5) est mouillé et placé sur la nitrocellulose Un autre morceau sec de taille similaire de Whatman 3 M est ajouté Environ 10 cm de serviettes brunes de 10,5 x 12 cm (Singlefold Garland Sof-knit Towel No 237; Fort Howard Paper Company, Green Bay, Wis 54305) sont empilés sur le gel On recouvre au moyen d'un enroulement en matière plastique serré autour du plateau L'appareil est laissé pendant 3510 à 20 heures àla température ambiante La plateforme à 20 heures à la température ambiante La plate-forme

de séchage est placée au-dessus pour former poids.

k) Les serviettes sont retirées (certaines de celles du dessus peuvent être encore sèches) en même temps que deux morceaux de papier Whatman 3 M laissant à nu le papier de nitrocellulose Une lame de rasoir neuve est utilisée pour découper la feuille de nitrocellulose en trois bandes contenant 2 ou 3 chemins d'ADN ( 2 chemins chacune avec le formeur de puits à 8 chemins et 3 chemins chacune avec le formeur de puits à 10 chemins) Le coin inférieur gauche de chaque bande est entaillé pour permettre l'orientation et un, deux ou trois trous sont

percés au bas des bandes appropriées pour l'identifica-

tion Lorsque les bandes sont sèches, elles peuvent être marquées avec un crayon marqueur, 1) Les bandes sont placées dans 250 ml de SSC 2 X dans un plateau de séchage Chacun des côtés des bandes est frotté avec des doigts gantés pour éliminer des morceaux d'agarose Les bandes sont placées sur un papier filtre Whatman-No 1 poursécher à l'air pendant 10 à 20 minutes Les bandes sont ensuite placées entre deux morceaux de papier Whatman 3 M et enroulées dans une feuille d'aluminium L'extérieur est marqué avec un crayon marqueur et peut être placé sous vide dans un

dessicateur pendant une durée pouvant atteindre 6 mois.

5 Des E coli MC 1 061 portant des plasmides recombinants sont cultivés dans 100 ml de bouillon L à partir d'une colonie individuelle de la collection produite dans l'exemple II et de l'ADN de plasmide est isolé par le mode opératoire suivant: a) les cellules sont centrifugées à 5000 tours/ minute pendant 5 minutes à 00 C. b) Les cellules sont lavées avec 1/4 de volume de TE (Tris-H Cl 10 m M, EDTA i m, p H 8) à 00 C. c) Les cellules sont remises en suspension dans 3 ml de sucrose à 25 %, du TrisH Cl 0,05 M p H 7,5 à 0 C, et on ajoute 0,3 ml de lysozyme ( 10 mg/ml dans du Tris-HC 1 0,25 M, p H 7,5); après quoi on incube sur de la glace pendant 5 minutes en brassant doucement

de temps à autre.

d) On ajoute 1,2 ml de EDTA 250 m M, p H 8 et on

poursuit l'incubation sur de la glace pendant 5 minutes.

e) On ajoute 48 mi de solution de Triton: 2 ml de Triton X 100 (Sigma) à 10 % ml d'EDTA 250 m M p H:

135 ml d'H 20.

et on fait incuber sur de la glace pendant 10 minutes supplémentaires. f) On fait tourner le mélange pendant 30 minutes

à 25 000 tours/minute à O C.

g) On élimine le liquide surnageant et on ajuste le volume à 8,7 ml, après quoi on ajoute 8,3 g de Cs Cl et 0,9 ml de bromure d'éthidium à 10 mg/ml (sigma No E-8151) L'indice de réfraction doit être entre

1,390 et 1,396.

h) On centrifuge l'échantillon à 35-38 K à 20 C pendant 48-72 heures et on visualise les bandes en éclairant le tube avec une lumière ultraviolette de

grande longueur d'onde.

i)La bande inférieure qui contient l'ADN super-

enroulé est recueillie en ponctionnant latéralement

le tube avec une aiguille no 21.

6 Les recombinants p AT 153 -ADN humains sont marqués avec du 32 p par translation d'encoche comme il est bien connu dans la technique ("A Manual for Genetic Engineering Advanced Bacterial Genetics" par Davis, R W, Botstein, D et Roth, J R 1980 Cold Spring

Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N Y p 168 -170).

a) On place dans un tube de microcentrifugeuse pl d'eau moins le volume de solution d'ADN qui doitêtre ajouté.

b) On ajoute ensuite 2,5 pil du Tris 0,5 M p H 7,5,

Mg SO 40,1 M, p TT 10 m M, 500 pg/ml de BSA.

c) 2,5 pi d'une solution contenant chaque d NTP 0,2 m M après quoi on ajoute 100 mg d'ADN recombinant humain p AT 153 provenant du stade 5 cidessus. d) On prépare au préalable et stocke à -20 C une solution de réserve de D Nase: 1 mg/ml de D Nase dans du Tris 50 m M, p H 7,5 Mg SO 4 10 m M DTT 1 m M

et 50 % de glycérol.

e) La solution de réserve de D Nase provenant de (d) ci-dessus est diluée à O C à 1/40 000 dans du Tris 50 m M, p H 7,5, Mg SO 4 10 m M, DTT 1 nm M et 50 pg/ml de BSA, et on ajoute au mélange réactionnel 0,5 pl de la D Nase diluée. f) On ajoute 10 P Ci de chaque 32 p d NTP en solution aqueuse. g) On amorce la réaction entière par addition de 0,1 1 Pl de polymérase I d'ADN E coli à 2 mg/ml et on

fait incuber à 14 C pendant 3 heures.

h) On ajoute 25 pl de Na 3 EDTA 0,02 M d'ADN support

2 mg/ml et du SDS 0,2 % pour arrêter la réaction.

i) On introduit le mélange réactionnel dans une colonne de Sephadex G-50 (medium) de 0,7 x 20 cm prééquilibré avec du Tris Na 3 EDTA 10 m M à p H 7,5 (TE)

et lavé avec le même réactif.

j) On recueille des échantillons d'effluent de 0,5 ml dans des tubes depolypropylène L'ADN apparaît après 2 ml de lavage L'emplacement de l'ADN marqué au 32 p est suivi avec un détecteur manuel et on recueille

le premier pic en négligeant la traînée.

7 La sonde marquée provenant du stade 6 est hybridée aux ADN génomiques séchés provenant du stade 4 conformément au mode opératoire suivant: a) On prépare 300 ml de solution de pré-hybridation de la manière suivante: 1) 100 ml de PO 4 3 X -(Na 2 PO 4 0,75 M, Na H 2 PO 4 0,75 M, Pyrophosphate de Na 0,01 M) 2) 90 ml de SSC 20 X (Na Cl 3 M, Citrate de Na 0,3 M) 3) 92 ml d'eau distillée 4) 15 ml de BFP 0,5 % ( 0,5 g pour 100 ml de chacun des produits suivants: sérum albumine de boeuf, Ficoll, et polyvinylpyrolydone-360) ) 3 ml de ss ADN à 5 ug/pl (ADN de sperme de saumon dénaturé) On fait passer la solution dans un bac en matière plastique avec un couvercle ( 20 x 14,5 x 10,5 cm) et on la chauffe à 68 C au bain-marie On ajoute les filtres à hybrider et on les fait incuber de 4 à 6 heures

à 68 C.

b) Pour les bandes d'hybridation, 3 à 4 bandes sont enroulées autour d'un flacon de verre siliconé et inserrées dans un flacon à scintillation en matière

plastique contenant 2 ml de solution d'hybridation.

Pour l'hybridation des feuilles de nitrocellulose dans des sacs, on ajoute la quantité appropriée de la solution d'hybridation et on scelle le sac à la chaleur

au moyen d'un dispositif de scellement Sears.

La solution d'hybridation est préparée comme suit pour l'hybridation dans un flacon: 1) 80 Pl de BFP à 0,5 % 2) 20 Pl d'EDTA 0,1 M, p H 7,0 3) 20 pl de SDS à 10 % 4) 20 pl de ss ADN à 5 Ig/4 l ) sonde translatée à encoche 32 p variable pour

donner 2-4 x 106 comptages/ml.

6) Eau distillée variable pour faire 1900 1 l, faire

bouillir 10 minutes; mettre à la glace 7 minutes.

7) 100 pl SSC 20 X 2000 Di c) En portant des gants, on retire les bandes directement de la solution de pré-hybridation et on enroule les 3 ou 4 bandes appropriées autour d'un flacon de verre siliconé ( 19 x 48 mm avec capuchon) et on les insère dans un flacon à scintillation en matière plastique ( 28 mm de diamère) contenant la solution d'hybridation préparée. Du parafilm est enroulé autour du couvercle En tapotant plusieurs fois, on assure que les filtres sont tous au fond du flacon Les filtres sont mis à incuber à 24 heures à 680 C dans un bain-marie gyratoryr

New Brunswick avec une lente agitation (réglage numéro 3).

Note: S'il y a moins de trois bandes à enrouler autour du flacon, on peut ajouter une ou deux bandes témoins

qui ont été pré-hybridées.

d) Les filtres sont lavés dans SSC 2 X, SDS 0,5 % comme suit: On prépare 6 à 9 litres de solution de lavage selon le nombre de filtres à laver Dans une bonbonne de verre avec-robinet d'arrêt à la partie inférieure, on ajoute 1) 600 à 900 ml de SSC 20 X 2) 300 à 450 ml de SDS à 10 % 3) 5100 à 7650 ml d'eau distillée On place un barreau d'agitateur au fond et on suspend un thermomètre à partir du dessus On chauffe la solution

à 680 C sur une plaque chauffante, en agitant.

On recueille 1 à 1,5 litre de solution de lavage dans un bac en matière plastique Les filtres sont retirés après l'hybridation (en portant des gants) et plongés aussitôt dans une solution de lavage Les pinces Millipore sont utilisées pour dérouler et transférer

les filtres.

e) Les filtres sont transférés dans 1 à 1,5 litre Mv él II 7 ,ê j solution de lavage fraîche et mis incuber 7 à inutes à 68 C dans un bain- marie La première lu: icn de lavage est soigneusement jetée dans le tuyau t 'àvacuation avec beaucoup d'eau pour la balay f) Les filtres sont a nouveau transférés dans 1 a 1,5 litre de solution de lavage fra Iche On pour le transfert toutes les 7 à 12 minutes et on fait incuber a 68 C jusqu'à ce que toute la solution de

lavage soit utilisée ( 4 à 7 lavages).

0 g) Le transfert final s'effectue dans un litre solution de lavage contenant du SSC 0,1 X, du SDS à 0,5 % ( 945 ml d'eau distillée, 50 ml de SDS à 10 %, ml de SSC 20 X) chauffée à 68 C L'incubation

s'effectue à 68 C pendant 10 minutes.

h) Les filtres sont retires et rincés dans 500 1 SSC 2 X à la température ambiante Les filtres sont p sur une feuille de papier Whatman numéro 1 pour séch

à l'air pendant 15 à 30 minutes.

i) Les six bandes provenant des deux gels sont tapotées sur un papier jaune d'un emballage de pellit pour radiographie, marquées, recouvertes d'un enroul en matière plastique et placées dans une cassette av des écrans d'intensification incorpoç 6 s En chambre noire, la cassette est chargée avec une pellicule poi radiographie X-Omat AR de 20,3 x 25,4 cm en plaçant la pellicule entre les bandes de nitrocellulose et l'écran La cassette est fermée et placée dans un

congélateur a 70 C.

j) La pellicule radiographique est développée ei 24 & 48 heures La pellicule est retirée de la cassel et développée en chambre noire avec seulement la lumière jaune de sécurité La cassette peut être

rechargée si une autre exposition est nécessaire.

8 Si la sonde testée donne davantage de bandes dans le chemin avec trois ADN individuels que dans 1 l bande avec seulement un ADN individuel, elle devient un

candidat pour la détection des polymorphismes.

9 Les sondes identifiées dans le stade 8 sont à nouveau essayées en les hybridant contre une grande série d'ADN humains pour déterminer le degré auquel

la région clonée est polymorphe Les sondes correspon-

dant aux régions ayant au moins quatre allèles différents

présents dans la population avec des fréquences supérieu-

res à 10 % chacun sont insorporées dans l'essai de

paternité ou dans l'essai d'identité individuelle.

EXEMPLE IV

Cet exemple illustre les performances et l'évaluation

d'un essai de paternité utilisant la présente invention.

1 Des échantillons de sang sont prélevés sur la mère, l'enfant et le père putatif et l'ADN est purifié comme il est décrit dans l'exemple I. 2 Ces ADN ont réagi séparément avec l'enzyme de

restriction Eco Rl comme il est décrit dans l'exemple III.

3 Ces ADN sont soumis à une électrophorèse comme il est décrit dans l'exemple Il, en faisant passer pg de chacun des ADN de la mère et du père putatif et 5 pg d'ADN de chacun des trois individus dans un

chemin adjacent -

4 Les ADN soumis à l'électrophorèse sont séchés

comme il est décriz dans l'exemple III.

La série d'ADN-de "sonde de paternité" est

marquée au 32 P comme il est décrit dans l'exemple III.

6 Les ADN sondes marqués du stade 5 sont hybridés avec les ADN génomiques séchés du stade 4

comme il est décrit dans l'exemple III.

Tous les gènes de l'enfant proviendront soit de la mère, soit du père Par conséquent, si le père putatif est le père biologique, toutes les bandes présentes dans le chemin avec l'ADN de l'enfant seront également présentes dans le chemin sans l'ADN de l'enfant Inversement, 3-8 si-le père putatif n'est pas le père biologique, de nouvelles bandes apparaîtront dans le chemin avec l'ADN

de l'enfant.

EXEMPLE V

Cet exemple fournit-des techniques spécifiques

pour l'évaluation d'un essai de paternité.

A PURIFICATION DE L'ADN DU SANG

1 Des échantillons de sang ( 5 à 10 ml) doivent être recueillis dans des tubes contenant de l'EDTA ou du citrate comme anticoagulant et stockés à 4 e C jusqu'à

leur traitement.

2 Remettre en suspension les cellules par inversion et les centrifuger à 2 000 tours/minute pendant 10 minutes à 4 C Enlever le sérum (au-dessus) sans déranger

la couche leucocytaire.

3 Ajouter un volume égal de tampon de lyse sanguine (sucrose 0,32 m M, Tris 10 m M, p H 7,6, Triton X-100 à

* 1 %) à 4 C et mélanger soigneusement par retournement.

Faire passer dans un tube conique de polypropylene de 50 ml (par exemple Corning, Falcon), rincer le tube de sang et ajuster le volume final à 4 fois le volume initial de sang Mélanger soigneusement et centrifuger

à 2000 tours/minute pendant 10 minutes à 4 C.

4 Décanter le liquide surnageant Si le culot de centrifugation n'est pas propre (c'est-à-dire s'il est

trop contaminé par les erythrocytes) remettre en sus-

pension le culot de centrifugation dans 3 ml de tampon

de lyse et centrifuger à nouveau.

Remettre en suspension le culot rose blanchâtre dans 2,5 à 5 ml de tampon de lyse d'ADN (Tris 10 m M,

p H 7,4, EDTA 10 m M, Na Cl 10 m N, 100 pg/ml de protéinase K).

Mélanger soigneusement et faire tourbillonner si nécessaire.

Ajouter du SDS (solution de réserve: 20 %) jusqu'à une concentration finale del % Mélanger en retournant

doucement le tube L'échantillon deviendra très visqueux.

2 e 41774 <; i ôD ia atu d'un agihateur à balancement a s e *-:n une nui; en mélangeant doucement ou a 4. ils;a er Ois 'r-4 hies en m-langeant de temps 3 -j,-D:'r du Pia Cl jusqu' une concentration finale

:;;a c,r I:d'une solution de réserve 6 M (c'est-

e ' ue a 1:5) 2 î 1 langer doucement àla main ou

r; 1 atreau d'un appareil d'agitation par balanca-

Ac t c S moment, l'# h-ntillon peut être stock& au

a frj Xs nd-& nimenn -

7 Ajouter un volume égal de mélange phénol-

chloroforme (une partie de phénol à 90 %, du Tris 1 M a 10 % p H 8,0: une partie de CHC 13) et agiter doucement

pendant 15 a 30 minutes à la température ambiante.

8 Faire passer dans un tube Corex de verre de 15 ml et centrifuger à 4 000 tours/minute pendant 15 minutes (beckman) ou 10 000 tours/minute pendant 5 minutes

(Sorvail) pour séparer les phases.

9 Eliminer la phase aqueuse supérieure avec une pipette à large embouchure et la renvoyer dans le tube en matière plastique initial Répéter ce mode opératoire

d'extraction deux fois supplémentaires.

Placer l'échantillon d'ADN dans un sac à dialyse marqué approprie et dialyser sur un excès de 100 fois

de tampon TE (Tris 10 m M p H 7,4, 1 m M).

11 Lire la densité optique d'une dilution de l'échantillon approprié (par exemple 1/20) contre le même type de solution témoin à 240 nm (pour 1 'EDTA); 250 nm (maximum pour l'ADN); 270 nm (maximum pour le phénol);

280 nm (maximum pour les protéines); 340 nm (turbidfté).

260/270: environ 1,2; 260/280: environ 1,8.

B DIGESTION DE L'ADN GENOMIQUE PAR L'ENDONUCLEASE

DE RESTRICTION

1 Ajouter les constituants suivants dans un tube d'Eppendorf de 1,5 ml:

2 541774

a) Prendre environ 10 pg d'ADN/essai (habituelle-

ment entre 10 p 1 et 50 pi).

b) La quantité appropriée du tampon de digestion de l'endonucléase spécifique 10 X préparée suivant les recommandations du fabricant. c) L'endonucléase de restriction dans un excès

de 3 fois.

2 Faire tourbillonner une à deux secondes ou tapoter le tube avec le doigt plusieurs fois pour

mélanger.

3 Faire tourner dans la microcentrifugeuse Eppendorf 10 à 15 secondes pour transformer les réactifs

en granulés.

4 Faire incuber 2 heures à 37 C pour Eco R 1 ou 65 C pour Taq I. a) Ajouter 1/10 volume d'acétate de NH 4 3 M b) 2 à 2,5 volumes de Et OH froid à 95 % c) Stocker à -20 C pendant une nuit Faire tourner dans la microcentrifugeuse pour transformer en granulés ( 15 minutes à 4 C) 6 a) Dissoudre ie granulé dans 15 ml de H 20 b) Ajouter les 10 X appropriés de tampon d'enzyme

de restriction et un excès de 3 fois d'endo-

nucléase de restriction-et répéter les opérations

2, 3 et 4.

7 Pour arrêter la réaction qui doit être chargée sur le gel aussitôt après digestion, ajouter une solution de colorant marqueur Ficoll 5 X à une concentration

finale de 1 X Ceci peut être effectué avec des échantil-

lons dans lesquels le volume final est inférieur à 20 pl.

C ELECTROPHORESE

1 Préparer un gel d'agarose en faisant bouillir de l'agarose dans du TAN 1 X (Tris 40 m M, p H 7,9; acétate de Na 4 m M, EDTA 1 m M) La concentration finale d'agarose doit être entre 0,4 % et 1,2 % suivant la taille du fragment à fractionner les échantillons qui doivent

être hybrides au p AW-101 sont soumis à une électro-

phorèse dans de l'agarose à 0,4 % tandis que pour l'hybridation au p LM 0, 8, on utilise de l'agarose à 1,2 % 2 Lorsque la solution d'agarose atteint environ C, ajouter de l'Et Br (bromure de 2,7-diamino-10,

éthyl-9-phényl-phénanthridinium) jusqu'à une concentra-

tion finale de 500 ng/ml à 12,5 ng/ml.

3 Verser immédiatement dans un moule pour électro-

phorèse sur gel horizontal pour produire un gel d'environ 4 mm d 1 épaisseur Placer un formateur de puits à chaque extrémité du moule Laisser refroidir à la température ambiante jusqu'à solidification Enlever le formateur de puits et couvrir le gel avec du TAN 1 Xo D Placer les échantillons en couche dans les puits

du gel Relier la boîte à gel à la source de courant.

Allumer l'alimentation en courant et amener le courant à la valeur appropriée Par exemple, pour séparer des

fragments de plus de 10 kb, on effectuera l'électro-

phorèse sous 20-V pendant 3 jours Pour des fragments de 1,5 kb, on effectue l'électrophorèse sous 40 V pendant une nuit ( 16 à 20 heures) et après l'électrophorèse, on débranche le récipient En portant des gants, on retire le gel avec une cuillère à gel On place le gel sur une boite à lumière ultraviolette et on applique une règle transparente le long du chemin avec l'ADN marqueur On prend une photographie du gel avec une pellicule photographique appropriée pour conserver

un enregistrement de l'électrophorèse.

D PREPARATION RAPIDE DU PLASMIDE

1 15 ml de E coli HB 101 portant soit p AW 101, soit

p LM 0,8.

2 Centrifuger 10 minutes à 8000 tours/minute.

3 Faire tourbillonner le culot de centrifugation.

4 Ajouter 300 ml de sucrose à 25 %; du Tris 50 m M p H 8,0; de l'EDTA 0,i; 0,2 mg/ml de R Nase:; 1 mg/ml

de lysozyme -

Laisser dans la glace pendant 15 minutes. 6 Ajouter 250 mi de Triton X100 à 0,5 %;

de 1 'EDTA 50 m M, du Tris 50 m M, p H 8,0.

7 Laisser sur la glace pendant 5 minutes.

8 Faire tourner à 4 C pendant 30 minutes sous

K dans SW-25, 27 ou 41.

9 Séparer le culot de centrifugation du liquide

surnageant (le culot est un gel d'ADN bactérien).

Au liquide surnageant, ajouter 10 ml de

protéinase K ( 5 mg/ml) -

11 Laisser 5 minutes:à-la température ambiante.

12 Extraire une fois avec du phénol: CHC 13 1:1; deux fois avec CHC 13; 13 Ajouter à la phase aqueuse de l'acétate NH 4 à une concentration finale de 0,3 M 14 Ajouter 2,5 X volume d'éthanol

15 Laisser au congélateur (-20 C) pendant une nuit.

16 Centrifuger, dissoudre le précipité dans du Tris 20 m M à p H 7,4, EDTA 10 m M.

17 Ajouter du Cs Cl pour la formation des bandes.

E TRANSLATION DE L'ENCOCHE

1 Pour chaque mélange réactionnel d'hybridation: a) 50 nanogrammes de l'ADN sonde naturel b) 0,7 pl de tampon de translation d'encoche X (lx = Tris HC 1 25 m M, p H 7,9, Mg Cl 2,5 m M, DTT 5 m M, 100 ig/ml de sérum

albumine de boeuf).

c) 2,5-pil d'alfa P-32 désoxynucléotides triphos-

phate ( 25 p Ci) d) 0,5 pl de D Nase I à 20 picogrammes/Pl e) 0,5 pl d'ADN polymérase I ( 3 unités) Le volume final est ajusté à 5 pi/ 2 Faire incuber à 16 C pendant 2 heures 3 Arrêter la réaction en ajoutant de i'EDTA à une

concentration finale de 10 m M et du SDS à une concentra-

tion finale de 0,5 % Volume final 100 pi.

4 Séparer l'ADN marqué des triphosphates n'ayant pas réagi par centrifugation du mélange réactionnel à travers 0,6 ml de S Epharose 6 BC 1 dans un tube de microcentrifugeuse percé à 1500 tours/minute pendant

2 minutes.

5 Prendre 1 pi de l'écoulement à travers la matière (c'est-à-dire contenant l'ADN marqué) et

compter dans un spectromètre à scintillation beta.

F MODE OPERATOIRE DE TRANSFERT SOUTHERN POUR LE

ZETAKIND

1 Faire l'ADN sur un gel d'agarose Colorer au bromure d'éthidium ( 10 pg/ml) pendant 15 à 30 minutes, éliminer le colorant en excès en plongeant dans un

tampon pendant 15 à 30 minutes et photographier.

2 Plonger le gel dans Na OH 0,5 M, Na Cl 1,0 M

pendant 30 minutes avec agitation modérée.

3 Rincer le gel à l'eau et répéter l'opération 2 avec du Tris HC 1 à 0,5 M, p H 7,5, Na Cl 0,3 M. 4 Mouiller le Zetabind avec de l'eau Puis plonger pendant 30 minutes dans un tampon phosphate de Na

( 0,025 M p H 6,5).

Plonger le gel pendant 15 minutes dans le même

tampon phosphate que dans le stade 4 pendant 20 minutes.

6 Placer deux bandes de Whatman 3 mm mouillées dans du tampon phosphate, de la dimension du gel S'assurer qu'il n'y a pas de bulles d'air emprisonnées entre les deux Placer le gel (les filtres en bas) sur un plateau avec-la mèche de papier 3 mm immergée dans un tampon phosphate Placer le Zetabind sur le gel, puis 2 bandes de papier 3 mm et finalement une serviette en papier (d'une hauteur de 7,5 à 10 cm) Placer un plateau plat sur le dessus et un certain poids (par exemple un flacon de 100 ml) pour assurer un contact uniforme

entre le gel et les papiers.

7 Transférer pendant une nuit en utilisant un tampon phosphate ( 0,025 m M p H 6,5). 8 Laver la membrane avec du tampon phosphate pendant 15 minutes (frotter gentiment le côté de la

membrane qui était en contact avec le gel).

9 Cuire en étude à vide pendant 2 heures à 80 C.

-10 Placer dans un sac "Seal-a-meal" et laver pendant 30 à 60 minutes à 60 C dans du SCC 0,1 X,

SLS 0,5 %( environ 15 mi).

11 Evacuer le tampon du stade 10 et le remplacer par un tampon de préhybridation (SSC 4 X, phosphate de Na 50 m M, p H 6,7, 5 X Denhardt, 200 pg/ml d'ADN de

sperme de saumon dénaturé et du formamide à 50 %).

Faire incuber 3 à 16 heures à 37 C.

12 Dénaturer l'échantillon en le chauffant dans

1 ml de tampon d'hybridation pendant 10 minutes à 70 C.

Hybrider avec l'ADN radioactif dénaturé pendant 40 à

72 heures à 37 C ( 2 x 10 dpm/sac).

13 Laver avec du SSCP 2 X, SLS 0,1 % à 65 C en agitant pendant 20 minutes jusqu'à ce qu'une partie aliquote de 10 ml de l'eau de lavage contienne moins de 100 cpm Cherenkov (environ 6 fois) Laver deux fois avec du SSCP 0,4 X, du SLS 0,02 % à 65 C et deux fois avec du SSCP 0,1 X Ajouter à chaque fois suffisamment

de tampon pour recouvrir les filtres.

14 Sécher le Zetabind et le laisser sécher à l'air avant de le recouvrir de cellophane et le placer

dans la cassette pour l'autoradiographie.

Avant la réutilisation enlever la sonde en la chauffant à 70 C pendant 10 minutes dans du tampon de

préhybridation -

PREHYBRIDATION (pour un volume total de 15 ml) 1,5 ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé ( 5 mg/ml) 3,0 ml de SCC 20 X 1,5 ml de Denhardt 50 X 1,5 ml de phosphate 0,5 M 7,5 ml de formamide à 100 % 0,15 ml de SLS à 20 % ADN dénaturé marqué au 32 P. encore 1,5 Dml de SSC 20 X. HYBRIDATION (pour un volume total de 15 ml) On tapote les six bandes des deux gels sur-un papier jaune d'un emballage de pellicule radiographique, on les marque, on les recouvre d'un enroulement en matière plastique et on les place dans une casette avec des écrans d'intensification incorporés En chambre noire, on charge la cassette avec une pellicule radiographique X- omat AR de 20 x 25 cm en plaçant la

pellicule entre les bandes de nitrocellulose et l'écran.

On ferme la cassette et on la place dans un congélateur

à -700 C.

16 On développe la pellicule radiographique en 24 à 48 heures On retire la pellicule de la cassette et on la développe en chambre noire sous la lumière jaune de sécurité On peut recharger la cassette si une autre

exposition est nécessaire.

EXEMPLE VI

Cet exemple illustre les performances spécifiques et l'evaluation d'un essai de paternité utilisant la

présente invention -

1 Des échantillons de sang sont prélevés sur la mère, l'enfant et le père putatif et l'ADN est purifié

comme il est décrit dans l'exemple VA.

2 Ces ADN sont mis à réagir séparément avec soit l'enzyme de restriction Eco Rl soit le-Taq 1 comme il est décrit à l'exemple V B. 3 Ces ADN sont soumis à une électrophorèse comme il est décrit dans l'exemple V C en utilisant 5 ig d'un des trois ADN de chacun des trois chemins adjacents dans l'ordre ( de gauche à droite) mère, enfant, père putatif. 4 On prépare des ADN "sonde de paternité" et on les marque comme il est décrit dans les exemples V B et 5 E. Les ADN soumis à l'électronhorèse sont séchés comme il est décrit dans l'exemple V F. 6 Les ADN sondes marqués provenant du stade 4 sont hybridés avec les ADN génomiques séchés du stade 5 comme il est décrit dans l'exemple V E. L'ADN p AW 101 est hybridé avec l'ADN génomique coupé de l'Eco R 1 tandis que le p LM 0,8 est hybridé à l'ADN

génomique coupé du Taq 1.

7 On effectue des autoradiogrammes comme il est décrit à l'exemple V F. 8 Après l'autoradiographie, on détermine la taille des bandes correspondant au fragment d'ADN polymorphe Ceci est réalisé en mesurant la distance de migration de ces bandes, par rapport à celle d'une collection de standards de masse moléculaire d'ADN

(Southern, E M, ( 1984) Anal Biochem 100, 319-323).

La taille des fragments d'ADN dans chacun des individus d'une même famille est comparée et utilisée pour déterminer si le diagramme observé chez l'enfant

est compatible avec ceux mesurés chez le père putatif.

Si la taille des fragments d 4 ADN chez l'enfant est différente de celle observée pour le père putatif, on en conclut que-ce n'est pas le père biologique (c'est-à-dire cas de non-paternité) Si l'enfant ne partage qu'un seul allèle avec la mère, on peut alors conclure que l'autre allèle est une forme héritée du père Si le père putatif ne possède pas cet allèle, on peut en conclure qu'il n'est pas le père D'autre part, si tous deux partagent au moins une paire de fragments d'ADN, non apportée par la mère, on peut déterminer si oui ou non l'individu peut être le père en se basant sur la probabilité qu'un individu pris au hasard dans une population puisse avoir la même taille de fragments d'ADN (c'est-à-dire indice de paternité; dans Inclusion Probabilities in Parentage Testing ( 1983), ed R H Walker, American Association of Blood Banks) Dans ce dernier cas, il est nécessaire de connaître la fréquence des allèles détectés avec la sonde d'ADN particulière Les fréquences observées pour les sondes p AW-101 et p LM-0,8 sont données dans

les tableaux 1 et 2.

EXEMPLE VII

Cas d'essai 1 En utilisant le mode opératoire de l'exemple VI, une mère, un enfant et un père putatif ont été essayés en utilisant la présente invention La figure 1

montre un autoradiogramme obtenu en utilisant le p AW-

101 comme sonde contre de l'ADN coupé dans de l'Eco Rl pour la mère; l'enfant et le père La mesure des distances de migration et la comparaison avec des étalons connus indiquent que la mère porte des allèles p AW-101 Nos 2 et 5, l'enfant porte des allèles p AW-101 Nos 5 et 10, tandis que le père putatif porte des allèles p AW-101 Nos 10 et 11 o La mère peut avoir apporté l'allèle p AW-101 no 5 à l'enfant, le père peut avoir apporté l'allèle No 10 On peut à présent comparer la chance pour que le père putatif apporte l'allèle Pa W-101 no 10 à un enfant par rapport à la chance qu'un homme pris au hasard apporte l'allèle no 10 Dans ce cas

le rapport de probabilité est de 16,67, ce qui corres-

pond à une chance de paternité de 94 %.

EXEMPLE VIII

cas d'essai 2 En utilisant les modes opératoires de l'exemple VI, on soumet une mère, un enfant et un père putatif à un essai en utilisant la présente invention La figure 1 montre l'autoradiogramme obtenu en utilisant le p AW-101 comme sonde contre un ADN coupé dans de l'Eco Rl obtenu pour la mère, l'enfant et le père La mesure des -distances de migration et la comparaison avec des étalons connus indiquent que la mère porte des allèles p AW-101 nos 5 et 9, l'enfant porte des allèles p AW101 nos 5 et 7 tandis que le père putatif porte les allèles p AW-101 nos 4 et 6 Comme le père de cet enfant doit avoir apporté l'allèle 7 à l'enfant et que le père putatif ne

porte pas cet allèle, il est exclu comme père possible.

EXEMPLE IX

cas d'essai 3 En utilisant les modes opératoires de l'exemple VI, on soumet une mère, un enfant et un père putatif à un essai en utilisant la présente invention La figure 3

représente un-autoradiogramme obtenu en utilisant le p LM-

0,8 comme sonde contre un ADN coupé dans du Taq 1 obtenu

de la mère, de l'enfant, et du père La mesure des dis-

tances de migration et la comparaison avec des étalons connus indiquent que la mère porte des allèles p LM 0,8 Nos 7 et 8, l'enfant porte des allèles p LM 0,8 nos 7 et 8 tandis que le père putatif porte des allèles p LM 0,8 no 2 et 8 Comme la mère pourrait avoir apporté soit l'allèle p LM 0,8 nos 7 ou 8 à l'enfant, on peut seulement conclure que-le père doit avoir apporté soit l'allèle 7, soit l'allèle 8 On peut comparer la chance que le père putatif ait apporté soit l'allèle p LM 0,8 n 7, soit p LM 0, 8 No 8 à un enfant à la chance qu'un l'allèle p LM 0,8 No 8 à un enfant à la chance qu'un homme pris au hasard apporte l'un ou l'autre de ces allèles Dans ce cas, le rapport de probabilité est de 3,55 ce qui correspond à une chance de paternité

de 71,8 %.

Tableau 1

Fréquence des allèles visualisés en utilisant p AW 101 comme sonde un ADN génomique humain coupé dans de l'Eco Rl dans une population de 298 individus pris au hasard Allèle no Taille (en kg paire de base) Fréquence

1 14,0 0,013

2 14,5 0,052

3 14,9 0,077

4 15,4 0,117

5 16,0 0,146

6 16,6 0,117

7 17,2 0,064

8 17,7 0,040

9 18,3 0,035

10 19,0 0,030

11 19,6 0,035

12 20,2 0,040

13 2 0,8 0,064

14 21,6 0,069

15 22,2 0,023

16 22,7 0,018

17 23,6 0,020

18 24,3 0,003

19 24,6 0,008

20 25,3 0,013

21 26,1 0,0 Q 8

22 27,1 0,002

23 28,1 0,002

Tableau 2 Fréquence des allèles visualisés en utilisant le p LM -comme sonde et un

ADN génomique humain coupé dans de l'Eco Rl dans une population de 268 individus pris au -5 hasard Allèle no Taille Fréquence (en kg paire de base) 2,35 2,65 2,75 2,95 3,08 3,40 3,-70 4,09 4,30 0,8 0,089 0,580 0,041 0,009 0,123 0,007 0,123 0,018 0,007

Claims (4)

REVENDICATIONS

1. Procédé d'identification d'un membre individuel d'une espèce d'organisme consistant à analyser l'ADN de cet organisme par rapport à une ou plusieurs régions génétiques polymorphes, à différencier chaque polymorphis- me en termes de taille relative de la région génétique,

et à caractériser ainsi un membre individuel de l'espèce.

2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ces régions sont détectées par les opérations consistant à: a) isoler l'ADN de l'individu à analyser; b) soumettre cet ADN à l'action d'endonucléases de restriction; classer-par taille et transformer les fragments d'ADN produits dans l'opération b) ci-dessus en molécules à un seul brin; c) hybrider ces molécules à un seul brin classées par taille, avec des molécules d'ADN sonde; et d) identifier le nombre et l'emplacement de ces fragments hybridés, étant entendu que cette

sonde n'est pas un c ADN du locus génétique HLA humain.

3 Procédé selon la revendication 1, caractéri-

sé en ce que ltindividu analysé est membre d'une espèce choisie parmi le groupe comprenant les virus, les bactéries, les algues, les champignons, les plantes et

les animaux -

4 Procédé selon la revendication l, caractérisé en ce que l'échantillon d'ADN est obtenu à partir de cellules de tissusembryonnaires adultes, jeunes ou foetaux. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les sondes comprennent une série de sondes dans lesquelles chaque sonde individuelle de cette série est choisie comme représentant un allèle unique d'une

région génétique polymorphe différente.

6 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce queladite série de 'sondes comprend de 1 à environ

20 sondes individuelles.

7 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le nombre d'allèles contenus dans ladite région génétique polymorphe est d'environ 2 à environ 40. 8 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les sondes sont le p AW-101 (ATCC 39605)

et le p LM 0,8 (ATCC 39604).

9 Procédé selon la revendication 1, qui comprend le stade supplémentairede comparer les tailles relatives desdiiesrégions génétiques polymorphes de ces individus avec celles d'une mère et d'un père

putatif pour la détermination de la filiation.

Procédé d'analyse légale conformé à la revendication 1, qui comprend un stade supplémentaire consistant à comparer les tailles relatives desditea régions polymorphes d'un premier échantillon de cet individu avec les régions polymorphes provenant d'un second échantillon d'une autre source en vue d'établir

l'identité entre les deux échantillons.

11 Procédé selon la revendication 1, qui comprend le stade supplémentaire consistant à comparer la taille relative de ladit e région polymorphe -de cet individu avec celle dérivant d'un autre membre d'une-souche ou organisme en vue d'établir l'identité de la souche

de cet individu.

12 Procédé d'identification d'un membre individuel d'une espèce ou d'un organisme consistant à analyser l'ADN de-cet organisme par rapport à une ou plusieurs régions génétiques polymorphes, à différencier chaque polymorphisme en termes de taille relative de la région génétique, et à caractériser ainsi un membre individuel de l'espèce, dans lequel ces régions sont détectées par des opérations consistant: a) à isoler l'ADN d'un individu à analyser; b) à soumettre cet ADN à l'action d'endonucléases de restriction; à classer par tailles et à transformer les fragments d'ADN produits dans l'opération b) ci-dessus en molécules à brin unique c) à hybrider ces molécules classées par tailles, à brin - unique, avec des molécules d'ADN sonde, ces molécules sondes étant en outre caractérisées en ce

qu'elles ont été produites par digestion par l'endo-

nucléase d'ADN génomique; et d) à identifier le

nombre et l'emplacement de ces fractions hybridées.

13 Procédé d'identification d'un élément indivi-

duel d'une espèce d'organisme consistant à analyser l'ADN de cet organisme par rapport à deux régions génétiques polymorphes ou davantage, à différencier chaque polymorphisme en termes de taille relative de la région génétique et à caractériser ainsi-un élément

individuel de l'espèce.

14 Procédé d'identification d'un élément individuel d'une espèce d'organisme consistant à analyser l'ADN de cet organisme par rapport à une ou plusieurs régions

génétiques polymorphes, à différencier chaque polymor-

phisme en termes de taille relative de la région génétique et à caractériser ainsi un élément individuel de l'espèce caxactérisé en ce quelesdites régions sont détectées par noe opérations consistant: a) à isoler l'ADN de l'individu

à analyser; b) à soumettre cet ADN à l'action d'endo-

nucléases de restriction; à classer par taille et à

transformer des fragments d'ADN produits dans 1 'opé-

ration b) ci-dessus en molécules à brin unique; c) à hybrider ces molécules classées par taille, à brin

unique avec des molécules d'ADN sonde, et d) à identi-

fier le nombre et l'emplacement de ces fragments.

hybridés, étant entendu que-cette sonde n'hybride pas

le locus génétique HLA humain.