JPS59166097A - 食品中のサルモネラ検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はサルモネラ属の開閉の検出に関する（本明細書
ニおいて、サルモネラ属の細菌はＪｌｕ　ｃ　ｈ、’ａ
　ｎｄ、ｎ等による二５ＩＬｏｒＬｅｒ　Ｂｅｒｇ−ｅ
、ｙ’ｓ−Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａ
ｔｉｖｅβａｃｔｅｒｉｏｌｏｇγ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ
　＆　１．ｒＶｉｌｋｉｎｓ、　１９８２年）でサルモ
ネラ属の細酌として分類された細菌に属するものとし；
このような細菌は以後単に”サルモイ、う”と記載する
）。

食品中のサルモネラの存在を検出づ−ろための最も一般
的に使用きれる試験は古典的な生物学的性状の測定を包
含する。この試験は数日間を費やす。

一般に、本発明は食品試料中のサルモネラの存在を検出
する方法に特徴があり、それはサルモネラＤＮＡと選択
的にノ・イブリダイズ（相補性結合）して検出可能な複
合体を形成することができる少なくとも１つのＤＮＡプ
ローブを用意し、そのＤＮＡプローブを食品試料中に存
在するサルモネラＤＮＡとノ・イブリダイズさせて・・
イブリッドＤＮＡ複合体を形成でせる粂件下にそのＤＮ
Ａプローブを食品試料中の細菌と接触させ、そしてその
・・イブリッドＤＮＡ複合体を食品試料Φにサルモネラ
が存在することの証拠として検出することを包含する。

（本明細書で使用する″選択的に・・イブリダイズする
”という表現はサルモネラのみに・・イブリダイズして
他のどの腸内ｊ１′（Ｉｆ菌にも−・イブリダイズし彦
いＤＮＡプローブを指して言う。）本発明の好才しい実
施態様においてそのＤＮＡプローブは標識されており、
例えば、そのプローブ中に二ンクトランスレーションＣ
ｎｉｃｋ−１ｒａｍｓ−１ａｔｉｏｎ）等により取り込
捷れろ放射・匣同位元素（例えば、Ｐまたは１２５Ｉ）
で標識されろ。

他の好ましい実施態様においてそのプローブはビオチン
で標識されており、このビオチンはアビジンと反応し、
このアビジンにはアビジンがビオチンと結合した場合に
そのノ・イブリッドＤＮ／１　仮合体を検出可能なもの
にする化学種ｈ）結合されており、その化学種は例えば
螢光団、ハイブリットＤＮＡ複合体を電子顕微鏡で検出
可能なものにすることができる電子密度の高い化合物、
ハイブリッドＤ　Ｎ　Ａ　ｆＪｆ合体を免役学的に・１
莢出可能なものにすることができろ抗体、寸たはハイブ
リットＤＮＡ複合体を酵素的に検出可能なものにするこ
とができる一対の触媒／基質のうちの一方、などである
。

細菌をそのＤＮＡプローブと接触させる前に、細されだ
ＤＮ’Ａはその後変性されてニトロセルロース膜のよう
な適当なりＮＡ結合支持体上に固定化されろ。そしてこ
の方法は少なくとも２種、好捷しくは少なくとも３．４
″！だは５種のサルモネラ（（特異的な異なるプローブ
を使用する。

他の通光な実施態様においてそのプローブは標？ｊ＆さ
れず、その４灸出はサンドインチ・・イブリッド形成法
により行われる。

本発明のサルモネラ検出法は１種まだは、好ましくはそ
れ以上のサルモネラＤＮＡプローブを使用し、それらの
プローブの谷々は大多数の既知サルモネラメ（株の全部
もしくはほとんど（好ましくは８０％以上、より好寸し
くは９０チ以上）に共通するサルモネラＤ’、ＮＡ断片
であって、他の全ての腸内細菌には明らかに４在しない
ものである。

サルモネラ属全体にわたって分布するサルモネラに非常
に特異的なりＮＡ断片の一群があるさいうこの発見は、
特にサルモネラを含む全ての腸内細菌が共通の種族であ
るらしいことを考慮すると、極めて篤くべきことであっ
た。

本発明のプローブ群は我々が現在知っているどの蛋白質
情報もコードしておらず、また病原性に寄与することも
知られていない。従って、本発明方法はＤＮＡプローブ
がサルモネラの特定の表現特性（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ
　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）と適合する能力には
依存しておらず、すなわちサルモネラ属のきわ立って特
徴的々性状のどれかに寄与することが知られるＤ　Ｎ　
Ａ　ｋＷ片をプローブみして使用する必要がない。我々
の仰る限りでは、本発明のプローブは一つの細菌属全体
に広く分布するものとして最初に見出された属特異性の
、ｊ聞直プローブである。

サルモネラに特異的なプローブが１つだけでなく多数存
在するという我々の発見は感度の増大３よび信号の増幅
（ｓｉｇｎａｌ　ｃｔｍｐｌｉｆｉｃａｔ、１ｏｎ）と
いう付加的利点を提供する。使用されろ異なったプロー
ブの数が多ければ多いほど、検定の感度が増す。このこ
とは、数個の異なるプローブを使用する場合に、その谷
々のプローブは単一のサルモネラ染色体のそれぞれ異な
る部分にハイブリク“イズされるからであり、こちして
その単一の染色体は多重標識をもつことを意味する。

本発明による検定は迅速かつ正確な結果をもたらし、食
品製造業者は出荷前の食品貯蔵期間を短縮するこ乏がで
きる。さらに、その試、験を完了さぜろのに要する時間
が短いので、実験室では短期間に非常に多くの試料を取
り扱うことが可能である。さらにまだ、その検定は細菌
の生化学的性状よりもむしろそれらの全ＤＮＡ配列にの
み依存しているので、定型サルモネラ菌と同様に非定型
ザルモネラ菌ケも生化学的に検出するＣ吉ができ、こう
して誤った陰性の結果を避けろことができろ。

この試験は精巧な装置を必要とせず、また多方面に及ぶ
技術訓練を受けていない職員でも容易に行うことができ
る。

本発明の他の特徴および利点は次の好ましい実施態様の
記述および特許請求の範囲から明らかになるだろう。

我々はまず第一に図面について簡単に説明する。

図面 第−図は本発明を実施するのに有用な装置の分解した等
角投影図である。

第二図は不発明のサルモネラに特異的なプローブの制限
地図である。

第一図には食品試料処理装置１０が示される。

この装置１・才本発明の一部分を構成１−ろものではな
い。この装置は蓋１２、使い捨ての上部円筒形部分１４
、および下部円筒形部分１６を含み、その円筒形部分１
６のノ朋くなった頂部１８は円１ヒ）形部分］４のくほ
んだ底部にぴったりとはめ込まれろ。

円筒形部分１４には、サルモイ・うと同じ大きさの小さ
な細菌を通過させろが小プな食品粒子やもつと大きな細
菌は濾過して取り除くことのできろ大キい孔（５〜２０
０ミクロン）のフィルター２２が設置される。フィルタ
ー２２は大きな孔の硬質プラスチックグリッド２４上に
支持される。

円筒形部分１６にはニトロセルロースのＤＮＡ結合膜２
６が設置され、この膜は円筒形７５１３分１６の床を構
成する大きな孔のプラスチックグリッド２８上に支持て
れる。円筒形部分１６は真空吸引装置（図示されていな
い）のマニホールドの円筒形孔にぴったりと合う大きさ
である。

例示した装置は次のような本発明方法に使用される。サ
ルモネラを含有すると思われろ食品試料を円筒形部分］
４に配置する。円筒形部分１４および１６は一緒にぴっ
たりと合わせ、円筒形部分１６の底部末端に真空を」］
４用してサルモネラと同じ大きさの細菌をフィルター２
６上に利殖させ、一方賞品粒子ともつと大きな細菌は円
筒形部分１４に］１１ｊ果さ−「だ１寸残し、これはそ
の後捨てら：ｉｔろ。欠いて本発明のサルモネラ検出法
は、下に詳ｉ；４ｉ１１に記載するごとく、フィルター
２６上の細菌に１刻して行われる。

ＤＮＡプローブ Ｓ、チフィムリウム（Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕＴｒ
ｌ）ＤＮ　ＡのライブラリーはＢｒｏａｃｈ、等にょろ
Ｇｅｎ、ｅ　　ｌｌｊ　、　１２１（１９７９）に記載
されたプラスミドベクター（、ＡＴＣＣｅ２３５６６株
）からのＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＢａηｔＨＩ
を用いて完全に加水分解して異なる長さのＤＮＡ断片ケ
作り、これはその後Ｃｏ　ｈ　ａ　ｎ等によるＰＮＡｓ
；　　７０，３２４０（１９７３）に記、伐された一般
方法を使用してＹＥｐ１３の特定のＢａｍ　ＨＩ部位に
結合（ｌｉｇａｔｅ）されろ。この結合混合物はその後
ロイ−サツカロミセス　セレビセアｘ　（Ｌａｕ−８ａ
ｃｃｈａｒｏｎｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ　、酵母
）宿主捷たは大腸（’ｉ？　（Ｅ、Ｃｏ１１Ａ／Ｃ１０
６１株）の培養物のどちらかを形質転換するのに使用さ
れ、その際大腸１尉の形７り転換体はアンピシリン耐性
を基にして選別されろ。１瞥ｆ１．および大腸菌の宿主
Ａ１１ｌｌ胞は５０Ｑｍｌの容量に」・ｄ殖させてサル
モネラＤＮＡのライ・フ゛ラリ−を得ろ。（欠いで、Ｓ
、チフイムリウムＤＮＡのライブラリーケ用い、サルモ
ネラＤＮＡと選択的に７・イブリダイズするが腸内細菌
群（本明細和ては’　１ＩｉＡ１７］　ｉ１萌閑”とい
う）に属するサルモネラ以外の他の示ｎ］囚を含む食品
中に見い出されろ他の＋＋ｉｌＢ菌とはクロスーツ〜イ
ブリダイズしないＤ　Ｎ　Ａ　Ｖｊｒ片を制限酵素で力
り水分′ｐＪイして子離選別する。選別は放射性同位元
素で二ノクトランスレーンヨンされたＳ、デフイム１ｊ
ウムのゲノムまだは大腸菌ＤＮＡを用いて行われる。

酵母での上記選別方法はサルモネラＤ’ＮＡと選択的に
−・イブリダイズするがサルモネラ以外の他の腸内細菌
ヲ會む他のπ用菌とはノ・イブリダイズしない１つのＤ
ＮＡ断片を与えた。この断片をもつブラスミ１−ＹＥ、
１３を含む大腸菌クローンは１９８３年１月１０日、メ
リーランド州ロックビルにあるアメリカン　クイズ　カ
ルチャー　コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔ’／ｐ
ＣＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）の培養・吻
コレクション中にＲＥ２Ｏ３と識別されて寄託され、そ
してＡＴＣＣ寄託礪３９２６１号と指定された。

上記のＩす１片が各種のサルモネラ菌に共通するもので
あることを立証するだめに、この断片をＢａｍ１’ｌ　
Ｉでプラスミドベクターから切断し、アガロースゲル電
気泳動で精製し、Ｒｉｇｂ’／等によるＪ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、１１３　、２３７　（１９７７）に記載され
たニックトランスレーション法を使用して３２ｐでニツ
クトランスレーションし、そして一本鎖状にして、多数
の野外分離サルモネラのＤＮＡのスクリーニングに用い
た。この断片は試験した全部の野外分離サルモネラとハ
イブリダイズすることが見い出された。

サルモネラに特異的なさらに別のプローブは酵射よりも
むしろ大腸菌ＩＷ’ｃ１０６１から約２００のプラスミ
ドミニブレノブ（７）ｌａｓｍ、ｉｃｌ　ｍ１ｎｉｐｒ
ｅｐ）を選別して先に記載したことくして得られた。よ
り詳細には、その方法は次の通りである。

最初に、ＭＣ１０６１形質１舐換体のブラスミトミニブ
レノフ”ｆｃ　Ｊｉｏ　１ｍｅ　ｓ等に□よろＡｎａｌ
　、Ｂｉｏｃｌｂｅｒｎ。

Ａ１４　、１９３　（１９’８１　）にｂ己ｉ；戊だれ
た方法により製造する。これらのミニブレツブの：１ｆ
ｌｌ限酵素での力Ｏ水分解物はアガロースゲル中で電気
泳動して、ＳｏｕｔｈｅｒｍによろＪ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ
ｌ、９８　、５０３（］−９７５）に記載されたように
ニトロセルロースフィルターに移し換えられろ。アルフ
ァー（３２−ｐ）ｄＡＴＰ−にたはアルファー＜、　３
２−　ｐ　）　ｄｃＴＰでニックトランスレーションさ
ＡｔたＭＣ１，０６１Ｂ、Ｉｌ、Ｃ，２３、６’４１　
（’１９６６　）　Ｋ記載されたように、これらのフィ
ルターとの・・イブリッド形成（（使用される。・・イ
ブリッド形成後の洗浄は０．３　Ａ４ＮａＣｅ　／　０
．０３　Ｍクエン酸ナトリウムを用いて６５℃で３０分
間行う。大腸菌プローブとハイブリダイズしないサルモ
ネラＤＮＡの断片を含むこれらのクローンは、サルモネ
ラに対するこれらの′配列の特異性を立証するだめに、
種々のサルモネラ菌株および非サルモネラ菌株に対して
さらに選別されろ。

大腸菌プローブと−・イブリダイズしないと思われる全
部で５４個のクローン化した１所片が、ミニブレツブに
より試験されたプラスミドコレクションから得られた。

これらのクローンは下の第−表に掲げた２３種のサルモ
ネラ培養菌株と３２種の非サルモネラ菌株に対して選別
さイｔだ。ここに示したサルモネラ菌株（アリゾナエ、
αｒｉｚｏｎａ、ｅを全部含む）はＴｈｅ　Ｓｈ、ｏｒ
ｔｅｒ　Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌｏｆ　Ｄｅｔ
ｅｒｍ、１ｎａｔｉｖｅ　１３ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ’
／、Ｉ（ｌに基づいて各血清型につき菌種名が与えられ
ろように示される。血清型が知られているがその対応す
る菌種名が知られていない場合のみ血清型で示される。

ジョーシア州アトランタにある疾病コントロールセンタ
ー（Ｃｅｎｔｅｒｓ　、ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏ
ｎｔｒｏｌ。

ＣＤＣ）により血清型が明らかにされた菌株を除いて、
全ての菌株はＳｐｉｃｅｒ−ＥｃＬｗｃｂｒｉｓ　％（
Ｄｉｆｃｏ：５７ｙｒａｔｔ等によるＭｏｌ、Ｇｅｎ、
、、１２１　、３４７−３５３）を使用してＨ抗原特異
性について試験された。

ここに示しだ分離サルモネラ菌は下の第二表てＯ抗原群
により大別されている。また、Ｃれらの分離菌のうち、
特に興味あるものは第−表に記載した。ここに示した非
サルモネラ菌株は食品から分離され、各種の他のＹ＋ｔ
ｌｌ菌学的培地での生育パラメーターの試験によりＥｎ
ｔｅｒｉｃ−１ｅん鑑定法（Ｄｉｆｃｏ）を使用して鑑
定された。これらの場合のいくつかにおいては属のみを
示す。

第−表 細菌および酵母の菌株 菌株　　　　菌属、菌種または血清型　　　菌株１ＷＣ
１０６１β、コリ ＸＹ８２０−４１　Ｓ、セレビシェー １−ｅ旦−３１μリー１２６馬傅−１１ａｄｅ２−ＧＩ
Ｏ ＤＢ９０００　　　；ｉ、−１ｙイ企刃−型付ｐ’／ｒ
Ｆ１４６　ａｘｂｔ　Ａ　ｔｒｐ　１３０　ｈＪｉｓ５
７ｚｅｇ６２９：　Ｔｎ５　（フェルス、ブ′ラスミド
）Ｓ１００　　　　サルモネラ　　　　　　　　　　　
　　　　ａＳＣＯ）：Ｚ２９Ｃ１ｉ） Ｓ１０２　　　ブ火モネラ　　　　　　　　　　　　　
　　。

Ｇ＜、０）：Ｚ２９ＵＪ） Ｓｌ０４　　　　ブ匹舌ネラ　　　　　　　　　　　　
　　　ａＣｌ　Ｃｏ）　：Ｇ値合体（１プ） Ｓ１０５　　　　　１袂イｖ：ｅ：４７　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　ａＭ’ＣＯ）　：ｚ
ｌｏ　＋ｅｎ、複合体（１１）Ｓｌ　（１６ブ之ｉ本之
　　　　　　　　　　　　　　“ＦＣＯ）：ｅｎ複合体
Ｃｌ−１） Ｓ１０８　　　　■五舌オー之　　　　　　　　　　　
　　　　ａＣｌ　（Ｑ）　：ｒ＋１　複合体（Ｈ）Ｓ１
１０　　　　力と±才う　　　　　　　　　　　　　ａ
。

ＫＣＯ）：　Ｚ４　（，１−１） Ｓｌｌｌ　　　　　”Ｉｌぞも表２−　　　　　　　　
　　　　　　α（、’１　（Ｑ）　：　Ｚ２９　（Ｈ）
５１２４　　　　サルモネラ　　　　　　　　　　　　
　ａＥ２　Ｃｏ）　：　ｉ　ＣＩＩ） Ｓ１２５　　　　サルモイ・ラ　　　　　　　　　　　
　　ａＭＣＯ）：ＺｌｏＣＨ） ８１２６　　　　サルモネラ　　　　　　　　　　　　
　ａＦＣＯ）：に＋１複合体（ｌｉ　） Ｓ１２７　　　　サルモネラ　　　　　　　　　　　　
　α０ＣＯ）　：Ｚ４　Ｃ１−１） Ｓ１２８　　　　　ツニイＶ、さ中３−４２　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　。

ＧＣＯ）：Ｇ複合体Ｃｌ−１） Ｓ１２９　　　　サルモネラ　　　　　　　　　　　　
ａＢＣＯ）：１ｃＩｉ） ８１３０　　　　サルモネラ　　　　　　　　　　　　
ａＥ２ＣＯ）：’ｅｎ複合体ＣＨ） Ｓ１３１　　　　サルモネラ　　　　　　　　　　　　
ａＩ（Ｏ）：ｂ（Ｈ） Ｓｌ　８２　　　　ｆ　１ｖ−Ｅ：：（５ａＧＣＯ）　
：　Ｚ＋ｅ　ｎ　１７合体（Ｈ）ＳＡ１９　　　　　ｓ
、＝ニーボート（ｎ、ｅｗｐｏｒｔ）　　　　　　　、
ａＳ１０３Ａ　　　クレブシェラ　　　　　　　　　　
　ｂＳ１０３Ｂ　　　ノトロバクター　　　　　　　　
　　　　ｂＳＬＯ７エンテロバクタ−ｂ Ｓ１０９Ａ　　　エンテロバクタ−ｂ 、Ｓ’１０９Ｂ　　　エンテロバクタ−ｂ８１１５Ｂ７
”ロチウス・ブルガリスｂＳｌ１７Ａ　　　クレプンエ
ラ　　　　　　　　　　　　ｂＳ１１２　　　エンテロ
バクタ−ｂ Ｓ１１３　　　　シトロバクタ−ｂ Ｓ１１４　　　　シトロバクタ−ｂ Ｓ１１６　　　　シＩ・ロバフタ−ｂ ＲＦ８’？５　　　　、Ｓ’、）しＤ’レスト（ｔｒｅ
ｒｏ７ｅｓｔ）　　　　　　ｃＲＦ８７６　　　　　　
　Ｓ、−ｈ１４ｚｌ＝　　ト　Ｃｕ−ｔ、ｒｅ−ｃｈｔ
）　　　　　　　　　　　　　　　ｃＲＦ８７７　　　
Ｓ７２’ｙｊｙｖ（ｈａｍｂａ７）　　　　　　　　　
ＣＩビＦ８Ｔ８　　　Ｓ、７１５（３ｃｃ−１−ｅ）　
　　　　　　　　　ｃ１ｉＦ８７９　　　　　　　石ｉ
、ｊ；／−７（４ｒａｎｏｙａ）　　　　　　　　　　
　　　　ｃＲＦ８８０　　　、Ｓ、７−ｉ９（ａ７ｔ−
ｉ−ｓ）　　　　　　　　ｃ１？Ｆ８８２　　　Ｓ−、
ｐ　’ｉｊＡ　（ｔ　ｏｊｃａｉ　）　　　　　　　　
　ｃＲＦ８８３　　　Ｓ−、−辷遺ｘ（ｂ−ａｓｐ　ｌ
　）　　　　　　　　　ｃＲＦ８Ｂ４　　　　ｓ−ベテ
ィオ９（ｂ−ｅｔｉｏｋ’／）　　　　　　　　ｃＲＦ
８８５　　　’　　５−７ｖ、−トン−（１１ｔＬｔ、
ｏｎＪ　　　、　　　　　　　　　ｃＲＦ８８６　　　
　　７ｚレ−ＥＪ−之　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　Ｃ（６４：ん；ｅ、ｘ、ｚ１５
） １１Ｆ８８７　　　”）ｌ、：Ｉレモネ之　　　　　　
　　　　　　　Ｃ（６５ニー：１，６） ＲＦ８８８　　　５ｊｙｔ３ｙ２イ−−ル士７　（ｂｙ
　ｐ　ｏ　ｉｃ、ｆ　ｉ、＠Ｉ、ａリ　Ｃ）Ｆ８８９　
　　　　、！￥、クー兄２５４７（ｃｒｏｓｓｎｅｓｓ
）　　　　　　　　’　　ｃＲＦ８９０　　　　−．５
．７ｊｖ２１ｙイーｙ、ｖ　）　ニー　　　　　　　　
　　　　　　　ｃＲＦ８９１　　　サルモネラ　　　　
　　　　　　　　　Ｃ（ｅｒ６：ｚ８５　ニー） ｔｙ８９２　　　ｓ、パンゴール（ｂａｎｇｏｒ）　　
　　　　　　　ｃノアＦ８９３　　　サルモネラ　　　
　　　　　　　　　　Ｃ（６６“　ｚ６５　　ニー） ＲＦ８９４　　　サルモイ、ラ　　　　　　　　　　　
　　Ｃ（４８：ｚ４１°−） ＲＦ８９５　　　サルモネラ　　　　　　　　　　　　
Ｃ（４４：４ニー） ＲＦ８９６　　　　Ｓ、’／ムスバリ（ｓｉｍｓｂｕｒ
ｙ）　　　　　　　　ｃＲＦ８９’ｌ　　　　Ｓ、ラド
ガース（ｒｒｂｔｇｅｒｓ）　　　　　　　　ｃＲＦ８
９Ｂ　　　　　Ｓ、エーンユ（ａＣｓｃｈ、）　　　　
　　　　　　　　　ｃＲＦ８９９　　　　Ｓ、クロスネ
ス　　　　　　　　　　　　ＣＲＦ９４４　　　　ンゲ
ラ（グループＢ）　　　　　　　　　　　　　ｄｌンＦ
９４５　　　　Ｓ、フレクスネリ　　　　　　　　　　
　　　　　ｄＲＦ９４６　　　ノゲラ（グループＢ）ｄ
ＲＦ９４７　　　ｙグ之（グループＢ）ｄ１１Ｆ９４８
　　　−イブ−２（り”ループＱ）　　　　　　　　　
　　ｄ（’／−ｅｒｓｉｎｊａ　　ｅｇｔｅｒｏ−ｐｏ
ｊｉｔ、ｉ、ｃａ）ｌ＆９５４　　　　夕４≦りも７・
円Ｚデ三３０隻デー左　　　　　　　ｄＲＦ９５５　　
　　　ヤピ・工Δ二Ｆ３ニョ７］２ノ九　　　　　　　
　　ｄσ、シリカ−１σｆ究所（５ｉｌｌｉｋｅｒ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）ｂ　本研究 Ｃ疾病コントロールセンター（（：ａｎｔａｒ　ｆｏｒ
Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ） ｄ　ゲアリー・トーンＣＧａｒ’ｌ　Ｄｏｅｒｎ　）大
腸菌とハイブリダイズしない５４個のクローンの多くは
非サルモネラ培養菌のいくつかにクロス−ハイブリダイ
ズする。１４個のクローン（第二図に示しだ１０個のク
ローンＩｆむ）は他の分離端とはクロス−ハイブリダイ
ズしないで、サルモネラ培養菌ｌＦ一対して非常に特異
的であることがわかった。これらはその後他のザルモイ
・う分離直を検査するために各々の甲のクローン化した
挿入物をプローブとして使用１゛ろことにより広１１ｉ
Ｕ囲に（すｆ死される。

この選別は次のように実７ｉＩ！ｉ烙れる。最初に、１
４個のサルモネラに特異的な１０〒片ｆ　Ｊ３ａｒｎＨ
Ｉを使用してプラスミドベクターから切断し、アガロー
スゲルを通して電気泳動し、電気溶離し、そして先に記
載したごと°くニノクトランスレーションにより３２Ｐ
で標識する。

上記プローブを使用して検査されるサルモネラ分離菌お
よび他の細菌分離物のドツト・プロント（１）ｏｔ　ｂ
ｌｏｔ　）は、Ｌプロ゛ス培地甲の＋ＮＩ］　１ａｊｌ
培養物を約２０倍に濃縮し、次いでニトロセルロースフ
ィルター上に１マイクロリツトルずつ滴下点在きせるこ
とにより作られる。その、に１月面イはそのｊ易で溶劇
され、それらのＤＮＡは変性されて引き続き０．２　Ｍ
ＮｃｔＯＨｌｏ、６　ＭＮａＣ１２ｂよび１八４（・リ
ス（ｐｈ１８．０　）　／　０，６　Ｍ　ＮａＣｌ１　
　で胞和塾せたワットマン３Ｍ紙（’Ｗｈａｔｍｎｎｎ
、　　１ｔＪｉ票名う上１／Ｃソｔ７）　７　’１　＃
　ターを置き、その後そのフィルターを無水エタンール
中に浸漬してそれらを＋：ｉ乞燥させることによりｉ屯
１定化されろ。

上記選別方法の結果は下の第二衣に示されろ。

そこに示されるごとく、クローンＲＦ８２１（第二衣）
は試験したサルモネラ分馳物の全てとハイブリダイズす
る。

Ｓ、オハイオ（ｏｌｖｉｏ）　　　　　　　　　１　　
　１　　　１　　　１Ｓ、オス口Ｉｏｓｌｏ）　　　　
　　　　　　１　　　１　　　１　　　１Ｓ、パラテイ
フイ＜ｐａｒａｔ、ｙｐＭ）　Ｃ１１１１峠―鹸−□ Ｓ、ボッダム（ｐｏｔｓｔｉａｍ）　　　　　　　　　
　１　　　　　１　　　　　１　　　　　１Ｓ、テネ：
／−（ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ）　　　　　　　　２　　　
　２　　　２　　　２ｓ、トムソン（ｔｈｏｍｐｓｏｎ
）　　　　　　　６　　　６　　　６　　　　Ｇ□□□
□− グループ　Ｃ２ Ｓ、ブロックリ−（ｂｌｏｃｌｃｌｅｙ）　　　　　　
　　４４　　　　４　　　　４Ｓ、クロストラップ（ｇ
ｌｏＳｔ恍ｐ）　　　　　　　　　　　１　　　　　１
　　　　　１＋ＳＨ”−ト（ｈａ、ａｒｄｔ）　　　　
　　　　　　２　　　　２　　　　２　　　　２Ｓ、ｍ
ｌｌヒトス（ｋｏｔｔｂｕｓ）　　　　　　　　１　　
　　１　　　　１　　　　　’、ｆＳ、リッヂフィーー
）レドｌ１ｉｔｃｈｆｉｅｌｃｌ）　　　　　　　　　
１　　　　　　１　　　　　　１　　　　　　　ｉＳ、
マンダカ（ｍａｎｄａｋａ）　　　　　　　　　　１　
　　　　１　　　　１　　　　１Ｓ、ミュンヘン（ｍｕ
　ｅ　ｎ　ｃ　ｈ　ｅ　ｎ　）　　　　　　　　４　　
　　４．　　　　４　　　　４−ンとハイブリダイズし
た分１：ｉｌ試料の数９　ｌｔ１イ１３３３１１づｊｒ
ｉ゛３０５−１　ｌＩ：Ｆ２Ｏ３７Ｉ：Ｆ：３４４１７
Ｆ３１８１１：ｌｉ′３４７−３１１づｊｒｉ゛３６７
１１　　　０１１１０ ４　　　４　　　０　　　０　　０　　　　Ｑ　　　　
１１１００１１０ １１　　　００１１０ １　　　１　　　０．０．　　１　　　１’０２２００
０００ ６、、　　６　　　０　　　０　　５　　　５　　　０
１１００１１０ ２　　２　　０　　０　　１　　１　　０１１　　　．
４　　　０　　　０　　４　　　４　　　１１１　　　
００１１０ １　　１　　０　　０　０　　０　　０１１　　　００
０００ ２２００’１．１０ １　　１　　０　　０　　１　　１　　０１１　　　０
０１　　　１０ １１０００００ ４１　　　００４　　　４０ Ｓ、ナランノＩｎａｒａｓｈｉｎｏ）　　　　　　　１
　　　　　７−　　　１　　　　１　　　　１Ｓ、ニュ
ーボート（ｎｅｕｆｐｏｒｔ）６　　　　　６　　　　
６　　　　６　　　　６Ｓ、タラハツセ−（ｔａｌｌａ
ｈａｓｓｅｅ）　　　　　　１　　　、　　　　１　　
　　　１　　　　　１　　　　　１Ｓ、ツーリール（ｔ
ｕｌｅａｒ）　　　　　　　　１　　　　　　１　　　
　１’　　　　　１　　　　１グループ　Ｃ３ Ｓ、ケンタラキー（ｋｅｎｔｕｃｌｃｙ）　　　　　　
　ｌ　　　　　　１　　　　１　　　　１．　　　　　
ＩＳ、バージニア（ｖｉｒｇｉｎｉａ、）　　　、　　
　　　１　　　　　１　　　　１　　　　　］　　　　
　ＩＳ、ボルナム（ｂｏｒｎｕｍ）　　　　　　　　　
１　　　　　　１　　　　１　　　　　Ｌ　　　　　１
グループ　Ｄ Ｓ、ベルタ（ｂｅｒｔａ）　　　　　　　　１　　　　
１　　　１　　　１　　　１Ｓ、グレグダム（ｇｌｅｇ
ｄｔｒｍ）　　　　　　　’　　１　　　　　　１　　
　　１　　　　　］、　　　　　ＩＳ、タブ２０ス９ラ
ーム（ｄａｒ−ｅｓ−ｓａａ、ｌｔｍ＋、）　　　　　
１　　　　　　　１　　　　　　１　　　　　　１　　
　　　　１Ｓ、ダブリン（ｄ、ｕｂｒＬｉｎ）　　　　
　　　　１　　　　　１　　　　１　　　　１　　　　
１Ｓ、イーストフ’／ｌ／不（ｅａｓｔｂｏｕｒｎｅ）
　　　　　　１　　　　　　　１　　　　　１　　　　
　１　　　　　１Ｓ、エンラ１リテイデイス（ｅｎｔｅ
ｒｉｔｉｄｉｓ）　　　　　　４　　　　　　　　　４
　　　　　　４　　　　　　　４　　　　　　４８゜ガ
リナルムＣｇａｌｌｉｎａｒｕｙｎｌ　　　　　　　１
　　　　　　１　　　　１　　　　　１　　　　１Ｓ、
ジャビアナ（ｊａｖｉａｎａ）　　　　　　　３　　　
　　３　　　　３　　　　３　　　　３Ｓ、モスコラ（
ｍｏｓｃｏｗ）　　　　　　　　　１　　　　　１　　
　　１　　　　１　　　　１イブリダイズした分離試料
の数 ｌビＦ３０５−Ｉ　　ＲＥ２Ｏ３１４；’３４４　１７
ｐ″３１８　ノアＦ３４７−３　７＜Ｆ３６７１．００
１１０ １　　　０１６　　　６　　　０ １　　　００１　　　１　　　　（Ｊ ｌ　　　　０００　　　０　　　０ １　　　００１　　　１　　　０ １０’ｏ１　　　１　　　　’０ １　　　０　　　０’ＯＯ０ １００１１０ １００１１０ １００１１０ １００１、１０ １１１０００ ４００４４４ １００１１０ ３１３２２０ １００１１１ Ｓ、ナポリ（ｎａｐｏｌｉ）　　　　　　　ｌ　　　　
　１　　　１　　　１　　　１ｓ、７、ナー（ｐａｎａ
ｙｒｒヶ）　　　　　　　　４　　　　　／ｌ　　　　
　４　　　４　　　４Ｓ、ベンザコラ（ｐｒｍ、ｓａ、
ｃｏｌａ）　　　　　　　１　　　　　１　　　　１　
　　　１　　　　１Ｓ、ｏストック（ｒｏｓｔｏｃん）
　　　　　　　　　ｌ　　　　　　　１１１１Ｓ、セン
ダイ（ｓｅｎｄ、ａｉ）　　　　　　１　　　　１　　
　　１　　　１　　　１Ｓ、テイフイ（ｔｙｐｈ、ｉ）
　　　　　　　７　　　　７　　　　７　　　７　　　
７Ｓ、フレスノげｒｅｓｎｏ）　　　　　　１　　　　
１　　　　１　　　１　　　、ＩＳ、ゲイツヘッド（ｇ
ａｔｅｓｈａａｔｌ）　　　　　　　１　　　　　　１
　　　　　１　　　　、　１　　　　　１Ｓ、ストラス
ブルグ（ｓ　ｔｒａｓｂｃｍｒｇ）　　　　　１　　　
　　１　　　　１　　　　１　　　　１グループ　Ｅ ザルモネラ （３，１０：１，６：−）　　　　　　　　１　　　　
１　　　１　　　１　　　１Ｓ、アナタム（ａｎａ、ｔ
ｕｍ）　　　　　　　　４　　　　　４　　　　４．　
　　　　／ｌ　　　　　ｙＩＳ６ブタンタン（ｂｕｔｃ
ｍ、ｔａｎ）　　　　　　　　１　　　　　１　　　　
１　　　　１　　　　１Ｓ、ギブ（ｇｉｖｅ）　　　　
　　　　　１　　　　１　　　１　　　１　　　１Ｓ、
ロンドンｌ１ｏｎｃｌｏｎ）　　　　　　　　　　２　
　　　　　２　　　　　２　　　　　２　　　　　２Ｓ
、ルアクリディス＜ｍａｌＣａｇｒｉ’、＋ｉ、ｑ’、
ｓ）　　　１１　　　　　１　　　　１　　　　１Ｓ、
ムエンスター（ｍｕｅｎｓｔｅｒ）　　、　　　　　２
　　　　　２　　　　２　　　　２　　　、　２８０ナ
イボール（ｙｂｏｒｇ）　　　　　　　　１１　　　　
１　　　　１　　　　　トイブリダイスした分離試料の
数 一１ゼＦ３（１５−Ｉ　ＲＥ２Ｏ３１−Ｍ３４４１イＦ
３１８　ＲＦ３４７−３１＜Ｆ３６７１’　　　０　　
　１　　１１０ ０００００ １０（ＪＩＩＯ １００１１、１ １０００００ ０００００ １，０，００（Ｊ’０ １　　　０１０　　　００ ＋−００１１０ １００１１０ ７１００４４，０ １０１０，００ １０１，０００ ２０２００、０ １、０００００ ２０’２　　０　　　　、、ｏ　　　　０１　　　０　
　　１　　０　　　０　　　’０Ｓ、オリオン（ｏｒｉ
ｏｎ）　　　　　　　ｌ　　　　１　　　１　　　１Ｓ
、プロラム（ｐｕｌｌｏｒｕｍ）　　　　　　　　１　
　　　　１　　　　１　　　　４Ｓ、アーカンサスＩａ
ｒｌｃａｎｓａｓ）　　　　　　　　１　　　　　１　
　　　１　　　　１Ｓ、ネビントンＩｎｅｗｉｎｇｔｏ
ｎ）　　　　　　　　１　　　　　１　　　　１　　　
　１Ｓ、イリノイ（ｉｌｌｉｎｏｉｓ）　　　　　　　
　　　２　　　　２　　　　２　　　　２Ｓ、ミ不アポ
リスーｎｎｅａｐｏｌｉｓ）　　　　　　１　　　　１
　　　　１　　　　１Ｓ、二二□フランス゛ウィック（
ｎｅｗｂｒａｎｓｗｉｃｌｃ）　　３　　　　　　３　
　　　　３　　　　　３Ｓ、チタゴングＣｃｌＬｉｔ　
ｔａｇｏｒｕ））　　　　　　　１　　　　１　　　　
１　　　　１Ｓ、タレイフエルド（ＩｃｒｅｆｅｉｃＬ
）　　　　　　　　　　　　１　　　　　　１　　　　
　　１　　　　　１Ｓ、ルシアナ（ｌｕｃｉａｎａ）　
　　　　　　　　ｌ　　　　　１　　　　１　　　　１
Ｓ、セフテノＪｚグ（ｓｅｆｔｅｎｂｅｒｇ）　　　　
　　　　２　　　　　２　　　　　２　　　　２Ｓ、ベ
スターステード（ｗｅｓｔｅｒｓｔｅｄｅ）　　　　　
　　１　　　　　　１　　　　　　１　　　　　　１グ
ループＦ、Ｇ Ｓ、アバジーン（ａｂｅｒｃｌｅｅｎ）　　　　　　　
　　１　　　　　１　　　　　１　　　　１Ｓ、ルビス
ロー（ｒｕｂｉｓｌａｗ）　　　　　　　　　　２　　
　　　２　　　　　２　　　　　２Ｓ、マーンヤ／ｌ／
　（ｒｎａｒｓｈｔｂｌｌ）　　　　　　　　　１　　
　　　１　　　　１　　　　１Ｓ、ボーナ（ｐｏｏｎａ
）　　　　　　　　　３　　　　３　　　３　　　３Ｓ
、ハハナ（ｈａ、ｖａｎａ）　　　　　　　　、１’　
　　１　　　　１　　　１Ｓ、ミシシソビ−１ｍ１ｓｓ
ｉｓｓｉｐｐｉ）　　　　　　１　　　　　１　　　　
　１　　　　１０−ンとハイブリダイズした分離試料の
数１９　１イＦ３　：３３　　ノでＦ２Ｏ３，−１１七
Ｆ３０４　　ＲＦ’３４４　　Ｍｌ；’３１８　１ンＦ
’３４７−３　１ｔＦ３６７１１００１１　　　　０ １　　　１０（Ｊｌｌ　　　　　Ｏ ｌ　　　　１　　　０　　　１　　　１　　　１−　　
　　　。

１１００１１　　　　０ ２２００２２　　　　０ １１００１１０ ３　　３　　０　　３　　３　　３　　　０１１００１
．１　　　　０ １１１１１１０ １１０１１１　　　　０ ２２００２２　　　　０ １　　　１００１１　　　　０ ｊ　　　　１　　　０　　　０　　　１　　　１　　　
　０２２０２２２　　　　０ １１００００　　　　０ ３３３３００’０ １１００１１　　　　０ １　　　１　　　０　　　１　　　０　　　０’　　　
　　０クローンＲＦ８５６、ＲＦ３５２、ＲＦ３５４、
およびＲＦ３５５−１はｌンＦ３０５−１と同じく全て
の分離サルモ不う菌とハイブリダイズする（ＡＴＣＣに
寄託されたクローン１１Ｆ３０５はその後ＲＦ３０５−
１と改名畑れた）。クローンＲＦ３２１、ＲＦ３５２、
ＲＦ８５４およびｌンＦ３５５＝１のうち少なくとも３
個は独立したクローンであるが、これらは同一の挿入片
を含むことがわかった。ＲＦ３２１とＲＦ３５４は同じ
ＢａｒｎＨＩ断片を含むが、その方向性はプラスミドベ
クターに関して反対である。ｕＦ３５５−１は１．４に
’Ｂの大きさの第二のｌコａηｔｌＪｌ断片をきらに包
むクローンから誘導され：５．６ＫＢ断片の方向性はＲ
Ｆ３５４と同じである。ＲＦ３５２はｌンＦ３２１に一
致する。クロニン１２Ｆ３５６は太きさおよび制限地図
により他のものと異なる。

クローンＲＦ３１９、ＩＩＦ８８Ｂ、ｌ七Ｆ３２６、お
よび１１Ｆ８０５−１は検奔した全サルモネラ分離菌の
うち１００％より少ないものとハイブリダイズする。大
きさ、：ｌ１ｌＪ限地図および・・イブリッド形成パタ
ーンにより、クローンＲＩ”：３ＢＢと１１Ｆ３２６は
これらがプラスミドベクター中で反対の方向性をもつと
いうことを除いて同一である。

第二図に示したμノ「片のうち５つは１９８３年６月２
９日にビオ−リアにある国際寄託機＋ａのアダリ力ルチ
ュラル　リサーチ　カルチャー　コレクション（Ａｇｒ
ｉｃｕｌｔｒｔｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃ）Ｌ　Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅＣａｌ　１ａｃｔｉｏｎ、　ＮＲＩＩＬ　）に寄
託された。谷々の断片は大腸菌にｉすれろプラスミドＹ
Ｅ７Ａ３に挿入されろ。これらの断片のＮＲＲＬ識別番
号は次の通りである。

ノンＦ８５６：ＮｌンＲＬＢ−１５４８４ＲＦ８８８：
ＮｊンノンＬＢ−１５４７３１２Ｆ’３１９：ＮＲＩン
ＬＢ−１５４７２１１Ｆ３０５　：ＮＲ１１Ｌ　　１３
−１５４７９ＲＦ８２１：ＮＩＩＲＬ　　Ｂ−１５４８
０クローンｌンＦ３０４、ｌイＦ３４４、ＪンＦ３］８
、ＲＦ３４７−８、およびＲＦ３６７は試験した全サル
モネラ分離菌の５０％もしくはそれ以下とノ・イブリダ
イズし、こうしてこれらのクローンは、はとんど疑いな
く染色体で。あって完全な染色体よりも小さ女部分から
なる鵠二図のプローブよりも、プローブとしてあ丑り適
さないものである。ＲＦ３４４およびＲＦ３４７−３に
ついて、そのハイブリッド形成パターンは互いに異なる
。ｉ＜　ｐ　３　ｉ　ＢはＲ，ＦＢ４７−３と同じ分布
をもつが大きさ２よひ制限地図において異なる。クロー
ンＲＦ：３０４とＲＦ８６７はその属中で狭い分布をも
つ。しかしながら、これらの２つのクローンについての
ハイブリッド形成パターンは異なる。これらのクローン
の全てはＳ、チフィムリウムに通常見い出されろ潜在プ
ラスミド（ｃｒｙｐｔｌｃ　ｐｌａｓｍｉｃｌ）　”ｉ
、）欠失しているΣチフィムリ？一台Ｌ　Ｔ　２菌株、
Ｊ）　Ｒ９０００からのＤＮＡとハイブリダイズづ−る
。これらのクローン化された１祈片の分布は広傾１ノ月
に変化するので、ＲＦ３０４．１ゼＦ３４４、ｊ６よび
ＪイＦ３４７−３は異なるファージまだはプラスミドの
一部であるかも知れない；もしそうなら、ＲＦ８１Ｂと
ＲＦ８４７−１は２そらく同じプラスミドまたはバクテ
リオファージから誘導きれたものだろう。

定量的サルモネラ検出法 本発明プローブを使用してのサルモネラ検出法を詳細に
述べる前に、本発明プローブとサルモネラＤＮＡとの間
に形成されろ・・イブリッド複合体の検出は種々の方法
で達成することができろということを指摘しておかなけ
ればならない。一つの方法はプローブを標識しておくこ
とにより、そのプローブが形成した・・イブリント被合
体を標識することである。プローブはいろいろなフ５法
のうちいずれかで１票６成することができる。いくつか
の４票識方法は直接的なものであり、すなわちプローブ
に結合される・瀦識それ自体か検出可能なものであって
、その例は放射性同位元累である。他の標識は間接的な
ものであり、すなわちその標識はハイブリッド形成後に
１つまたはそれ以上の反応を行うｌでそれ自体検出不可
能なものであって、その例はビオチンのような化合物で
あり、ビオチンそれ自体は検出されないが、螢光団や西
洋ワサビ被層オキ／ダーゼＣ１１１？、Ｐ）のようなト
Ｉイ素のごとき検出可能な化学種に結合ざイｔたアビジ
ンと反応しだ後に検出可能になる。Ｈ１１Ｆの場合に、
検出はＩｆ　ＲＰのだめの基質を使用して行われ、好適
々そのよう々基質は色原体ジアミノベンジジンである。

今俊本明＃Ｉｌ書甲で使用する゛標識“′という用語は
、便宜上、放射性同位元素のような面接的に検出可能な
化学種およびビオチンのような間接的に検出可能な化学
種の両刀を意味する。間接的に検出可能な標識全検出可
能にするために結合されろ化学種（例えば、ｌ１ＲＰ　
／アビジン）は本明細書に２いて゛表示体“とじて示さ
れろ。

プローブのだめの最も好捷しいｉｑ、Ａ　Ｉイあはプロ
ーブのンドシン塩基とアテニン塔基に結合基を経て結合
される非同位体標識である。このような標識化は本件出
願さ同日Ｆ士で出、願され、本件出願の出願人に譲渡さ
れた′°像識されたＤＮＡ”と題するＬａｎｄｅｓによ
る米国特許出願明細書（参照することによりここに引用
される）に記載されている。

上記のＬａｎｄｅｓによる米国特許出願明細書に記載き
れた非同位体標識化法は、酵素分子をＤＮＡに結合させ
るために架橋剤を使用することが必要て゛あり：この反
応を実施するためにＤＮＡは一本鎖の形でなけれげなら
力い。この型の標識化を使用する場合に、標識化の前に
プローブを一本鎖の形に保持することが有利である。こ
のことはファージベクター、例えばＺｊｎｄｅｒ等によ
ろＧｅｎｅ１９．１（１９８２，）に記載されて公的に
入手できろファージベクターＦｄ、の中にそこに記載さ
れた方法を使用して一本領ブローブを組み入れることに
より行われる。その方法はプローブの末端に１Ｊｉｎｔ
ｌ　Ｉｌｌ結合剤を加え、その後ファージベクターＦｄ
、の特定のＨｉｎｃＨ１部位に挿入したプローブをクロ
ーン化することを包合する。一本領プローブを標識化す
る場合、１ｉｉｎｄｐｄ制限酵素を使用してこのプロー
ブｒ、）　Ｆｄ、から切断する。

プローブを同位体で標識する場合は、該プローブは通常
標識化の前にプラスミドベクター（例え’ｙｆ、ＹＥア
１３）の中に担持される。標識化は最も一般的にはハイ
ブリッド形成検定法で使用するプローブをそのプラスミ
ドから切断し、その後そのプローブをニックトランスレ
ーションするこトラ包會する。別の方法として、完全な
プラスミドを二ツクトランスレーションして検定に使用
づ−ろことかできる。どちらの場合にも、プラスミドの
中で二本知になっているプローブを壕ず第一に、例えば
熱処理や墳墓との処理により、一本領にし斤ければなら
ない。

プローブの標識化を必要としない他の検出方法は欧州特
許出願第００７９１３９号明細書（参照することにより
ここに引用されろ）に記載されたいわゆるザンドイツチ
ノ・イブリッド形成法と呼ばれるものである。この検定
においては、−重鎖ベクター甲に苫まれろ未（票；識ブ
″ローブはサルモネラＤＮＡと）・イブリダイズし、そ
し７てプローブ不言の標識された一本鎖ベクターがプロ
ーブ含有ベクターとハイブリダイズすることによって７
１イブ；ｊノド俵合体の全体を標識１ヒする。

本発明のサルモネラに特異的な、例えば３２ｐで標識さ
れたプローブはどれも次のようにｎ聞直混合物中のサル
モネラの存在を証明するのに使用され釈し、次いで一連
の二ｒロセルロースｊ摸上に点在略せる。平行に置いた
もう一組のニド。ロセルロース膜にはＳ、テフイムリウ
ムの同じ段階的希釈液液だし各希釈液は一定量の大腸菌
と混合される）全点在きせる。細菌を溶菌し、それらの
ＤＮＡは例えば膜をＮａ　ＯＨ／Ｎ’ａ　ＣＡ中に浸漬
することにより変性され、そしてその変性溶液は例えば
トリス／Ｎａ　Ｃβ　中に丹び浸漬することにより中和
される。

その後細菌ＤＮＡはその膜を無水エタノール中に浸漬し
て、次いでそれらを乾燥させることによりｊ漢上に固定
される。膜はそれからデン・・−ト（Ｄｅ　ｎ、ｈａｒ
ｄ　ｔ　）によるＢＢＲＣ２３，６４１（１９６６）に
記載されグζような予備・・イブリッド形成溶液中に３
７℃で２時間、浸漬する。その予備ハイブリッド形成溶
液は４５％ホルムアミド、２５　ｍＭ’　Ｎａ２Ｐ（Ｊ
）４、ｐ　ｉ−１６，８，５×デン・・−ト溶液（１×
は０．０２ｖ１／ｖ％のポリビニルピロリドン、フィコ
ール５００、および牛血清アルブミンである）、および
２５０μｊ；／ＡｒＬｌ！の超音波処理され変性された
担体ＤＮＡ（例えば子牛の胸腺まだはサケの精液由来の
もの）から成る。その後、・・イブリント形成はにｒｕ
、ｎ５ｔｅｉｎ等によるＰＮＡＳ　　ＵＳＡ７２．３Ｌ
６１（１９７５）ｔだはＦａｌｋｏｗ等によろ米国特許
第４３５８５３５号明細書（参照することによりここに
引用される）Ｋ記載された方法のよう力慣用の−・イブ
リッド形成法を使用して、上で述べた１つ一！たはそれ
以上のＤＮＡプローブを用いて実施される。そのハイブ
リッド形成溶液はそれがさらに１０　／Ｖ％のデギスト
ランナルフ工−トおよび０．１−１０μ９７Ｍの標識プ
ローブを含むということを除いて、上記の予備ハイブリ
ッド形成溶液と同じ組成をもつ。

ハイブリッド形成反応は３７℃で２時間進行きせる。そ
の後、ハイブリダイズされなかったプローブを既定の洗
浄法（例えば、１０　ｍｕ　ＮａＣ−ｅを用いて３７℃
で１０分間ずつ３回洗浄する）でその固体支持体を繰返
し洗浄ｊろことにより除去する。

膜に固定された標識ＤＮＡ複合体は各膜上のサルモ不う
の量に定量的に一致する。各希釈液に関しては、純粋な
サルモイ、う試料に対して得られる定量的結果は大腸菌
を含む試料に対して得られる定量的結果と同じであり、
このことは大腸菌ＤＮＡの：σ在がプローブと存在する
サルモネラＤＮＡとのハイブリッド形成に何ら影響を及
ぼさないこと、および本発明のサルモネラに特異的なプ
ローブは細菌混合物中のサルモネラの存在を検出するの
に使用するこさができろことを示している。

本発明プローブを１つたけ使用しても良い結果が得られ
るけれども、我々は上で論じたように１つ以上の異なる
プローブを同時に使用する時最も良い結果が得られろと
いうことを見い出した。

食品中のサルモネラの検定 食品中のサルモネラの存在を検出する方法は次のように
要約される。

無作為に選択した試験されるべき２５！；Ｉの食品試料
１５個を３０〜３７℃において２０〜２４時間栄養培地
中で培養する。その培養・吻のｌ　ｍ１分画を第一図の
円筒形部分１４の中にピ被ソトで計って入れ真空′ｆｆ
適用する。こうして上で述べたよりに、サルモネラと同
じ大きさの小さな細菌をニトロセルロースフィルター２
６上に捕集し、食品粒子と大きな細菌とを含む円筒形部
分１４はその後捨てられろ。

次に、細菌を溶菌しかつ細菌ＤＮＡを変性することがで
きる溶液（例えばＮａＯＨ７ＮａＣ君）を円筒形部分１
６に力りえる。ＤＮＡを変性した後にトリス／　Ｎ（Ｌ
　Ｃ，ｅを加えてＮａ　ＯＩＩ／Ｎａ　Ｃ（Ｊの溶液を
中和する。

細菌ＤＮＡはその後、本件出願の出願人に譲渡された１
９８２年１２月１３日イ寸のＧｒｏｅｔ等による米国特
許出願ｉ４４８９７９１明副書（参照することによりこ
こに引用される）に記載されるように、無水エタノール
を膜２６に雄刃（ｌし、次いでそれを乾燥させろことに
より膜２６上に固定される。

固定した後に、］Ｉ莫ＩＯ２上記の予備−・イブリッド
形成緩衝液中に１５−８０分間浸漬する。それから上で
述べたように３２Ｐ−標識プローブを含む・・イブリッ
ド形成緩衝液を雄刃１」［２て・・イブリッド形成を３
７℃で２−３時間進行きせる。放射性・・イブリッドＤ
Ｎ、４　複合体は食品試料中にサルモネラが存在するこ
とを表示するものである。

上記方法は全ての食品中の第二光に掲げたサルモネラの
存在を検出するのに使用することができる。

ハイブリッド形成による検定を行う前に、食品試料は米
国食品医薬凸周ＣＦＤＡ）食品部微生物課によろＢａｃ
　ｔ　ｅｒｉａｌ　ｏｇ、Ａｎａｌ　、Ｍａｎｕａｌ　
、　第５版。

ワ／ントンＤＣ，分析化学協会（１９７８）に記載され
た方法に従って処理されろ。

第二光に示すように、試験した食品培養物のいくつかは
一晩インキュベ−７ヨンする前腎予め決められた数のサ
ルモネラを接種した。これらの場合にはサルモネラをＬ
グロス培地で約２Ｘ１０８細胞／　ｍ１３に増殖させ、
Ｌグロス培地で希釈し、そして食品培養物に加えられた
。

５つのＮＲＲＬ−寄託プローブ（３２Ｐで二ノクトラン
スレーンヨンしたもの）の全部につき、核酸ハイブリッ
ド形成を使用して、次の食品群（試、験した食品試料は
サルモネラを接種したものさ汚染されていない試料の両
方であった）を検定ツーろのに使用した：ピーナツツバ
ター、大豆粉、マカロニ、板チョコレート、脱脂粉乳、
凍結保存したフィッシュスティック、乾燥卵、ドンダフ
ード、ザワークリーム、およびインスタントマツ／ユボ
テト。

サルモネラを接種した各種の食品試料は非常に強い・・
イブリット形成結果を与え、一方汚染されていない試料
は非常にはっきりとした１ぢで性の結果を与えた。

食品中に一般に見い出されろ異なったサルモネラ菌株が
ハイブリッド形成による検定で同じようにふる丑うかど
うかを決定するために、大豆粉に１９８２年１２月に発
行さイｔた疾病コントロールセンターの１９８０サルモ
ネラ　ザーベイランスアニュアル　ザマリー（１９，８
０ＳａｌｍｏｎａｌｌａＳｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ　Ａ
ｎｒｕｂａ、ｌ　Ｓｕｎｍａｒｙ　）によれば、食品、
ヒトの臨床試料および他の動物中に最も−ｔｆｙ？的に
見い出されろとされた４種のサルモネラ菌株約１０００
個を接種する。これらの４棟の菌株は一晩インキュベー
ションを行う。各培養物から反後試験フィルター全作り
、そして３２１）でニックトランスレーションされた５
つのＮｌンＲＬ−ｗ託プローブを使用して検定する。そ
のフィルターはオートラジオグラフィー用のフィルムに
感光させ、後でンンチレーション計数計で数える。

−サルモネラのいくつかの菌株１’ｕ、Ｈｌｓ、ハイデ
ルベルグ）（才、ハイブリッド形成の強さが等しい数の
他のサルモネラ菌株の強さよりも弱いという点で、ハイ
ブリット形成での決定において違ったようにふるまうか
も知れない。しかしながら、この相違はプローブの相違
（でより生ずるものではなくフィルム上の細菌の不十分
な溶菌（ハイブリット形成反応にぢらされるＤＮＡの数
を減少させろ）のようなある種の機械的現象から生ずる
ものと思われろ。この相違は多量のＤＮＡプローブを検
定で使用することにより少なくすることができるかも知
れない。・・イブリッド形成の強さがやや小さいにもか
かわらず、Ｓ／・イデルベルグはザルモ不うに特異的な
プローブのいずれかまたはそれらの全部を使用してこの
検定で容易に検出することができろ。

こうして種々の食品はこの試（倹において容易に取り扱
うことができろ。これらの艮品は栄養培地中で一晩イン
キコーベートすることが望１しく、強化培養による細菌
の選択的増殖は必要としない。

本発明の方法の利点は数多くある。１つの食品試料の分
析に要する時間は一般に微生物学的検定に要する５−７
日からかなり短縮ζｔ＋、ろ。その」＝、大多数の食品
試料を短時間で処理することかできる。これらの試験に
おいて、−・イブリッド形成の基底値（陰性試料の放射
能値）は非常に低り１．このことは陽性の結果と陰性の
結果との間のはっきりとした区別を可能にするものであ
る。ここに記載したプローブは丑だ糞便のサルモネラの
存在を試験するだめの臨床項目に適用され、尻便試料は
食品試料と同じ方法で処理されろ。

他の実施態様は特許請求の範囲内のものである。

例えば、すでに述べたように、プローブは各種の標識を
使用して標識される。ニトロセルロース膜がＤＮＡｔ結
合させるのに好適であるが、他の適当なりＮＡ結合支持
体（例えば、ジアゾベンジルオキシメチル紙）も使用す
ることができろ。

【図面の簡単な説明】

第一図は本発明を実施するのに肩側な装置の分ＪＱイし
た等角投影図である。 第二図は本発明のサルモネラに特異的なプローブの制限
地図である。 １０：食品試料処理装置　　１２：蓋 １４：上部円筒形部分　１６゛下部円筒形部分１８：頂
部　　　２２°大きい孔のフィルタ、−２４＝硬質プラ
スチツクグリツド ２６：ニトロセルロース膜 ２８：硬質ブラスチソクグリッド 手　　続　　補　　正　　書 昭和ｉ年３月夕日 特許庁長官若　杉　和　夫殿 １、事件の表示 昭和Ｓゴ年特許願第　　Ｆ３￥′０　号２発明の名称 ・蝕′。孕のサル８才う杖佑二転 ６補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所 名將　　インチク゛レテ、１−・　−“−オティシフス
イ、コー＋、°ｂ−テ、１−゛ ４代理人 ５、補正の対象 ５５６−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　サルモネラＤＮＡと選択的にハイブリダイズ
   （相補性結合）して検出可能な複合体を形成することが
   できろ少なくとも１つのＤＮＡプローブを用意し、該Ｄ
   ＮＡプローブを食品試料中に存在するサルモネラＤＮＡ
   と−・イプリタ′イスさせて・・イブリットＤＮＡ復合
   体ケ形成させろ条件下に、該ＤＮＡプローブを食品試料
   中の灯附と接触させ、そして該ハイブリットＤＮＡ′Ｏ
   ｇ、合体を食品試料中にサルモネラか存在することの表
   示として咲出ｊ乙、ことから成るｉ面ｌｉＡ含有食品試
   料甲のサルモネラの存在を検出する方法。 （２）プローブが・標識して用いられろ！１４許請求の
   範囲第１項に記載の方法。 （３）標ｉｉ哉はそイを自体１灸出可能なものであるか
   、あるいは表示体に選択的に結合して検出可能な複合体
   を形成することができろものである特許請求の範囲第２
   項に記載の方法。 （４）プローブは放射性同位元素で標識されろ特許請求
   の範囲、第３項に記載の方法。 （５）放射性同位元素は二ツクトランスレーションで該
   プローブに組み入れられた３２ｐである特許請求の範囲
   第４項に記載の方法。 （６）放射性同位元素はニックトランスレー／コンで８
   亥ブロー７″に組み入れられだ１２５Ｊである住寺許言
   青求の範囲第４項に記載の方法。 （７）標識はビオチンでありかつ表示体はバイブリソｌ
   −Ｄ＃　Ａ　９合体上のビオチンと結合する場合に検出
   可能な化学種を結合しているアビジンである唱“許請求
   の範囲１児３項ＶＣ記槙の方法。 （８）化学種は・・イブリッドｎ　＃　Ａ複合体を螢光
   測定により検出可能にする螢光団である特許請求の範し
   ！ＩＪ第７項に記載の方法。 （９）化学種はバイブリソ）ＤＮＡ？）２合体を７Ｅ子
   顕微鏡により検出可能にする電子密度の高い化合物であ
   るｔ特許請求の範囲第７項に記載の方法。 （１０）化学種はハイブリッドＤ　Ｎ　Ａ　ｌｔ合体を
   免疫学的に検出可能にする抗体である特許請求の範囲第
   ７項に記載の方法。 （１１）化学種は・・イブリッドＤＮＡ複合体を酵素的
   に検出可能にする一対の触媒／基質のうちの一方である
   特許請求の範囲第７項に記載の方法。 （１２）　　細菌をプローブ吉接触させる前に、該１別
   画は試料から分離されかつ溶菌されてそれらのＤＮＡを
   放出し、その後膣ＤＮＡは変性されてＤＮＡ結合支持体
   上に固定されろ特許請求の範囲語１項に記載の方法。 （刊　支持体はニトロセルロース膜である特許請求の＋
   犯四第１２項に記載の方法。 （１４）完全外サルモネラ染色体を含丑ず、かつザルモ
   ネラ種の８０％まだはそれ以上からのＤＮＡと・・イブ
   リターイズすることができるか他の腸内ａ　を茅］とは
   ハイブリダイズしないサルモネラ染色体の一部分から成
   るＤＮＡプローブ。 （ト））サルモイ・う紳の９０％またはそれ以上とハイ
   ブリダイズすることができる特許請求の範ｌａｌ第１４
   項に記載のＤＮＡプローブ。 （１６）標識された特許請求の範囲第１４項に記載のＤ
   ＮＡプローブ。 ｔ、１７）　　大腸菌（ＮｌでＲＬ　　Ｂ−１，５４８
   ０）に含まれるプラスミドＹＥｐ１３中に挿入されたサ
   ルモネラＤ　Ｎ　Ａ　　Ｂａｍ　ＨＩ断片である特許請
   求の範囲第１４項に記載のＤＮＡプローブ。 （１８）　　大腸菌ＣＮＲＲＬ　　Ｂ−Ａ５４７９．Ａ
   ＴＣＣ３９２６１）に含まれろプラスミドＹＥ、１３中
   に挿入されたサルモネラＤ　Ｎ　Ａ　　Ｂａｍ、　ｌｉ
   　Ｉ断片である特許請求の範囲第１４項に記載のＤＮＡ
   プローブ０ （１９）大腸菌（ＮｌイｌンＬ　　Ｂ−１５４７２）に
   言まオ′しろプラスミドＹＥ７）１Ｂ中に挿入されたサ
   ルモネラＤ　Ｎ　Ａ　　Ｂａｒ７ｔ　１１１断片である
   特許請求の範囲第１４項に記載のｆ）ＮＡプローブ。 （２０〕　大腸菌（ＮｊでｌンＬ　　Ｈ−１５４７３）
   に含まれろプラスミドＹＥ、ｐ１３中に挿入されたサル
   モネラＤＮＡＢαｍＨＩ蹄ｆ片である特許請求の範囲第
   １４項に記載のＤＮＡプローブ。 ｃ２１）大腸菌（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５４７４）ＶＣ言
   １１１．るプラスミドＹＥ、１３中に挿入されたサルモ
   ネラＤ　Ｎ　Ａ　　Ｂａｍ　ＨＩ断片である特許請求の
   範囲第１４項に記載のＤＮＡプローブ。 （２２）少なくとも２種の異なるプローブを使用する特
   許請求の範囲第１項に記載の方法。 （２３）少なくとも３種の異なるプローブ全使用する特
   許請求の範囲第２２項に記載の方法。 ［株］　少なくとも４棟の異なるプローブを使用する特
   許請求の範囲第２３項に記載の方法。 （２５）少なくとも５種の異々ろプローブを使用する特
   許請求の範囲第２４項に記載の方法。 （２６）フ“ローフ゛は４票ｉ哉されてεらず、・・イ
   フ゛リッドＤ＃　Ａ　複合体の検出はサンドイノチノ・
   イフ゛リッド形成法により行われる特許請求の範ｌＢＡ
   第１項に記載の方法。