JPS59199000A - 父系の決定および個々の遺伝的同一性を確立する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、父系の決定および個々の遺伝的同一性を確立
するのに用いられる新規かつ改良された試験方法に関す
る。

個体の同定が可能であることが重要な場合が数多くあり
、例えば、犯罪の場合における物理的証拠が特定の容疑
者のものと一致するかどうか、個人の父系（親糸、ｐａ
ｔｅｒｎｉｔｙ　）の決定について、彼（または彼女）
の母または父との関係を同定するとか、またより一般的
には、ウィルス、バクテリア、藻類、真菌、植物または
動物の株を遺伝的に同定する場合などがある。そのよう
な決定に用いられている試験法のいくつかは、当該個体
のプラズマ、その表面、または細胞からの抽出物などに
おける多形性蛋白質を同定することによる。

公知のヒトＡＢＯ血液群物質が説明に使われている。そ
の／ＩＲＱ血液群物質は組成物の形態の炭水化物であっ
て、単一のヒト遺伝子の生成物である酵素により合成さ
れる。一つの型の遺伝子（Ａ対〃遺伝子）はＡ型血液の
合成に用いられる酵素を生成し、他の型の遺伝子（＋１
対立遺伝子）はＢ型血液の合成に用いられる酵素を生成
する。両対立遺伝子が無い場合は０型血液が生成され、
また両対立遺伝子が有る場合はＡＲ型血液が生成される
ことになる。このＡＲＯ物質は抗原性を有し、適当な抗
血清と反応させることにより免疫学的に測定できる。こ
れらの物質の抗血清との別異の反応性は、ＡＳＲ，Ｏお
よびＡＲの血液型のグループ分けの基礎となる。

もしすべての者が同じ血液型を持っている場合には、こ
の物質はそれらを個々に区別するためには用いえない。

この血液群物質が数種の型を有する（すなわち、多形性
である）という事実によって識別が可能になる。しかし
ながら、親について争がある場合においては、異なる対
立遺伝子の数のみならず、それら対立遺伝子の発生頻度
が、その除外能力において重要になってくる。これらの
対立遺伝子の発生頻度は人口間において変るため、その
除外能力も変ってくる。除外するための試験の能力は、
その除外能力、０〜１．０の範囲の数値、で表わされる
。アメリカの黒人におけるＡＲＯ系の除外能力は０．１
７７４であり、アメリカのコーカサス地方でのそれは０
．１３４２である。この除外能力はスウェーデン人では
０．１８３０に、また日本人では０．１９１７に増大す
る。

この除外能力を増大させる１つの方法は、分析を、他の
多形性物質を含むように拡張することである。スウェー
デンでは、１２の多形性物質が分析される。この試験法
での除外能力は計０．８７０となる。このセットに他の
系を付加しても、それが高い情報性をもっていても、累
加的な可能性はあまり増大せず、包含される系の数が大
きくなるだけである。免疫学的テスト（抗原抗体反応）
に基づく２５の系での検査では非親の累加的可能性は０
．７６９４となり、生化学的テスト（酵素反応または電
気泳動移動度）に基づく３２の系の同様の分析では０．
９５１２の値になる。これらを組合せて５９の系で行な
っても、その除外値は０．９８８７となるにすぎない。

系が過多、試薬が高価で少ない、技術が複雑、信頼性が
低い、経験が少ないなどにより所定の仕事として行なう
には適当でないとの理由で、この父系試験プログラムに
ついて広い調査は行なわれていない。

同定法として複合テスト系を用いることが裁判科学では
よく知られている。例えば、ＡＲＯ血液群抗原に加えて
、ＭＮおよびＲｈ抗原も分析する方法がある。そのテス
ト試料が液体であるときには、ＬｅおよびＳｅ抗原も含
まれる。赤血球細胞酵素アシドホスファターゼ、ホスホ
グルコムターゼ、およびエステラーゼＤの３種を電気泳
動変化の存在で試験する。最後に、ハプトグロビンのよ
うな血清蛋白質について試験する。父系の決定の場合の
ように、この裁判科学での調査はコスト面、技術の複雑
性および低い信頼性のため、その適用には制限がある。

上記のような実施可能性が考えられているにもかかわら
ず、より深刻な理論的問題のために、それら既存のテス
ト法はすべて■１なる飾り物となっている。このような
テスト法は蛋白質またはその活性の分析に基づくもので
あるため、調査の対象となるものは遺伝子生成物であっ
て、遺伝子自体ではない。父系が争われている場合にお
いては、遺伝情報が表現される過程に退化が生じるため
、本発明では、その表現による生成物よりもむしろ遺伝
子を直接分析するのが好ましい。

細胞内の遺伝情報の流れはよく知られている。

蛋白質の生合成に向う情報は、遺伝子として知られてい
るＤＮＡヌクレオチドの配列でコードされる。この細胞
のＤＮＡは遺伝情報の貯蔵された形態であるとみられて
いる。このＤＮＡ分子は大きく、化学的に安定で、容易
に複製され、多くの遺伝子配列を含んでいる。例えば、
大腸菌の全遺伝子貯蔵所には約４．２ｘ１．０６　ヌク
レオチド塩基対からなる単−ＤＮＡ分子が含まれる。

転写は情報の回復が開始される工程である。転写にはＲ
ＮＡと呼ばれる核酸の形で情報の再合成が含まれる。１
つの形のＲＮＡ、メツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、
はりボゾームと呼ばれる蛋−白質合成の部位に情報を転
写する。

ｍＲＮＡが遺伝子から合成されると、蛋白質合成の工程
が開始する。この工程は本質的に１つの分子の解読であ
り、そこではｍ　ＲＮ　Ａのヌクレオチド配列が特定の
蛋白質の合成のための鋳型を与える。核酸言語から蛋白
質言語への変換があるため、この蛋白質合成工程は翻訳
に引用される。さらに若モ類推を進めれば、核酸言語お
よびアミノ酸のアルファベットを表わすものとして核酸
、ヌクレオチドの構成について考え、また蛋白質言語の
アルファベットる表わすものとして蛋白質の組立ブロッ
クを考えるとよい。この翻訳の過程では、言語の変換の
みならずアルファベットの変換もある。これはとくに複
雑な工程であって、１．　ＯＯ以」−のタイプの分子が
包含されることが知られている。このｍ　ＲＮ　Ａはリ
ボースを通る（テープレコーダーをテープが通るのに酷
似）ため、３つのヌクレオチド群（コドン）が、トラン
スファーＲＮＡ　（ｔ　ＲＮＡ　）として知られている
副ＲＮＡ分子を配向する位置にある。このｔ　ＲＮＡは
、アミノ酸を生長している蛋白質鎖に付加するために単
一アミノ酸を適当な配置に運搬する。

本発明にとくに意味があるのは、ヌクレオチドのアミノ
酸へのコード比（暗号比、ｃｏｄｉｎｇ　ｒａｔｉｏ）
である。上述のとおり、この比は３つのヌクレオチドが
１つのアミノ酸をコードすることである。

２０種の異なったアミノ酸を４つの型のヌクレオチド（
Ａ、Ｕ％Ｇ、Ｃ）で個別にコードする必要があるため、
３つが最小の受容しうる比を示す。

１つのヌクレオチドの１つのアミノ酸へのコード比は、
蛋白質合成に必要な２０種のアミノ酸のうちの４つを収
容する。２つのコード比は１６（４２）の組合せを与え
ることになるが、複雑な組合せには不足する。しかし、
３つのコード比では６４（４３）の異なった組合せが可
能となる。この２０を超えるコード語は、縮退（ｄｅｇ
ｅｎｅｒａｃｙ　）として知られている条件を遺伝子コ
ードに与える。縮退コードは同じアミノ酸に数種の異な
ったコード語を含む。しかし、これは１つのコード語が
２つの異種アミノ酸を特定する場合には存在しない。

このコードは縮退されるかも知れないが、不明瞭ではな
い。

ｍ　ＲＮ　Ａのヌクレオチド配列がわかっていれば、そ
こにコードされるアミノ酸の配列を明瞭に書くことは可
能であるが、その反対はできない。遺伝子コードの縮退
のため、数多のヌクレオチド配列は当該アミノ酸配列と
合致する上例えば、２種の個体「Ａ」および「１３」に
おける同じ遺伝子からのｍ　ＲＮ　Ａの７ラグメントに
ついて考えてみよう。

個体「Ａ」 ｍ１ＬＮＡ　　［ＬＪｔＪＣＣＣＣＣ，Ｃ，八　Ｇ１１
Ｌ３　　ＣＬＪＡ　　ＡＡＧ３蛋白質　［ｐｈｅ−ｐｒ
ｏ−ａｒｇ−ｖａｌ−１ｃｕ−１ｙＳ］１固イ本ｒＪ ｍＲＮＡ　　　［ＬｌｊＪＣＣＣＧ　ＡＧＧ　　ＧＩＪ
ＣＣＬＪＬＩ　　ＡＡＧＩ蛋白質　［ｐｈｅ　−ｐｒｏ
−ａｒｇ−ｖａｌ−１ｅｕ−１ｙｓ　］この蛋白質の分
析では該２種の個体は同一であることが示されているか
、ｍ　ＲＮ　Ａの分析では明らかに相違している。蛋白
質分析に基づく父系テストでは、免疫学的方法であれ生
化学的方法であれ、２つの個体を識別することはできな
い。ＲＮＡまたは好ましくはＤＮＡのような遺伝子物体
の分析に基づくテストでは容易に識別が可能である。

」１記議論はもっばらヒトにおける父系の決定について
行なったが、このようなテストは、過当な試材を用いれ
は、他の動物種（馬、牛、犬など）にも拡げられること
に留意されるべきである。本発明では、その特有な手法
のために、植物および動物を含めて性的に複製しうる生
物体の父系決定に該テスト法は適用される。

本発明のさらに他の適用では、個体の遺伝的同定も行な
われる。この適用はとくに、裁判科学の分野または微生
物、植物または動物の株の同定に有用である。

本発明の目的は、性的に複製しうる生物体における父系
決定および個々の遺伝的同定のための新規かつ改良され
たテスト法を提供するものである。

このような目的は、１またはそれ以上の多形性遺伝領域
について生物の種におけるＴ）ＮＡを分析し、該遺伝領
域の相対的サイズによって各多形性を区別し、核種の個
々のメンバーを特徴付けることによって達成される。

一態様では、子供、その母親およびその推定」二の父親
からのＤＮＡを、１またはそれ以上の制限酵素で別々に
消化し、得られたフラグメントを電流下ゲルマｌ−ＩＪ
ラックス通して移動させてサイズにより分ける。その多
形性は、ラベルした（例えば放射線標識）プローブＤＮ
Ａで上記処理したＤＮＡをハイブリダイズして決定され
る。

このプローブＤＮＡは各種のＤＮＡフラグメンであって
、宿主細胞で複製されうるベクターＤＮＡ（例えは、大
腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２、バクテリオファージ入
またはＭ１３、または猿細胞の５Ｖ４Ｑ）に結合させ、
その宿主細胞から精製される。

反応したプローブＤＮＡはその位置を順化され、子供、
母親および推定上の父親のＤＮＡフラグメントのサイズ
はプローブＤＮＡのそれと均一とされる。プローブＤＮ
Ａは多形性遺伝子座からの一つの対立遺伝子であるもの
から選択されているため、プローブのサイズと均一なｒ
）ＮＡフラグメントのサイズは各個体間で変わる。

子供が所有している全ＤＮＡフラグメントはその子供の
母親または父親のいずれかから誘導され、変異やある種
の他のまれな状況は阻止される。このプローブＤＮＡに
より決定されたＤＮＡフラグメントのサイズを比較する
ことにより、推定上の父親が生物学的父親か否かが決定
される。例えば、子供のＤＮＡがプローブＤＮＡの１つ
に均等な８６００塩基対フラグメントを与え、母親のＤ
ＮＡがこのフラグメントを欠いている場合には、生物学
的父親のＤＮＡがそれを含んでいなければならない。も
し推定上の父親のＤＮＡがこのフラグメントを欠いてい
れば、彼は生物学的父親からは除外される。

他の態様においては、犯罪の場合の容疑者および物理的
証拠物件（血液、皮膚、精液など）から得られたＤＮＡ
試料について上記のようなプローブを用いて比較するこ
とにより、試料と容疑者との同定ができる。このように
、ハイブリダイゼーション試験におけるＤＮＡ多形性（
ｐｏｌ　ｙｍｏｒｐｈｉ　ｓｍ　）は、裁判科学者に対
して、他の物理的証拠物件の分析と共に含まれるべき［
分子指斑（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｖ
　）　Ｊを提供することになる。

さらに他の態様においては、個体の株同定のために、個
体からのｒ）ＮＡ試料について、その相対的サイズを、
生物体の株の他のメンバーからのＤＮＡのそれと比較す
る。

これらの態様の１つにおいては、本発明は下記４つの相
関的工程からなる。ＤＮＡの単離と制限；ゲル電気泳動
とＤＮＡプロッテイング：ハイブリタイゼーションと洗
浄；および最終のオートラジオグラフィ。

細胞試料からのｒ）ＮＡの単離は当該技術分野で望めら
れている方法で行なわれる。ＤＮＡ調製には細胞分解、
ドデシル硫酸すｌ−ＩＪウムおよび過塩素酸ナトリウム
、クロロホルム／イソアミルアルコール抽出、およびエ
タノール沈殿を含む。

この調製後、各ＤＮＡ試料を１またはそれ以上の制限エ
ンドヌクレアーゼによる分析に付す。制限エンドヌクレ
アーゼは、約４〜７ヌクレオチド塩基対の短かい特定配
列を認識し、それらの部位またはその近傍でそのＤＮＡ
を切断する酵素である。選ぶべき制限酵素は２００種以
上あるが、このテストで用いられる特定の酵素の選択は
試料ＤＮＡの型、要求されるフラグメントの数、および
試薬の入手性と費用によって決められる。

ヒトの遺伝子は約６×１０９　　塩基対のＤＮＡからな
り、単一制限エンドヌクレアーゼにより１０２〜１０５
塩基対のサイズにある１０６〜１０７の分離フラグメン
トに開裂される。このような消化の複雑さは、試料ＤＮ
Ａ内のエンドヌクレアーゼ開裂位の数と位置に対応して
いる。数多の異なったエンドヌクレアーゼを含む処置か
らの各フラグメントの徹底的な同定により、理論的に、
ヒト各人に個有な「分子指斑」を与えることができる。

そのような詳細な分析は、理論的には可能であるが実際
」−は実施不可能である。本発明によれば、既存の開裂
生成物集合体を分析することによりこの問題を解決する
ことができる。遺伝子工学分野の専門語を用いれば、関
連物の個有のヌクレオチド配列の存在のために既存の開
裂生成物を１プローブする」と云う。この分析を行なう
公知方法の１つはサウザン（５ｏｕｔｈｅｒｎ　）プロ
ッティングの技術である。

サウザンの方法（ＪｌＭｏｌ　、Ｒｉｏｌ　、　　９８
＠、５０３〜５１．７　（１９７５）によれば、制限エ
ンドヌクレアーゼ処理で得られる二木線ＤＮＡフラグメ
ントをアガロースゲル電気泳動によりサイズで分離し、
そのｒ）ＮＡをアルカリ中にゲルを漬けて一本線にする
。そのケルを、製塩溶液を含む水槽に連結したρ紙の心
（ｗｉｃｋ　）　　に平らに置く。硝酸セルロースの一
枚シートをそのゲルの上にＷｌキ、その硝酸セルロース
の」−に乾燥吸収ペーパータオルを大量に積む。その塩
溶液を吸収ペーパータオルで扱吸−１−げ、そのゲルお
よび硝酸セルロースシートを通過させる。その溶液がゲ
ルを通過するときに、一本線ＤＮＡはゲルから沖され、
硝酸セルロースｒ紙に通される。硝酸セルロースは一本
線ＤＮＡを結合する性質があるため、全ＤＮＡはその支
持体に粘着する。この方法で得られるものは元のアガロ
ースゲルからのＤＮＡの完全な複製物であるが、このＤ
ＮＡは一本線であり、硝酸セルロース諷過シート上に固
定されている。その元のアガロースゲルからのＤＮＡサ
イズパターンは、しかし、正確に保持されている。フラ
グメントのサイズは既知のサイズの標識ＤＮＡと比較す
ることにより測定できる。

ハイブリダイゼーション反応は、異種源からの２つの一
本線ＤＮＡを再合体してその２つの相互作用する線の間
の相補的塩基対によって二本線ＤＮＡを形成させるとき
に起るといわれている。類似の合体によりＤＮＡ／ＲＮ
Ａハイブリッドも形成されうる。

本発明においてはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーショ
ンが行なわれる。ハイブリダイゼーション反応のための
物質の１つの寄与する源は、制限フラグメントのザウザ
ンプロットに存在する一本線ＤＮＡである。ハイブリダ
イズする線の他の源はいわゆる「プローブ」Ｉ）ＮＡで
ある。これらの１）　Ｎ　Ａは、多形性遺伝子座の−っ
の対立遺伝子に対応する配列を表現するということに基
づいて選択される変異性ＤＮＡフラグメントを表わす。

このプローブのｉ４を離および特徴については後に詳細
に示す。

ハイブリダイゼーションの種々の条件は当該技術分野に
おいて知られており、５０％ホルムアミドで４０〜５０
℃処理または緩和な塩で６５〜６８℃処理などが含まれ
る。再合体の速度を高めるためにデキストラン硫酸を用
いてもよい。ハイブリダイゼーション後、そのρ紙を充
分に洗浄して残りの（ハイブリダイズされない）プロー
ブを除去する。洗浄工程は加温下に行なわれ、塩濃度を
減じて非特異的ＤＮＡ／ＤＮｋハイブリッドも除去する
。

先述したように、プローブＴ）ＮＡは変異性ＤＮＡフラ
グメントを表わし、それは、それらが多形性遺伝領域の
一つの対立遺伝子を表わすことに基いて選択される。こ
の背景において、多形性は要点の１つである。フラグメ
ントの長さが変り易いことは、フラグメントの生成過程
で攻撃されるエンドヌクレアーゼ制限部位の数および／
または位置が異なることに基づく。このように、すべて
の個体が、プローブＤＮＡにハイブリダイズする同様の
サイズのＤＮＡフラグメントを有していれば、その領域
は単形性であると考えられ、本発明に関してはほとんど
利用し得ない。一方、個体が、プローブＤＮＡフラグメ
ントでハイブリダイズする異なったサイズのＤＮＡフラ
グメントを有していれば、そのフラグメントはサイズ多
形性を示す遺伝領域の対立遺伝子を表わすといえる。プ
ローブの評価はきわめて重要であり、プローブ生成とプ
ローブ同定の２つの相関的工程をなすと考えられる。

プローブの生成（発生）はクローン化ＤＮＡフラグメン
トの収集に関して当該技術分野で一般に行なわれる方法
によって達成される。その工程は通常次のものからなる
：特定のエンドヌクレアーゼによるｒ）ＮＡ試料の消化
、消化物からの適当なサイズのＤＮＡフラグメントの回
収、フラグメントの沈殿、そのフラグメントの適当なり
ローニングベクターへの導入、およびクローン化プロー
ブＤＮＡを含むコロニーの回収。種々のエンドヌクレア
ーゼおよびベクターがプローブの生成に用いられる。ク
ローニングを達成する方法は公知である（例えば、Ｍｏ
１ｅ（ｆａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒ　−
△ ａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａ！、　Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ
、　ｅｔ　ａｌｌＣｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　ｌ１ａ
ｒｌ）ｏｒ　　Ｌａｂ　ｌ　９８２を参照）。

そのような方法で生成されるヒ）ＤＮＡプローブとして
ＰＡＷｌｏｌおよびｐ　Ｔ−Ｍ　０．８　（７）　２　
つが例示される。ＰＡＷＩＯＩおよびｐＬＭＱ、８を宿
す大腸菌はＡＴＣＣ（１，２３０ｉ　　Ｔ’ａｒｋｌａ
ｗｎＰｒｉ＋ｉｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙ
ｌａｎｄ　）に１９８４年２月８日伺“で、それぞ゛れ
ＡＴＣＣ３９６０５およびＡＴＣＣ３９６０４として寄
託され、必要な費用も支払われている また、ｃＤＮＡＤＮＡプローブられる。これらのプロー
ブは逆複写法によりＲＮＡから生成され、本明細書の実
施例２またはヨーロッパ特許出願公開第００８４７９６
号に詳細に示されている。

プローブ生成に用いられる方法のいかんを問わず、得ら
れたプローブについて本試験方法に用い得るか否か評価
すべきである。

上記生成したプローブの収集から特定プローブの有効性
の評価には、ＤＮＡを４つの異なる個体からｔｌ、　Ｍ
ｌｌし、制限エンドヌクレアーゼで別々に消化する。こ
れらのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動にかけ、３つの
個体ＤＮＡの混合物を第１のレーンに流し、第４番目の
個体からの試料を隣接する第２のレーンに流す。該電気
泳動に付したＤＮＡを前述のようにしてプロット（吸取
）する。前記生成りローンを含むプローブ群から選択し
た個々のクローンから一本線ＤＮＡを単離する。該プロ
ーブＤＮＡを標識し、４つの個体の電気泳動したＴ）Ｎ
Ａとハイブリダイズするために用いる。そのテストプロ
ーブが、１つの個体ＤＮＡでのレーンよりも３つの個体
ＤＮＡでのレーンでより多くのバンドを与えるならば、
それは多形性を検定する候補になる。」−記方法で同定
されたプローブを充分な数のテスト個体とハイブリダイ
ゼーションを試験して多形性の範囲を有効に決定する。

少なくとも４つの異なる対立遺伝子が１０％を超える頻
度で該テスト個体群の中に存在する領域に対応するプロ
ーブはその試験に供される。

本発明の好ましい態様によれば、単一の多形性プローブ
よりはむしろ一群の多形性プローブ収集物かより信頼性
がある。複数のプローブを用いるとテストの感度が顕著
に増大する。例えば、１０種のプローブを用い、各プロ
ーブが８つの同等の頻度で対立遺伝子を発生するような
多形性領域であると同定されるならば、約１００万の個
体を個別に同定することができる。

特定のプローブがその収集体に含まれるよう１こ選択す
る場合の評価パラメーターは多形性の程度、すなわち、
対立遺伝子の数およびその対立遺伝子がテストされる群
に存在する頻度である。特定のプローブ遺伝子座中に多
数の対立遺伝子（例えば６０）が存在するというだけで
は有用なプローブとはいえず、例えば、テストされる群
の９９．９％が１つの対立遺伝子を有し、残り０．１％
が他の５９対立遺伝子中に分布しているような場合には
使えない。このように、各種の対立遺伝子の発生頻度が
重量である。

プローブ群中の個々のプローブの数はきわめて多数、１
００以」二ということはあり得るが、実際上は１〜約４
０、好ましくは１〜約２０程度に制限される。

多形性遺伝子座当りの対立遺伝子の数は大きく２〜約６
０またはそれ以上でもよいが、好ましくは２〜約４０で
ある。最適には、対立遺伝子ははゾ同等の頻度で発生す
る。

ハイブリッドはオートラジオグラフィにより具象化され
る。ハイブリダイゼーションに先立って、プローブＤＮ
Ａをラジオアイソトープ、通常３２ｐにより標識する。

約１０８　カウント７分／ｕｇＤＮＡの比活性が要求さ
れ、通常少なく七も２種の標識ヌクレオチド（ＴＴＰお
よびｄｃＴＰ４００ｃｉ／ｍｍｏｌ）　　で標識された
ものを含む。放射性のハイブリダイズしたプローブは常
法により、例えばフィルムを放射線照射して、集中させ
る。放射性ハイブリッドはタームオートラジオグラフイ
（ｔｅｒｍ　ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ　）によ
り自体で像映する。

オートラジオグラフィはハイブリッド分子の集中に当該
分野で採用されている方法であるが、本発明ではこの特
定の分析法に限定されない。該ハイブリッドはいかなる
分析試薬による手段で検定してもよい。例えば、螢光に
よる検定、呈色反応、免疫反応、あるいは酵素や他の蛋
白質標識試薬などをハイブリッドしたプローブの検定に
用いてもよい。

実施例１ この実施例はヒト末梢血液からのＤＮＡの単離を示す。

その単離Ｔ）ＮＡはプローブＴ）ＮＡの評価に有用であ
る。

末梢血液１０〜２０ＣＣを抗凝固剤として■乙ＤＴＡを
用いて採集する（その血液は直ちに処理してもよいしま
た一７０℃で凍結してもよい）。

その血液を５０ｒｎｌチユーブに移し、同量の溶解緩衝
液（ｉ　ｍ　ＭＭｇ　Ｃ１１ｍＭ　ＮａＩ−Ｔ２ＰＯ４
、１ ｐＨ５，５、０，８％ノニデットＰ−４０，０，４％デ
オキシコール酸ナトリウム）を加える。このチューブを
２５〜５０回振ってよく混合させる。

この混合物を５０．ｎ！プラスチックソーパルチューブ
（５ｏｒｖａｌｌ　　ｔｕｂｅ　）に移し、Ｓ　Ｗ　３
４．　ｏ−ター中で１１００００ｒＰ　　（１２０００
ｇ）で３０分間回転する。」−清を傾斜して除き、その
ペレットをＴＮＦ、（１０ｍＭＴｒｉｓ　、ｐＨ８，３
，１５０ｍＭ　Ｎａ（Ｊ’　、５ｍＭＦ、ＤＴＡ　）］
−□ｒｎ／に懸濁させる。そのチューブを激しく振って
ペレットを崩解させる。１０％５ＤＳ（ｆ、ｃ、１．０
％）１−．５ｍｌを加え、数回振る。５　Ｍ　Ｎａ　Ｃ
Ｉ　Ｏ，ｉ　（ｆ　、ｃ　、　１．０Ｍ）３ｒｎｌを加
えて混合する。同量のクロロホルム：イソアミルアルコ
ール（２４：１）を加え、そのチューブをニュープラン
ズウイック回転振盪機上で３５００ｒｐｎ１　にて１５
分間振話する。これをタモン遠心機にて３００Ｏｒｐｍ
　　で１０分間遠心して相分離する。水性層（、Ｊ一層
）を回転した１０ｍ１ヒヘツト（綿なし）（シリコン化
パスツールピペットを用いてもよい）できり、新しい５
０ｍ１チユーブに移す。有機層（下層）を傾斜でとり、
同室のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１
）を加え、」一連のとおり抽出、分離する。層分離後の
中間層が澄明になるまで抽出を繰返す。

通常、３〜５回の抽出である。

最終抽出物からの水層をプラスチックビーカーに移し、
これに−２０℃９５９６エタノール２〜２゜５容量をそ
の側面に徐々に注加して２層：水性ＤＮＡ層（下部）お
よびエタノール層（」一部）を形成させる。この液をき
れいな乾燥ガラス棒でまぜて２層を混合させる。水−エ
タノール界面に沈降するｒ）ＮＡをガラス棒」−に収集
し、２層を混合後、その捧を取り出し、１０分間空気乾
燥する。

この捧を１．５　ｍｌチューブに入れ、パラフィルムで
覆う。１８ゲージ針でそのパラフィルムに３か所穴をあ
け、その試料を２０分間デシケータで乾燥する。パラフ
ィルムを除き、０．０１ｘＳＳＥ（ｌ、５　　ｍＭ　　
ＮａＣＩ、　　　Ｑ、ｌ　　５　　ｍＭ　　　ＥＤＴＡ
　　、　　　ｐＴ−Ｉ　　７．０）０．５〜ＬＯｍｌを
加える。この試料にキャップをし、アメスロッカー（Ａ
ｍｅ　ｓ　　ｒｏｃｋｅ　ｒ　）Ｊｌで４℃で一夜懸濁
させる。

この懸濁液中のＤＮＡ量を、その試料の１／２０希釈液
の光学密度（０，Ｄ、）を測ることにより測定する。こ
のｒ）ＮＡ懸濁液２５μｌを蒸留水４７５μｊに加え、
キュベツトに移し、０．０１ｘＳＳＥを充填したキュベ
ツトを用いて２６０．２７０および２８０でのＯ，Ｄ、
を記録する。各々ゼロ点で読み取る。懸濁液中のＤＮＡ
濃度ｍ９／ｍｌ（μｇ／μｌ）はＯ，Ｄ、２６０での１
／２０希釈液の読み取り値と同等である（０．Ｄ、２６
０の１．０００−５０μｇ／ｒｎｌ）。ＤＮＡ濃度とＯ
，Ｄ、間の相関が直線的である場合は、Ｏ，Ｔ）、２６
０が０．１００と１．０００の間に保たれるように希釈
を行なう。０゜Ｄ、が１．５００以上の場合は不正確と
なる。この０、ｒ）、２６０　／２８０は１．８以上と
すべきであり、蛋白質混入量を測定する。例えば、末梢
血液から（７）　Ｄ　Ｎ　Ａ懸濁液の１／２０希釈液０
．５　ｍＩ！についての０．Ｄ、は次のとおりであった
。

０．３５ｆｌ　ｘ　５０μＩ／ｍｌ　Ｘ　２０　＝　３
５０１１ｇ／ｍｌ　＝　０．３５μｆｊ／ｌｔｌ実施例
２ この実施例はヒトＤＮＡプローブの生成法を示す。

Ａ、メツセンジャーＲＮＡの弔離 １、　１０７〜１０８ヒト細胞を水冷リンゲル液２ｍｌ
に懸詞させ、２０００ｘｐにて４℃で５分間遠心する。

２、］−清液を吸出したのち、細胞を再度水冷分解緩衝
液に懸濁させる。この緩衝液は下記組成を有する。

０、３．４　Ｍ　ＮａＣＩ ］、、　５　ｍＭ　Ｍ　ｆｌ　Ｃｚ　２ｌ　ＱｍＭ　　
Ｔｒ　ｉ　ｓ　−Ｃ１ｐＨ８，６０，５％　ＮＰ　　−
４Ｑ １、Ｑ　Ｑ　０ｕｎｉｔｓ／、ｚＲＮａｓｉｎ　（Ｂｉ
ｏｔｅｃ　）３、この）Ｖ濁液を１０秒間渦状に攪拌し
、蔗糖（２４％Ｗ／ｖ）および１％ＮＰ−４Ｑを含む同
量の分解緩衝液で下張りし、氷上に５分間放置する。

４、この懸濁液を１．　ＯＯＯＯＸ　ｇにて４℃で２０
分間揺りパケットローター中で遠心する。

５、その濁った」一層（細晧質）を回収し、同量の２　
ＸＰＫ緩衝液を加える。

この２×ＰＫ緩衝液＋　０．２　Ｍ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　−
Ｃ１ｐＨ７，５２５ｍＭ　　ＥＤＴＡ Ｑ、３ＭＮａＣ４ ２％Ｓ、Ｄ、Ｓ。

プロテイナーゼＫを最終濃度２００μｇ／ｒｎｌ　　と
なるように加え、３７℃で３０分間インキュベートする
。

６、この層をフェノール／クロロホルムで１１］出し、
水層を回収し、これに２．５容量のエタノールを加え、
−２０℃で少なくとも２時間保持する。

７、このフラクションを５０００×ｇにて０℃で１０分
間遠心し、得られたペレットを０．１Ｍ酢酸ナトリウム
含有７５％エタノールにて洗浄する。

８、この核酸を、少計（〜５０　μｌ　）の５ＱｍＭＴ
ｒ　ｉ　ｓ　−ｃＩ！ｐｌ−１７，５および１．　ｍ　
Ｍ　Ｆ、ＤＴＡ　　の混液に町溶解させる。

９この再懸濁フラクションにＭｇＣｌ！２を最終濃度］
　ＱｍＭ、　ＲＮａｓｉｎ（Ｒｉｏｔｅｃ）　２０００
ｏｎ　ｉ　ｔ　ｓ　／　ｍｌ　　となるように加える。

１０、インキュベーション後、ＥＤＴＡおよびＳｌ）　
Ｓをそれぞれ最終濃度１０ｍＭおよび０．２９６となる
ように加える。

１１、この懸濁液をフェノール／クロロホルムで抽出し
、酢酸ナトリウム（ｐｔｌ　５．２　’）を０．３Ｍま
で加え、２容晴のエタノールにて核酸を沈殿させる。

１２、このＲＮＡを７０９６エタノール中−７０℃で貯
蔵する。

Ｂ、ポリＡ十ＲＮＡの選択 １、オリゴ（（（Ｔ）　　セルロースを滅菌２×増量緩
衝液中に平衡化する。この緩衝液は、４　Ｑ　ｍ　ＭＴ
ｒｉｓ　−Ｃ１ｐＴ（７，６、１，０Ｍ　ＮａＣｌ　、
　　２　ｍＭＥＤＴＡ、０．２％ＳＯＳからなる。

２、そのオリゴ（ｄＴ）セルロースを用いて１ｍｌ。

カラムを形成させ、（ａ）滅菌水、（ｂ）　Ｑ、　ｌ　
Ｍ　Ｎ　ａ　ＯＨ／　５　ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　、
　（ｃ）滅菌水の各３カラム量にて洗浄する。

３、溶出ｐｌ（を８．０未満とする。

４、このカラムを５容量の増量緩衝液で洗浄する。

５、」二記人工程で単離したＲＮＡを滅菌水にとかし、
６５℃で５分間加熱する。等量の２×増量緩衝液を加え
、その試料を室温（〜２５℃）に冷却する。

６、この試料をカラムに通し、通過液を収集する。

この通過液を６５℃に加熱し、冷却し、再度カラムにか
ける。

７、このカラムを５〜１０容量の増量緩衝液で洗浄し、
さらに０゜１ＭＮａｃ／を含む増量緩衝液の４容量にて
洗浄する。

８、これらのフラクションを集め、０Ｄ２６０　を読み
取る。最初のフラクションは高濃度のポリ（Ａ）−ＲＮ
Ａを含むが、あとのフラクションは０Ｄ２６゜吸収物質
をほとんどまたはまったく含まない。

９、このポＩＪ　（Ａ）＋ＲＮＡ　を、滅菌した緩衝液
（ｌ　Ｑ　ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　Ｓ　−Ｃ／？　ＰＩＴ　７
．５、ｌ　ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　。

０．０５９６ＳＯ８）の２〜３容晴ニテ溶出する。

１０、この溶出液に酢酸すｌ−ＩＪウム（３Ｍ、　ｐＩ
４５．２）を最緩濃度０．３Ｍになるように加え、２．
２容量のエタノールを加える。

１１、このＲＮＡを５０００ｘｇにて０℃で１０分間遠
氾・する。

１２、このペレットを水に再溶解させる。

Ｃ１第１のｒ）ＮＡ線の合成 １、ポリＡ１−ｍＲＮＡの初期計５０ＪＬｇと推定して
下記反応条件を採用する。５０μｇより多いか少いとき
には反応混合液を過当に調節する。

２、反応混合液は下記の組成からなる 試　薬　　　　　　添加量　　　　最終濃度１０　　ｍ
Ｍ　　ｄＡＴＩ’　　　　　２５μ＋　　　　５００　
　μＭＩＱ　　ｍＭ　　ｄＧＴＰ　　　　　２５μｍ　
　　　５００　　μＭ１０　　ｍＭ　　ｄＴＴ＋’　　
　　　２５μｌ　　　　５００　　μＭ’；２　　ｍＭ
　　ｄＣＴＰ　　　　　２５μｍ　　　　１００　８Ｍ
５×　リバーストランス　　　　　　　　　　　５０　
ｍＭＴｒ　ｉ　ｓクリプターゼ緩衝液 ２５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　　８．２：　　　　　　　　
５０　ｍＭ　ＫＣＩ　：２５０　ｍＭＫＣＩ：３０ｍＭ
　　　　　　　　６　ｍＭＭｇＣＩ　２Ｍ　ｇ　Ｃ！　
２　　　　　　　１００μｍ２００ｍＭＤＴＴ　　　　
　　　２５／ｌｌ　　　　１０　ｍＭポリ（Ａ）ｍＲＮ
Ａ　　　　　　　（５０ｉｔりＲＮａｓｉｎ　（Ｒｉｏ
ｔｉｃ） 胎盤ＲＮａｓｅ　　　　　　　　５．。

インヒビター ３２Ｉ’−ｄＣＴＰ　　　　　１〜１０　ｕＣｉ１５０
０１１ｔ！反応 ５００μｌ 蒸留水　　　　　　　　　（全量） ６） ３、　反応ヲ１．．５　ｍｌシリコン化エッペンドルフ
（Ｆ、ｐｐｅｎｄｏｒｆ　）　　チューブにて行ない、
ｍ　ＲＮ　Ａ　を添加して開始する。

４、反応混合物を４２℃で６０分間インキュベートし、
５　Ｑ　Ｑ　ｍＭ　Ｅ　ｎ−ＶＡ　］　Ｑ　７＋　７；
　　を加えて反応を停止させる。

５、反応混合物を’Ｉ”、Ｃ，Ａ、で沈殿させ、第１線
合成効果を測定する。一般に、１７〜２５％の効率で得
られ、まれに４０％にも達する。

６、３２Ｐ−ｄ　ＣＴＩ’　／　５００　ｔｔｌの１．
　Ｑ　７ｔ　Ｃｉ　では一本線ＤＮＡ　２．２　ｘ　１
．０６ｃｐｍ／ｌｔ９　（Ｄ比活性を得る。この比活性
は、多用のＤＮＡを失なうことなく次工程にまで維持さ
れる。

７、この試料を同量の５　Ｑ　ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　
ｐｒｌ　８．０飽和フエノールにて２回抽出する。

８、このフェノール抽出液をエーテルにて２回抽出する
。これに３Ｍ酢酸ナトリウムを０．３Ｍまで添加する。

９．９５％エタノール３倍唱・を加え、その混合物をド
ライアイス−エタノール」−に５〜１０分間放置し、つ
いで室温まで温める。

１０、この混合物をミクロファージ中で１５分間振り、
」−清を傾斜除去し、ペレットを７５％エタノールで洗
浄する。

１１、このＤＮＡを３００ｍＭ酢酸ナトリウム０゜５ｍ
ｌに再溶解させ、上記工程９および１０を繰返す。

１２、このＤＮＡを蒸留水２００μｌに再溶解させ、５
〜２０％のアルカリ性蔗糖勾配（３０ｍＭＮａＯＨ，２
ｍＭＥＤＴＡ　）上に積層し、５Ｗ−４０ローター中で
３７００　Ｏｒｐｍ　にて４℃で４０分間回転する。

１３、その勾配上部からフラクション０．５　ｍｌを収
集し、ＩＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ５，８）２５μｌ上に置
き、各フラクションをカウントする。

１４．５０００〜１００００力ウント／分のものを各他
のフラクションからとり、アルカリ性アガロースゲルに
流す。これによりサイズ分布を推定する。一般に、５０
０未満のヌクレオチドのｃＤＮＡを有するフラクション
は捨てる。とくに有用なフラクション（例えば少なくと
も５００ヌクレオチド長さのもの）はチューブの底から
１２番目のフラクションに生じる。したがって、ゲルを
通過、展開する場合、１〜１０７ランクシヨン（ペレッ
トを含む）は貧弱であり、水２リットルで透析する。フ
ラクション１１．１２．１３および１４も透析するが個
別に行なう。そのゲルパターンはさらにプールする必要
があるか否かを提示する。

一般に、５００ヌクレオチドよりも大きい物質はＴＣＡ
沈殿性カウントの６０％でカウントする。

１５、その５ｓｃＰＮＡを５ｅｃ−ブタノールとともに
〜４００μｊの量に濃縮し、ついでブタノールをエーテ
ルで抽出する。

１６、この抽出液に３Ｍ酢酸ナトリウム４０μｌを加え
、チューブの残部に９５９６エタノールヲ充填する。エ
タノール−ドライアイスで５分間沈殿させ、ついで、そ
のチューブを５Ｗ−２７０−ターの水充填バケツに入れ
、２５００Ｏｒｐｍにて２６０分間遠心する。

１７、エタノールを傾斜してとり、カウントする。

このエタノールは１％未満のカウントを有する。

ペレットをエタノールで洗浄し、洗浄液を再びカウント
する。１％未満のカウントのものは捨てる。

全弁カウントはペレットに残っており、このペレットを
１０〜２０分間凍結乾燥し、水１．　ＯＯμｒに再懸濁
させる。

Ｄ、フレナラ（Ｋｌｅｎｏｗ　）による第２線合成１、
下記反応液を、ｓｓ　ｃＤＮＡ　２〜５μｇ／ｒｎｌの
濃度にて１ｒｎ１反応に供する。

ｌＱｍＭ　ｄＡＴＴ’、ＴＴＰ、ＣｒＴ’、ＧＴＩ’　
５０μｌ　　５Ｑ０７ｚＭ７ＱＱｍＭ　ＫＣＩ　　　　
　　　１００μｌ　　７ＱｍＭ１０×クレナウ緩衝液　
　　　　　１００μｌ　　３０ｍＭ　Ｔｎｓ３００ｍＭ
Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，５４ｍＭＭｇＣｊ２４　Ｑ　ｍＭ　
Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２ クレナウポリメラーゼ　　　　　　　　　１５０〜２０
０ベ一リンガーマンハイムｕｎｉｔｓ／ｍｌｓ　ｓ　Ｃ
ｒ）ＮＡ　　　　　　　　　　　　２．５μｙ２、反応
は１８〜２０℃で５〜６時間インキュベートして行なう
。

３、反応混合物をフェノール−Ｔｒｉｓ　　ｐＨ８およ
びエーテルで２回抽出する。

４、部分試料（２〜１０１００００ＣＰをゲル分析に供
する。

５、残りの抽出物をコロイドバッグ中で一夜水に透析す
る。

Ｅ、Ｓ１反応 １、−］−記り工程で得られたフレナラ反応液を透析中
に５〜６イの容量に増量させ、重水にてつぎの最高ｍｌ
に調節し、１／１０量の１．ｏｘｓ１緩衝液を加える。

この緩衝液は、３　ＭＮａＣ／　、Ｑ、　３　Ｍ酢酸ナ
トリウムルミ（４，５、］、　Ｑ　Ｑ　ｍＭ　Ｚ　ｕ　
ＣＡ’２からなる。

２．３１ヌクレアーゼ（シグマ社製）を最終濃度１０　
ｕｎｉｔｓ／、、、７Ｂとなるように加え、３７℃で３
０分間インキュベートし、５００ｍＭ　ＥＤＴＡを最終
濃度１００ｍＭとなるように加えて反応を停止させる。

部分試料をゲル分析に供する。

３、この反応混合物をフェノールで２回、エーテルで２
回抽出する。抽出液を室温にて５〜６時間水で透析しく
少なくとも１回水を変える）、ついで５ｅｃ−ブタノー
ルとともに〜４００μｌに濃縮する。

４、この試料を中性５〜２０％蔗糖勾配（０，１ＭＮａ
Ｃ／、１０ｍＭＴｒｉｓ　ｐＨ７，５，１ｍＭＥＤＴＡ
）にかけ、Ｓ　Ｗ　−４Ｑ　ｏ−ター中で３７０００ｒ
Ｐｍにて４℃で２０時間遠心する。

５、そのチューブ」二部からフランクジョン０１５ｒｎ
ｌを採取する。フランクジョン１〜１４にはｄｓ　ｃＤ
ＮＡ〜５００ｔ）ｐｓ　　を含む。サイズ分布をみるた
めにゲルに流す。

６、このフランクジョンを蒸留水ではシー夜透析する。

７、試料を５ｅｃ−ブタノールとともに〜４００μｌま
で心網し、酢酸すｌ・リウムおよびエタノールで２回沈
殿させる。このペレットを７５％エタノールで各々洗浄
する。このＩ）　Ｎ　Ａは夾雑物なしでなければならな
い。

８、このｄｓｃｒ）ＮＡを凍結乾燥する。

Ｆ、末尾の反応（Ｔａ　ｉ　Ｉ　ｉｎｇ　　ｒｅａｃｔ
　ｉｏｎ　）１、下記反応条件はｄｓｃｎＮΔ１μｇ　
の場合であり、適当に規模を増大または減少する。

原液：　　５０μＭｄＣＴｒ’、１０　ｍＭ　ＣｏＣＡ
’　２２×カコジル酸塩緩衝液： １．２Ｍカコジル酸すトリウム（ｐＨ７，１９、ｌＩＣ
１！にて）２５０１ｔｌ １ｍＭＩ’）ｒ）Ｔ　　２５０μｌ 水７５０μ１ ２Ｘカコジル酸塩緩衝欣　　　　　　　　２００μｍｃ
Ｔ）ＮＡ　　（５Ｑ　ｎｇ／ｕ　ｌ　）　　　　　　　
　２０μＩ（ｊｕｇ）５０　ｌＩＭ　　ｄＣＴＰ　　　
　　　　　　　　　　４０μｍ２０μＭ　Ｃｏ　Ｃ＋　
２　”　　　　　　　　２０μｍ２５　”ｊ／ｍｌ　Ｂ
　Ｒｒ−ヌクレアーゼ（ＢＳＡフリー）８μ＋ｄ１１２
０６８μ■ ＴｄＴ（Ｒｅｔｈｅｓｄａ　　Ｒｅｓ、ＬａＩ）ン　　
　　　　　　　　　４４μ＋　　（７６０ｕ／ｒｎ！最
終濃度） （−＊ＢＳＡ直前にＣｏ　Ｃｌ　２添加、でないと沈殿
する）２、反応混合物（−ＴｄＴ）を２０℃で２０分間
インキュベートする。

３、ＴｄＴを加え、さらに２０分間インキュベートする
。

４、コれニ５０　Ｑ　ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　３　ｐ
　ｌ：を加えて反応を停止させ、フェノールついでエー
テルにて各２回抽出する。

５、この試料を５ｗ−２７０−ター中で酢酸ナトリウム
およびエタノールにて前記と同様に沈殿させる。

６、このペレットを７．５％エタノールで洗浄、凍結乾
燥し、蒸留水５０μｌに再懸濁させる。

Ｇ０尾部処処理ＤＮＡのプラスミドｄＧへのアニール １、アニール反応は１０μｌ密封毛細管中で行なう。

２、反応混合物は下記の組成からなる。

ｄ　ｓ　　ｃＤＮＡ　　　　　　　　　　１．ｔｔｌ　
（５ｎ！Ｖ　）プラスミド　　　　　　　　　１μＪ（
２０ｎｇ）１０×アニール緩衝液 ］−Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃｌ； ｌＱＱｍＭ−ｒｒｉｓ　　ｐＨ７，５ １、ＱｍＭＥＤＴＡ 蒸留水　　　　　　　　　　　７μ１ ３、この混合液を６８℃で８分間、ついで４２℃で２時
間インキュベートし、水浴をはずし、反応混合物を室温
にまで放冷する（５時間〜−夜）。

実施例３ この実施Ｖ］はプローブの固定法を示し、それはヒトに
おける多形性の検定に有用である。

１、前記実施例１に示す４人のヒトの末梢血液からＤＮ
Ａをｌｆ−ｉ４１にする。

２、そのＤＮＡ４訊料を下記の方法にて制限酵素Ｆ、ｃ
ｏＲＴにて別々に処理する。

ａ）下記成分を１．、５　ｍｌエツペンドルフチューブ
（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　　ｔｕｂｅ　　）に加える。

ｔｌ）１０μｇに充分量のＤＮＡ溶液（通常１０〜５０
μｌり （２）蒸留水（所望により、最終反応量に適合）（３）
適当量の特定の５×エンドヌクレアーゼ消化緩衝液 （４）制限エンドヌクレアーゼ１．５〜２．５倍過剰量
（１０μｇ消化に１５〜２５単位） ｂ）この混合物を１〜２秒間渦状に攪拌するか、チュー
ブを振って混合させる。

Ｃ）コの混合物をエツペンドルフマイクロ遠心機にて１
０〜１５秒間回転させて反応剤をペレット化する。

ｄ）このペレットを３７℃で２〜１６時間インキュベー
トする。

ｅ）反応を停止し、のちの電気泳動に供するために保存
するように下記のものを加える。

＋１）　　１　／　１０容量のＱ、　ｌ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　
Ｔ　Ａ　ｐｉ−Ｔ　７，０（ｆ、Ｃ９１０ｍＣ９ １Ｏ＋　　１．　／　１０容量の５％Ｓ　Ｔ−Ｓ　（ｆ
、ｃ、Ｑ、５％）＋３＋　　１．／１．０容にの３ＭＮ
ａＣＪ　または３Ｍ酢酸ナトリウム（ｆ、　Ｃ，０，３
Ｍ） （４）２〜２５容慴の冷９５９６エタノール（ｆ、Ｃ１
約７０％） この試料は一２０℃で数カ月保存できる。

この試料は、消化ｒ）ＮＡ、反応停市剤およびエタノー
ル浴中むエツペンドルフチューブをドライアイス−エタ
ノール浴中に２〜５分間（容量による）エタノールが粘
稠になるまで放置することにより、容易に沈殿させられ
る。この試料は凍結してはいけない。この試料をミクロ
ファージ中で回転してペレット化する。

ｆ）消化後直ちにゲルにかけるために、５×フイコール
（Ｆｉｃｏｌ＋　）標識染料液を最終濃度１×となるよ
うに加えて反応を停止させる。これは試料の最終容量が
７５μ１未満の場合に行なう。

ｇ）典形的な反応混合物は下記の構成を有する。

１０ｍｇＤＮＡ　　　　　　　　　２０□Ｉ水　　　　
　　　　　　　　　　　　１６μ１５Ｘ緩衝液　　　　
　　　　　　１０μｌＦ、　ｃ　ｏ　Ｒｌ　　５　ｌｔ
／　／ｉ　／？　　　　　　　　　４．　ｐ　ｌ□、Ｉ
ＭＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　　　６゜２５μ１５
ｏ６　ＳＤＳ　　　　　　　　　　　　　　　　６．２
５μ１３ＭＮａＣ１７，０μ１ ９５％エタノール　　　　　　　　１４．０　μｌこれ
を３７℃で２時間インキュベートする。このＦ、ｒ）Ｔ
Ａ、ＳＤＳ、ＮａＣ／およびエタノールを−Ｉ−記のと
おり加え、−２０℃で貯蔵するか、または５Ｘフィコー
ル標識染料１２．５μｌを加え、ゲルに通す。

３、これらＤＮＡを前記実施例２と同様に、３種の個体
ＤＮＡの各５μｇを１つのレーンに、第４番目の個体の
ＤＮＡ５μｇを隣接レーンに通して電気泳動に付す。

４、電気泳動に付したＤＮＡを下記の方法でプロットす
る。

ａ）ゲルをプロット容器（丸い耐熱ガラス、］、９９０
１１．００ｍｍ）（ＩＭＫＯＨ，０，５ＭＮａＣｌ！を
含有）に移し、ニュープランズウィック回転振需機上で
２０Ｏｒｐｍ　にて室温で２５分間（０，８％ゲル）〜
３０分間（１，２％ゲル）振盪して、該ｒ）ＮＡをゲル
中で変性させる。

１））ニトロセルｏ−スレート（９，５Ｘ１５ｃｍ）を
蒸留水２００〜３００　ｍｌ　ｌ−に置いて完全に湿潤
させる。

０この溶液を傾斜してとり保持する（ＫＯＩＩ−ＮａＣ
Ｊ　　溶液は１０回までゲル変性に使用できる）。この
ゲルを蒸留水２００〜３００ｍ１！で洗浄し、全洗浄水
をパスツールピペットテ除＜。ＩＭＴｒｉｓ（Ｐ１１７
．０　）　　２５０〜３００　ｍｌを加え、５　Ｑ　ｒ
ｐｍにて室温で３５分間振盪を続ける。

ｄ）このゲルを傾斜して中和し、ＩＭＴｒｉｓ（ｐＨ７
，０）　　２５０〜３００ｍｌを加えて３０分間振盪を
続ける。Ｔｒｉｓ　溶液を保存し、濃塩酸でｐ　Ｔ−Ｔ
７．０に戻して１０回まで使用できる。

ｅ）所望により、ゲルを傾斜してとり、ＩＭＴｒｉｓ（
ｐＦ（７，０）　２５０〜３００ｍｌを加え、２５分間
振替を続ける。

ｆ）Ｔｒｉｓ　　液全部を傾斜し、パスツールピペット
で除く。このゲルを６ＳＳＣ（ＩＸ＝０．１．５ＭＮａ
Ｃ１，０，Ｏ１５Ｍクエン酸ナトリウム）２５０〜３０
０ｍ１を加え、２０分間振盪する。

ｇ）ニトロセルロースから蒸留水を傾斜除去し、６ＸＳ
ＳＣ１００〜２００ｍ１を加える。

１〕）側熱ガラス製トレイ（２８ｘ１８ｘ４ｃｍ）を用
い、６Ｘ　５ＳＣ６００〜７００ｍＡ’を加える。

＋７７トマン（Ｗｈａｔｍａｎ）３Ｍ（１５，５Ｘ３８
ｃｍ）の二線の心を６ｘ　ｓｓｃ液で湿らす。プラスチ
ック製プロットプラットホーム（１８，５ｘ１９ｘ１α
）を該トレイの中央に置き、該ワットマン３Ｍの心をプ
ラットホームの中心にし、各末端が６ｘｓｓｃ液に浸さ
れるようにする。

ｉ）手袋をはめて、そのゲルを容器から心（ｗｉｃｋ）
に移す。そのゲルを手袋をはめた指でこすり、ゲルと心
が充分に接触するようにする。

ｉ）事前に浸潤させたニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉ
ｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌ　Ｉ　、　Ｋｅｅｎｅ、　
Ｎ、　Ｈ８）　　をゲル上に置き、プロットすべきレー
ンの位置に合せる。手袋をした指でこすってゲルとニト
ロセルロールの接触を充分に行なうとともに気泡が見ら
れないようにする。プロットされないゲルは取除く。１
　ｍｉピペット３個をゲルの各側面にそって置き、接触
しないようにさせる。ワットマン３Ｍ（１５，５Ｘ　９
．５　）の１個を湿し、ニトロセルロースの頂部に置く
。他の同様の寸法のワットマン３Ｍの乾燥品を加える。

１０．５Ｘ１．２Ｃ１１のブラウンタオＪｌ／　（Ａ　
２３７　Ｓｉｎｇｌｅｆｏｌｄ　Ｇａｒｌａｎｄ　Ｓｏ
ｌ　−Ｋｎｉｔ　　Ｔｏｗｅｌｓ：　　Ｆｏｒｔ　　Ｈ
ｏｗａｒｄ　　ＰａｐｅｒＣｏｍｐａｎｙ。

Ｇｒｅｅｎ　Ｒａｙ、　Ｗｉｓ、　５４３　Ｑ　５　）
の約１０ｃｍをゲルの上に積み重ねる。プラスチックの
カバーをかけ、トレイの囲に引張って密にかぶせる。こ
の装置を室温で１２〜２０時間放置する。このプロット
プラットホームを頂部に置いて重しにする。

ｋ）タオルをワットマン３Ｍの２個に沿って除き（頂部
の幾分かは乾燥したままである）、ニトロセルロースペ
ーパーを暴露させる。新しいカミソリを用いてニトロセ
ルロースシートをカットし、ＤＮＡの２または３レーン
を含む３本の線条とする（２レーンは各８−レーンウェ
ルフォーマ−（ｗｅｌｌ　　ｆｏｒｍｅｒ　）　３レー
ンは各１０−レーンウエルフオーマー）。各線条の左下
隅を配向用に切目を入れ、同定のために、適当な線条の
底に１．２または３個の穴をあける。この線条を乾燥後
、マークペンで標識する。

１）これら線条をプロットトレイ中で２ｘｓｓｃ２５０
ｍＺ！に入れる。その線条の各側面を手袋をした指でこ
すってわずかなアガロースを除く。該線条をワットマフ
　ＪＩＧ　１　ｉｌＴ”紙上に置き、１０〜２０分間空
気乾燥する。該線条をワットマン３Ｍ紙２枚の間にはさ
み、アルミホイルで包む。その外にマークペンで標識し
、デシケータ中で６力月間減圧で保持する。

５、組換えプラスミドを保持するイー・コリＭＣ１０６
１を実施例２で生成したライブラリィの個体コロニーか
らのＬブロス１００ｒｎ１．で培養し、プラスミドＤＮ
Ａを下記の方法で単離する。

３）細胞を５００Ｏｒｐｍ　にて０℃で５分間遠心する
。

ｂ）細胞を１／４容量（７）Ｔ　Ｅ　（１０ｍＭ　Ｔｒ
　ｉ　５−ＨＣｌ、ｌ−ｍＦ、ＤＴＡ　ｐＨ８）にて０
℃で洗浄する。

Ｃ）細胞を２５９６庶糖、ＯＱ　５Ｍ　Ｔｒｉｓ　−ｒ
ｒｃｚｙｐＴＩ７．５の混液３　ｍｌに０℃てＩ′１１
懸洞し、リゾチー／−（０，２５Ｍ　Ｔｒｉｓ　−ｔｉ
ｃ）４　ｐｒｆ　７．５中１０〜／　ｍｌ　）　０．３
　ｍｌを加え、ついで氷上で５分間時々ゆるやかに渦状
にまぜながらインキュベートする。

ｄ）　２５０ｍＭ　ｒらＤＴＡ　（ｐＩＴ　８　）Ｌ２
ｍｌを加え、水」−インキュベーションを５分間続ける
。

ｅ）１・　　リ　ト　ン溶液　（１０％　ト　リ　ト　
７Ｘ１００（シグマ社製）２ｒｎｌ、２５０ｍＭ　Ｅｒ
）ＴＡ　（ｐＴ−１３）５０℃ノおよび水１．３５ｍ／
の溶液）４．８．Ｉ／！を加え、氷４−でさらに１０分
間インキュベートする。

「）この混合物を２５００Ｏｒｐｍ　にて０℃で３０分
間回転させる。

ｇ）−１−清を除き、容量を８．７　ｍｌに調整し、Ｃ
５Ｃ１８，３！および臭化エチジウム（Ｓｉｇｍａ＃Ｅ
−８１５１，）１０ｍＹ／ｍｌを加える。その屈折率は
１．３９０と１．．３９６の間にあるべきである。

ｈ）この試料を３５〜３８にで２０℃にて４８〜７２時
間遠心し、そのチューブを長波長紫外線を照射してバン
ドを可視化する。

１）２１ゲージ針でチューブの側面に穴をあけて高次コ
イルＤＮＡを含む低バンドを収集する。

６、　Ｔ’ＡＴＩ　５３−ヒトＤＮＡ組換え体を公知の
ニック翻訳（Ａ　Ｍａｎｕａｌ　　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｔ
ｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂ
ａｃｃｅｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ″　ｂｙ　Ｄａｖｉ
ｓ、Ｒ，Ｗ、、　　Ｂｏｔｓｔｅｉｎ。

Ｄ、　＆　Ｒｏｔｈ、　Ｔ、Ｒ９１９８Ｑ　、　Ｃｏ１
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｒ（ａｒｌ）ｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｉ−Ｔａｒｂｏ
ｒＮ、　Ｙ、、　ｐｐ　１６８−１７０　）により３２
ｐで標識する。

ａ）水（２０μｌから加えるべきＤＮＡ溶液の量を差引
いた量）をミクロファージチューブに入れる。

１））０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ　　ｐＨ７，５、Ｑ、　Ｉ　
Ｍ　Ｍｇ　ＳＯ４、］　ＱｍＭ　ｐＴＴ、５００　ｔｔ
（１／、Ｉ　ＵＳＡ　　の混液２．５μｌを加える。

ｃ）　０．２　ｍＭ　ｄ　ＮＴＰを含む溶液２．５　μ
／　ヲ加え、さらに上記工程５で得られたＰＡＴｌ、５
３ヒト組換えＤ　Ｎ　Ａ　１００　ｍｆｌを加える。

ｄ）　　ＤＮａｓｃ原液（５ＱｍＭ　Ｔｒｉｓ　　ｐＨ
７，５、］、ＱｍＭ　ＭｇＳＯ４、ｌ　ｍＭ　Ｄ　Ｔ　
Ｔ　　および５０％グリセリン中ＤＮ　ａ　ｓｅ　１．
　”ｉ／ｒｎ１．）を事前に調製し、−２０℃で貯蔵す
る。

ｅ）上記ｄ）のＤＮａｓｅ原液を、５　Ｑ　ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓｐｒ−＋７．５、Ｉ　Ｏｒｎ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ
４，１ｍＭｒ）Ｔ−Ｔおよび５０１１ｆｊ／ｍｌ　ＵＳ
Ａの混液に０℃で１／４００００に希釈し、希釈したＤ
Ｎａｓｅ　Ｏ，５μｅ　を反応混合物に加える。

ｆ）各３２ｐｄＮＴｐ水溶液１０μＣｉを加える。

ｇ）２ｍ９／９１イー−コリＤＮＡｆ！＋）メラーゼＴ
Ｏ，１／＋／を加えて全反応を開示し、１４℃で３時間
インキュベートして反応させる。

ｈ）　　０．０２　Ｍ　Ｎａ５ＥＤＴＡ、　　２ｍｇ／
ｍｌキー１’　ＩＪ　７１’）ＮＡおよび０．２９６Ｓ
　ＯＳの混液２５μｌを加えて反応を停止させる。

ｉ）ｌ　ＱｍＭ　Ｔｒｉｓ　　Ｎａ５ＥＤＴＡに事前に
ＰＨ７，５（Ｔ’Ｅ　）で平衡化した０、７Ｘ２０ｃｍ
セファデックスａ−５Ｏ（メディウム）カラムに通し、
同緩衝液で洗浄する。

ｉ）溶出試料０．５．ｎｌをポリプロピレンチューブに
収集する。洗浄２ｒｎＩＶ後にＤＮＡが現われる。

３２Ｐ標識ＤＮＡの位置を手動モニターで調べ、終りを
無視して最初のピークを集める。

７、下記の方法により、上記工程６で得られる標識プロ
ーブを工程４のプロットした遺伝子ＤＮＡにハイブリダ
イズする。

ａ）４４ｍｌハイブリダイゼーション溶液３００ｒｎｌ
を下記のように調製する。

ｆｌ、）　　３　×ＰＯ（０−７５Ｍ　Ｎ　ａ　２　Ｐ
　Ｏ、ｉ、０．７５ＭＮａ■−■２ＰＯ４，０，０１Ｍ
　ピロリン酸ナトリウム）ｉｏｏｍｌ （２）２０ｘＳＳＣ（３ＭＮａＣＩ！、０．３Ｍクエン
酸ナトリウム）９０ｍｌ （３）蒸留水９２ｍ１ （４）　０．５％ＲＦＰ　（牛血清アルブミン、フィコ
ール（ｆｉｃｏｌｌ　）　およびポリビニルピロリドン
−３６０の各０．５ｇ／１００ｍ１）１５−（５）５μ
ｇ／μＪｓｓＤＮＡ（変性サケ精子ＤＮＡ　）　３　ｍ
ｌ 上記溶液を上蓋付プラスチック瓶（２０Ｘ　１４−。

５Ｘ１０．５σ）に移し、水浴中６８℃で加熱する。

ハイブリダイズすべきフィルターを加え、６８℃で４〜
６時間インキュベートスル。

ｈ）線条をハイブリダイズするために、３〜４線条をシ
リコン処理ガラスバイアルの囲に巻き付け、ハイブリダ
イゼーション溶液２ｍｌを含むプラスチック製シリチレ
ーションバイアルに挿入する。

バック中テニトロセルロースシートをハイブリダイズす
るために、適当量のハイブリダイゼーション溶液を加え
、そのバッグをシエアズ（５ｅａｒｓ　）シール器具で
熱シールする。

そのハイブリダイゼーション溶液はバイアル中でのハイ
ブリダイゼーション用につぎのようにして調製される。

＋１．ｌ　Ｏ，５％ＢＦＰ　８０μ１ （２）　（ｌ　ｉ　Ｍ　Ｆ、ＤＴＡ　（ｐＩ−Ｉ　７．
０　）　２０μ１ｔ３）　１０　％　Ｓ　Ｄ　Ｓ　　２
０　ｔｔ　１（４）５μｇ／μｌ　５ｓＤＮＡ２０μｇ
（５）変り得る３２ｐニツク翻訳したプローブ（２〜４
×１０６　カウント／ｒｎｌ）（６）変り得る蒸留水１
９００μｌに調節、１２分間煮沸し、７分間水冷する。

（７）２０ｘＳＳＣ１００μ／　／２０００μｌＣ）手
袋をし、線条をハイブリダイゼーション溶液から直接除
き、適当な３または４線条をシリコン処理ガラスバイア
ル（１９Ｘ４．３ｍｍ、キャップ付）の囲りに巻き、該
調製したハイブリダイゼーション溶液を含むプラスチッ
ク製シンチレーションバイアル（直径２８ｍｍ　）に挿
入する。

その詰めたふたの囲りをパラフィルムで包む。

バイアルの底を数回軽くたたいてフィルターを固定し、
そのフィルターをニューブランズウィック回転水浴中で
ゆっくりと振盪しながら（セット数３）６８℃で２０〜
２４時間インキュベートする。

〔注〕バイアルの囲りを包む線条が３未満の場合は、事
前にハイブリダイズしたブランク線条１または２個を加
えてもよい。

ｄ）そのフィルターを２ｘ　Ｓ　ＳＣ，０，５％ＳＤＳ
中でつぎのように洗浄する。洗浄液６〜９リツ（５７） トルを洗浄すべきフィルターの数に応じて調製する。底
に止めコックを有するガラス瓶に下記のものを加える。

ｔｌ、１２０　ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ６００〜９００ｍ１ｉ２
）１０％５ｒ）５　３００〜４５０ｍ１（３）蒸留水　
　　５１００〜７６５０ｍ／攪拌捧を底に置き、温度計
を上から入れる。その溶液を加熱プレート」−で攪拌し
ながら６８℃に加熱する。洗浄液１〜１．５リツトルを
プラスチック瓶に収集する。ハイブリダイゼーション後
、フィルターをはずしく手袋をする）、直ちに洗浄液中
に浸す。フィルターをはずし移送する際には、ミリポア
（Ｍｉ　ｌ　Ｉ　１ｐｏｒｅ　）　　ピリセットを用い
る。

ｅ）そのフィルターを新しい洗浄液１〜１．５リツトル
に移し、水浴中６８℃で７〜１２分間インキュベートす
る。多量の水を流して、新しい洗浄液を注意深く除く。

「）そのフィルターを再度新しい洗浄液１〜１゜５リツ
トルに移す。すべての洗浄液を使いきるまで、７〜１２
分間ごとに移しかえおよび６８℃で（５８） のインキュベーションを続ける（４〜７回の洗浄）。

ｇ）最後の移送は、０．１　ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ，０，５％
ＳＤＳを含み６８℃に加熱された洗浄液１リツトル（蒸
留水９４５ｍ１，１０％ＳＤＳ５０ｍｌ、２０ｘＳＳ　
Ｃ５ｍｌ　）に行ナウ。インキュベーションは６８℃で
１０分間行なう。

ｈ）そのフィルターをとり、２ＸＳＳＣ５００−中で室
温にてすすぎ、ワットマン漸１シート上で１５〜３０分
間空気乾燥する。

ｉ）２つのゲルからの６木の線条をＸ線フィルムパック
からの黄色紙上にテープで止め、ａ識し、プラスチック
包装で包み、強化スクリーンに設けたカセット内に設置
する。暗室で、そのカセットに８×１０インチのＸ　−
Ｏｍａ　ｔ　　ＡＲＸ線フィルムをつける。該フィルム
はニトロセルロース線条とスクリーンの間に設置する。

そのカセットを密閉し、−７０℃でフリーザー中に保持
する。

ｊ）このＸ線フィルムを２４〜４８時間展開させ、カセ
ットからとり出し、暗室にて黄色安全光で現象する。こ
のカセットは他の露光に再使用できる。

８、テストしたプローブか、唯一個の個体のＤＮＡのレ
ーンよりも３個体のＤＮＡのレーンに多くのバンドを示
せは、それは多形性を検定する候補となる。

９、工程８で同定したプローブをより多くの系のヒトＤ
ＮＡとハイブリダイゼーションに付して、クローン化領
域が多形性である範囲を決定する。

少なくとも４種の異なる対立遺伝子が１０％以」−の頻
度で存在する領域に対応するプローブは父系のテストま
たは個体同定テストに供される。

実施例４ この実施例は本発明の父系テストの実施および評価を示
す。

１、血液試料を母親、子供および推定」−の父親からと
り、そのＤＮＡを実施例１と同様にして精製する。

２、これらのＩ）　Ｎ　Ａを実施例３と同様にして別々
に制限酵素ＥＣ０ＲＩと反応させる。

３、これらのＤ　Ｎ　Ａを実施例２と同様にして電気泳
動に付し、母親および推定上の父親のＤＮＡを各５ｔｔ
９］つのレーンに流し、３つの個体のＤＮＡ各５μｇを
隣接レーンに流す。

４、電気泳動したｒ）ＮＡを実施例３と同様にしてプロ
ットする。

５、「父系プローブＪ　ＤＮＡの組を実施例３と同様に
して３２Ｐ　で標識する。

６、工程５で得られた標識プローブＤＮＡを実施例３と
同様にして工程４で得たプロットした遺伝子ＤＮＡとハ
イブリダイズする。

子供の全遺伝子は母親または父親のいずれががら導かれ
る。したがって、推定上の父親が生物学的父親であるな
らば、子供のＤＮＡのレーンに現われるすべてのバンド
は子供のＤＮＡのないレーンにも現われる。逆に、推定
」二の父親が生物学的父親ではない場合には、新しいバ
ンドが子供のＤＮＡのレーンに現われるだろう。

実施例５ この実施例は父系テストの特定の技法および評価を示す
。

Ａ、血液からのｌ）　Ｎ　Ａの精製 １、血液試料（５〜１．０　ｍｌ　）を、抗ａ固剤とし
てＥｒ）　Ｔ　Ａまたはクエン酸塩を含有するチューブ
に収集し、処理に用いるまで４℃で貯蔵する。

２、相転換により再懸濁した細胞を２００　Ｏｒｐｍに
て４℃で１０分間遠心する。淡黄色の被膜をみたさずに
血清（頂部）を除く。

３、等量の血ｅ、溶解緩衝液（０，３２蔗糖、ｌＱｍＭ
Ｔｒｉｓ　　　ｐｒｌ　　７．　６　　、　５ｍＭＭｇ
Ｃ７２、１％　　ト　リドンｘ　−１００）を４℃で加
え、逆転にてよく混和させる。５０ｍ１ポリプロピレン
製円錐チューブ（例えは、コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ
　）、Ｆａ　ｌ　ｃｏｎ製）に移し、血液チューブをす
すき゛、最終容量を原曲液量の４倍にする。よく混和し
、２０００ｒｐ＋ｎ　　にて４℃で１０分間遠心する。

４、−１−清液を傾斜除去し、ペレットが澄明でないと
き（すなわち、多くの赤血球が混入しているとき）、そ
のペレットを溶解緩衝液３ｍＩＶに再懸濁させて再度遠
心する。

５、白色がかったピンクのペレットをＤＮＡ溶解緩衝液
（１０ｍＭＴｒｉｓ　　ＰＴ（７，４、ｌＱｍＭＦ、　
ｒ）ＴＡ、　　］、　ＯｍＭ　ＮａＣ１、１００１１！
／ｍｌプロテイナーゼＫ）２．５〜５　ｍｌに再懸濁さ
せる。よく混和し、必要により渦状にまぜる。５ＤＳ（
原液：２０％）を最終濃度１％になるように加える。

チューブをゆるやかに逆さにして混ぜる。この試料は非
常に粘稠になる。これをロッカープラットホーム中でゆ
るやかに攪拌しながら３７℃で一装置くかまたはときど
き攪拌しながら６０℃で３時間放置する。

６、ＮａＣＪを６Ｍ原液にて最終濃度０．４〜１．　Ｍ
となるように加える（すなわち、希釈度１：５）。

手またはロッカープラットホーム中でゆるやかに混ぜる
。この時点で試料を冷却下に貯蔵できる。

７、　等ｔのフェノール−クロロホルム混１　（９０％
７エ／−ル１部、１０％Ｉ　Ｍ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　ｐＨ８
，０、クロロホルム１部）を加え、室温で１５〜３０分
間ゆるやかに振盪する（例えば、手で振る）。

８．１５ｒｎ！、ガラスコレツクス（Ｃｏｒｅｘ　）チ
ューブに移し、４．０００ｒＰｍ　で１５分間（ベック
マン）または１．０００Ｏｒｐｍ　で５分間（ツルポー
ル）遠心し層分離する。

９頂部、の水層を広口径ピペットで除き、元のプラスチ
ックチューブに戻す。この抽出処理を２回以北繰返す。

ＩＱ、　Ｄ　Ｎ　Ａ試料を適当な標識透析バッグに入れ
、１００倍過剰（７）　’Ｔ’　Ｅ　緩衝液（１０ｍＭ
　Ｔｒ　ｉ　ｓ　ｐＴ−Ｔ７、４　］、　ｍＭ　）に対
して透析する。

■適当に希釈（例えば１．／２０）Ｉ、た試料のＯｊ）
、を同型のブランク溶液と対比して２４０部ｍ（Ｅｎ’
ｒＡに対し）、２５０部ｍ（ＤＮＡに対して極大）、２
７００ｍ　（フェノールに対して極大）、２８０１ｍ（
蛋白質に対して極大）、３４．ｎｍ（副度）、２６０／
２７０：約１．２．２６０／２８０：約１．８にて読み
取る。

！１．遺伝子ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化１　
、−’Ｆ　記６　分を１．、５　ｍｌエツペンドルフチ
ュープに加える。

３）約１．　Ｑ　１ｔ９　ＤＮＡ　／テスト（通常１０
μｌ〜５０ｔｉｌ）をとる。

”）　特定の１０×エンドヌクレアーゼ消化緩衝液の適
当量 ｃ）　　３倍過剰量の制限エンドヌクレアーゼ２．１〜
２秒間渦状に攪拌するかチューブを指で数回振って混合
する。

３、エツペンドルフミクロ遠心機中１０〜１５秒間回転
して反応剤をペレット化する。

４、ＥｃｏＲＩについて３７℃で、ＴａｑＩについて６
５℃でインキュベートする。

５．３）　１．／１０量の３Ｍ酢酸アンモニウムを加え
る。

１））９５％冷エタノール２〜２．５量添加Ｃ）−２０
℃で一夜貯蔵し、ミクロファージで回転（４℃で１５分
間）してペレット化する。

６、ａ）ペレットを水１５μｒに溶かす。

Ｉ））約１０倍の制限酵素緩衝液および３倍過剰量の制
限エンドヌクレアーゼを加え、工程２．３および４を繰
返す。

７、消化後直ちにゲルに通すために、５倍のフィコール
標識染料溶液を最終濃度１倍になるように加で反応を伴
出する。これは最終容量２０ｔｔｉ未満の試料に行なう
。

０５電気泳動 １、アガロースをｉ　ｘ−１−Ａ　Ｎ　（４Ｑ　ｍＭ　
Ｔｒ　ｉ　ｓ　。

ｐｌ！　７．９．４ｍＭ酢酸ナトリウム、ｌ　ｍＭ　　
Ｆ、　ＤＴＡ）中で省沸してアガロースゲルを調製する
。

アガロースの最終濃度は０４９６と１．２％（分画すべ
きフラグメントのサイズによる）の間とする。

ＰＡＷ−１，０１にハイブリダイズする試料を０．４０
６アガロース中で電気泳動に付す。ｐ　Ｌ　Ｍ　Ｑ、　
３に対するハイブリダイゼーションには１．２９６アガ
ロースを用いる。

２、アガロース溶液が約７５℃になったときに、１’：
ｔ’ｌＳｒ　（２，７−ジアミ／−１０−エチ／Ｌ／　
−９−フェニルーフエナントリジニウムブロマイド）Ｉ
！終濃度５００　ｎｇ／ｍ／！　〜１２．５　ｎ９　／
　ｍｌ　　で加える。

３、直ちに水″＝ＩＺゲル電気味電気型動金型し、ゲル
ヲ約４　ｍｍ厚みに生成させる。ウエルフオーマーを金
型の一端に置く。固化するまで室温で放冷する。ウェル
フォーマ−を除き、ゲルを１ｘＴＡＮで被覆する。

４、試料をゲル井戸（ｗｅｌｌｓ）に積層する。ゲルボ
ックスを電源につなぎ、電源を入れる。電流を適当な強
さに合せる。例えば、１０ｋｂ以上のフラグメントを分
離するには、２０Ｖで３日間電気泳動する。■、５ｋｂ
フラグメントには、４０ｖで一夜（１６〜２０時間）電
気泳動する。電気泳動後、タンクを離す。手袋をはめて
、ゲルをゲルバケツからとる。そのゲルを紫外線ボック
スに入れ、標識ＴＵＮＡのレーンの側面に沿って澄明な
平定規を置く。ゲルの像を適当な写真フィルムにとり、
電気泳動の記録とする。

Ｄ、プラスミドの即製 １、ｐＡＷＩＱｌまたはｐＬＭＱ、８のいずれかを保有
するイー・コリＨＢＩＯＩの１５ｍ１をとる。

２、これを８０００ｒＰｍ　にて１０分間遠心する。

３、渦状にまぜてビレット化する。

４．２５％蔗糖、５　Ｑ　ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　ｐＨ８
，ＯｌＱ、１　Ｅ＋）−ｒＡ、　Ｑ、２ｍｙ／ｍＩ　Ｒ
Ｎａｓｅ、１ｍｇ／ｍｚ　　リゾチームの混合物３００
μｌを加える。

５、水中に１５分間放置する。

６．０．５％）　　リ　ト　７Ｘ−１００、５０ｍＭＥ
ｒ）ＴＡ　、　５０　ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　ｐＴ−Ｔ　
８．０の混合物２５０μｌを加える。

７、水上に５分間放置する。

８．８Ｗ−２５，２７または４１０−ター中２５に、４
℃で３０分間回転させる。

９、ト清とペレットを分離する（このペレットは細菌ｒ
）ＮＡのゲル化したもの）。

１０、」−諸にプロテイナーゼＫ（５ｍｇ／ｍ！　）　
１０ｔｔｌを加える。

１１、室温で５分間放置する。

１２、フェノール：クロロホルム（１：１）で１回、ク
ロロホルムで２回抽出する。

１３、水層に酢酸アンモニウムを最終濃度０．３　Ｍと
なるように加える。

１４、．２．５倍量のエタノールを加える。

１５、フリーザー（−２０℃）に−夜装置する。

１６、遠心し、その沈殿を２０　ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　
ｐＨ７，４，１０ｍＭＥＤＴＡに溶かす。

１．７．ＣｓＣ１をバンディングのために加える。

Ｅ、ニック翻訳 ■、ハイブリダイゼーション反応のために下記成分を混
合する。

ａ）純プローブＤＮＡ　　５０”９ ｂ）１０ｘニツク翻訳緩衝液（Ｉ　Ｘ＝　２５　ｍＭＴ
ｒ　ｉ　５−１４ＣＩＳｐＨ７，９，２，５ｍＭＭｇＣ
／２．５ｍＭＤＴＴ、１００μｇ／−牛血清アルブミ　
ン　）　０．７　μノ？ Ｃ）アルファＰ−３２デオキシヌクレオチドトリホスフ
ェート２．５μｊ（２５μＣ１）ｄ）　ＤＮａｓｅ　Ｉ
　（２０Ｐ９／Ｉｌｌ　）　０．５μ１ｅ）ＤＮＡポリ
メラーゼ（３ｕｍｉｔｓ）　０，５　Ｉｌｌ最終容量５
μｌに調節。

２、それを１６℃で２時間インキュベートする。

３、ＥＤＴＡを最終濃度ＩＱｍＭに、ＳＤＳを最終濃度
０．５％に加えて反応を停止させる。最終容量は１００
μｊ ４、反応混合物を貫通ミクロ遠心チューブ中セファロー
ス６Ｒ−ＣＩ−０，６ｍｌを通して１５００ｒｐｍにて
２分間遠心して非反応トリホスフェートから標識ＤＮＡ
を分離する。

５、標識ＤＮＡを含む通過液１ｔｔｚをとり、ベータシ
ンチレーションスペクトロメーターにてカウントする。

Ｆ、　Ｚ−結合（ｚｅｔａｂｉｎｄ　）のためのサウザ
ン転移案内 １、　Ｄ　Ｎ　Ａをアがロースゲルに流す。臭化エチジ
ウム（１０μｇ／ｍｌ）にて１５〜３０分間染色し、緩
衝液に１５〜３０分漬けて過剰の染色を除き、写真にと
る。

２゜そのゲルを０．５　Ｍ　Ｎ　ａ　０ｒ−１、１，Ｑ
ＭＮａＣｌ！におだやかに攪拌しながら３０分間浸漬す
る。

３、ゲルを水ですすき、Ｑ、５　Ｍ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　−
ＨＣ１！、Ｐ　Ｈ７，５，０，３Ｍ　ＮａＣ７；を用い
て工程２を繰返す。

４、ｚ結合（Ｚｅｔａｂｉｎｄ　）を水で湿し、リン酸
ナトリウム緩衝液（０，０２５Ｍ％ｐＨ６，５）に３０
分間浸漬する。

５．そのゲルを工程４と同じリン酸緩衝液に２０分間浸
漬する。

６、ワットマン３ＭＭｗｅｔ　　の２つの線条をリン酸
緩衝液に入れ、ゲルのサイズをみる。２つの間に気泡が
ないようにする。リン酸緩衝液に浸した３ＭＭペーパー
心のトレイ上にゲル（フィルター下）をおく。そのゲル
上にＺ結合をのせ、ついで２つの３ＭＭペーパー線条お
よび最後にペーパータオル（３〜４インチ高さ）をのせ
る。その頂上に平らなトレイをのせ、重しく例えば１０
０ｒｎｌ瓶）をのせてゲルとペーパーの接触を確実にす
る。

７、リン酸緩衝液（０，０２５Ｍ、　ｐＩ−Ｉ　６，５
　）を用いて一夜転写を行なう。

８、その膜をリン酸緩衝液で１５分間洗浄する（膜の側
面、すなわちゲルと接触している部分をおだやかにこす
る）。

９、真空で８０℃にて２時間熟成する。

１０、密閉バック中に入れ、０．（ＩＸ　Ｓ　Ｓ　Ｃ，
０，５％ｓ　ｒ−ｓ　（約１５記）で６０℃にて３０〜
６０分間洗浄する。

１１　　工程１０での緩衝液を除き、ハイブリダイゼー
ション緩衝液（４ＸＳＳＣ，５０ｍＭリン酸ナトリウム
Ｐ■−１６，７，５Ｘデンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）
、２００μ９／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、および５０％
ホルムアミド）で置換する。これを３７℃で３〜１６時
間インキュベートする。

１２　　そのプローブをハイブリダイゼーション緩衝液
１ｒｎｌ中７０℃で１０分間加熱して変性する。

その変性放射性ＤＮＡで３７℃にて４０〜７２時間ハイ
ブリダイズする（　２　Ｘ　１０　ｄｐｍ　／＜ラグ）
。

１３、これを２ｘＳＳＣｐ、０．１％ｓ　ｒ、　ｓにて
、洗液１０ｍ１アリコツトが１．　ＯＯＣｐｍ　　チェ
レンコフカウンター以下になるまで６５℃で２０分間攪
拌して洗浄する（約６回）。０，４ＸＳＳＣＩ’、０゜
０２％ｓ　ｒ−ｓにて６５℃で２回、０．１ｘＳＳＣＰ
にて２回洗浄する。各々、充分な緩衝液を加えてフィル
ターを被う。

１４．７結合をプロットし、セロファンで被ｗする削に
空気乾燥し、オートラジオグラフィーのためにカセット
に入れる。

再使用前に、事前にハイブリダイズした緩衝液中で７０
℃で１０分間加熱してプローブを除く。

事前ハイブリダイゼーション（全量１５ｒｎりの成分 １５．２つのゲルからの６線条をＸ線フィルムパックの
黄色紙上にテープでとめ、標識し、プラスチック製包装
で被覆し、強化スクリーンに設けたカセット中におく。

暗室で、そのカセットに８×１０インチＸ　−ｏｍａｔ
　ＡＲＸ線フィルムを入れる（該フィルムはニトロセル
ロース線条とスクリー△の間に挿入）。そのカセットを
密閉し、−７０℃にてフリーザー中に保持する。

＋６．Ｘ線を２４〜４８時間かける。そのフィルムをカ
セットからはずし、暗室にて黄色安全光をかける。その
カセットは他の露光に付してもよい。

実施例に の実施例は本発明による父系テストの特定の技法および
評価を示す。

１、母親、子供および推定」−の父親から血液試料を採
取し、実施例５．Ａと同様にしてＤＮＡを精製する。

２、これらのＤＮＡを実施例５．Ｒと同様にして制限酵
素Ｅ（ｏｋｌまたはＴａｑｌ　で別々に反応させる。

３、これらのＤＮＡを実施例５．Ｃと同様にして電、　
気泳動に付し、３つのＤＮＡの各５μｇを母親、子供、
推定上の父親の順に（左から右へ）隣接レーンに各々通
す。

４、実施例５．Ｄおよび５．Ｅと同様にして、「父系プ
ローブＪ　ＤＮＡを調製し、標識する。

５、実施例５、Ｆと同様にして電気泳動ＤＮＡをプロッ
トする。

６、工程４からの標識プローブＤＮＡを、実施例５、Ｅ
と同様にして、工程５のプロットした遺伝子Ｔ）ＮＡと
ハイブリダイズする。ＰＡＷｌｏｌＤＮＡをＦ、ｃｏｌ
ｔＴ切断遺伝子ＤＮＡとハイブリダイズし、一方、ｐ　
Ｔ、　Ｍ　Ｑ、　８をＴａｑｌ　　切断遺伝子ＤＮＡと
ハイブリダイズする。

７、実施例５、Ｆと同様にしてオートラジオダラムをと
る。

８、オートラジオグラフィ後、多形性ＤＮＡフラグメン
トに対応するバンドのサイズを測る。これは、それらバ
ンドで移動する距離を測り、ＤＮＡ分子量標準品のコレ
クションのものと相対して行なわれる（　５ｏｕｔｈｅ
ｒｎ　、　Ｅ、Ｍ、、　（１９８４）Ａｎａｌ。

Ｒｉｏｃｈｅｍ、　１００　、３１９−３２３　）。

家族の各個体におけるＤＮＡフラグメントのサイズを比
較し、子供で観察されるパターンが推定」二の父親のも
のと一致するか否か調べる。子供のＤＮＡフラグメント
のサイズが推定上の父親のものと異なっているときは、
彼は生物学的父親ではないと結論される（非父親のケー
ス）。Ｔ−供が母親と維−の対立遺伝子を共有し７てい
るときは、他の対立遺伝子が父親から受継いたものと結
論される。４［１・定１−の父親がこの対立遺伝子を有
していないときは、彼は父親ではないと結論できる。ま
た、その２つか母親によっては寄与しない少なくとも一
対のｒ）ＮＡフラグメントを共有しているときは、その
個体が父親であるかどうかの決定となるよりも、人口か
らランダムにとった個体が同じＤＮＡフラグメントサイ
ズを有する可能性がある〔すなわち、Ｔｎｃｌｕｓｉｏ
ｎ　　Ｉ’ｒｏ１１ａｌ〕１ｌｉｔｉｃｓ　　ｉｎｒ’
ａｒｅｎｔａｇｅ　Ｔｅｓｔｉｎｇ　（１９８３３、Ｒ
，ＩＴ、Ｗａｌｋｅｒ茗、　　Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ａ
ｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ＲｌｏｏｄＲａｎｋ
ｓ　　における父系インデックス（ｐａｔｅｒｎｉｔｙ
ｉｎｄｅｘ　）　３゜この後者の場合、特定のＤ　Ｎ　
Ａプローブで検定された対立遺伝子の頻度を知る必要が
ある。プローブｐＡＷ−１０１およびｐ　ｒ−Ｍ　−０
゜８について観察される頻度を第１表および第２表に示
す。

第１表 人口からランダムにとり出した２９８個体におけるＥ　
ｃｏ　ＲＴ　切断ヒト遺伝子ＤＮＡについて、プローブ
としてｐＡＷ　１０１を用いて順化した対立遺伝子の頻
度 第２表 人口からランダムにとり出した２６８個体におけるＥｃ
ｏｋＩ切断ヒト遺伝子ＤＮＡについて、プローブとして
ｐ　Ｌ　Ｍ　Ｑ、　８を用いて順化した対立遺伝子の頻
度 実施例７（テスト１） 実施例６の方法によって母親、子供および推定上の父親
について本発明のテストを行なった。それら母親、子供
および推定−にの父親からのＥｃｏｋＩ切断ＤＮＡにつ
いてプローブとしてｐＡＷｌ　０１を用いた場合のオー
トラジオグラム像を第１図に示す。移動距離を測定し、
公知の標準品と比較す、２ ると、母親はＰＡＷ　１０１対立遺伝子ナン・・）およ
び５を、子供はＩ’ＡＷＩＱｌ対立遺伝子ナンバー５お
よび１０を有する。一方、推定」−の父親はｐＡＷｌ−
Ｑｌ対立遺伝子ナンバー１０および１１を有する。母親
は子供のｐＡＷＩ　Ｏ１対立遺伝子ナンバー５に寄与し
ている筈であるから、父親は対立遺伝子ナンバー１０に
寄与している。この場合、確度（１ｉｋｅｌｉｈｏｏｄ
　ｒａｔｉｏ　）　１６．６７で、父親の可能性は９４
％となる。

実施例８　（テスト２） 実施例６の方法によって母親、子供および推定−１−の
父親について本発明のテストを行なった。それら母親、
子供および推定上の父親からのＥｃｏｋＩ切断ＤＮＡに
ついてプローブとしてｐＡＷｌｏｌを用いた場合のオー
トラジオグラム像を第２図に示す。移動距離を測定し、
公知の標準品と比較すると、母親はｐＡＷ１０１対立遺
伝子ナンバー５および９を、子供はｐＡＷｌ　０１対立
遺伝子ナン・・−５および７を有する。一方、推定−１
−の父親はｐＡＷ１０１対立遺伝子ナンバー４および６
を有する。父親は丁−供のＰＡＷＩ　Ｏ１対立遺伝子ナ
ンバー７に寄１ｊ、シている筈であり、その推定−１−
の父親はこの対立遺伝子を有していないため、彼は父親
であるｉ１能性からは除外される。

実施例９　（テスト３） 実施例６の方法によって母親、子供および推定１−の父
親について本発明のテストを行なった。それら母親、子
供および推定−１−の父親からのＴａｑｌ切断ＤＮＡに
ついてプローブとしてｐ’Ｌ　Ｍ　０．８を用いた場合
のオートラジオグラム像を第３図に示す。移動距離を測
定し、公知の標準品と比較すると、母親はｐＴ、ＭＯ９
８対立遺対立遺伝子ナンバエフ８を、子供はｐＩ・Ｍ　
０．８対立遺伝子ナンバー７および８を有する。一方、
推定上の父親はｐＬＭｏ、８対立遺伝子ナンバー２およ
び８を有する。母親は子供のｐ　Ｌ　Ｍ　Ｏ，８対立遺
伝子ナンバー７または８のいずれかに寄与しているので
、その父親は対立遺伝子７または８のいずれかに寄与し
ていなければならないと結論できる。その推定上の父親
が子供のｐ　Ｌ　Ｍ　Ｑ、　８対立遺伝子ナンノく−７
または８に寄与するチャンスと、ランダムにとりだした
ヒトがこれら対立遺伝子のいずれかに寄与するチャンス
とを比較すれば、確度は３．５５で、それは父親の可能
性が７１．８％に対応する。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例７におけるオートラジオグラフ、第２図
は実施例８におけるオートラジオグラフ、第３図は実施
例９におけるオートラジオグラフを示す。 特許出願人　アクタゲン・インコーポレイテッド代理人
弁理士青山葆外１名 昭和５１ｊ年　４月１２日 昭和５１３年特許願第　　　　３）ｉ　４５１５確−γ
、するノｊ法 ３補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　アメリカ合衆国ニューヨーク、エルムス７才一ド
、４、代理人 住所　大阪府大阪市東区本町２−１０　本町ビル内７、
補正の内容 別紙の通り。 （１）出願の際、ゼロックスで゛複写した明細書および
図面を提出致しましたので正調整したものを提出致しま
す。 尚、内容についての補正は行なってお１〕ません。 （２狂特許出願人」の欄の代表者の氏名を記載した願書
および同副本ならびに委任状（訳文付）を提出致します
。 ８、添付書類 （１）特許順　　　　　正・副各１通 （２）明細書　　　　　１通 （３）図　　面　　　　　　　　　１通（４）委　任　
状（訳文付）　　　　　　　１通以上 昭和５９年　５月１（）日 特許庁艮　官　殿 昭和５１ｊ年特許願第　　　　：ｑ　８４．５１　　万
２発明の名称 父系の決定ｔ）よび個／／の遺伝的同一性を確Ａγ、す
るｈ法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　　アメリカ合衆国ニューヨーク、エルムス７才一
ド、−ンエストチェスター・ブラザ′４番 名ｆ糸　　アクタデン・インコーホレイテッド４、代理
人 住所　大阪府大阪市東区本町２−１０　本町ビル内７、
補正の内容 （１）明細書（昭和５９年４月１２日付提出の手続補正
書に添付のもの）第６４頁８行の［７，４１ｍＭＪを「
７．４．１＋ｎＭＥＤＴＡＪと補正する。 以」二 ２−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）工またはそれ以上の多形性遺伝領域について生物
   の種におけるＤＮＡを分析し、該遺伝領域の相対的サイ
   ズによって各多形性を区別し、核種の個々のメンバーを
   特徴付けることを特徴とする、生物の種の個々のメンバ
   ーを同定する方法。 （２）該領域を下記の工程： （ａ）分析すべき個体のＤＮＡを単離し、（１））該Ｄ
   ＮＡを制限エンドヌクレアーゼの作用に付し、上記で生
   したＤＮＡフラグメントをサイジングし、一本線分子に
   変換し、 ｔｃ）該寸法合せした一本線分子をプローブＤＮＡ分子
   でハイブリダイズしくただし、該プローブはヒｌ−ｉ（
   Ｌ　Ａ遺伝生産のｃＤＮＡではない）、ｆｄ）該ハイブ
   リクイズしたフラグメントの数および位置を同定する こきによって決定する第（１）項の方法。 （３）該分析する個体が、１クイルス、バクテリア、ｔ
   ※・類、真菌、植物および動物からなる群から選ばれる
   種の一員である第ｔ１１項の方法。 （４）該ｒ）ＮＡ試料が大人、若者、胎児または胚子組
   織の細胞から得られる第（１）項の方法。 （５）該プローブが、異なった多形性遺伝領域の単一の
   対立遺伝子を表わす各個体プローブの一組である第（２
   ）項の方法。 （６）該−組のプローブが１〜約２０の個体プローブか
   らなる第（５）項の方法。 （７）該多形性遺伝領域に含まれる対立遺伝子の数が約
   ２〜約４０である第（５）項の方法。 （８）該プローブがｔ’ＡＷ１．０１　（ＡＴＣＣ３９
   ６０５）およびＩ）ＬＭｏ、８（ＡＴＣＣ３９６０４）
   である第（５）項の方法。 （９）親子関係を決定するために、該個体の多形性遺伝
   領域の相対的サイズを惟定的父母のものと対比する上程
   をさらに含む第（１）項の方法。 （１０１２つの試料間の同一性をみるために、該個体の
   第１の試料からの多形性遺伝領域の相対的サイズを他の
   起源からの第２の試料から得られる多形性遺伝領域と対
   比する工程をさらに含む第（１）項の方法。 （１１）該個体の株同定のために、該個体の多形性遺伝
   領域の相対的サイズを生物様の他のメンバーから得られ
   る多形性遺伝領域と対比する工程をさらに含む第（１）
   項の方法。 （１ｚ１またはそれ以上の多形性遺伝領域について生物
   の種におけるｒ）ＮＡを分析し、該遺伝領域の相対的サ
   イズによって各多形性を区別し、核種の個々のメンバー
   を特徴付ける方法であって、該領域を下記の工程： ｔａ）分析すべき個体のｒ）ＮＡを単離し、＋１））　
   該ｎ　Ｎ　Ａを制限エンドヌクレアーゼの作用に付し、
   」−記で生じたＤＮＡフラグメントをサイジングし、−
   木線分子に変換し、 ＋Ｃ）該寸法合せした一本線分子をプローブＤＮＡ分子
   でハイブリダイズしくただし、該プローブは遺伝子ＤＮ
   Ａのエンドヌクレアーゼ消化によって発生されたもので
   ある特徴を有する）、（（１）該ハイブリダイズしたフ
   ラグメントの数および位置を同定する ことによって決定することを特徴とする、生物の種の個
   々のメンバーを同定する方法。 １．１１１またはそれ以上の多形性遺伝領域について生
   物の種におけるＤＮＡを分析し、該遺伝領域の相対的サ
   イズによって各多形性を区別し、核種の１固々のメンバ
   ーを特徴付ける方法であって、該領域を下記の工程： ｔａ）分析すべき個体のｒ）ＮＡを単離し、（Ｉ））該
   ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼの作用に付し、上記で
   生じたＤＮＡフラグメントをサイジングし、−木線分子
   に変換し、 ＋Ｃ）該寸法合せした一本線分子をプローブＤＮＡ分子
   でハイブリダイズしくたたし、該プローブはヒトｒ、Ｔ
   　Ｌ　Ａ遺伝子座のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａではない）、ｔｄ＋
   該ハイブリダイズしたフラグメントの数および位置を同
   定する ことにより決定することを特徴とする、生物の種の個々
   のメンバーを同定する方法。