DE3344649A1 - Verfahren und vorrichtung zum feststellen einer analysesubstanz im eluat einer fluessigkeitssaeulenchromatographieanlage - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zum feststellen einer analysesubstanz im eluat einer fluessigkeitssaeulenchromatographieanlage

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Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Chromatographie und bezieht sich insbesondere auf die Flüssigkeitssäulenchromatographie und Nachweisgeräte für der Säule nachgeschaltete Reaktionen. '
Der Nachweis einer chemischen Umsetzung bei der Flüssigkeitssäulenchromatographie ist eine allgemein bekannte Technik, mit der Proben für die Auflösung oder Analyse besser geeignet gemacht werden. In der Säule nachgeschalteten Reaktionen werden aus der Säule eluierte Substanzen chemisch umgewandelt, um die Wahrnehmbarkeit der Analysesubstanz zu verbessern. Die Reaktion erfolgt vor dem Nachweis, unmittelbar nachdem die getrennte Probe die Säule verlassen hat. Solche der Säule nachgeschaltete Reaktionen haben normalerweise den Zweck, die Empfindlichkeit des Nachweises der chromatographisch getrennten Bestandteile der Probe zu steigern oder ihre Empfindlichkeit gegenüber störenden Bändern zu fördern, die die interessierenden Bänder überlappen.
Die meistens für die Durchführung von Reaktionen im Anschluß an die Säule benutzten Reaktionszellen sind bisher einfache Vorrichtungen, die grundsätzlich aus einem Leitungssegment bestehen, welches das Eluat aus der Säule führt und von einer weiteren Leitung gekreuzt wird, die das Reagens führt und an einen oder mehrere Vorratsbehälter für Reagentien angeschlossen ist. Die Menge des dem Eluat aus der Säule zugeführten Reagens wird meistens durch die Fördermenge einer Pumpe geregelt, die das Reagens aus dem Vorratsbehälter bzw. den Vorratsbehältern in die ausströmende Flüssigkeit hineinpumpt. Einer der größten Nachteile dieser der Säule nachgeschalteten Reaktionszellen besteht in dem zusätzlichen apparativen Aufwand in Form von Pumpen und Ventilen, die zum Einführen des Reagens in die ausströmende Flüssigkeit mit dem richtigen Druck und in der richtigen Menge und Geschwindigkeit nötig sind.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung
für der Chromatographiesäule nachgeschaltete Reaktionen zu schaffen, mit denen die Notwendigkeit für Pumpen und sich schneidende Leitungen vermieden wird* Insbesondere soll eine Reaktionszelle geschaffen werden, . die ohne weiteres austauschbar ist und in der ein Reagens bis unmittelbar vor seiner Benutzung trocken aufbewahrt werden kann.
Gemäß einem Aspekt· der Erfindung wird eine Vorrichtung 2am Untersuchen der aus einer Flüssigkeitschromatographiesäule ausströmenden Flüssigkeit auf das Vorhandensein einer Analysesubstanz geschaffen, die folgendes aufweist:
a) Ein Reaktionsgefäß, welches in seinem Inneren durch eine schlauch- bzw. rohrförmige, halbdurchlässige Membran, die sich durch das Innere des Gefäßes erstreckt, in eine erste Kammer und eine zweite, davon getrennte Kammer unterteilt ist, von denen die erste Kammer vom Innenraum der Membran bestimmt ist und einen Durchlaß für die aus der Säule ausströmende Flüssigkeit durch das Gefäß bildet, während die zweite Kammer von dem Raum zwischen der Membran und der Wand des Gefäßes bestimmt ist; und
b) ein Reagens, welches in der zweiten Kammer enthalten ist und mit der Analysesubstanz zu einem nachweisbaren Reaktionsprodukt umsetzbar ist, welches, in gelöstem Zustand, die halbdurchlässige Membran in die erste Kammer hinein durchdringt, um darin mit einer beliebigen Analysesubstanz in der durch das Gefäß fließenden, aus der Säule ausströmenden Flüssigkeit umgesetzt zu werden und das nachweisbare Reaktionsprodukt zu bilden.
Gemäß einem zweiten Aspekt wird auch ein Verfahren zum Feststellen einer Analysesubstanz in dem Eluat einer Flüssigkeitschromatographiesäule geschaffen, bei dem:
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a) ein Reaktionsgefäß vorgesehen wird, dessen Innenraum durch eine schlauch- oder rohrförmige, hai "bdur chi äs si ge Membran, die das Innere des Gefäßes durchquert, in eine erste Kammer und eine zweite, davon getrennte Kammer unterteilt ist, von denen die erste Kammer von dem Innenraum der Membran bestimmt ist und einen Durchlaß für den durch das Gefäß strömenden Eluat der Säule bildet, während die zweite Kammer von dem Raum zwischen der Membran und der Gefäßwand bestimmt ist,
b) eine Lösung aus einem Reagens in der zweiten Kammer in Berührung mit der halbdurchlässigen Membran geschaffen wird, wobei das Reagens durch die halbdurchlässige Membran diffundieren und mit der Analysesubstanz zu einem nachweisbaren Reaktionsprodukt umgesetzt werden kann;
c) das Eluat durch die erste Kammer in Berührung mit.der halbdurchlässigen Membran hindurchgeleitet wird, wodurch das Reagens durch die Membran in die erste Kammer diffundiert und mit der Analysesubstanz in dem Eluat reagiert, um das nachweisbare Reaktionsprodukt zu bilden; und
d) das nachweisbare Reaktionsprodukt festgestellt wird«
Andere Aspekte der Erfindung betreffen ein Verfahren und eine Vorrichtung, die eingesetzt werden, um Bestandtejle im Eluat zu verringern oder auszuschalten, die den Nachweis der Analysesubstanz in der ausströmenden Flüssigkeit stören. Diese Vorrichtung und das Verfahren sind ähnlich wie die Vorrichtung und das Verfahren zum Erzeugen nachweisbarer Reaktionsprodukte, außer daß das Reagens nicht mit der Analysesubstanz sondern statt dessen mit einer oder mehreren störenden Komponenten umgesetzt wird, um nicht mehr länger störende Reaktionsprodukte zu erhalten. Ein bestimmtes Ausführungsbeispiel der Erfindung besteht in diesem Sinn in einem Verfahren zur Verringerung der Hintergrundsleitfähigkeit der aus einer Ionenaustauschersäule ausströmenden Flüssigkeit, in der das Reagens eine erste Ionenart darstellt, die verdrängbar an eine nicht-
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lösbare Matrix in der zweiten Kammer gebunden ist. Diese erste Ionenart wird gegen eine zweite Ionenart ausgetauscht, die dem Bestandteil bzw. den Bestandteilen zugeordnet ist, die für die Hintergrundleitfähigkeit verantwortlich sind, um nichtleitende Reaktionsprodukte zu bilden.
Im folgenden 1st die Erfindung mit weiteren vorteilhaften Einzelheiten anhand schematisch dargestellter Ausführungsbeispiele näher erläutert. In den Zeichnungen zeigt:
Fig. 1 ein Blockschaltbild einer Flüssigkeitschromatographieanlage mit einer der Säule nachgeschalteten Reaktionsvorrichtung (wahlweise vorgesehene Bauteile der Anlage sind gestrichelt umrandet);
Fig. 2 einen vergrößerten Längsschnitt durch ein Ausführungsbeispiel einer der Säule nachgeschalteten Reaktiölvorrichtung gemäß der Erfindung;
Fig. 3 einen vergrößerten Längsschnitt durch ein weiteres Ausführungsbeispiel einer der Säule nachgeschalteten Reaktionsvorrichtung gemäß der Erfindung.
In Fig. 1 ist eine komplette Flüssigkeitschromatographieanlage dargestellt, bei der die der Säule nachgeschaltete Reaktionsvorrichtung mit herkömmlichen Einrichtungen zum Trennen und zum Nachweis im Wege der Flüssigkeitschromatographie verbunden ist. Die gezeigte Anlage ist für die Hochleistungs-Flüsslgkeitschromatographie geeignet. Zu ihr gehören: Vorratsbehälter 11 für die mobile Phase, die eine entsprechende Menge an mobiler Phase für die Dosierungs- oder Gradientenelution enthalten; ein Fördersystem bzw. eine Zufuhranordnung 12 für die mobile Phase, welche die mobile Phase aus den Vorratsbehältern fördert und durch die restliche Anlage pumptj eine Überwachungseinrichtung 13, die gleichzeitig aus jedem Vorratsbehälter eine veränderliche Menge fördert; eine Säule 1^, bei der es sich typischerweise um ein Rohr aus rostfreiem Stahl handelt, welches
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als Füllkörper bzw. Trägermaterial eine stationäre Phase enthält; eine Probeneinspritzvorrichtung 15* typischerweise ein Drehventil; es könnte aber auch eine an der Säule vorgesehene Spritzenvorrichtung benutzt werdenj eine Reaktionszelle 16, in welcher die aus der Säule ausströmende Flüssigkeit bzw. der Abfluß mit einem Reagens umgesetzt wird? eine Temperatureteuereinrichtung 17, z.B. ein Bad, mit dessen Hilfe die Reaktionstemperatur gesteuert wird; ein Nachweisgerät 18, welches eines oder mehrere der in der Reaktionszelle 16 gebildeten Reaktionsprodukte wahrnimmt; und eine Daten- oder Aufzeichnungseinrichtung 19, die die Ausgangswerte des Nachweisgerätes aufzeichnet oder speichert.
Bei der mobilen Phase handelt es sich um eine Flüssigkeit, welche ein Lösungsmittel für die zu trennende Probe darstellt. Die chemische Zusammensetzung der mobilen Phase hängt also in erster Linie von der Art der Probe ab. Außerdem muß die mobile Phase mit der stationären Phase verträglich sein sowie mit dem Reagens bzw. den Reagentien für die Umsetzung und mit dem Produkt bzw. den Produkten, und muß gegenüber der schlauchartigen oder rohrförmigen Membran inert sein. Mobile Phasen, die die der Säule nachgeschaltete Umsetzung hemmen oder zur Ausfällung des Reagens oder Produktes führen, sollten natürlich vermieden werden, wie auch Phasen, die die Wahrnehmung des Reaktionsproduktes erschweren. Für die meisten der gängigen Reaktionen im Anschluß an die Säule ist ein einphasiges, wäßriges Lösungsmittelsystem nötig. Deshalb sollten mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel, wie Heptan und Äther vermieden werden. Das Lösungsmittel kann sogar nur aus Wasser oder gepufferter Lösung bestehen, oder es kann ein Gemisch aus den vorstehenden Substanzen mit mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmitteln, wie Alkoholen und Acetonitril benutzt werden.
Mit Hilfe eines Fördersystems für die mobile Phase, allgemein als "Pumpe" bezeichnet, wird die mobile Phase durch die Anlage geleitet. Bei Anlagen für die Hochleistungs-Flüssigkeitschroma-
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tographie ist erheblicher Druck, typischerweise bis zu 40
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MNm nötig, um den Säulenwiderstand gegen die Strömung zu überwinden. Eine konstante Strömung der mobilen Phase bei so hohem Druck kann entweder mittels Kolbenpumpen oder mit Hilfe motorisierter Spritzpumpen erreicht werden.
Mit der Förderanlage für die mobile Phase wird diese unter einem gewissen Betriebsdruck in die Säule eingeführt. Gleichzeitig wird die Probe mittels einer Einspritzvorrichtung, normalerweise mit Hilfe eines Drehventils in die Säule eingeführt. Sobald die Probe in die Säule eingespritzt wurde, mischt sie sich mit der mobilen Phase und wird mit dem Füllkörper in der Säule in Berührung und in Wechselwirkung gebracht. Der Füllkörper ist mit einer gebundenen Phase chemisch geeignet gemacht-(derivitized) und wird als stationäre Phase bezeichnet. Diese stationäre Phase tritt mit Bestandteilen der Probe in Wechselwirkung, während diese durch die Säule wandern. Eine unterschiedliche Wanderung der Probenbestandteile wird mittels ionischer oder hydrophober oder durch Ausschlußmechanismen erreicht, je nachdem welcher Art die stationäre Phase ist. Probenbestandteile werden also physisch getrennt und treten als individuelle Bänder, getrennt durch die mobile Phase in die Reaktionszelle ein.
Im Dauerzustand wird in der Reaktionszelle das Reagens kontinuierlich durch Diffusion hinzugefügt, und darauf folgt ein Vermischen und eine Inkubation unter Bedingungen, die die Umsetzung zwischen dem Reagens und einer oder mehreren in dem Eluat enthaltenen Analysesubstanzen fördern. Die geometrische Beschaffenheit der Analysezelle ist so gewählt, daß die Bandtrennung in dem Eluat auf dessen Weg durch die Zelle im wesentlichen erhalten bleibt.
Wie Fig. 2 zeigt, weist die Reaktionszelle ein zylindrisches Gefäß 22 auf, dessen Innenraum in Längsrichtung durch eine schlauch- oder rohrförmige, halbdurchlässige, elektrisch neu-
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trale Membran 23 in eine innere Kammer 24, definiert durch den Innenraum der Membran 23, und eine äußere, dazu konzentrische Kammer 25 unterteilt ist, welche durch den Raum zwischen der Innenseite der Gefäßwand und der Außenseite der rohrförmigen, halbdurchlässigen Membran definiert ist. Die Kammer 25 könnte, was in Fig. 2 nicht gezeigt ist, in zwei oder mehr Abteile unterteilt sein. Die Verbindungsstellen zwischen den Enden der rohrförmigen Membran und den Stirnwänden des Gefäßes sind fluiddicht. In einer Stirnwand des Gefäßes ist ein Einlaß 26 vorgesehen, der mit einer Leitung 27 verbunden ist, welche zum Auslaß der Säule führt, und in der anderen Stirnwand ist ein Auslaß 28 vorgesehen, der mit einer Leitung 29 verbunden ist, die zum Nachweisgerät führt. Einlaß und Auslaß sind zum Innenraum der rohrförmigen Membran offen und bilden einen Strömungsweg durch das Gefäß für das Eluat bzw. die aus der Säule ausströmende Flüssigkeit.
Die Kammer 25 enthält eine vorherbestimmte Menge eines Reagens 32, welches in Fig. 2 in trockener, fester Form gezeigt ist. Bei anderen Ausführungsbeispielen kann das Reagens entweder in Lösung vorliegen oder in verdrängbarer Bindung an eine nichtlösliche .Matrix bzw. einen Träger. ' . Für den Fall daß mehr als ein Reagens nötig ist, könnten weitere Reagentlen, Verträglichkeit vorausgesetzt, in /ier Kammer 25 untergebracht werden, oder die zusätzlichen Reagentien können in getrennten Unterabteilen innerhalb der Kammer 25 vorgesehen sein. Das Reagens wird durch das Hindurchströmen der mobilen Phase durch die Reaktionszelle aktiviert. Die mobile Phase durchdringt die halbdurchlässige Membran und tritt in die Kammer ein» Die Zusammensetzung der mobilen Phase ist derart, daß sie die Auflösung des festen Reagens fördert und das Reagens für die der Säule nachgeschaltete Umsetzung vorbereitet. Wenn das Reagens durch die mobile Phase nur langsam gelöst wird, kann dieser Vorgang durch Einspritzen eines besser geeigneten Lösungsmittels 33 durch eine durch ein Septum 35 eingesetzte Lösungsmitteleinspritzvorrichtung 34 in die Kammer 25 gefördert
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werden. Gemäß einer Alternative kann das Reagens auch im Voraus in einem entsprechenden Lösungsmittel aufgelöst und durch die schon genannte Lösungsmitteleinspritzvorrichtung 34 in die Kammer 25 eingeführt werden« Das Reagens kann mit der Analysesubstanz "bzw. den Analysesubstanzen in dem Eluat der Säule zu einem Reaktionsprodukt bzw. Reaktionsprodukten umgesetzt werden, das bzw. die mit dem Nachweisgerät wahrnehmbar ist bzw. sind. Das Reagens muß auch imstande sein, in gelöstem Zustand in gesteuerten Mengen durch die halbdurchlässige Membran zu diffundieren.
Die Rate R der Diffusion des Reagens in den Abfluß aus der Säule, der durch die rohrförmige Membran fließt, kann durch Anwenden des Pick'sehen Diffusionsgesetzes unter Annahme eines Dauerzustands angenähert werden, was zu folgender Gleichung führt: R = -D χ C/L, worin D = Diffusionskoeffizient des Reagensmoleküls, C = Reagenskonzentration und L = Dicke der halbdurchlässigen Membran. Die Menge Q des in ein Fluidelement auf seinem Weg durch die rohrförmige Membran eintretenden Reagens kann durch folgende Gleichung bestimmt werden: Q=RxAxT, worin A = Innenflächenbereich der Membran und T = Verweilzeit eines Pluidelements auf seinem Weg durch die Membran. Wenn man diese Gleichungen an einen typischen Satz von Konstruktionsparametern einer Reaktionszelle anlegt, kann man die typische durchschnittliche Konzentration des Reagens in der Reaktionskammer bestimmen, die mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung erreichbar ist. Bei folgendem Satz von Konstruktionsparametern: L = 0,05 cm, C=I Millimol/cm ,
CO O
D=Ix 10" ^ cm /sec, A = 15,7 cm und F = 15 see wird folgender Wert für Q erzielt: 4,71 χ 10"2 Millimol. Dabei ist die in einem solchen Reaktionsgefäß entstehende durchschnittliche Konzentration ca. 60 millimolar.. Polglich eignet sich die erfindungsgemäße Vorrichtung für der Säule nachgeschaltete Reaktionen, die mit Reagenskonzentrationen in dieser Größenordnung durchführbar sind.
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Reaktionen, die eine beträchtliche Änderimg des pH-Wertes des durch das Reaktionsgefäß strömenden Fluides erfordern, sind nicht ohne weiteres durchführbar, weil hohe Pufferkonzentrationen meistens nötig sind, um eine solche Änderung hervorzurufen. Oft müssen Pufferkonzentrationen von 0,5 M oder mehr eingeführt werden, um eine angemessene pH-Änderung hervorzurufen. Solche hohen Konzentrationen liegen außerhalb des normalen Betriebsbereichs der Erfindung.
Es wird von einer völligen Auflösung des Reagens in der Kammer 25 und davon ausgegangen, daß das Reagens sich im Gleichgewicht mit dem durch die Zelle strömenden Fluid befindet, und daß das Volumen der Reagenskammer 100 cnr beträgt. Dann wurde nach ca. 5 Betriebsstunden 50 % des Reagens aufgebraucht sein, was mindestens für mehrere Analysen angemessen wäre. Die Betriebszeit kann durch Vergrößern des Volumens der Reagenskammer direkt erhöht werden.
Obwohl die durchschnittliche Reagenskonzentration innerhalb des rohrförmigen Reaktionsgefäßes im Verlauf der Zeit allmählich abnimmt, wird die Menge des erzeugten Produktes solange nicht beeinträchtigt, wie die Reaktion ihre Vervollständigung erreicht. Das macht es nötig, daß mindestens eine stöchiometrische Menge des Reagens vorhanden ist. Für Reaktionen, die keine vollständige Umwandlung der Analysesubstanz erreichen, kann die Menge des gebildeten Produkts immer noch nahezu konstant sein, vorausgesetzt daß die Reagenskonzentration ein Mehrfaches des stöchiometrischen Erfordernisses ausmacht. Das läßt sich ohne weiteres vom Gesetz der Massewirkung ableiten. Da meistens die Konzentrationen der Analysesubstanz im mikromolaren Bereich liegen, wenn diese aus der Chromatographiesäule eluiert werden, sind Reagenskonzentrationen im millimolaren Bereich im allgemeinen ausreichend zur Erfüllung des Massewirkungserfordernisses für ein reproduzierbares Ansprechverhalten.
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Für Reaktionen, die eine ziemlich konstante Reagenskonzentration erfordern, muß ein anderer Gesichtspunktder Erfindung genutzt werden. Ein gleichbleibender Durchsatz an Reagenszufuhr in den Innenraum, der Membran erfordert eine gleichbleibende Reagenskonzentration in der äußeren Umgebung, d.h. in der Kammer 25. Das läßt sich dadurch erreichen, daß eine gesättigte Lösung des Reagens benutzt wird, die mit dem ELuat in dynamischem Gleichgewicht steht. Unter der Voraussetzung, daß das ungelöste Reagens in der Kammer im Verhältnis zum Diffusionsdurchsatz rasch aufgelöst wird, bleibt die Reagenslösung in der Kammer 25 gesättigt. Dieser Gesichtspunkt der Erfindung ist auch in jenen Anwendungsfällen wichtig, in denen das Reagens einen signifikanten Beitrag zur Basislinienversetzung des Nachweisgeräts liefert. Eine gleichbleibende Basislinie hängt also davon ab, daß eine gleichbleibende Reagenskonzentration das Nachweisgerät erreicht.
Den Bemühungen, durch Vergrößern der Oberfläche der Membran oder Verlängern der Verweilzeit des Abflusses in der Reaktionszelle, den maximalen Reagensfluß zu erreichen, sind chromatographisch Grenzen gesetzt. Wenn nämlich die chromatographisch getrennten Bänder durch die Zelle bewegt werden, neigen sie zur Verschmelzung. Diese Erscheinung wird als "Bandverbreiterung" bezeichnet und ist zum Radius des Rohres direkt proportional und proportional zur Quadratwurzel der Länge des Rohres. Da der Radius des Rohres bei den meisten Ausführungsbeispielen auf weniger als 0,03 cm begrenzt ist, ist der maximale Oberflächenbereich der Membran entsprechend eingeschränkt. Der Oberflächenbereich kann bei minimaler-Bandverbreiterung dadurch vergrößert werden, daß die Länge des Rohres vergrößert wird. In der Praxis sind die Längen durch die Konstruktion des Reaktionsgefäßes auf weniger als ca. 15 m (50 Fuß) begrenzt. Für die üblichen Durchsätze an mobiler Phase und Reagensströmung beträgt die Verweilzeit im Reaktionsgefäß typischerweise weniger als 120 Sekunden und liegt meistens im Bereich von 20 bis 50 Sekunden. Mit dieser Vorrichtung kann also bei normalem Betrieb nicht erwartet
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werden, daß die erreichbare durchschnittliche Konzentration über 250 millimolar liegt. Praktisch werden die Werte etwas niedriger sein, da die Membran der Diffusion einen gewissen Widerstand entgegensetzt.
Da die Membran für kleine Reagensmoleküle durchlässig ist, ist sie auch für kleine Analysesubstanzen durchlässig, die durch die rohrförmige Membran geleitet werden. Auch diese Diffusion kann anhand des Pick'sehen Gesetzes eingeschätzt werden, wenn davon ausgegangen wird, daß der Dauerzustand erreicht ist und daß die Diffusion überall radial ist, so daß folgende Gleichung angewendet werden kann: Q = -ZTj χ D χ T χ C/log(b/a), wobei b = Außenradius und a = Innenradius des Rohres, während die anderen Parameter der vorstehend gegebenen Definition entsprechen. Ausgehend von den gleichen typischen Parameterwerten wie zuvor, außer daß C = 10 Nanomol/cnr und b/a = 2 erhält man als Wert für Q = -313 χ 10**·^ Nanomol/cm. Wenn die Bandbreite einer Spitze auf dem Weg durch die rohrförmige Membran mit 10 cm in axialer Richtung angenommen wird, ergibt sich ein ca. k #iger Verlust an Analysesubstanz unter der Annahme, daß eine gleichbleibende Diffusion in einer einzigen Richtung erfolgt. Da die Analysesubstanz aber auch in die fließende Strömung zurückdiffundiert, beträgt der Verlust an Analysesubstanζ ungefähr 2 % unter Bedingungen, bei denen die Reagenskonzentration ca. 60 millimolar ist. Wenn die Bedingungen so gewählt werden, daß die Konzentration des diffundierenden Reagens auf 10 millimolar herabgesetzt wird, beträgt der Verlust an Analysesubstanz ca. 0,3 #» was viel eher annehmbar ist. Ist die Molekülgröße der Analysesubstanz wesentlich größer als die Molekülgröße des Reagens, so wird vorzugsweise eine Membran gewählt, die gegenüber der Analysesubstanz im wesentlichen undurchlässig ist.
In Pig. 3 ist ein Ausführungsbeispiel der Erfindung gezeigt, bei dem das Reagens verdrängbar an eine unlösliche Matrix ge-
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bunden ist, z.B. eine Ionenart, die an ein. Ionenaustauschharz gebunden ist. Dies Ausführungsbeispiel eignet sich zum Entionisieren der aus einer Ionenchromatographiesäule ausströmenden Flüssigkeit. Die in Fig. 3 gezeigte Reaktionszelle weist ein Gefäß 36 auf, welches an einem Ende eine abnehmbare Stirnkappe 37 hat. Durch das Innere des Gefäßes erstreckt sich in axialer Richtung eine schlauch- bzw. rohrförmige, halbdurchlässige Membran 38, die den Innenraum in zwei Kammern 42, 43 unterteilt wie bei dem Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 2. Die Kammer 42 wird vom Innenraum der Membran definiert und bildet einen Strömungsweg für die aus der Säule ausströmende Flüssigkeit. Die Kammer 43 ist mit einem Ionenaustauschharz 44 (als jMatrix) gefüllt, welches ohne weiteres Wasserstoff ionen (Reagens) gegen Natrium oder andere Kationen austauschen kann. Das Harz kann entweder als Suspension oder als trockenes FiI-trat vorgesehen sein. Die Harzkammer kann zum Nachfüllen mit frischem Harz dadurch geöffnet werden, daß ein Ansatzstück 45, welches das Harz in seiner Lage hält, vom Ende des Gefäßes abgeschraubt wird. Bei dieser Ausführungsform ist keine Nachfüll-Öffnung für das Reagens nötig.
Im Betrieb wird das Harz entweder durch Einfüllen eines Fluids in die Kammer 43 oder durch Diffusion einer mobilen Phase in die Kammer 43 suspendiert. Kationen aus dem Eluat diffundieren durch die halbdurchlässige Membran und verdrängen Protonen aus dem Harz. Die verdrängten Protonen diffundieren aus der Kammer 43 in die Kammer 42 und fördern die Assoziierung schwacher Säuren oder Basen in der mobilen Phase zu nichtleitfähigen chemischen Arten, d.h. sie erniedrigen die Hintergrundkonduktanz der mobilen Phase. Ein Anionenaustausch (Analysesubstanzaustausch) kann durch Donnan-Ausschluß verhindert werden, indem ein Ionenaustauschharz von gleicher Ladung wie das Anion benutzt wird.
Nachfolgend werden einige Beispiele von der Säule nachgeschalteten Reaktionen beschrieben, die mit der Erfindung durch-
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geführt werden können. Diese Beispiele sollen allerdings die Erfindung in keiner Weise einschränken.
1. Der Säule nachgeschaltete Indikatorreaktionen
Wenn saure oder basische Zusammensetzungen, in einer ungepufferten oder schwach gepufferten Lösung aus einer Säule eluiert werden, wird der örtliche pH-Wert durch das Vorhandensein des sauren oder basischen Gelösten stark geändert. So können Kartionsäuren ohne weiteres durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie getrennt werden. Der herkömmliche Ultraviolettnachweis ist nicht sehr empfindlich wegen der schwachen molaren Absorptionsfähigkeit dieser Verbindungen. Ein der Säule nachgeschalteter Nachweis mit Hilfe eines pH-Indikators kann durch Zusatz einer schwachen Konzentration eines Indikatorfarbstoffs mit einer der Säule nachgeschalteten Reagenspumpe durchgeführt werden. Gemäß der Erfindung könnte ein solcher Indikator ohne weiteres auf dem Wege der Diffusion durch die halbdurchlässige Membran eingeführt werden, wie vorstehend beschrieben.
2. Farbstoffbindende Reaktionen
Proteine sind große Polymere von Aminosäuren, die im allgemeinen ein Molekulargewicht von mehr als 10 000 haben. Es gibt halbdurchlässige Membranen, die das Ausströmen von Proteinen einschränken, aber die freie Diffusion kleiner Moleküle erlauben. Folglich gingen erfindungsgemäß keine Proteine verloren, aber ein Reagens könnte ohne weiteres zugefügt werden. Eine analytisch nützliche Eigenschaft von Proteinen besteht in deren Fähigkeit, Farbstoffe selektiv zu binden. Durch diese Komplexbildung wird das Absorptionsspektrum des Farbstoffs geändert, und sie kann zum Quantifizieren der vorhandenen Menge an Protein benutzt werden. Einige Farbstoffe lassen sich nur an eine sehr beschränkte Anzahl von Proteinen binden. Bromkresolgrün ist ein Beispiel für einen Farbstoff, der selektiv
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an Serumaltiumin aber nicht an andere Proteine zu binden ist. Dies Reagens könnte ohne weiteres der aus der Säule ausströmenden Flüssigkeit gemäß der Erfindung hinzugefügt werden. Andere Farbstoffe lassen sich an eine große Vielfalt von Proteinen binden und können zum Quantifizieren vieler Proteine benutzt werden. So1 wird Coomassieblau zur Bestimmung von Proteinkonzentrationen in chargenweisen Untersuchungen benutzt. Die Reaktion erfordert, daß das Eluat angesäuert wird; aber das läßt sich mit stöchiometrischen Mengen der Säure für diese Reaktion und nicht mit großem Überschuß bewerkstelligen. Typische Pufferkonzentrationen für Proteintrennvorgänge liegen bei ca. 20 millimolar, · was innerhalb des Bereichs der Erfindung liegt. Da die meisten Farbstoffe in wäßrigen Systemen nicht ohne weiteres lösbar sind, bilden sich Niederschläge, die abgefiltert werden müssen, um Verstopfungen zu vermei4en. Die natürliche Filterwirkung der halbdurchlässigen Membran verhindert ohne weiteres, daß derartige Filtrate in das der Säule nachgeschaltete Reaktionssystem eintreten.
3. Enzymreaktionen
Enzyme sind Proteine, die chemische Umsetzungen katalysieren. Sie bewirken die Umwandlung eines oder mehrerer Substrate in ein oder mehrere Produkte, und die Geschwindigkeit dieser Umsetzung ist das Maß, welches zum Quantifizieren der Menge des vorhandenen Enzyms herangezogen wird. Einige Enzyme haben eine Anzahl von strukturell verwandten Formen, die alle als Katalysatorenfür die gleiche Reaktion wirksam sind« Sie werden als Isoenzyme bezeichnet und sind für klinische Diagnosen und genetische Verkettungen wichtig. Solche Isoenzyme können durch die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie getrennt und in einer in die Reihe eingeschlossenen, der Säule nachgeschalteten Reaktion quantifiziert werden. Die für die der Säule nachgeschaltete Reaktion verwendeten Substratkonzentrationen liegen normalerweise unter 100 millimolar. Die Substrate sind auch unstabil und müssen häufig in Pulverform gelagert werden, und das Reagens.muß täglich frisch zubereitet werden.
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33U649
Mit der Erfindung werden sowohl die Speicher- als auch die Substratanforderungen für Enzymuntersuchungen im Anschluß an die Säule erfüllt. Die Anwendung der Erfindung macht den Nachweis der Enzyme in einer an die Säule angeschlossenen Reaktion zweckmäßiger, da erfindungsgemäß keine der Säule nachgeschaltete Reagenspumpe bzw. -pumpen nötig sind und das Reagens nicht umständlich vorbereitet werden muß.
k. Entionisierung
Die Entionisierung des Eluats ' der Säule ist besonders wichtig bei der Ionenchromatographie, bei der in der chromatographischen Säule getrennte Probenionen vor dem Hintergrund aus Ionen der mobilen Phase gemessen werden müssen. Die Gegenionen der mobilen Phase sind typischerweise schwache Säuren oder Basen, deren Assoziierung zu einer nichtionisierten Form durch eine Änderung des pH-Wertes gefördert werden kann. Das kann mit einer Säule erreicht werden, die mit einem Ionenaustauschharz als Füllkörper versehen ist, welches ohne weiteres Protonen gegen Natrium oder andere Kationen austauscht. Die Protonen fördern die Assoziierung schwacher Säuren zu nichtleitfähigen Arten und verringern damit den untergrund. Angesichts des Donnan-AusSchlüsses kann das Harz an der anderen Seite einer halbdurchlässigen Membran angeordnet werden. Die Gegenkationen diffundieren frei durch die Membran und verdrängen an das Harz gebundene Wasserstoffionen. Die hier interessierenden Probenanionen, z.B. Chlorid oder Nitrat haben wegen der festgelegten negativen Ladung des Harzes nicht die Tendenz, in die Harzkammer zu diffundieren. So kann für die Ionenchromatographie das zweckmäßige Ionenaustauschharz einfach in der Reagenskammer angeordnet werden. Durch Anwendung der Erfindung wird der direkte Kontakt zwischen der Probe und dem Ionenaustauschharz vermieden.
Bei vielen der Säule nachgeschalteten Reaktionen spielt die Temperatur und die Temperatursteuerung eine wichtige Rolle, obwohl das in Fig. 2 und 3 nicht gezeigt ist. Mit der Temperatur
steigt die Reaktionsgeschwindigkeit und damit die Menge des während der Verweilzeit im Reaktionsgefäß geschaffenen Produkts. Die Temperatur steigert aber nicht nur die Reaktionsgeschwindigkeit sondern senkt außerdem die Viskosität und fördert damit den Diffusionsbeiwert und verbessert das Vermischen. Folglich ist ein Anheben der Temperatur das einfachste Mittel, um die Leistung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zu verbessern. Für eine gleichbleibende Leistung sollte jedoch auch die Temperatur gleichbleibend gehalten werden. Ein geregeltes Bad kann für die genaue Steuerung der Temperatur benutzt werden.
Sobald die Reaktion beendet ist, fließt die ausströmende Flüssigkeit aus der Reaktionszelle in das Nachweisgerät.-Die Art des Nachweisgerätes hängt von der Art des Produktes der der Säule nachgeschalteten Reaktion oder der Art der Analysesubstanz ab. Die meisten Produkte können mit einem photometrischen Detektor, der entweder durch Absorption, Fluoreszenz oder Lumineszenz arbeitet, angemessen nachgewiesen werden. Elektroaktive Produkte können am besten mit einem elektrochemischen Nachweisgerät festgestellt werden. Wenn die Erfindung bei der Ionenchromatographie angewandt wird, wird meistens ein Leitfähigkeits-Detektor benutzt, obwohl in einigen Anwendungsfällen auch ein Brechzahl-Detektor verwendet werden könnte.
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Claims (1)

  1. Verfahren und Vorrichtung zum Peststellen einer Analysesubstanz im Eluat einer Flüssigkeitssäulenchromatographieanlage
    Priorität: 22. Dezember I982 - USA- Serial No. 452 O88
    Patentansprüche
    f 1^) Vorrichtung zum Untersuchen des Eluats einer
    Flüssigkeitschromatographiesäule auf das Vorhandensein einer
    Analysesubstanz,
    ge" kennzeichne t durch
    a) ein Reaktionsgefäß, dessen Inneres durch eine rohrförmige, halbdurchlässige Membran, die das Innere des Gefäßes durchquert, in eine erste Kammer und eine davon getrennte zweite Kammer unterteilt ist, von denen die erste Kammer durch den Innenraum der Membran bestimmt ist und einen Durchlaß für die Strömung des Eluats durch das Gefäß bildet, und die zweite Kammer von dem Raum zwischen der Membran und der Wand des Gefäßes bestimmt ist, und
    b) ein Reagens, welches in der zweiten Kammer enthalten ist und mit der Analysesubstanz zu einem nachweisbaren Reaktionsprodukt umsetzbar ist und welches, in gelöstem Zustand, durch die halbdurchlässige Membran in die erste Kammer diffundiert und darin
    O c> H <4 Ό
    mit einer "beliebigen Analyse subs tanz in dem durch das Gefäß fließenden Eluat unter Bildung des nachweisbaren Produktes reagiert.
    2. Vorrichtung nach Anspruch 1,
    dadurch gekennzeichnet , daß die Membran gegenüber der Analysesubstanz im wesentlichen undurchdringlich
    3. Vorrichtung nach Anspruch 1#
    dadurch gekennzeichnet , daß das in der zweiten Kammer enthaltene Reagens in Form eines Feststoffs vorgesehen ist, der in der mobilen Phase des Eluats lösbar ist.
    h. Vorrichtung nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet , daß die Auflösungsgeschwindigkeit des Reagens in der mobilen Phase im Vergleich zur Diffusionsgeschwindigkeit des Reagens durch die Membran schnell ist.
    5. Vorrichtung nach Anspruch 1,
    dadurch gekennzeichnet , daß das in der zweiten Kammer enthaltene Reagens verdrängbar an eine nichtlösbare Matrix gebunden ist.
    6. Vorrichtung nach Anspruch 1,
    dadurch gekennzeichnet , daß das in der zweiten Kammer enthaltene Reagens sowohl in gelöster als auch in ungelöster Form vorliegt und eine gesättigte Lösung bildet, die in dynamischem Gleichgewicht mit dem durch den Innenraum strömenden Eluat steht.
    7. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß
    1. die Analysesubstanz eine Karbonsäure ist und das Reagens ein
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    Farbstoffindikatorj oder
    2. die Analysesubstanz ein Protein ist und das Reagens ein Farbstoff, der sich an das Protein bindetf oder
    3. die Analysesubstanz: ein Enzym ist und das Reagens ein Substrat, auf das das Enzym einwirkt.
    8, Verfahren zum Feststellen einer Analysesubstanz im Eluat einer Flüssigkeitschromatographiesäule, dadurch gekennzeichnet , daß
    a) ein Reaktionsgefäß vorgesehen wird, dessen Inneres durch eine rohrförmige, halbdurchlässige Membran, welche das innere des Gefäßes durchquert, in eine erste Kammer und eine davon getrennte zweite Kammer unterteilt ist, von denen die erste Kammer durch den Innenraum der Membran bestimmt ist und einen Durchlaß für die Strömung des Eluats durch das Gefäß bildet, und die zweite Kammer durch den Raum zwischen der Membran und der Wand des Gefäßes definiert ist, und
    b) eine Lösung aus einem Reagens in der zweiten Kammer in Berührung mit der halbdurchlässigen Membran gebildet wird, wobei das Reagens geeignet ist, durch die halbdurchlässige Membran, zu diffundieren und mit der Analysesubstanz unter Bildung eines nachweisbaren Reaktionsproduktes zu reagieren,
    c) daß .das Eluat durch die erste Kammer in Berührung mit der halbdurchlässigen Membran hindurchgeleitet wird, wodurch das Reagens durch die Membran in die erste Kammer diffundiert und mit einer Analyse subs tanz in dem Eluat unterBildung ^es nachweisbaren Reaktionsproduktes reagiert, und
    d) daß das nachweisbare Reaktionsprodukt festgestellt wird.
    9. Verfahren nach Anspruch 8,
    dadurch gekennzeichnet , daß die Lösung des Reagens von der mobilen Phase des Eluats gebildet wird, die durch die Membran in die zweite Kammer diffundiert und das Reagens auflöst.
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    10. Verfahren nach Anspruch 9»
    dadurch gekennzeichnet , daß die Auflösungsgeschwindigkeit des Reagens im Vergleich zur Diffusionsgeschwindigkeit des Reagens durch die Membran schnell ist.
    11. Verfahren nach Anspruch 8,
    dadurch gekennzeichnet , daß das Reagens eine Ionenart ist, die verdrängbar an ein Ionenaustauschmaterial gebunden ist.
    12. Verfahren nach Anspruch 8,
    dadurch gekennzeichnet , daß
    1. die Analysesubstanz eine Karbonsäure ist und das Reagens ein Farbstoffindikator; oder
    2. die Analysesubstanζ ein Protein ist und das Reagens ein Farbstoff, der sich an das Protein bindetf oder
    3. die Analysesubstanz ein Enzym ist und das Reagens ein Substrat, auf das das Enzym einwirkt.
    13. VorrichtTmg zum Eliminieren oder Reduzieren der Menge eines Bestandteils in einem Eluat einer Flüsssigkeitschromatographiesäule, .welcher die Wahrnehmung des Vorhandenseins einer Analysesubstanz in dem Eluat stört, gekennzeichnet durch
    a) ein Reaktionsgefäß, dessen Inneres durch eine rohrförmige, halbdurchlässige Membran, die das Innere des Gefäßes durchquert, in eine erste Kammer und eine davon getrennte zweite Kammer unterteilt ist, von denen die erste Kammer durch den Innenraum der Membran bestimmt ist und einen Durchlaß für die Strömung des Eluats durch das Gefäß bildet, und die zweite Kammer von dem Raum zwischen der Membran und der Wand des Gefäßes bestimmt ist, und
    b) ein Reagens, welches in der zweiten Kammer enthalten ist und mit dem Bestandteil umsetzbar ist, um dadurch den Bestandteil in ein nichtstörendes Produkt umzuwandeln, und welches, in ge-
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    löstera Zustand, durch die haitidurchlässige Membran in die erste Kammer diffundiert und darin mit dem Bestandteil reagiert.
    14. Vorrichtung nach Anspruch IJ9
    dadurch gekennzeichnet , daß das Reagens eine Ionenart ist, die verdrängbar an ein Ionenaustauschharz gebunden ist,
    15. Verfahren zum Eliminieren oder Reduzieren der Menge eines Bestandteils der mobilen Phase in einem Eluat aus einer Flüssigkeitschromatographiesäule, welcher die Wahrnehmung des Vorhandenseins einer Analysesubstanz in dem Eluat stört, dadurch gekennzeichnet , daß
    a) ein Reaktionsgefäß geschaffen wird, dessen Inneres durch eine rohrförmige, halbdurchlässige Membran, die das Innere des Gefäßes durchquert, in eine erste Kammer und eine davon getrennte zweite Kammer unterteilt ist, von denen die erste Kammer durch den Innenraum der Membran bestimmt ist und einen Durchlaß für die Strömung des Abflusses durch das Gefäß bildet und die zweite Kammer von dem Raum zwischen der Membran und der Wand des Gefäßes bestimmt ist, und
    b) eine Lösung eines Reagens in der zweiten Kammer in Berührung mit der halbdurchlässigen Membran gebildet wird, wobei das Reagens geeignet ist, durch die halbdurchlässige Membran zu diffundieren und mit dem Bestandteil zu reagieren, um den Bestandteil in ein nichtstörendes Reaktionsprodukt umzuwandeln, und
    c) das Eluat durch die erste Kammer in Berührung mit der halbdurchlässigen Membran hindurchgeleitet wird, wodurch das Reagens durch die Membran in die erste Kammer diffundiert und mit dem Bestandteil unter Bildung des nichts tor enden Prodiiktes reagiert.
    16. Verfahren nach Anspruch 15,
    dadurch gekennzeichnet , daß das Reagens eine
    Ionenart ist, die verdrängbar an ein Ionenaustauschmaterial gebunden ist, und daß die Lösung von einer anderen Ionenart gebildet wird, die aus dem Eluat durch die halbdurchlässige Membran in die zweite Kammer diffundiert und die Ionenart verdrängt .
    17. Verfahren nach Anspruch 16,
    dadurch gekennzeichnet , daß das Ionenaustausehmaterial und die Analysesubstanζ gleiche Ladungen haben, wodurch die Diffusion der Analysesubstanz in die zweite Kammer durch Donnan-AusSchluß verhindert wird.
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DE19833344649 1982-12-22 1983-12-09 Verfahren und vorrichtung zum feststellen einer analysesubstanz im eluat einer fluessigkeitssaeulenchromatographieanlage Withdrawn DE3344649A1 (de)

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