DE3211963A1 - Verfahren zur bestimmung der sauren prostataphosphatase - Google Patents
Verfahren zur bestimmung der sauren prostataphosphataseInfo
- Publication number
- DE3211963A1 DE3211963A1 DE19823211963 DE3211963A DE3211963A1 DE 3211963 A1 DE3211963 A1 DE 3211963A1 DE 19823211963 DE19823211963 DE 19823211963 DE 3211963 A DE3211963 A DE 3211963A DE 3211963 A1 DE3211963 A1 DE 3211963A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- phosphoric acid
- acid
- serum
- specific
- substrate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Ceased
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 20
- 239000002253 acid Substances 0.000 title claims description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 16
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 7
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 5
- -1 - cyclohexylammonium Chemical class 0.000 claims description 4
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 3
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 claims description 3
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 claims description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 3
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 3
- UXFQFBNBSPQBJW-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-methylpropane-1,3-diol Chemical class OCC(N)(C)CO UXFQFBNBSPQBJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical class [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical class C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical class [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000011591 potassium Chemical class 0.000 claims description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 11
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims 6
- KJFMBFZCATUALV-UHFFFAOYSA-N phenolphthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2C(=O)O1 KJFMBFZCATUALV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- IOAOAKDONABGPZ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-ethylpropane-1,3-diol Chemical class CCC(N)(CO)CO IOAOAKDONABGPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- LDKDGDIWEUUXSH-UHFFFAOYSA-N Thymophthalein Chemical compound C1=C(O)C(C(C)C)=CC(C2(C3=CC=CC=C3C(=O)O2)C=2C(=CC(O)=C(C(C)C)C=2)C)=C1C LDKDGDIWEUUXSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerol Substances OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- CMPQUABWPXYYSH-UHFFFAOYSA-N phenyl phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=CC=C1 CMPQUABWPXYYSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 15
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 15
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 4
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- RSSDWSPWORHGIE-UHFFFAOYSA-N $l^{1}-phosphanylbenzene Chemical compound [P]C1=CC=CC=C1 RSSDWSPWORHGIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CQTZJAKSNDFPOB-UHFFFAOYSA-N 2-naphthyl dihydrogen phosphate Chemical compound C1=CC=CC2=CC(OP(O)(=O)O)=CC=C21 CQTZJAKSNDFPOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002532 anti-gammaglobulin Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 231100000206 health hazard Toxicity 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000002559 palpation Methods 0.000 description 1
- 150000003014 phosphoric acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 210000003708 urethra Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
- C12Q2334/10—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases p-Nitrophenol derivatives
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Beschreibung
Verfahren zur Bestimmung der sauren Prostataphosphatase
Die Erfindung betrifft ein Verfahren, das geeignet . ist, zur immunochemischen Bestimmung der sauren
Prostataphosphatase sowie ein Mittel zur Durchführung des Verfahrens.
Es ist bekannt, daß die sauren Phosphata'sen zellulare
Enzyme sind, die im gesinnten Organismus vorkommen
und die imstande sind, die Hydrolyse von Phosphorsäureestern in saurer Umgebung hervorzurufen.
'Die saure Prostataphosphatase (APP) ist ein spezifisches
Isoenzym, das gegenüber den Phosphatasen, die in anderen Geweben vorkommen, antigen unterschieden
werden kann. Sie tritt bei Prostatakrebs im Blutstrom auf. Diese Tumorart bleibt über lange Zeit
asymptotisch und ist häufig an der hinteren Kapselwand (rear lobe) von der Harnröhre entfernt lokalisiert,
/2
1Λ-5)5 709
Die klinischen Stadien des Krebses sind im wesentlichen vier:
1. Ein in der Prostatadrüse eingeschlossener Tumor, der
durch Palpation nicht nachgewiesen werden kann;
2. Ein noch in der Prostatakapsel eingeschlossener Tumor, der jedoch proktoskopisch nachgewiesen
werden kann;
3. Ein Tumor, der sich lokal ausdehnt mit einer Rückdrängung
(involution) der umgebenden Lymphknoten;
k. Ein metastasierender Tumor.
Die Aktivität der sauren Phosphatasen kann jedoch auch
durch andere Syndrome verstärkt werden, was dazu führt, daß eine frühe Diagnose nur erreicht v/erden kann,
wenn auf ein analytisches Verfahren zurückgegriffen wird, das sowohl empfindlich als auch spezifisch
ist.
Es ist bekannt, daß bei einem Karzinom„unabhängig davon
wie und wo es lokalisiert ist(nur eine rechtzeitige Be-
2V) handlung geeignet ist, um eien guten Behandlungs erfolg
v.w or X-I. öl on: Eine solche Behandlung kann im Falle eines
Proctatakarzinoms nur in den ersten Stadien des Tumorwachstums durchgeführt v/erden, wenn der Gehalt an sauren
Phosphatasen im Blutserum noch sehr gering ist.
Die Bestimmung der Aktivität der APP kann direkt durchgeführt werden unter Anwendung mehr oder weniger spezifischer
Substrate oder auch indirekt durch Anwendung eines APP-Inhibitors, wie Weinsäure. Im letzteren Falle
/3
• *
1A-55 789 -/- .
wird der Anteil der Enzymaktivität, der der APP zuzuschreiben ist, berechnet durch Bildung der Differenz
zwischen der Gesamtaktivität und der Restaktivität in
Gegenwart von V7einsäure. Die Anwendung dieser zuletzt genannten Verbindung als Inhibitor für das Prostataisoenzym
führt jedoch nicht zu der erforderlichen Spezifität bezüglich der Dosis, da auch andere anteilig
vorhandene saure Phosphatasen anderen Ursprungs gehemmt werden, wie insbesondere dio aus Blutplättchen,
Leber und Nieren stammenden Phospha.asen.
Die Anwendung spezieller Antisera i ;t in jüngster Zeit
angegeben worden zur immunochemischon Bestimmung von APP, wodurch es möglich wird, das phostatische Isoenzym
aus dem Blutserum abzutrennen, in dem auch andere Arten von Phosphatasen enthalten sind. Verfahren, wie
die gegenläufige Immunoelektrophorese und radioimmunologische Bestimmungen beruhen auf einem derartigen
grundlegenden immunochemischen Prinzip.
Die Gegenstromimmunoelektorphorese ist ein Verfahren,
das sowohl vergleichsweise einfach als auch spezifisch ist, das jedoch keine quantitativen Aussagen möglich
macht.
Radioimmunologische Bestimmungen erlauben eine quantitative Bestimmung. Es gibt jedoch Faktoren, die
ihre praktische Anwendung begrenzen, wie die Kosten der Reagenzien, die Gesundheitsgefährdung, die von
Radioisotopen ausgeht, die Instabilität der markierten Enzyme und die Notwendigkeit, übereinstimmende Mengen
an menschlicher, saurer Prostataphosphatase zu verwenden, die gleichmäßig rein sein muß,· um die Diagnoseeinheiten
herzustellen.
1A-55 769
Erfindungsgemäß wurde nun ein Verfahren entwickelt, mit dessen Hilfe es möglich wird, eine quantitative Analyse
der sauren Prostataphosphatase auf einfache Weise mit hoher Empfindlichkeit und hoher Genauigkeit und
einer zufriedenstellenden Spezifität durchzuführen. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren sind keine Inhibitoren
erforderlich und es führt zu dem weiteren Vorteil, daß die saure Prostataphosphatase bestimmt wird,
nachdem sie von inaktivierenden Bestandteilen, die in dem Blutserum enthalten sein können, abgetrennt
worden ist (P. Vihko, Clin. Chem. 24, 1783 (1979) ).
Außerdem brauchen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren keine teuren und unbeständigen radioaktiven Markierungssubstanzen angewandt zu werden, noch ist es erforderlich
gleichmäßige Mengen an reinem Enzym vorher herzustellen, um das markierte Enzym zu erhalten, das erforderlich ist,
um eine radioinimunologische quantitavie Bestimmung durchzuführen.
Das erf indungsgemäf: e Verfahren zur Bestimmung von
APP umfaßt die Zugf be eines spezifischen Antiserums zu der zu untersuchenden Probe eines Antigammaglobulinserums
der gleicher1 Tierart, die zu Bildung des spezifischen Antiserums angewandt wird (diese Seren können
in einer entsprechenden Pufferlösung verdünnt werden),
Zentrifugieren der so erhaltenen Suspension und schließlich Messung der Enzymaktivität des Restes nach Zugabe
einer Lösung eines entsprechenden Substrats.
Die Bestimmung der Enzymaktivität in den Rückstand der
Zentrifugation kann durchgeführt werden, da das APP-Enzym seine Aktivität beibehält, auch wenn es an spezifische
Antikörper gebunden int.
/5
1A-55 789 "^ ?-
Als Substrat wurde das Natriumsalz von p-Nitrophenylphosphorsäure
erfolgreich angewandt. Zufriedenstellende Ergebnisse können jedoch auch erhalten werden
unter Verwendung anderer Salze dierer Säure und
das Gleiche trifft zu für die Natrium-, Kalium-, Ammonium- oder Ammoniumderivatsalze, wie die
Cyclohexylammonium-j 2-Amino-2-ethyl-1,3-propandiol-,2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol
-Salze oder die Salze anderer Kationen von Phenylphosphor-, ß-Glycerinphosphor- ,^-Naphtylphosphor-,Phenolphthaleinphosphor-jThymolphthaleinphosphor-,t( -Naphthyl-AS-B!phosphor
und ß-Naphthylphosphorsäure.
Das Verfahren, das die Bestimmung der APP-Aktivität erlaubt, kann mit Vorteil durchgeführt werden,
durch Anwendung des erfindungsgemäßen Mittels,
bestehend aus einem Reagenz zur Durchführung einer Blindprobe, einem spezifischen Serum (oder einer
entsprechenden Antikörperfraktion), einem Antigammaglobulinserumzu
dergleichen Tierart, die angewandt worden ist zur Bildung des Anti-APP-Seruins
(diese Reagenzien können in entsprechender Pufferlösung verdünnt sein) und einem Substrat-Puffer-System,
das geeignet ist zur Bestimmung der Enzymaktivität .
Das Reaktionsmedium kann einen geeigneten Zusatz enthalten, z. B. um eine maximale Ausfällung des
Immunkomplexes mit einer gleichzeitigen minimalen Wirkung auf die anderen freien Phosphate zu erhalten,
z. B. kann das Medium ein Polyethylenglykol. enthalten.
Als Alternative kann die gleiche Wirkung erreicht
/6
1A-55 789
werden durch Einhaltung eines pH-Wertes im Bereich
von 4,8 bis 5,6.
Wie oben angegeben,ist es mit Hilfe eines solchen Mittels möglich, ein spezifisches Verfahren durchzuführen,
das eine beachtliche Empfindlichkeit besitzt sowie eine schnelle und einfache Durchführung
ermöglicht und das dadurch wesentlich besser ist als die bekannten immunochemischen Verfahren.
Alle diese Merkmale und \veitere Einzelheiten zum Verständnis und zur praktischen Ausführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens gehen aus dem folgenden Beispiel hervor, in dem auch eine besonders günstige
Zusammensetzung eines erfindungsgemäßen Mittels angegeben ist.
0,2 ml der zu untersuchenden Probe in Form von frischem menschlichem Blutserum, das mit Essigsäure auf einen
pH-Wert von ungefähr 6 angesäuert ist, werden zu 0,1 ml
spezifischem Anti-APP-Serum, z. Bo von Kaninchen, zugegeben,
das entsprechend verdünnt ist und getrennt werden 0,1 ml normales Kaninchenserum entsprechend verdünnt
in Reagenzgläser (vorzugsweise 5-ml Reagenzgläser) gegeben.
Es können Kunststoffreagenzröhrchen verwendet
werden, vorausgesetzt daß in ihnen keine Adsorption eintritt.
Die Verdünnungen der Sera, die als Reagenzien angewendet v/erden, v/erden für die jeweiligen Proben durch
Vorversuche (trial and error) optimiert.
In dem Beispiel werden die folgenden Reagenzien ange-
/7
1Ä-55 789
wandt:
wandt:
Spezifisches Anti-APP-Serum (Charge CP 101),
Verdünnung 1 : 100, mit einer 0,1 m Glycin und 0,5 % Rinders e'rumalbuminlö sung mit pH 7»2;
normales Kaninchenserum (Charge FB 201), Verdünnung 1 : 75, mit der gleichen Lösung wie
oben;
10
10
Anti-J'-globulinkaninchenserum von Ziegen (Charge
MB 25), Verdünnung 1 : 15, mit 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, NaCl 0,15 m, mit Polyethylenglykol
unter optimierten Konzentrationsbedingungen;
Das Reagenzröhrchen, enthaltend das spezifische Anti-APP-Serum,
ist die Testprobe, während das Reagenzröhrchen, enthalten!das normale Kaninchenserum, die
Blindprobe-ist. Nach einer entsprechenden Inkubationszeit
(4 0C), die zwischen 5 Minuten bis zu 24 Stunden liegen kann, wird in jedes Reagenzröhrchen 1 ml
Antikaninchen-J-globulin von Ziegen oder einem anderen
entsprechend immunisierten Tier, verdünnt mit 10 mM Phosphatpuffer, pH 7, 0,15 m NaCl gegeben. Polyethylenglykol
(6 000) wird in einer optimalen Konzentration in der Pufferlösung gelöst, um die maximale Ausfällung
des Immunkomplexes zu erreichen, jedoch mit einer minimalen Beeinflussung der anderen freien
Phosphate.
Unter den so eingestellten Bedingungen kann die Konzentration an Polyethylenglykol in dem Pufferverdünnungsmittel
von 0,5 bis 4 % betragen, wobei 1,5 % bevorzugt sind.
/8
1A-55 789
Die gleiche Wirkung kann erreicht werden durch Verdünnen des Kaninchenanti-jf-globulinserums mit 50 mM
Citratpuffer mit einem pH-Wert im Bereich von 4,8
bis 5,6, wobei der bevorzugte Wert 5,3 beträgt.
Nach einer entsprechenden Inkubationszeit bei 4 0C
(5 Minuten bis zu 24 Stunden, vorzugsweise 30 Minuten)
wird das Gemisch zentrifugiert ζ. Β. 15 Minuten mit 1 500 g, um den Immunkomplex von der überstehenden
Flüssigkeit abzutrennen, die verworfen wird.
Der Niederschlag wird in ein thermostatisch geregeltes
Wasserbad (37 °C) gegeben und mit einer Lösung des Substrats in einem entsprechenden Puffer aufgeschlämmt.
Es kann irgendein Substrat angewandt werden, vorausgesetzt daß es durch die sauren Phosphatasen hydrolysiert
werden kann, da das Prostataisoenzym imrnunologisch abgetrennt .-/orden ist. Nach einer solchen
Zeit, wie sie erfor lerlich erscheint;, um eine ausreichende
Entwicklung von Substanzen, die entweder mit Hilfe einer ans fließenden chemischen Reaktion
oder aufgrund ihrer homogenen Eigenschaften direkt bestimmt v/erden können,. aus dem Substrat zu erreichen,
wird die Reaktion durch eine alkalische Lösung abgebrochen.
Z. B. kann die Bestimmung der Aktivität unter Ver-Wendung
des Natrimsalzes von p-Nitrophenylphosphat,
wie später näher erläutert, durchgeführt v/erden.
Zu den Reagenzröhrchen, die den durch Zentrifugieren
der Testprobe und cer Blindprobe erhaltenen Nieder-
/9
1A-55 789 ' Sf--
schlag enthalten, -werden je 0,5 ml IJatriuinsalz von
p-Nitrophenylphosphat gelöst in 50 rM Citratpuffer
pH 5,0+0,1 in einer Konzentration von 6 mM zugegeben. Nach 30 Minuten langer Inkubat on (genaue Zeit)
bei 37 °C wird 1 ml der die Reaktion abbrechenden Lösung zugegeben, die 0,1 nNaOH Lösung ist und 26,3 mM
Na^PO/. Der Unterschied zwischen den optischen Dichten
bei 405 nm zwischen der Testprobe und der Blindprobe wird abgelesen. Dieser Unterschied lultipliziert mit
13,A4 ergibt die Enzyrnaktivität, di · dem APP zuzucchreiben
ist in mE/ral des untersuc iten Serums.
6231
Claims (6)
1.J Verfahren zur Bestimmung von saurer Prostataphosphatase,
dadurch gekennzeichnet , daß man
5 a) zu der zu untersuchenden Probe ein'spezifisches
Antiserum und ein Antiserum zu demjp-Globulin
der Tierart, die angewandt worden ist zur Herstellung des spezifischen Antiserums, zugibt;
10 b) die so erhaltene Suspension zentrifugiert;
c) 'zu dem Rückstand eine Lösung eines entsprechenden Substrats zugibt und
15 d) die Enzymaktivität mißt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man als Substrat
eine Verbindung aus der Gruppe der Salze von Natrium, 20 Kalium, Ammonium,- Cyclohexylarnmonium, 2-Amino-2-ethyl-1,3-propandiol,
2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol von
/2
1A-55 789 -2-
p-Nitropheny!phosphorsäure, Phenylphosphorsäure,
ß-Glycerinphosphorsäure, (K-Naphthylphosphorsäure,
ß-Naphthy!phosphorsäure, Phenolphthaleinphosphorsäure,
Thymolphthaleinphosphorsäure, o^-Naphthyl-AS-BI-phosphorsäuren
anwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Substrat das
Natriumsalz von p-Nitrophenylphosphorsäure verwendet. 10
l\. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß man die Stufe (a) in
Gegenwart von Polyethylenglykol durchführt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß man die Stufe (a) bei
einem pH-Wert zwischen 4,8 und 596 durchführt.
6. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet ,
daß es aus einem spezifischen Anti-APP-serum,einem
.spezifischen Anti-|"-globulinserum für die Tierart,
die zur Bildung der Anti-APP-serums angewandt worden j r.t, cinorn entspx'oc hendcn Substrat, einem Reagenz
2lj zum Abstoppen der cnzymatisehen Aktivität, einem Puffersystem
und gegebenenfalls einem Polyethylenglykol besteht.
6231
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT20826/81A IT1167728B (it) | 1981-03-31 | 1981-03-31 | Composizione adatta alla determinazione della fosfatasi acida prostatica e metodo impiegante la stessa |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE3211963A1 true DE3211963A1 (de) | 1982-10-14 |
Family
ID=11172621
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19823211963 Ceased DE3211963A1 (de) | 1981-03-31 | 1982-03-31 | Verfahren zur bestimmung der sauren prostataphosphatase |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS57189699A (de) |
| AR (1) | AR226782A1 (de) |
| DE (1) | DE3211963A1 (de) |
| ES (1) | ES511351A0 (de) |
| FR (1) | FR2503184A1 (de) |
| GB (1) | GB2095832A (de) |
| GR (1) | GR76485B (de) |
| IT (1) | IT1167728B (de) |
| PT (1) | PT74679B (de) |
| SE (1) | SE8202063L (de) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5981206A (en) * | 1992-05-20 | 1999-11-09 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostic Systems, Inc. | Dry analytical element and method for the detection of prostatic acid phosphatase |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2128670B2 (de) * | 1971-06-09 | 1977-06-30 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Immunologische isoenzym-bestimmungsmethode |
| DE2258822A1 (de) * | 1972-12-01 | 1974-06-06 | Merck Patent Gmbh | Verfahren und mittel zur analyse von isoenzymmustern |
| DE2861945D1 (en) * | 1978-01-04 | 1982-08-26 | Research Corp | Composition and a diagnostic method for the detection of prostatic cancer |
| US4267272A (en) * | 1979-11-05 | 1981-05-12 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Prostatic acid phosphatase immuno assay |
-
1981
- 1981-03-31 IT IT20826/81A patent/IT1167728B/it active
-
1982
- 1982-03-22 GB GB8208321A patent/GB2095832A/en not_active Withdrawn
- 1982-03-23 GR GR67714A patent/GR76485B/el unknown
- 1982-03-26 ES ES511351A patent/ES511351A0/es active Granted
- 1982-03-30 PT PT74679A patent/PT74679B/pt unknown
- 1982-03-30 FR FR8205452A patent/FR2503184A1/fr active Pending
- 1982-03-31 SE SE8202063A patent/SE8202063L/ not_active Application Discontinuation
- 1982-03-31 AR AR288977A patent/AR226782A1/es active
- 1982-03-31 DE DE19823211963 patent/DE3211963A1/de not_active Ceased
- 1982-03-31 JP JP57053645A patent/JPS57189699A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS57189699A (en) | 1982-11-22 |
| GB2095832A (en) | 1982-10-06 |
| SE8202063L (sv) | 1982-10-01 |
| ES8304315A1 (es) | 1983-02-16 |
| ES511351A0 (es) | 1983-02-16 |
| IT1167728B (it) | 1987-05-13 |
| PT74679B (en) | 1985-01-08 |
| FR2503184A1 (fr) | 1982-10-08 |
| AR226782A1 (es) | 1982-08-13 |
| PT74679A (en) | 1982-04-01 |
| GR76485B (de) | 1984-08-10 |
| IT8120826A0 (it) | 1981-03-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE3855714T2 (de) | Verfahren und Zusammensetzung zum Nachweis von Natrium-Ionen in Flüssigkeiten | |
| DE3249743C2 (de) | ||
| EP0133272B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung eines Partners einer Immunreaktion sowie Reagens zur Durchführung dieses Verfahrens | |
| DE2600465C3 (de) | Verfahren zur radioimmunologischen Bestimmung von Östrogenen | |
| EP0032204B1 (de) | Verfahren und Mittel zur immunologischen Bestimmung von Enzymen | |
| EP0092801B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung der Low Density Lipoproteine (LDL) und Reagenz zu seiner Durchführung | |
| DE3208253A1 (de) | Verfahren zur spezifischen bestimmung des cholesterins der ldl-fraktion im serum | |
| DE2548963B2 (de) | Verfahren und Mittel zur Bestimmung der Aktivität von Creatinkinase-MB | |
| DE2128670B2 (de) | Immunologische isoenzym-bestimmungsmethode | |
| DE69215983T2 (de) | Verfahren zur Messung der Konzentration eines Immuno-Reaktanden unter Verwendung von Elektrochemilumineszenz | |
| DE69615956T2 (de) | Methode zur Messung der Menge eines in einem spezifischen Lipoprotein enthaltenen Bestandteils | |
| DE3811083C2 (de) | ||
| DE2532779B2 (de) | Verfahren zur elektroquantitativen Bestimmung von Proteinen | |
| EP0378204B1 (de) | Verfahren zur Ablösung eines Analyten von seinem Bindeprotein | |
| DE69412940T2 (de) | Verfahren und zusammensetzung zur verminderung der effekte von endogener alkalischer phosphatase | |
| DE2653537A1 (de) | Verfahren und mittel zur bestimmung von hydroperoxiden | |
| DE3780938T2 (de) | Reagens zur bestimmung von chloridionen. | |
| DE3533671A1 (de) | Verfahren zur beschleunigung einer antigen-antikoerper-reaktion | |
| DE3211963A1 (de) | Verfahren zur bestimmung der sauren prostataphosphatase | |
| DE2906732C2 (de) | Verfahren und Reagenz zur Bestimmung der Peroxidase | |
| DE2701928A1 (de) | Radiologisches verfahren zur quantitativen bestimmung von methotrexat | |
| DE69119576T2 (de) | Verfahren zur Abtrennung, Identifizierung und Quantifizierung von Isoenzymen und Isoformen der alkalischen Phosphatase | |
| DE2718700A1 (de) | Verfahren zur gesamtbestimmung von hormonen und pharmaka | |
| DE2707913A1 (de) | Verfahren zum nachweis von rheumatoiden faktoren | |
| DE2908053C2 (de) | Verfahren und Reagenz zur Bestimmung der Creatinkinase MB |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
| 8131 | Rejection |