DE3129738A1

DE3129738A1 - "biologisch sicheres klonierungssystem aus einem nicht selbst replizierbaren vektor und einem selbst replizierenden plasmid, transformierte wirtszellen und verfahren zur herstellung des vektors und des plasmids"

Info

Publication number: DE3129738A1
Application number: DE19813129738
Authority: DE
Inventors: Klaus 6902 Sandhausen Geider; Thomas F. 6900 Heidelberg Meyer
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1981-07-28
Filing date: 1981-07-28
Publication date: 1983-02-17

Description

Durch DNA-Klonierung ist es möglich, in vitro Gene oder Teile von
Genen in einer natürlicherweise nicht vorkommenden Anordnung zu kombinieren und sie in eine lebende Wirtszelle einzuschleusen, die die Replikation dieser neu kombinierten DNA erlaubt. Die Klonierungstechnik macht einen "Gen-Transfer" zwischen Organismen möglich, die in der-Natur kein genetisches Material austauschen, so zum Beispiel die Einschleusung und stabile Erhaltung eukaryontischer DNA in einen prokaryontischen Organismus.
Die Technik der DNA-Klonierung besteht in der Kopplung eines DNA-Fragments mit einer Träger-DNA (Vektor-DNA). Diese Vektor-DNA enthält die genetische Information für ihre Replikation in einer Wirtszelle und erlaubt ebenfalls die Replikation des mit ihr gekoppelten, heterologen DNA-Fragments.
Als Klonierungsvehikel dienen kleine DNA-Moleküle, die unabhängig von der Replikation der chromosomalen DNA des Wirts replizieren, zum Beispiel bakterielle Plasmide, die DNA von Bakteriophagen oder Viren.
Die Reinigung von DNA-Sequenzen komplexer Genom, vorzugsweise von höheren Organismen, und ihre Amplifikation in der einfachen, schnell wachsenden Bakterienzelle erleichtert nicht nur das Studium der Funktion der heterologen DNA, sondern führt unter geeigneten Umständen auch zu einer Expression der Genprodukte der fremden DNA.
In diesem Zusammenhang stellt sich die Frage, inwieweit potentiell pathogene Organismen geschaffen werden, die bei unvorsichtiger Handhabung zur Ausbreitung von pathogenen Eigenschaften für andere Organismen führt. Eine Gefahr könnte dadurch entstehen, daß ein unerwünschtes Gen mitkloniert wird oder potentiell pathogene Eigenschaften mitkloniert werden. Es muß sichergestellt sein, daß die neukombinierten DNA-Moleküle nicht unkontrolliert in Organismen außerhalb des Labors übertragen werden und nicht in Mensch, Tier- oder Pflanze gelangen. Dies aber setzt yoraus, daß der Vektor selbst nicht spontan oder zufällig auf andere Zellen übertragen wird.
Möglichkeiten für einen Transfer zwischen Bakterien sind: 1. Mobilisierung von Plasmiden durch konjugativen Transfer 2. Infektion der Wirtszelle mit Bakteriophagen und anschließende Ausschleusung der rekombinierten DNA durch Phagen 3. Lyse der Wirtszelle und Aufnahme der rekombinierten DNA durch andere Bakterien.
Richtlinien zum Schutz gegen potentielle "Bio-Hazards" wurden in den USA vom National Institute of Health (NIH) ausgearbeitet. Eine Zusammenfassung der NIH-Richtlinien wurde veröffentlicht (Singer 1977).
Diese umfassen technische Einrichtungen zur Verhinderung der Ausbreitung pathogenen Materials (beschrieben von Kourilsky 1977) sowie die Bereitstellung von biologischen Klonierungssystemen mit verminderter Fähigkeit, unter Bedingungen außerhalb des Labors zu überleben.
Derzeit wird als Wirt für viele Klonierungsexperimente der Stamm E.coli K12 verwendet, der sich normalerweise im menschlichen Darm nicht vermehrt. Da er jedoch die Darmpassage überlebt, gilt er als potentieller Donor von Plasmiden und Bakteriophagen für natürlichvorkommende Darmbakterien.
Derivate von E.coli K12, z.B. X1776, zeigen eine stark verminderte Überlebensrate nach der Magen-Darm-Passage in Ratten (Maturin und Curtiss III, 1977) und werden daher als "sichere" Wirte angesehen.
Was die Plasmid-Vektoren betrifft, so sollten für die Klonierung fremder DNA nur Plasmide verwendet werden, die sich nacht selbst urc Konjugation auf andere Bakterien übertragen können. Selbst wenn die Plasmide nicht konjugativ sind, wie das E.coli Plasmid ColE1, so besteht die Möglichkeit der Übertragung in andere Bakterien durch in der Wirtszelle ebenfalls vorhandene konjugative Plasmide (konjugative Mobilisierung). Derivate von ColE1, wie das Plasmid pVH51 (Hershfield et al., 1976) oder pCR1 (Armstrong et al., 1977), zeigen eine sehr viel geringere Häufigkeit der Übertragung und werden daher als sicherer angesehen als das Originalplasmid ColEl. Für alle Plasmid-Vektoren besteht jedoch die Möglichkeit der Übertragung durch Transposonvermittelten konjugativen Transfer, nämlich dann, wenn sich in der Wirtszelle gleichzeitig ein konjugatives Plasmid befindet, das ein oder mehrere Transposons enthält (Crisona et al., 1980). Es konnte weiterhin gezeigt werden, daß sich bei dem Plasmid RK2 der Ursprung der Replikation von den Genen für Replikationsproteine getrennt klonieren läßt (Figurski und Helinski, 1979).
Sicherheitsüberlegungen werden auch beim Gebrauch von Bakteriophagen als Klonierungsvektore ang stellt. Als Vektor dient am häufigsten der Bakteriophage Lambda (). DNA kann verpackt in Phagen-Partikel in die Umgebung gelangen oder im lysogenen Zustand durch konjugativen Transfer in andere Bakterien übertragen werden.
Verschiedene t -Phagen wurden konstruiert, die aufgrund genetischer Defekte eine geringere Chance der unkontrollierten Verbreitung zeigen. Hierzu gehören Charon-Phagen (Blattner et al., 1977; Williams und Blattner, 1979), deren DNA nicht mehr in die Wirtszelle integrieren kann und die zudem aufgrund von amber-Mutationen nur noch in bestimmten- Supressor-Stämmen aus Phagen-Partikel verpackt werden. Ähnliche Eigenschaften zeigen die zu gtWES-Phagen (Leder et al., 1977), die zudem wegen einer weiteren Mutation die Wirtszelle nicht mehr lysieren können.
Der Bakteriophage Å hat gegenüber den Plasmidvektoren den Nachteil, daß er nur DNA-Fragmente eines bestimmten Größenbereichs aufnehmen kann; wenn dieser nicht eingehalten wird, wird die DNA nicht mehr in Phagenpartikel verpackt.
Zum Klonieren fremder DNA eignen sich auch Derivate der F-Pilus spezifischen filamentösen Bakteriophagen (Ff: M13, fd, fl) (Gronenborn und Messing, 1978; Herrmann et al., 1980; Zacher et al., 1980; Nelson et al., 1981). Diese Phagen enthalten einzelsträngige DNA und infizieren nur Escherichia coli-Zellen, die ein F-Episom enthalten. Die Phagen-DNA wird in der Zelle als Doppelstrang repliziert (RF-Replikation), jedoch wird nur ein Einzelstrang in die Phagenpartikel verpackt. Der Vorteil dieser Vektoren besteht darin, daß Fragmente in eine doppelsträngige DNA kloniert werden, die dann nach Transformation in die Wirtszelle und Replikation als Einzelstrang-DNA aus den Phagen-Partikeln isoliert werden kann. Bestimmte Techniken, wie die Isolierung komplementärer RNA, Heteroduplexanalysen oder DNA-Sequenzierung, werden durch einzelsträngige DNA erheblich erleichtert.
In bezug auf Sicherheitsüberlegungen haben diese Vektoren den Nachteil, daß sie verpackt als Phagen-Partikel leicht in die Umgebung ausgeschleust werden und andere E.coli-Zellen befallen können. Einer dieser Vektoren, pKN16 (Nelson et al., 1980), bildet eine Ausnahme, da aufgrund einer Deletion in einem Strukturgen die freigesetzten Phagen-Partikel nicht mehr andere E.coli-Zellen infizieren können.
Der Nachteil der Klonierung in die Ff Phagen-Vektoren besteht darin, daß nach Klonierung großer DNA-Fragmente während der Phagenvermehrung Deletionen der klonierten Sequenzen auftreten können (Herrmann et al., 1980). Ein weiterer Nachteil ist, daß durch die Vermehrung dieser Phagen in der Wirtszelle diese in ihrem Wachstum beeinträchtigt wird, was vor allem bei der Proteinexpression klonierter Fragmente von Bedeutung sein kann.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Klonierungssystem bereitzustellen, das nach Transformation in die Wirtszelle zur Replikation nützlicher DNA-Sequenzen befähigt und gleichzeitig "sicher" ist, d.h. daß die Replikation einer klonierten DNA-Sequenz nur unter bestimmten Bedingungen gewährleistet ist.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Klonierungssystem bereitzustellen, das die Wirtszelle nicht schädigt.
Diese Aufgaben werden durch die Bereitstellung eines Klonierungssystems gelöst, das aus zwei Komponenten besteht.
1. Eine der Komponenten bildet der Vektor, der für die Klonierung nützlicher Nukleotidsequenzen vorgesehen ist. Dieser Vektor ist "sicher", da er die klonierten Sequenzen nur unter bestimmten Bedingungen repliziert. Der Vektor ist nicht selbst replizierbar. Er enthält jedoch eine Startstelle für seine Replikation, die durch einen bestimmten externen Initiator initiierbar ist. Ist dieser Initiator nicht vorhanden, kann sich der Vektor in der Wirtszelle nicht -vermehren.
2. Die zweite Komponente bildet ein Plasmid, das die Nukleotidsequenz enthält, die für den externen Initiator kodiert, der mit der Replikationsstartstelle des genannten Vektors interagiert und somit dessen Replikation initiiert.
Gegenstand der Erfindung ist somit sowohl das aus dem Vektor und dem Plasmid bestehende Klonierungssystem als auch der selbst nicht replizierende Vektor und das denvInitiator zur Replikation des Vektors liefernde Plasmid jeweils einzeln.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Vektor der vorstehend genannten Art, der eine nützliche Nukleotidsequenz kloniert enthält.
Diese hybride DNA ist ebenfalls nur dann replizierbar, wenn ein externer Initiator die Replikation an der Replikationsstartstelle initiiert. Die klonierte Nukleotidsequenz kann an einer beliebigen Stelle des Vektors außerhalb der Replikationsstartstelle inseriert sein.
Gegenstand der Erfindung sind ferner auch transformierte Wirtszellen, die entweder nur das Plasmid mit der Nukleotidsequenz enthalten, welche für den Replikationsinitiator des Vektors kodiert, oder die neben dem genannten Plasmid auch den selbst nicht replizierbaren Vektor enthalten bzw. den Vektor mit der klonierten nützlichen Nukleotidsequenz enthalten.
Die transformierten Wirtszellen der Erfindung, die nur das Plasmid mit der Nukleotidsequenz enthalten, die für den Replikationsinitiator des Vektors der Erfindung kodiert, sind naturgemäß allein noch nicht zur Replikation der nützlichen Nukleotidsequenz in der Lage. Sie können jedoch zu diesem Zweck in Bereitschaft gehalten werden und nach Einschleusung des Vektors der Erfindung, der die nützliche Nukleotidsequenz kloniert enthält, dessen Replikation in Gang setzen, da das Plasmid den Initiator für die Replikation des Vektors exprimiert.
Die beiden Bestandteile des biologisch sicheren Klonierungssysenis der Erfindung werden nachstehend genauer beschrieben Der Vektor der Erfindung dient als Klonierungsvehikel für eine nützliche Nukleotidsequenz. Der Vektor ist jedoch nicht in der Lage, sich und somit auch die klotiierte Nukleotidsequenz zu replizieren. Der Vektor ist durch zwei wesentliche Merkmale gehennzeichnet: Das erste dieser Merkmale ist eine Startstelle für seine Replikation, die jedoch einen externen Initiator für den Replikationsstart benötigt. Der Vektor darf demnach keine (eigene) Startstelle für seine Replikation aufweisen, die ohne externen Initiator zu seiner Replikation führt. Das zweite charakteristische Merkmal des Vektors besteht darin, daß er für eine bestimmte Restriktionsendonuklease vorzugsweise nur eine Schnittstelle aufweist.
Dieses Merkmal folgt an sich nur aus Zweckmäßigkeitsgründen, da es damit ermöglicht wird, durch bestimmte Restriktionsendonukleasen den Vektor. gezielt zu schneiden und eine gewünschte Nukleotidsequenz gezielt an einer bestimmten Stelle des Vektors zu inserieren. Natürlich kann der Vektor vorzugsweise je eine Schnittstelle für verschiedene Restriktionsendonukleasen aufweisen. Dies ermöglicht es, gezielt in bestimmte Abschnitte des Vektors hineinzuschneiden und Nukleotidsequenzen mit den entsprechenden Schnittstellen einzusetzen.
Der Vektor der Erfindung enthält vorzugsweise mindestens einen Marker, um die Selektionierung zu erleichtern. Spezielle Beispiele für geeignete Marker sind Nukleotidsequenzen im Vektor, die für eine Antibiotikumresistenz, für ein Bakteriocin, für ß-Galactosidase oder für eine Resistenz gegen Schwermetalle kodiert. Der Vektor kann auch zwei oder mehrere Marker enthalten.
Das Plasmid, das den zweiten Teil des Klonierungssystems der Erfindung bildet, kann ein beliebiges nicht konjugatives Plasmid sein, das sich ebenfalls durch zwei wesentliche Merkmale auszeichnen muß: Erstens muß es selbst replizierbar sein, d.h. ohne Beeinflussung von außen in der Lage sein, sich selbst zu replizieren.
Zweitens muß es die Nukleotidsequenz enthalten, die für den Initiator kodiert, der zur Replikation des selbst nicht replizierbaren Vektors der Erfindung erforderlich ist.
Dies bedeutet, daß bei der Replikation und Expression der Plasmid-DNA ein Genprodukt entsteht, welches als Initiator für die Replikation des Vektors wirkt.
Auch das Plasmid der Erfindung enthält vorzugsweise mindestens einen Marker. Spezielle Beispiele für geeignete Marker sind, wie vorstehend im Zusammenhang mit dem Vektor der Erfindung erläutert, Nukleotidsequenzen, die für eine Antibiotikumresistenz , für ein Bakteriocin, für ß-Galactosidase oder für eine Resistenz gegen Schwermetalle kodieren. Auch das Plasmid der Erfindung kann zwei oder mehrere Marker enthalten.
Es ist bevorzugt, daß der Vektor und das Plasmid der Erfindung mindestens einen verschiedenen Marker aufweisen.
Nachstehend wird die Erfindung anhand einer bevorzugten Ausführungsform näher erläutert. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Ausführungsform beschränkt. Insbesondere lassen sich die Versuche, wie sie im folgenden Kapitel beschrieben werden, auch mit den Bakteriophagen M13 und fl durchführen. Das zu beschreibende Gen 2-Protein ist an RFI DNA der Phagen fd, M13 und fl aktiv (Meyer und Geider, 1979b), und der Ursprung der Replikation enthält für diese drei Phagen eine nur geringfügig abweichende Nukleotidsequenz (Schaller, 1978).
Ein spezielles Beispiel des Klonierungssystems der Erfindung ist daher ein System, dessen eine Komponente aus einem nicht selbst replizierenden Vektor besteht, der eine durch Bakteriophage Ff Gen 2-Protein initiierbare Startstelle für seine Replikation trägt. Die zweite Komponente bildet ein selbst replizierendes Plasmid, das die Nukleotidsequenz enthält, die für Bakteriophage Ff Gen 2-Protein kodiert.
Gen 2-Protein der filamentösen Bakteriophagen (d, fl, M13) ist das Schlüsselenzym für die DNA-Replikation dieser Phagen. Es ist eine spezifische Endonuklease, die bei der Replikation der Ff-DNA den viralen Strang an einer bestimmten Stelle, der Replikationsstartstelle, schneidet, und die Replikation initiiert. Gen 2-Protein ist das einzige vom Phagen kodierte Protein, das für die Replikation der DNA benötigt wird. Andererseits ist Gen 2-Protein für die Replikation der Ff-Phagen-DNA spezifisch, d.h. es kann nicht die Replikation anderer DNA-Moleküle initiieren.
Eine Komponents des Klonierungssystems ist ein hybrides DNA-Molekül, das die Startstelle der Replikation der Ff-Bakteriophagen enthält, verknüpft mit einer Antibiotikaresistenz. Dieses DNA-Molekül kann nur replizieren, wenn in der Zelle gleichzeitig eine Quelle für Gen 2-Protein vorhanden ist. Diese Quelle kann entweder ein Ff-Bakteriophage sein oder eine vom Phagen stammende, auf ein Plasmid klonierte Nukleotidsequenz, die für Gen 2-Protein kodiert und dieses exprimiert.
Die Abhängigkeit der Replikation der oben genannten DNA von Gen 2-Protein wird erfindungsgemäß für die Verwendung dieser DNA als Klonierungsvektor genutzt; er bildet die eine Komponente des Klonierungssystems. Der Vektor wird als sicher angesehen, da er nur in Anwesenheit eines funktionellen Gen 2-Proteins repliziert wird und nicht in Phagenpartikel verpackt wird, so daß eine Ausbreitung außerhalb des Wirtes nicht möglich ist. Das für die. Replikation des Vektors notwendige Gen 2-Protein wird von der zweiten Komponente des Klonierungssystems bereitgestellt. Die DNA-Sequenz, die für Gen 2-Protein kodiert, kann beispielsweise auf das E.coli-Plasmid pBR325 kloniert und in eine E.coli-Zelle transformiert werden. Das hybride Plasmid mit der Information für Gen 2-Protein kann in der Wirtszelle replizieren, wobei der Initiator für die Replikation des Vektors erzeugt wird. Wird diese Zelle zusätzlich mit dem Vektor transformiert, so wird dieser mit Hilfe des in der Wirtszelle vorhandenen Gen 2-Proteins repliziert.
Das erfindungsgemäß als Vektor benutzte hybride DNA-Molekül (bestehend aus der Startstelle der Replikation eines. Ff-Bakteriophagen und einem Antibiotikum-Resistenzgen) bietet die Möglichkeit der Klonierung nützlicher Nukleotidsequenzen. Als solche "nützliche Nukleotidsequenzen" kommen grundsätzlich alle Nukleotidsequenzen (Gene) in Betracht, die bei ihrer Expression wertvolle Produkte liefern, beispielsweise Enzyme, Hormone, Vaccine und dgl., und deren Klonierung in den Vektor der Erfindung möglich ist. Spezielle Beispiele für nützliche Nukleotidsequenzen, die in den Vektor der-Erfindung kloniert werden können, sind die Gene für Insulin, Interferon oder biochemisch wichtige Enzyme.
Die nützliche Nukleotidsequenz kann an einer entsprechenden Schnittstelle des Vektors der Erfindung kloniert werden. Danach wird die Wirtszelle, die bereits das Plasmid der Erfindung mit der Information für Gen 2-Protein enthält, zusätzlich mit dem Vektor, der die klonierte nützliche Nukleotidsequenz enthält, transformiert. Mit Hilfe des in der Wirtszelle vorhandenen Gen 2-Proteins werden der Vektor und die klonierte Nukleotidsequenz repliziert. Das dabei erhaltene nützliche Genprodukt kann in üblicher Weise gewonnen werden In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist es auch möglich, den Vektor in eine Ff-Phagen infizierte Wirtzelle zu transformieren. Dies kann nach den üblichen Methoden der Gentechnologie durchgeführt werden.
Die gesteuerte Verwendung von Nfirtzellen, die mit Ff-Phagen infiziert sind, zur Transformation des Vektors stellt zwar eine Möglichkeit dar, die Replikation des selbst nicht replizierbaren Vektors der Erfindung, der Gen 2-Protein für seinen Replikationsstart benötigt, in der Wirtzelle zu starten, da der Phage selbst natürlich das Gen 2-Protein zur Verfügung stellen kann. Diese Methode ist aber im Hinblick auf die Tatsache, daß eine Infektion der Wirtszelle mit Ff-Phagen in der Praxis auch unbeabsichtigt erfolgen kann, erfindungsgemäß nicht bevorzugt. Durch eine ungesteuerte Infektion der Wirtzelle mit Ff-Phagen würde nämlich der Vorteil der "biologischen Sicherheit" des Klonierungssystems der Erfindung verringert, da der Vektor für seinen Replikationsstart dann nicht mehr auf die gesteuerte Anwesenheit des Gen 2-Protein angewiesen ist. Bevorzugt werden erfindungsgemäß deshalb Wirtszellen eingesetzt, die die Eigenschaften aufweisen, daß sie von Ff-Phagen nicht infiziert werden können. Ein spezielles Beispiel für solche Wirtszellen sind E. coli-Zellen, die kein F-Episom aufweisen (Zellen) und die deshalb nicht in der Lage sind, F-Pili für das Einschleusen der Ff-Phagen auszubilden.
In der besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Klonierungssystem deshalb in mehrfacher Hinsicht "biologisch sicher".
a) Der Vektor, der die durch Bakteriophage Ff Gen 2-Protein iniziierbare Startstelle für seine Replikation aufweist, kann allein aus sich heraus nicht replizieren, sondern benötigt dafür eine zweite Komponente, nämlich das Gen 2-Protein als Initiator.
b) Der Vektor wird nicht in Phagenpartikel verpackt und kann deshalb nicht aus der Wirtzelle ausgeschleust werden, so daß eine Ausbreitung außerhalb des Wirts nicht möglich ist.
c) Das für den Replikator des Vektors erforderliche Gen 2-Protein kann dem System nur gesteuert über das Plasmid der Erfindung (das selbst replizierbar ist und die Nukleotidsequenz enthält, die für Bakteriophage Gen 2-Protein kodiert) zugeführt werden, nicht aber ungesteuert durch den Bakteriophagen Ff selbst, da die bevorzugt verwendeten Wirtzellen gegen dessen Eindringen geschützt sind.
Wie vorstehend erwähnt, existieren von dem im erfindungsgemäßen Vektorsystem bevorzugt verwendeten Ff-Bakteriophagen mehrere Unterarten, die mit fd, fl, M13 bezeichnet werden. Alle diese Unterarten eignen sich - neben zahlreichen anderen Plasmiden oder Phagen - für die Zwecke der Erfindung. In den nachstehenden Beispielen wird die Erfindung anhand eines Vektorsystems erläutert, das auf dem Bakteriophagen fd beruht (Vektor mit Replikationsstartstelle von Phage fd; Plasmid mit fd-Gen 2). Die Erfindung ist nicht auf diese Ausführungsform beschränkt, sondern umfaßt auch Vektorsysteme auf der Basis der anderen Unterarten von Ff-Bakteriophagen sowie von anderen Plasmiden oder Phagen.
Beispiel 1 Herstellung eines selbst replizierenden hybriden Plasmids mit dem fd Gen 2 Vorausgehende Befunde über den sogenannten "killing effect" des Gen 2-Proteins (Review s. Marvin and Hohn, 1969) weisen darauf hin, daß die Expression dieses Proteins durch ein Multikopien-Plasmid möglicherweise mit dem Zellmetabolismus interferieren könnte. Wir beschreiben hier eine Möglichkeit, das Gen 2 zu klonieren, die eine hohe Ausbeute an hybriden Genomen liefert, deren Information für fd Gen 2 in einer definierten Stelle des Vektormoleküls enthalten ist (Abb.
1): Ein EcoRI/AtuI Restriktionsfragment, das die vollständige Nukleotidsequenz für ausschließlich fd Gen 2 enthält, wurde hierzu aus RFI des Phagen fd 11 gewonnen (Herrmann et al., 1980). Sein Einbau zwischen die Schnittstellen EcoRI und Hindlil des Plasmids pBR325 (Bolivar, 1978; Prentki et al., 1981) hat die Eliminierung eines Teils des Strukturgens für Cm-Resistenz zur Folge. Gleichzeitig gelangt das Gen für Tc-Resistenz unter die Kontrolle starker fd Promotoren, die sich innerhalb des Gen 2-Fragments befinden (Schaller et al., 1978).
Die Konstruktion des Plasmids ist in Abb. 2 dargestellt. Mit dieser hybriden DNA transformierte Zellen wurden durch Wachstum auf Aphaltigem Nährboden selektioniert und auf Tc-Resistenz, Cm-Sensitivität und auf Komplementation von fd Gen 2 amber Phagen auf dem sup Wirt H403 getestet. Es zeigte sich, daß vorwiegend Zellen, die kleine Kolonien bilden, Plasmide mit intaktem Gen 2 tragen. Einer dieser Klone, pTM11, wurde im weiteren analysiert.
Analyse eines hybriden Zellklons Endonukleolytische Verdauung des gereinigten Plasmids pTMI1 mit den Restriktionsenzymen AluI, HpaII und EcoRI/HpaI zeigen, daß das in den Vektor inserierte Fragment Abschnitte entsprechend den Fragmenten AluI C, HpaII D,F und EcoRI/HpaI des Bakteriophagen fd 11 enthält.
Innerhalb dieser Fragmente ist die gesamte Information des Gen 2 enthalten (Herrmann et al., 1980; Beck et-al., 1978).
Nachfolgend wird gezeigt, daß das durch das Plasmid pTM11 kodierte Gen 2-Protein Wachstum von fd amber 2 Phagen ermöglicht: Da der Stamm H403 mit dem Plasmid pTM11 keine Darstellung von Einzelplaques F-spezifischer Phagen ermöglicht, wurden in Form eines Schnell-Tests Tropfen einer verdünnten Phagensuspension auf eine plattierte Zellkultur verabreicht (zur Erläuterung siehe Legende zu Abb. 2). Mit dieser Methode konnte Wachstum auf H403 (pTM11) für fd Wildtyp und fd Gen 2 amber (fd amll), aber nicht für fd Gen 5 amber (fd am51) Phagen gezeigt werden (Tab. I). Der sup Stamm H403 ohne Plasmid oder transformiert mit pBR325 vermehrte weder fd amll noch fd am51 (Tab. I).
Um nachzuweisen, daß das Wachstum des Phagen fd amll auf dem Stamm H403 (pTM1l) auf Komplementation, aber nicht auf Rekombination der Phagenmutante mit dem Gen 2 hybriden Plasmid zurückzuführen ist, wurde fd amll auf diesem Stamm in Flüssigkultur gezüchtet. Unter diesen Bedingungen ist die Phagenvermehrung im Vergleich zur Plattierung gesteigert. Abb. 3 zeigt eine Erhöhung des fd amll Titers, begleitet von einer Erhöhung des Wildtyp-Titers. Der Versuch demonstriert die Komplementation des defekten fd-Gen 2, obgleich auch zu einem geringen Ausmaß Rekombination bzw. Reversion im mutierten Gen 2 des Phagen stattfindet.
Überproduktion des fd Gen 2-Proteins Ein biochemischer Naclweis für die Synthese funktionellen Gen 2-Proteins in hybriden Zellkionen wurde durch Studien der Replikation von fd RFI des Phagen fd in löslichen Zellextrakten des Stamms H403 (pTM11) erhalten. Tab. II zeigt, dß Extrakte dieses Stammes fd RFI replizieren, was auf die Funktion des Gen 2-l'roteins zurückzuführen ist (Meyer und Geider, 1979a). Der Cehalt aii aktivem Gen 2-Protein in Stamm H403 (pTM11) und Stamm H40 (pTM12, pfdl) (I;. unten) übertrifft denjenigen von fd Wildtyp infizierten Zellen etwa 200nach und den von fd am51 infizierten H403 Zellen ca. 10nach (Tab. IL). Gen 2-Protein, das nach einer früher veröifentlichten Nethode (Meyer und Geider, 1979a)) aus dem Stamm H403 (pTM11) gereinigt wurde, zeigt alle Eigenschaften des Gen 2-Proteins aus fd am51 infizierten Zellen, einschließlich seiner spezifischen Endonuklease- und Topoisomerase-Aktivitäten (Meyer und Geider, 1979b; Harth et al., 1981).
Eigenschaften des Gen 2 Hybridklons und eines Derivates Infolge des langsamen Wachstums des Stamms H403 (pTM11), vermutlich wegen der Überproduktion des Gen 2-Proteins, wird eine Anhäufung schneller wachsender Spontanmutanten begünstigt. Nach ungefähr 15 Wachstumsgenerationen in Antibiotika-freiem Medium konnten in etwa 1% der Zellen Plasmide mit inaktivem Gen 2-Produkt nachgewiesen werden. Diese Rate konnte durch Wachstum in Gegenwart von Tc deutlich verringert werden, da etwa 70% der spontanen Mutanten in Gen 2 polare Effekte auf die Expression des Tc-Resistenzgens zeigten.
Der hybride Zellklon H403 (pTM11) vermehrt F-spezifische Phagen nur schwach (Tab. II, Abb. 3) und ist nicht für Ca-Behandlung zur Produktion kompetenter Zellen geeignet (Tab. III). Durch Retransformation der Plasmid-DNA in den Stamm H403 isolierten wir eine spontane Mutante des Plasmids pTM11. Dieses Plasmidderivat, das mit pTM12 bezeichnet wurde, zeigt ein identisches Restriktionsmuster wie Plasmid pTM11 für die Restriktionsnukleasen EcoRI/HpaI/BamHI und HpaII.
Es komplementiert ebenfalls wie pTM11 das Wachstum von fd-Gen 2 amber-Phagen (Abb. 3). Plasmid pTM12 exprimiert Gen 2-Protein in einem geringeren Ausmaß im Vergleich zu pTMll, andererseits interferiert es jedoch nicht mit dem Wachstum F-spezifischer Phagen (Tab. II) und ist verträglich mit der Ca-Behandlung zur Produktion von kompetenten Zellen (Tab. III). Aus diesem Grund kann das Plasmid als Grundlage für die Entwicklung des im folgenden beschriebenen Vektorsystems benutzt werden.
Beispiel 2 Herstellung eines nicht selbst replizierbaren, funktionell vom Gen 2 des Phagen fd abhängigen Vektors (fd Miniplasmid) Um ein fd Miniplasmid herzustellen, wurde ein EcoRI/BamHI-Fragment des Phagen fd 11, das den Replikationsorigin enthält (Abb. 1), mit einem EcoRI/BamHI-Fragment des Phagen fd 106 (Herrmann et al., 1980) fusioniert, das Km-Resistenz kodiert und das 3 -Ende des Gens für Cm-Resistenz trägt. Mit dieser hybriden DNA wurden H403 (pTM12) Zellen transformiert und nach Km-Resistenz selektioniert. Cm-sensitive Zellen enthielten das fd Miniplasmid, das mit pfdAl bezeichnet wurde (Abb. 4 und 5).
Eigenschaften des Miniplasmids pfdAl Das Plasmid pfdAl trägt als den einzigen Replikationsorigin den des Phagen fd, jedoch kein Strukturgen des fd. Dementsprechend repliziert es nur in Bakterienstämmen, die funktionelles Gen 2-Protein produzieren, wie in H403 (pTM12) Zellen oder in fd infizierten E.coli-Zellen (Tab. II). Der Stamm H517 (pTM12> ~ ) eignete sich nicht als Wirtsstamm für pfdAl, was im Einklang mit den Erfordernissen der RF Replikation des Phagen fd steht (Fidanian und Ray, 1972) Plasmid DNA, die aus dem Stamm K403 (pTM12, pfdAl) gewonnen wurde, enthält, wie erwartet, beide Plasmide (Abb. 5). Das Vorkommen von pfdAl in einer hohen Kopienzahl wird durch die stark ausgeprägte Bande im Agarosegel deutlich. Wie das Gel weiterhin zeigt, bilden die Plasmide pTM12 und pfdAl in vivo keine Kointegrate in einem sichtbaren Ausmaß.
Diese Beobachtung wird durch den weiteren Befund erhärtet, daß Plasmid-DNA aus dem Stamm H403 (pTM12, pfdAl) den Stamm H517 (rep ) bei Transformation nicht zur Km-Resistenz befähigt (Tab. II).
Plasmid pfdAl besitzt im Gegensatz zu pTM12 keine Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen PstI, SalI und HpaI. Die kovalent geschlossene Form (RFI) vom pfdAl läßt sich daher auf einfache Weise in einem CsCl-Ethidiumbromidgradienten von dem zuvor mit diesen Nukleasen linearisierten Plasmid pTN12 abtrennen. Andererseits besitzt pfdAl mehrere Einzel-Schnittstellen, wie EcoRI oder BamHI, in die fremde DNA inseriert erden kann.
Auf F -Zellen, die das Plasmid pTM12 zusammen mit dem Plasmid pfdAl enthalten, bilden fd Phagen keine Plaques. Die Ursache hierfür ist nicht bekannt, wird aber in der nur unzureichenden Ausbildung von F Pili in dieser Situation vermutet. Andererseits kann das Plasmid pfdAl in fd infizierte Zellen übertragen und als separates Replikon erhalten werden (Abb. 6). Es wird jedoch in Gegenwart des Helferphagen nicht verpackt, obwohl dieser selbst sehr effizient aus der Zelle ausgeschleust wird (Abb. 6). Dieser Befund bedeutet, daß das für die Verpackung zu Phagenpartikeln notwendige Signal auf dem Miniplasmid pfdAl fehlt.
Die hier aufgezeigten Eigenschaften von pfdAl lassen das Plasmid als einen sicheren Klonierungsvektor erscheinen, da es erstens nicht als Phagenpartikel aus der Zelle ausgeschleust werden kann und zweitens nur in Zellen beibehalten werden kann, die eine Quelle von Gen 2 Protein zur Verfügung stellen. Ein weiterer Vorteil ist die Eigenschaft, daß Zellen, die ein Gen 2 abhängiges Replikon enthalten, von diesem Plasmid befreit werden können indem man sie über wenige Generationen bei erhöhter Temperatur (42 C) wachsen läßt (Tab. IV).
Dieser Beobachtung liegt die Temperatursensitivität des Gen 2-Proteins in vivo und in vitro zugrunde (Meyer und Geider, 1979a).
Das Miniplasmid pfdAl stellt aus folgenden Gründen ein gutes, universelles Vektorsystem dar: (I) Die Sicherheit des Vektorsystems ist durch das Unvermögen des bliniplasmids pfdAl gewährleistet, in infektiöse Phagenpartikel verpackt zu werden. Zudem ist sein Aufenthalt durch seine Abhängigkeit von funktionellem Gen 2-Protein auf eine bestimmte Wirtszelle beschränkt. (11) pfd Plasmide erhalten sich in einer hohen Kopienzahl in der Wirtszelle und erlauben somit einfache Isolierung ihrer DNA. (III) Das pfd Replikon trägt keine homologen DNA-Sequenzen zu anderen häufig benutzten Klonierungsvektoren. Es ist daher attraktiv für Kreuzhybridisierungsexperimente. Um Homologie zu Vektoren mit dem Chloramphenicol-Resistenzgen (pBR325, fdiO6) zu beseitigen, wurde außerdem das Fragment CM" von EcoRI bis zum HaeII-Schnitt deletiert und das resultierende Plasmid pfdA2 über EcoRI-linker verbunden. (IV) Die Wirtszelle kann leicht durch Inkubation bei erhöhter Temperatur von dem fd Replikon befreit werden. (V) Die Möglichkeit, einzelsträngige Plasmid-DNA in Phagenpartikel verpacken zu lassen, ist fakultativ und kann durch den Einbau einer zusHtzlichen Nukleotidsequenz in pfd Plasmide erreicht werden, die das Verpackungssignal des Phagen fd trägt . Die Einfachheit, mit der durch diese Methode einzelsträngige DNA erhalten werden kann, erleichtert z.B. das Sequenzieren nach der Methode von Sanger et al. (1977), sowie Hybridisierungsexperimente oder andere Techniken, die große Mengen einzelsträngiger DNA erforderlich machen. (VI) Die Plasmide pfdAl und pTM12 lassen sich durch EcoRI-Schnitte zu einem einzigen Plasmid vereinigen, das die Resistenzen Ap, Cm, Km und Tc trägt (pfdCO).
Verkleinerung dieses Plasmids führt zu pfdCl mit dem Replikationsorigin des Phagen fd, fd Gen 2 und dem Km-Resistenzgen. Für das Klonierungssystem pfdA in E. coli K12-F -Zellen mit dem Plasmid pTM12 wurde bei der Zentralen Kommission für die biologische Sicherheit (Berlin) die Anerkennung als Vektorsystem der Sicherheitsstufe B2 beantragt.
Beispiel 3 Klonierung eines Fragments in das Miniplasmid pfdA1 Uz die Brauchbarkeit des Klonierungsvektors pfd A1 nachzuweisen, wurden DNA Fragmente verschiedener Größe in die Vektor-DNA inseriert.
Ein Fragment (5 Kilobasen; 3 x10 Dalton) trägt eine Resistenz gegen Ampicillin, ein anderes Fragment (15 Kilobasen; 9,3 x 10 Dalton) enthält eine Sequenz der T-DNA des Ti-Plasmids. Die Umklonierung des ersten Fragments auf den Vektor pfdAl führt zu Ap-resistenten Kolonien (Tabelle V). Dies zeigt, daß ein DNA-Fragment auf dem Vektor effizient exprimiert wird.
Der Gentechnologie mit Pflanzenzellen kommt in der Zukunft eine große Bedeutung zu. Die zweite Ausführungsform ist eine Vorstufe für den gezielten Gentransfer in Pflanzenzellen. Ein Bodenbakterium, Agrobacterium tumefaciens, überträgt ein Plasmid (Ti-Plasmid, pTi) in Zellen von dikotylen Pflanzen, das zu Zelltransformation führt. Ein Teil des Ti-Plasmids (T-DNA) bleibt in solchen Zellen chromosomal integriert erhalten (Lemmers et al., 1980). Es wurde gezeigt, daß auch fremde DNA, die in den T-DNA Abschnitt des Ti-Plasmids eingefügt wurde, ebenfalls in den Pflanzen konserviert wird. Mit klonierten Stücken des Ti-Plasmids, die Teile der T-DNA enthalten, lassen sich durch in vivo Rekombination mit dem Ti-Plasmid in der T-DNA gezielte Genänderungen erreichen, die dann im Transfer zu Pflanzenzellen untersucht werden können.
Die Umklonierung des Eco RI-Fragments 1 von pTi-C58 (Schweitzer et al., 1980) zeigt, daß auch ein großes Fragment in dem pfd Al-Vektor stabil erhalten bleibt. Die Instabilitäten von großen Fragmenten, die bei Klonierungen in fd Phagen beobachtet wurden (Herrmann et al., 1980), scheint nach diesen Ergebnissen aus der Verpackung von fd Phagen zu resultieren. Die Replikation der hybriden DNA beeinflußt dann die Stabilität großer Fragmente weniger. Das Plasmid kann daher gut zum Klonieren bis zur Größe von 15 Kilobasen (und wahrscheinlich mehr) eingesetzt werden.
Methodischer Teil 1. Bakterien- und Phagenstämme, die in den beschriebenen Experimenten benutzt worden sind, sind in Tabelle A gelistet.
TABELLE A Bakterienstämme und Genotyp Quelle Bakteriophagen H403 endAl, rnsA100, tsx, F'iq Meyer & Geider (1979a) H404 endAl, rnsA100, tsx, F T.F. Meyer B560 endAl, tsx, polAl, F+ X. Hoffmann-Berling H570 endAl, rnsA100, tsx, polAl H. Hoffmann-Berling H517 rep-3, F+ H. Hoffmann-Berling GM48 dam-3 dcm-6 thr-l leu-6 thii Bolivar lac-Y gal K2 gal T22 ara-14 (1978) tonA-31 tsx-78 : supE44 1101 endAl, supE, F H.- Hoffmann-Berling HfrC6 met, HfrC H. Hoffmann-Berling C60O hsdR D. Sanders fd wt Wildtyp H. -Hoffmann-Berling fd amll gen-2 amber H. Hoffmann-Berling fd am51 gen-5 amber H. Hoffmann-Berling 2. Zirkuläre doppelsträngige DNA, die in den beschriebenen Experimenten als Ausgangsbasis benutzt bzw. durch Genkonstruktion gewonnen wurde, ist in Tabelle B aufgeführt.
TABELLE B Plasmidiphage Resistenz Replikon Quelle pBR 325 Tc, Cm, Ap ColEI Bolivar (1978) pTM 11 Ap, Tc ColEI diese Arbeit -pTM 12 Ap, Tc ColEI diese Arbeit pfd Al Km fd diese Arbeit pfd Co Tc, Cm, Ap, Km ColEI, fd diese Arbeit fd 11 - fd Herrmann et al. (1980) fd 106 Cm, Km fd Herrmann et al. (1980) pSS 83 Tc ColEI Schweitzer et al.
(1979) RSF 1050E Ap (Derivat von RSF 1050) Heffron et al. (1979) 3. Isolierung von Plasmid-DNA und RFI des Phagen fd Plasmid DNA wurde entsprechend einer publizierten Methode (Meyer und Geider, 1979a) isoliert, jedoch mit dem Unterschied, daß die mit Lysozym vorbehandelte Zellsuspension nicht mit Triton X100, sondern mit 2 M Harnstoff in der Endkonzentration lysiert wurde. Dadurch entfiel die Zugabe von NaCl und KC1 zur PEG-Präzipitation. RFI des Phagen fd wurde nach Meyer und Geider (1979b) isoliert. Für den Fall, daß die DNA für die Reaktion mittlltdI Endonuklease bestimmt war, wurde jedoch als Wirtsstamm GM48 F benutzt.
Beide Methoden der Plasmidreinigung umfaßten folgende Schritte: a. Abtrennung der Zellfragmente aus dem Lysat durch Zentrifugation.
b. Präzipitierung der DNA mit Polyäthylenglycol aus dem Überstand.
c. Dichtebandung der DNA in CsCl/Ethidiumbromid Dichtegradienten.
4. Genkonstruktion (allgemein) a. Restriktion: Die zu spaltende DNA wurde in einer Konzentration von 25 pg/ml mit 30 Einheitenlml des entsprechenden Restriktionsenzyms behandelt. Die Inkubation erfolgte 1 h bei 37 C in wässriger Lösung mit 20 mM Tris-Cl, pH 7,5, 10 mM MgCl2 und 1 mM 2-Merkaptoäthanol. Reaktionsansätze mit AtuI Endonuklease enthielten zusätzlich 500 pg/ml Rinderserumalbumin.
b. Egalisierung einzelsträngiger DNA Termini wurde bei einer DNA Konzentration von 5 pg/ml mit 200 ng/ml E.coli DNA Polymerase I unter Reaktionsbedingungen ausgeführt, wie sie bei Backman et al. (1976) beschrieben sind.
c. Ligation: Lineare DNA wurde in einer Konzentration von 10 pg/ml mit 1 pg/ml T4 DNA Ligase in wässriger Lösung mit 50 mM NaCl, 60 mM Tris-Cl, pH 7,5, 10 mM Mg12, 10 mM 2-Merkaptoäthanol, 1 mM EDTA und 1 mM ATP für die Dauer von 4 h bei -40C behandelt.
d. Enzym-Inaktivierung: Die Reaktionen a-c wurden durch 10-minütiges Erhitzen auf 700C beendet. Hitzestabile Enzyme wurden durch Verdünnung des Reaktionsansatzes auf ein fünffaches Volumen und anschließende Phenolbehandlung entfernt.
Die proteinfreie wässrige Phase wurde über einer Ultrogel AcA 54 Säule (LKB), die in H20 äquilibriert war, von gelöstem Phenol befreit und anschließend lyophilisiert.
5. Enzyme a. Restriktionsendonukleasen, außer AtuI, wurden von BRL bzw. von Böhringer Mannheim geliefert und besaßen eine Aktivität von 1 Einheit/l. AtuI Restriktionsendonuklease wurde aus Agrobacterium tumefaciens B6 Zellen isoliert.
Das Enzym wurde durch folgende Schritte gereinigt: (a) Polymin P-Fällung, (b) Ammoniumsulfatfällung, Cc) BioRex 70 Chromatographie, (d) DEAE Zellulose Chromatographie, (e) Ultrogel AcA 34 Gelfiltration und (f) Chromatographie an Hydroxylapatit. Die Präparation enthielt Restaktivitäten einer DNA Einzelstrang-spezifischen Endonuklease (LeBon et al., 1978). Diese Kontamination erlaubte eine Ligation von AtuI Fragmenten erst nach Behandlung mit DNA Polymerase 1. Die Aktivität von AtuI betrug 0.5 Einheiten/pl.
b. T4 DNA Ligase wurde von dem überproduzierenden Stamm 1100 dT4 lig) nach Murray et al. (1979) isoliert.
c. Polymerase Wurde nach einer früher beschriebenen Methode aus E.coli-Zellen isoliert (Meyer und Geider, 1979a).
6. Genkonstruktion (spezieller Teil) a. Plasmid pTM1l Schritt I: 1 pg fd 11 RFI DNA wurde mit AtuI Endonuklease geschnitten und anschließend deproteinisiert.
Schritt II: Das Produkt von Schritt I und 0,2 µg Plasmid pBR325 wurden mit EcoRI Endonuklease geschnitten.
Schritt III: Produkt II wurde mit T4 DNA Ligase behandelt.
(Ligation kam nur an EcoRI Schnittstellen zustande.) Schritt IV: Produkt III wurde mit HindIII Endonuklease geschnitten.
Schritt V: Produkt IV wurde mit T4 DNA Ligase zirkularisiert nach Transformation in 11403 Zellen Schritt VI: Plasmid pTMll in Produkt V wurde durch Selektion auf Amplcillin-Resistenz isoliert und antchließend auf den Genotyp (Apr , Tc , Cm, fd gen-2 ) getestet.
b. Plasmid pfdAl Schritt I: 50 ng fd 11 RFI DNA und 50 ng fd 106 RFI DNA wurden mit EcoRI und BamHI geschnitten.
Schritt II: Produkt I wurde mit T4 DNA Ligase ligiert.
Schritt III: Produkt II wurde in H403 (pTM12) Zellen. transformiert und auf den Genotyp (Kmr, Cms) wie auf die Abhängigkeit von Plasmid pTM12 (gen-2+) und E.coli rep getestet.
c. Plasmid pfdCO Schritt I: Je 50 ng pTM12 DNA und pfdAl DNA wurden mit EcoRI Restriktionsendonuklease geschnitten.
Schritt II: Produkt Wurde mit T4 DNA Ligase behandelt.
Schritt III: Plasmid pfdCO wurde nach Transformation in Stamm H570 durch Selektion nach Cmr isoliert und auf den Genotyp (Cmr Apr Kmr Tcr) sowie auf die Unabhängigkeit von E.coli rep oder polAl getestet.
7. Klonierung von Plasmid DNA a. Kompetente Zellen von E.coli wurden durch Ca2+-Behandlung gewonnen, wie bei Prentki et al. (1981) beschrieben.
b. Kompetente fd infizierte Zellen. Hierzu wurde der Stamm E.coli H408 bei 37VC und Belüftung bis zu einer Dichte von 3 x 10 Zellen/ml gezüchtet und nach Zugabe von fd wt (bei einer moi von = 5) weitere 4 h bei 370C und Belüftung inkubiert. Diese Zellen wurden dann einer Ca2+-Behandlung (wie unter a. beschrieben) unterzogen.
c. Transformation kompetenter Zellen mit neu konstruierter bzw. isolierter Plasmid-DNA erfolgte nach einer bei Prentki et al. (1981) beschriebenen Methode.
d. Selektion nach Antibiotika-Resistenz. Selektion transformierter Zellen erfolgte durch Zugabe des gewünschten Antibiotikums nach 30 min Inkubation des Transformationsansatzes (vgl. c.) in antibiotikumfreiem Medium in einer Konzentration von 2 zg/ml (Tc und Km), 5 pg/ml (Cm) und 10 pg/ml (Ap). Nach weiterer Inkubation des Ansatzes (1 h bei 35°C) wurden die Zellen auf Antibiotika-Nährböden ausgestrichen mit einer Antibiotikakonzentration von 20 jig/ml (Tc und Km), 50 pg/ml (Cm) bzw. 100 pglml (Ap). Diese Konzentrationen sind Standard.
8. Präparation von fd Phagen und fd SS-DNA erfolgte - wie bei Meyer und Geider (1979b) beschrieben -aus dem Überstand einer fd infizierten Zellkultur. Kulturen mit Zellen, die ein fd Replikon mit einem Resistenzgen trugen, wurden 30 min nach der ursprünglichen Infektion in Gegenwart des entsprechenden Antibiotikums (Standardkonzentration) gezüchtet. Aus dem Überstand wurden die Phagenpartikel isoliert.
9. Wachstum von E.coli-Zellen erfolgte in Voll-Medium bei Belüftung bzw. auf reichen Nährboden bei 350C.
Die Zelldichte in Suspension wurde über die Extinktion bei 590 nm bestimmt.
10. Komplementationstests für fd amber-Phagen a. Komplementation auf Nähragar. Der zu testende E.coli-Stamm wurde mit TC-Weichagar auf TC-Nährboden plattiert und anschließend mit je einem Tropfen verschiedener Phagensuspensionen mit einem Titer von je 10 PFU/ml (fd amll, fd am51 und fd wt) versehen. Die Testplatte wurde 12 h bei 37 C inkubiert und danach auf Komplementation (Hemmung des bakteriellen Wachstums) von fd amber-Phagen untersucht.
b. Komplementation in Flüssigkultur. Die zu testenden E.coli-Zellen wurden in 10 ml TC-Medium bei 370C bis zu einer Dichte von 108 Zellen/ml gezüchtet und dann mit fd amber-Phagen (moi = 1) infiziert. Die Phagenvermehrung wurde durch Bestimmung des Phagentiters zu bestimmten Zeitpunkten nach der Infektion kontrolliert. Als Indikatorstamm für amber-Phagen diente E.coli 1101, als Indikator für Revertanten der Stamm HfrC6. Die zur Infektion benutzten Phagensuspensionen enthielten eine wt Revertante in 5 x 10 amber Phagen.
11. Umklonierung von Fragmenten in pfdAl a. Fragment 1: Gereinigtes Plasmid pfdAl (ohne pTM12) (0,2 pg) und pSS83 (0,4 µg). wurden mit EcoRI Endonuklease geschnitten und mit T4 DNA Ligase ligiert. Transformiert wurde in H404 (pTM12) Zellen wie oben beschrieben. Die Selektion erfolgte auf kanamycinhaltigen Platten. Mögliche hybride DNA wurde durch Bandung in einem CsCl/Äthidiumbromid-Gradienten gereinigt und durch Gelelektrophorese analysiert. Ein Klon mit den richtigen Eigenschaften (Größe, Restriktionsfragmente) wurde auf seine Stabilität geprüft.
b. Fragment 2: Das Experiment wurde wie unter lla durchgeührt, jedoch statt Plasmid pSS83 wurden 0,4 pg von Plasmid RSF 1050E eingesetzt. Zur Tranformation wurden außer H404 (pTM12)-Zellen auch fd infizierte Hfr C6-Zellen genommen.
Die Selektion erfolgte auf Platten mit Kanamycin bzw.
mit Kanamycin und Ampicillin für die Transformation in cd infizierte Zellen. Für Transformation in H404 (pTM12)-Zellen, die Ap-resistent waren, wurde die Größe der möglichen pfdAl-Hybride über Minilysate durch Gelelektrophorase bestimmt (Schweitzer et al., 1980).
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Tabelle III Einfluß der Ca-Behandlung (Mandel und Higa, 1970) auf H403 Zellen Stamm Plattier-Ausbeute H403 8 x H403 (pTMll) 2 x 10-6 H403 (pTM12) 6 x 10-1 Tabelle IV Verlust des pfd-Replikons bei Wachstum bei 420C in Antibiotika-freiem Medium (für H403 (pTM12, pfdAl)) Passage Resistenz Ap 0 100/100 100/100 1 97/100 22/100 2 98/100 5/100 3 95/100 0/100 Angegeben ist die Koloniebildung auf Agarplatten mit Antibiotika verglichen mit der Anzahl vor der Kolonie auf normalen Agarplatten (normiert auf 100).
Tabelle V Umklonierung der Ap-Resistenz auf pfAl pfdAl gesamte transformierte davon kloniertes mit Kolonien (pfdAl) Fragment in pfdAl HfrC6-fd infiz. 120 25 (Plattentest) H404 (pTM12) 33 6 (Gel) LEGENDEN ZU DEN ABBILDUNGEN Abb. 1: Restriktionskarte des Phagen fdll (6,4 kb) (Herrmann et al., 1980), des Plasmids pBR325 (6,0 kb) (Bolivar, 1978) und des Plasmids pTMll (6,2 kb).>+: Promotoren und Richtung der Transkription. Die äußeren Pfeile zeigen Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen an.
Innere Ziffern bezeichnen Phagen-Gene.
Abb. 2: Ein Schema für gezieltes Klonieren von fd Gen 2 in pBR325.
Step I: RFI (1 pg) des Phagen fdll wurde mit Atul Endonuklease geschnitten, und die Reaktionsmischung wurde phenol-extrahiert und gefriergetrocknet. Step II: Das Reaktionsprodukt von Step I und Plasmid pBR325 (0,2 pg) wurden mit EcoRI Endonuklease geschnitten. Step III: Die Reaktionsprodukte von Step II wurden mit T4 Ligase nur an der EcoRI Schnitt stelle ligiert (Ligation an den Atut Schnittstellen wurde vor der Behandlung mit DNA Polymerase 1 nicht gefunden). Step IV: Ligationsprodukte am rechten Arm des linearen pBR325 (Abb. 2) wurden durch Behandlung mit HindIII Endonuklease beseitigt. Step V: fiberstehende Enden der DNA wurden durch DNA Synthese mit DNA Polymerase I aufgefüllt und mit T4 Ligase ligiert. Step VI: Ap-resistente Transformanden wurden selektiert und dann auf Resistenz gegen Tc und Sensitivität gegen Cm geprüft. Kulturen von positiven Kolonien wurden plattiert, und Tropfen der Phagen (10 pfu/ml) fd, fd amll und fd am51 wurden auf die Oberfläche gegeben. Nach Inkubation bei 370C wurde gefunden, daß etwa 25% der Klone den Phagen fd amll komplementieren.
Großbuchstaben zeigen die Schnittstellen für die Endonukleasen AtuI (A), EcoRI (E) und HindIII (H) an. Eingefügtes Bild: Schnitt- und Ligationsmuster in einem zeigen Agarosegel nach den Einzelschritten der Hybridkonstruktion.
Abb. 3: Komplementation des Phagen fd amll durch A403 (prall) (o) und H403 (pTM12) (-). Die Zellen wurden bei 370C bei der Dichte von 1 x 10 Zellen pro ml mit einem fd amll Phagen pro Zelle infiziert. Die Phagen wurden auf Stamm 1101 ( ) und für Revertanten auf Hfrg6 (-----) titriert. Die infizierende Phagenmutante enthielt 2 x 10 Revertanten.
Abb. 4: Restriktionskarten der Plasmide pfdAl (2,4 kb) und pfdCO (8,6 kb). Die dicke ausgezogene Linie zeigt DNA Sequenzen des Phagen fd. Für weitere Erklärungen siehe Abb. 1.
Abb. 5: Agarose-Gele der konstruierten hybriden DNAs. A: pTM11 nach Schneiden mit EcoRI; B: pTM12 und pfdAl nach Schneiden mit EcoRI; C: pTM12 und- pfdAl nach Schneiden mit Bam11I; D: pTM1l nach Doppelverdauung mit Bam11I/EcoRI; F: fd1O6 nach Doppelverdauung mit BamHI/EcoRI.
Lineares Plasmid pfdAl ist markiert durch LS; das Fragment mit der Kin-Resistenz (E, pfdA1; F, fd106) ist durch jimarkiert. Der Unterschied in der Wanderung der beiden Banden ergibt sich aus der Beseitigung des Fragments, das den Ursprung der Replikation von fdll enthält, Schwache Banden sind pTM DNA.
Abb. 6: Vermehrung des Plasmids pfdAl in fd infizierten Zellen.
Superhelikale DNA (A) und Phagenpartikel (B) wurden von Zellen isoliert, die mit dem Bakteriophagen fd infiziert waren und mit Plasmid pfdAl transformiert wurden. Proben der superhelikalen DNA und der entproteinisierten Phagen wurden auf einem 1,2%gen Agarosegel elektrophoretisiert. Die Position der fd Einzelstränge (fdSS) und der fd RFI und des pfdAl sind markiert. Einzelstränge von pfdAl sind auf dem Gel nicht sichtbar. Dies zeigt eine Verpackungsausbeute von pfdAl an, die geringer als 0,5% ist.
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Claims

Patentansprüche 1. Biologisch sicheres, nach Transformation in eine Wirtszelle zur Replikation nützlicher Nukleotidsequenzen befähigtes Klonierungssystem, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß es aus a) einem nicht selbst replizierbaren Vektor, der eine durch einen externen Initiator initiierbare Startstelle für seine Replikation und für eine definierte Restriktionsendonuklease vorzugsweise nur eine Schnittstelle aufweist, sowie b) einem selbst replizierenden Plasmid, das die Nukleotidsequenz enthält, die für den für die Replikation des Vektors erforderlichen Initiator kodiert, besteht.
2. Nicht selbst replizierbarer Vektor zur Klonierung von nützlichen Nukleotidsequenzen, dadurch gekennzeichnet, daß er eine durch einen externen Initiator initiierbare Startstelle für seine Replikation und für eine definierte Restriktionsendonuklease vorzugsweise nur eine Schnittstelle aufweist.
3. Nicht selbst replizierbarer Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine durch einen externen Initiator initiierbare Startstelle für seine Replikation aufweist und eine nützliche Nukleotidsequenz kloniert enthält.
4. Selbst replizierendes Plasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es die Nukleotidsequenz enthält, die für den Initiator kodiert, der für die Replikation des nicht selbst replizierbaren Vektors gemäß Anspruch 2 oder 3 erforderlich ist.
5. Transformierte Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Plasmid gemäß Anspruch 4 eingeschleust enthält.
6. Zur Replikation nützlicher Nukleotidsequenzen befähigte transformierte Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie a) einen Vektor gemäß Anspruch 3, sowie b) ein Plasmid gemäß Anspruch 4 eingeschleust enthält.
7. Biologisch sicheres, nach Transformation in eine Wirtszelle zur Replikation nützlicher Nukleotidsequenzen befähigtes Klonierungssystem, dadurch gekennzeichnet, daß es aus a) einem selbst nicht replizierbaren Vektor, der eine-durch Bakteriophage Ff Gen 2-Protein initiierbare Startstelle für seine Replikation und für eine definierte Restriktionsendonuklease vorzugsweise nur eine Schnittstelle aufweist, sowie b) einem selbst replizierenden Plasmid, das die Nukleotidsequenz enthält, die für Bakteriophage Ff Gen 2-Protein kodiert, besteht.
8. Nicht selbst replizierbarer Vektor zur Klonierung von nützlichen Nukleotidsequenzen, dadurch gekennzeichnets daß er eine durch Bakteriophage Ff Gen 2-Protein initiierbare Startstelle für seine Replikation und für eine definierte Restriktionsendonuklease vorzugsweise nur eine Schnittstelle aufweist.
9. Nicht selbst replizierbarer Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine durch Bakteriophage Ff Gen 2-Protein initiierbare Startstelle für seine Replikation aufweist und eine nützliche Nukleotidsequenz kloniert enthält.
10. Selbst replizierendes Plasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es die Nukleotidsequenz enthält, die für Bakteriophage Ff Gen 2 Protein kodiert.
11. Transformierte Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie däs Plasmid gemäß Anspruch 10 eingeschleust enthält.
12. Transformierte, mit Ff-Phagen infizierte Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Vektor gemäß Anspruch 8 und 9 enthält.
13. Zur Replikation nützlicher Nukleotidsequenzen befähigte transformierte Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie a) einen Vektor gemäß Anspruch 9 sowie b) ein Plasmid gemäß Anspruch 10 eingeschleust enthält oder mit einem Ff-Phagen bzw. einem Derivat desselben infiziert ist.
14. Vektor nach Anspruch 1 bis 3, 6 bis 9 oder 13, dadurch gekenazeichnet, daß er mindestens einen selektionierbaren Marker enthält.
15. Plasmid nach Anspruch 1, 4 bis 7 oder 10, 11 und 13, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens einen selektionierbaren Marker enthält.
16. Klonierungssystem nach Anspruch 1 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor und das Plasmid mindestens einen verschiedenen Marker aufweisen.
17. Transformierte Wirtszellen nach Anspruch 5, 6 oder 11-13, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen prokaryontische Zellen sind.
18. Transformierte Wirtszellen nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die prokaryontischen Zellen E.coli sind.
19. Vektor nach Anspruch 7 bis 9 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß er sich von Bakteriophagen fd 106 und fd 11 ableitet.
20. Plasmid nach Anspruch 7 bis 9 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß es sich vom Plasmid pBR325 und fdll ableitet.
21. Verfahren zur Herstellung des Vektors nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man aus einem Plasmid oder Bakteriophagen eine Startstelle für die Replikation herausschneidet, deren Replikation von einem externen, vom Plasmid oder Bakteriophagen kodierten Initiator abhängt, und diese mit einem selektionierbaren Marker (nach Anspruch 14) verknüpft.
22. Verfahren zur Herstellung des Vektors nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in den gemäß Anspruch 21 erhaltenen Vektor eine nützliche Nukleotidsequenz kloniert.
23. Verfahren zur Herstellung des Vektors gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man aus Bakteriophage Ff die Startstelle für die Replikation herausschneidet und diese mit einem selektiollierbarea Marker verknüpft.
24. Verfahren zur Herstellung des Plasmids nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man in ein selbst replizierendes Plasmid die Nukleotidsequenz kloniert> die für den Initiator kodiert, der für die Replikation des nicht selbst replizierbaren Vektors gemäß Anspruch 2 oder 3 erforderlich ist.
25. Verfahren zur Herstellung des Plasmids nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man in ein selbst replizierendes Plasmid die Nukleotidsequenz kloniert> die für Bakteriophage Ff Gen 2-Protein kodiert.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß man als selbst replizierendes Plasmid pBR325 verwendet.