DE3127138A1 - Messgefaess fuer analysen unter verwendung fest angebrachter enzyme - Google Patents
Messgefaess fuer analysen unter verwendung fest angebrachter enzymeInfo
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Description
1A-54 967 D-8000 MÜNCHEN 90
Olympus Optical Company Ltd. , schweigerstrassez
Toyko, Japan
telefon: (089) 66 zo 51
TELEGRAMM: PROTECTPATENT TELEX: J 24 070
Meßgefäß für Analysen unter Verwendung fest angebrachter Enzyme
Die Erfindung betrifft ein Meßgefäß für Analysen unter Verwendung
eines fest angebrachten Enzyms in einem selbsttätigen Analysiergerät für biochemische Analysen.
Bisher sind Enzyme für qualitative und quantitative Analysen eines gewissen Stoffs aufgrund der Substratspezifizität verwendet
worden und sind weitverbreitet auf biochemischem Gebiet, da sie eine hohe analytische Empfindlichkeit besitzen.
Weil Enzyme teuer sind, sind verschiedene Verbesserungen unternommen worden, um ein Enzym über längere Zeit hinweg wiederholt
und stabil benutzen zu können. Die Verwendung fest angebrachter Enzyme, die jeweils durch Fixieren des Enzyms an
einem nicht löslichen Peststoff gebildet werden, ist daher in neuerer Zeit schon vielfach anzutreffen. Für selbsttätige Analysen wird ein Strömungssystem verwendet, bei dem das Enzym an
einerInnenfläche eines Nylonschlauchs fest angebracht ist, oder
ein Strömungssystem mit einer Säule, die mit Perlen gefüllt ist, an denen Enzyme haften, und schließlich auch ein Elektrodensystem,
welches einen fest angebrachten Enzymfilm und dgl. aufweist. Alle diese Anordnungen eignen sich für eine Einfachkanal-Einfachpos
ten-Analyse aber nicht für eine Einfachkanal-Mehrfachposten-Analyse.
Wenn das Strömungssystem für eine Kehrfachposten-Analyse angewendet wird, bleibt als latentes
Problem die Gefahr des Übertrags. Im Fall der Elektrodenanordnung muß für jeden Posten ein fest angebrachter Enzymfilm
und eine Anzeige- oder Meßelektrode verwendet werden, so daß
.für die Mehrfachposten-Analyse eine Vielzahl fest angebrachter Enzymfilme und Elektroden benötigt werden. Folglich eignet
sich die Elektrodenanordnung aus wirtschaftlichen Gründen und
wegen der Leistungsfähigkeit nicht für Mehrfachposten-Analysen.
Aufgabe der Erfindung ist es, die genannten Nachteile bekannter
Meßgefäße mit fest angebrachtem Enzym tunlichst zu vermeiden und ein Meßgefäß für Analysen mit fest angebrachtem Enzym zu
schaffen, welches in einem selbsttätigen biochemischen Analysiergerät nicht nur für die Analyse eines einzelnen Postens - ■■
sondern auch für Mehrfachposten-Analysen verwendbar ist.
Zur Lösung dieser Aufgabe sieht die Erfindung bei dem eingangs
genannten bekannten Meßgefäß für Analysen unter Verwendung
eines fest angebrachten Enzyms vor, daß es eine innere Umfangsoberfläches
die zumindest teilweise mit mindestens einem fest angebrachten Enzym versehen ist und einen beweglichen Boden
aufweist^-
Vorteilhafte Ausgestaltungen dieses Meßgefässes ergeben sich
aus den Unteransprücheno
Im Meßgefäß für Analysen unter Verwendung eines fest angebrachten Enzyms gemäß der Erfindung haftet mindestens ein fixiertes Enzym'
an mindestens einem Teil der inneren Umfangsfläche des Meßgefässes, so daß das Reagenz wirtschaftlich genutzt werden
kann und gleichzeitig die verschiedenen Vorteile beibehalten bleiben, die auf der Verwendung des bekannten,fest angebrachten
Enzyms beruhen, und außerdem das Reagenz stabil einsetzbar und leicht zu'beiiahren ist. Ferner ermöglicht die Erfindung,
nicht nur EinCachkanal-Einfachposten-Analysten sondern auch
Einfachkanal-Mehrfachposten-Analysen durchzuführen. Darüber hinaus ist das Meßgefäß gemäß der Erfindung am Boden mit einer
Antriebsvorrichtung für den Bodenteil versehen, so daß die
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Stellung des Bodens entsprechend dem zu analysierenden Posten
bewegbar ist, "beispielsweise entsprechend einem Posten, für den
das Enzym nicht benötigt wird, einem Posten, für den ein bestimmtes Enzym nötig ist, und dgl. In manchen Fällen läßt sich
eine rasche, kontinuierliche Messung durchführen. Zum Waschen des Meßgefässes kann der Boden mittels der Antriebsvorrichtung
ohne weiteres nach unten zu einer Abgabeöffnung für Waschwasser
bewegt werden, so daß das benutzte Reagenz und die Probe, die die Ursache für Verschmutzung sein können, nicht im Gefäß zurückbleiben,
was eine exakte Messung ermöglicht. Wenn das Meßgefäß gemäß der Erfindung mit den obengenannten vorteilhaften
Merkmalen in einem automatischen Analysiergerät für biochemische
Analysen angeordnet ist, läßt sich nicht nur eine Einfachkanal-Mehrfachposten-Analyse
durchführen, sondern auch eine Verbesserung der Wirtschaftlichkeit, der Genauigkeit der Analysewerte
und dgl. erzielen.
Im folgenden ist die Erfindung mit weiteren vorteilhaften Einzelheiten
anhand schematisch dargestellter Ausführungsbeispiele näher erläutert. In den Zeichnungen zeigt:
Fig. 1 ein Gesamtschema eines biochemischen Analysiergeräts mit einem Ausführungsbeispiel einer Meßvorrichtung gemäß
der Erfindung;
Fig. 2A und 2B Schnittansichten von Meßgefässen gemäß der Erfindung;
Fig. 3A und 3B Schnittansichten von Meßgefässen gemäß der Erfindung, die am Boden jeweils mit einer Antriebsvorrichtung
versehen sind.
In Fig. 1 ist ein selbsttätiges Analysiergerät für biochemische Analysen als Ganzes gezeigt, welches mit einem Ausführungsbeispiel
eines Meßgefässes gemäß der Erfindung versehen ist.
In Pfeilrichtung wird längs einer Probenreihe ein Probengefäß
1 "befördert. Eine im Probengefäß 1 enthaltene Probenflüssigkeit
wird in gegebener Menge von einem Probenpipettierglied 2
an ein Reaktionsröhrchen 3 abgegeben. Dies Reaktionsrohrchen
3 ist ein Meßgefäß gornäß der Erfindung. Anclorerr.ei tr. wird f.in
in einem Reagenzvorratsbehäl te.r k entha]tenes Kearonz mittoJr
eines Reagenzpipettiergliedes 5 in das Reaktionsrohrchen 3 abgegeben»
Das Reaktionsrohrchen 3 steht unter thermostatischer Steuerung in einer thermostatischen Kammer 6. Im Reaktionsrohrchen
3 wird die Probenflüssigkeit mit dem Reagenz umgesetzt. Die Reaktionsflüssigkeit wird z.B. mittels eines Verfahrens
unter Verwendung ionenempfindlicher Elektroden, einer spektroskopischen Analyse oder dgl» gemessen und der Meßwert als
elektrisches Signal in einen Meßschaltkreis eingegeben (siehe
Fig„ 2A)3, wo das Signal in einen der Konzentration entsprechenden
Wert umgewandelt und aus dem Schaltkreis abgegeben wird. Nach beendigter Messung wird die im Reaktionsrohrchen 3 vorhandene
Reaktionsflüssigkeit mittels einer Entleerungspumpe 7
in einen Abfallbehälter 8 abgegeben. Dann wird aus einem Wasserbehälter
9 mittels einer Pumpe 10 Waschwasser in das Reaktions*-
röhrchen 3 geleitet, um das Innere desselben zu reinigen.· Anschließend wird das Waschwasser mittels der Entleerungspumpe
in den Abfallbehälter 8 abgegeben.
In den Fig. 2A und 2B sind Ausführungsbeispiele von Meßgefässen gemäß der Erfindung im Schnitt gezeigt.
Das Meßgefäß bzw. Reaktionsrohrchen 3 gemäß der Erfindung kann
verschiedene Gestalt haben und ist bei dem hier gezeigten Ausführungsbeispiel ein hohler Zylinder. An mindestens einem Teil
der inneren Umfangsflache des Reaktionsröhrchens3 ist ein
fixiertes Enzym in Form eines Bandes 11 vorgesehen. Beim gezeigten Ausführungsbeispiel sind drei verschiedene fest angebrachte
Enzymbänder 11a, 11b und lic axial in Abständen von
einander an der inneren Umfangsflache des Reaktionsröhrchens 3
vorgesehen, deren Enzyme sich, wie schon gesagt, voneinander unterscheiden. Ferner hat das Reaktionsrohrchen 3 einen nach
oben und unten bewegbaren Boden 12„ Der Boden 12 kann also
-.L
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innerhalb des Reaktionsröhrchejns 3 entsprechend dem gewünschten
Keßposten, der Flüssigkeitsabgabe "bzw. dem Viaschvorgang zu der
entsprechenden. Stellung bewegt werden.
FIg". 2A zeigt ein Ausführungsbeispiel des Reaktionsrohrchens 3
zur Verwendung in einem mit ionenempfindlicher Elektrode arbeitenden
Verfahren. In diesem Fall ist der Boden 12 des Reaktionsröhrchens 3 mit einer Meß- oder Anzeigeelektrode 13 und einer
Bezugselektrode Ik versehen, die beide an einen Meßschaltkreis
15 angeschlossen sind. Ferner ist jedes fest angebrachte Enzymband 11 auf einem entsprechenden ionenempfindlichen Film angeordnet,
der auf einem Gatterbereich eines ionenselektiven Feldeffekttransistors (ISFET) 16 ausgebildet ist, welcher an
axial vorherbestimmter Stelle in der Wand des Reaktionsrohrchens
eingebettet und an den Meßschaltkreis 15 angeschlossen ist. Um
die Aufgabe des ISFET 16 voll ausnutzen zu können, muß das fest angebrachte Enzymband 11 porös oder mit einer Vielzahl
von Öffnungen versehen sein. Gemäß einer Alternative kann der ISFET 16 oder eine ionenempfindliche Elektrode oberhalb und
unterhalb jedes fest angebrachten Enzymbandes und getrennt von denselben angeordnet sein.
Fig. 2B zeigt ein Ausführungsbeispiel eines Reaktionsrohrchens
3 zur Verwendung in der spektroskopischen Analyse. In diesem Fall ist die Wand des Reaktionsrohrchens lichtdurchlässig, und
es sinddrei fest angebrachte Enzymbänder 11 an der inneren Umfangsfläche
des Röhrchens in axial vorherbestimmten Abständen voneinander angeordnet. Ferner sind an beiden Seiten des Reaktionsrohrchens
.3 Lichtquellen 17, Linsen 18, Interferenzfilter 19 von jeweils unterschiedlichem Durchlässigkeitsgrad
sowie Lichteitipfangselemente 20 angeordnet.
Wenn bei Benutzung des Reaktionsrohrchens 3 für den Analyseposten
das fest angebrachte Enzym benötigt wird, wird der Boden 12 zunächst in solche Stellung bewegt, daß die in das
Reäktionsröhrchen 3 zu füllende Probenflüssigkeit sowie das
Reagenz ausreichend mit dem benötigten fest angebrachten Enzymband
11 in Berührung treten können. Dann werden mittels entsprechender Pipettierglieder die Probenflüssigkeit und das Beagenz
in das Reaktionsröhrchen 3 gefüllt, wo sie mit dem Enzym
in Berührung gelangen, um die für einen gegebenen Posten nötige Reaktion durchzuführen. Nach Beendigung der Reaktion wird die
entsprechende Messung an der Reaktionsflüssigkeit vorgenommen. Nach beendigter :.Messung wird der Boden 12 in solche Stellung
bewegt, daß die Reaktionsflüssigkeit mittels der Entleerungspumpe 7 in den Abfallbehälter 8 durch eine Entleerungsöffnung
21 abgegeben werden kann, um auf diese Weise die Flüssigkeit
zu entfernen und das Gefäß zu waschen.
Wenn für einen Analyseposten das fest angebrächte Enzym nicht
benötigt wird8 wird derjenige Bereich des Reaktionsröhrchens 3
benutzt, an dessen innerer Umfangsfläche kein fest angebrachtes Enzym vorhanden ist, d.h. ein enzymfreier Bereich 22. In diesem
Fall wird der Böden 12 des Reaktionsröhrchens 3 zunächst in solche Stellung gebracht, daß die in das Reaktionsröhrchen zu
füllende Probenflüssigkeit und das Reagenz nie mit dem fest angebrachten Enzymband 11 in Berührung gelangen. Dann wird
mittels der entsprechenden Pipettierglieder die Probenflüssigkeit und das Reagenz in das Reaktionsröhrchen 3 gefüllt, wo
sie ohne Berührung mit dem fest angebrachten Enzym miteinander
umgesetzt werden. Der Vorgang nach beendigter Reaktion ist der gleiche wie bei" dem bereits beschriebenen Beispiel eines Analysepostens
unter Verwendung des fest angebrachten Enzyms.
Durch Wiederholen des obengenannten Verfahrens für jeden Posten
im Meßgefäß bzw« im Reaktionsröhrchen gemäß der Erfindung kann
also eine Einkanal-Mehrposten-Änalyse durchgeführt werden.
Außerdem kann, wenn die Wand des Reaktionsgefässes, die dem enzymfreien Bereich 22 entspricht, lichtdurchlässig ist, eine
kolorimetrische Analyse durchgeführt werden.
Die Erfindung soll nun in Anwendung an eine Messung unter
Benutzung ähnlicher Reagenzien, die einander nicht stören, beschrieben werden.
Es ist allgemein bekannt, daß Glukose, Cholesterin, Neutralfett,
Phospholipid, Harnsäure und dgl. alle mit einem oxidierenden Enzym unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid reagieren.
Deshalb wird beim Messen dieser Substanzen unter Verwendung ähnlicher Reagenzien das Verfahren der Probenaufgabe
-9 Reagenzaufgabe -? Messung des Postens a ■? Messung des Postens
b -» Flüssigkeitsabgabe ■? Waschen durchgeführt, statt das Verfahren
für jeden Posten als Probenaufgabe -$>
Reagenzaufgabe ·» Messung ■>
Flüssigkeitsabgabe -^Waschen zu wiederholen, wie oben erwähnt. Das bedeutet, daß Mehrfachposten kontinuierlich
pemessen werden können.
Wenn z.B. die freie Cholesterinmenge und die Cholesteringesamtmenge
der Probenflüssigkeit unter Verwendung des Meßgefässes
gemäß der Erfindung (Fig. 2A) kontinuierlich gemessen werden, wird der Boden 12 des Reaktionsröhrchens zunächst in eine
Stellung bewegt, die einem fest angebrachten Enzymband 11a entspricht, welches Cholesterinoxidase enthält. Dann wird die .
Probenflüssigkeit und ein gegebenes Reagenz (phosphorsaure Pufferlösung) in das Reaktionsröhrchen 3 gefüllt, wo das in der
Probenflüssigkeit enthaltene freie Cholesterin unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid oxidiert. Die entstehende Menge Wasserstoffperoxid
wird mittels der Meßelektrode I3 gemessen, die
im Boden 12 eingebettet ist (Messung der freien Cholesterinmenge).
Danach wird der Boden 12 in eine Stellung bewegt, die einem .fest angebrachten Enzymband lib entspricht, welches Cholesterinesterhydrase
und Cholesterinoxidase enthält, . wodurch esterartiges Cholesterin in der Probenflüssigkeit unter
Erzeugung von Wasserstoffperoxid hydrolisiert und oxidiert wird. Wiederum wird.die Menge des entstehenden Wasserstoffperoxids
mittels der Meßelektrode I3 gemessen. Der Meßwert wird mit dem
Meßwert für freies Cholesterin kombiniert, um den Cholesteringesamtwert.
zu bestimmen (Messung der Cholesterxngesamtmenge).
Wenn im Fall der oben beschriebenen kontinuierlichen Messung die Menge des für den zweiten Posten benötigten Reagenz nicht
ausreicht, oder wenn die für den zweiten Posten einzusetzende Menge des Reagenz größer ist als die für den ersten Posten benutzte
Reagenzmenge kann die zusätzliche Menge des Reagenz für
den zweiten Posten nach der Abwärtsbewegung des Bodens 12 und vor dem Messen des zweiten Postens hinzugefügt werden» Das bedeutet,
daß die Messung rasch auf die geänderte Reagenzmenge für jeden Posten anspricht.
In Fig. 3& und JB sind Ausführungsbeispiele des Meßgefässes
oder Reaktionsröhrchens gemäß der Erfindung im Schnitt gezeigt, die an ihrem Boden jeweils mit einer Antriebsvorrichtung
für den Boden versehen sind..
Fig. 3A zeigt ein Ausführungsbeispiel des Reaktionsröhrchens 3»
bei dem als Antriebsvorrichtung ein Schrittschaltmotor 23, der
an eine Motorsteuerschaltung Zh angeschlossen ist, am Boden 12
angebracht ist. .
Fig. 3B zeigt ein Ausführungsbeispiel des Reaktionsröhrchens
39 bei dem als Antriebsvorrichtung ein Umkehrmotor 25 am Boden
12 angebracht ist. Da der Umkehrmotor 25 den Boden 12 des Reaktionsröhrchens
3 nach oben und unten bewegt, wird die Betätigung dieses-Motors durch Wahrnehmen von Strahlung gesteuert,
die von einer Photodiode 26 ausgeht, welche entsprechend
jeder Halteposition des Bodens 12 an einer vom Boden 12 nach unten vorstehenden Hubantriebswelle angebracht ist und
mit einem Lichtmeßfühler 2? zusammenwirkt, um die Bewegung des Bodens 12 zu steuern.
Beim Meßgefäß gemäß der Erfindung kann der Boden abgesehen von dem genannten Motor von jeder beliebigen bekannten Antriebsvorrichtung
nach oben und unten bewegt werden.
Claims (1)
- PatentansprücheI0 Meßgefäß für Analysen tinter Verwendung fest angebrachter Enzymes Insbesondere für ein automatisches Analysiergerät fur "biochemische Analysen9dadurchgeke η η ζ; e i c hn e tdaß das Gefäß eineinnere Unrfangsoberflacheβ die zumindest teilweise mit mindestens einem fest angebrachten Enzym versehen ist, und einen beweglichen Boden (12). aufweist.2 ο Meßgefäß nach Anspruch I1dadurch gekennzeichnet , daß zwei oder mehr fest angebrachte Enzyme an der inneren Umfangsoberfläche des Gefässes in bestimmten axialen Abständen voneinander angeordnet sind«3« Meßgefäß nach Anspruch 1, dadurch gekennze i ohne t fässes lichtdurchlässig ist«,daß die Wand des Ge-kο Meßgefäß nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet , daß der Boden (12) mit einer Meßelektrode (13) und mit einer Bezugselektrode versehen ist«. .5. Meßgefäß nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet , daß ein ionenselektiver Feldeffekttransistor (16) in der Wand des Gefässes an einer Stelle eingebettet ist, die der Lage des fest angebrachten Enzyms entspricht.
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DE3127138C2 DE3127138C2 (de) | 1983-01-27 |
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