DE2944143A1

DE2944143A1 - Neues antibiotikum sf-2052, verfahren zur herstellung desselben sowie antibakterielles mittel, welches das antibiotikum sf-2052 als wirkstoffkomponente enthaelt

Info

Publication number: DE2944143A1
Application number: DE19792944143
Authority: DE
Inventors: Shigeharu Inoue; Tatsuo Ito; Michio Kojima; Kazunori Ohba; Shoji Omoto; Takashi Shomura; Takashi Tsuruoka; Kanagawa Yokohama
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1978-11-06
Filing date: 1979-11-02
Publication date: 1980-05-08
Also published as: CH645385A5; ES8103166A1; FR2440955A1; DE2944143C2; IT1119435B; ES485746A0; IT7969161A0; FR2440955B1; GB2043050A; NL7908047A; GB2043050B

Description

MEISSNER & BOLTE

BREMEN

29AAU3

PATENTANWÄLTE nlPL.-ING. HANS MEISSNER niPL.-ING. ERICH BOLTE

Anmelder: MEIJI SEIKA KAISHA, LTD. 4-16, Kyobashi 2-chome, Chuo-ku, Tokyo, Japan

Erfinder; Kazunori OHBA,

1443, Hiyoshi-Honcho, Kohoku-ku, Yokohama-shi, Kanagawa-ken, Japan

D 28OO BREMEN Slevogtitrafia 21 Bundeuepubllk DeuhditoiKl Telelon 0421 -34 201t Telegramme: PATMEIS BREMEN Telex: 244157 (meibo d)

Datum

Unser Zeichen

Ihr Zelchm

31.10.1979 1511

Takashi SHOMURA,

203, Komaoka-cho, Tsurumi-ku,

Yokohama-shi, Kanagawa-ken,Japan

Michio KOJIMA,

30-8, Honcho 1-chome,

3hibuya-ku, Tokyo, Japan

Shoji OMOTO,
4-3-14-407, Kami Osaki, Shinagawa-ku, Tokyo, Japan

Takashi TSURUOKA,

2-88, Tode-cho, Saiwai-ku,

Kawasaki-shi, Kanagawa-ken, Japan

Shigeharu INOUE,

16-2, Tsutsujigaoka, Midori-ku,

Yokohama-shi, Kanagawa-ken, Japan

Tatsuo ITO,

15S8-5, Takamori, Isehara-shi,

Kanagawa-ken, Japan

Neues Antibiotikum SF-2052, Verfahren zur Herstellung desselben sowie antibakterielles Mittel, welches das Antibiotikum SF-2052 als Wirkstoffkomponente enthält

Die Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum, welches die Bezeichnung SF-2052 trägt. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung dieses neuen

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Antibiotikums durch Züchtung eines Stammes von Actinomycetes, insbesondere eines Stammes der Gattung Dactylosporangium oder der Gattung Micromonospora in einem geeigneten Kulturmedium. Schließlich betrifft die Erfindung auch ein antibakterielles Mittel, welches das Antibiotikum SF-2052 als Wirkstoff komponente enthält.

Aus der Kulturbrühe verschiedener Stämme von Mikroorganismen ist bereits eine große Zahl unterschiedlicher Antibiotika isoliert worden. Bei dem Versuch, neue und wertvolle Antibiotika zu finden, die nicht nur sowohl gegen gram-negative als auch gegen grampositive Bakterien, sondern auch gegen verschiedene gegenüber den bekannten Antibiotika resistente Bakterienstämme wirksam sind, ist jetzt die Gärbrühe eines neuen Mikroorganismus untersucht worden, der die Bezeichnung Dactylosporangium matsuzakiense SF-2052 trägt. Dabei konnte festgestellt werden, daß ein neues Antibiotikum erzeugt wird, wenn man diesen Mikroorganismus in einer Gärbrühe, die assimilierbare Nährstoffe enthält, unter aeroben Bedingungen züchtet. Das neue Antibiotikum konnte aus der Gärbrühe isoliert werden und wurde als Substanz SF-2052 bzw. einfach als SF-2052 bezeichnet. Die chemischen, physikalischen und biochemischen Eigenschaften von SF-2052 konnten fest-

25 gestellt werden. Es konnte außerdem festgestellt

werden, daß sich das neue Antibiotikum auch gewinnen läßt, wenn man den Stamm eines weiteren neuen Mikroorganismus mit der Zeichnung Micromonospora sp. SF-2098 züchtet.

Es ist infolgedessen die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Antibiotikum, nämlich SF-2052, welches als antibakterielles Mittel brauchbar ist, bereitzustellen und ein Verfahren vorzuschlagen, mit

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welchem dieses neue Antibiotikum unter Verwendung eines Stammes von Actinomycetes gewinnbar ist.

Gegenstand der Erfindung ist zum Ersten das neue Antibiotikum SF-2052 einschließlich der pharmazeutisch akzeptablen Säureanlagerungssalze derselben. SF-2052 ist eine wasserlösliche basische Verbindung mit antibakterieller Wirkung, deren Hydrochlorid in Form eines farblosen und amorphen Pulvers vorliegt, welches unter neutralen und sauren Bedingungen im wesentlichen beständig, unter alkalischen Bedingungen jedoch instabil ist, keinen definierten Schmelzpunkt zeigt, vielmehr sich bei oder nahe bei 170⁰C allmählich braun verfärbt und sich bei 209 bis 210⁰C unter Aufschäumen zersetzt. Die Reaktion gegen Ninhydrin, Lemieux-Reagenz und Greig-Leiback-Reagenz ist positiv, die Reaktion gegen Sakaguchi-Reagenz und Silbernitrat dagegen negativ. Das Hydrochlorid ist leicht löslich in Wasser, löslich in Methanol und unlöslich in Äthylacetat, Chloroform, Benzol und Äthyläther.

Das SF-2052-Hydrochlorid weist darüberhinaus folgende weitere Kennzeichen auf:

(a) Gewichtsanalyse: C 35,69 %; H 7,04 %; N 11,80 %;

(b) das Fehlen eines charakteristischen Absorptions-Peaks bei 220 mn bis 370 mn im Ultraviolett-

25 Absorptionsspektrum in wässriger Lösung;

(c) ein Infrarot-Absorptionsspektrum in Kaliumbromidtablette entsprechend dem in Figur 1 der hier beigefügten Zeichnungen dargestellten;

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(d) ein Wasserstoff-NMR-Absorptionsspektrum in Deuterowasser entsprechend dem in Figur 2 der beigefügten Zeichnungen dargestellten;

(e) ein Kohlenstoff-IMR-Absorptionsspektrum in

Deuterowasser entsprechend dem in Figur 3 der beigefügten Zeichnungen dargestellten;

(f) eine spezifische optische Drehung von

(a)_D = +87° (c=1, Wasser) in wässriger Lösung;

(g) einen Einzelfleck bei Rf = 0,46 bei der Dünn-Schichtchromatographie an Cellulose unter Verwendung von n-Propanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (15:10:3:12) als Laufmittel sowie einen weiteren Einzelfleck bei Rf = 0,09 bei der Papierchromatographie mit n-Butanol-Essigsäure-Wasser (2:1:1) als Laufmittel (aufsteigende Methode).

SF-2052 gemäß vorliegender Erfindung kann in Form von Säureanlagerungssalzen mit pharmazeutisch akzeptablen anorganischen Säuren wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure oder Phosphorsäure oder mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Ascorbinsäure oder Apfelsäure vorliegen.

Die Eigenschaften von SF-2052-Hydrochlorid können wie folgt zusammengefaßt werden:

1. Aussehen: farblos, amorphes Pulver.

2. Schmelzpunkt: kein definierter Schmelzpunkt;

langsame Verfärbung nach braun beim Erwärmen bei oder nahe bei 170⁰C; anschließend Zersetzung bei 209 bis

21O⁰C unter Aufschäumen.

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3. Gewichtsanalyse: C 35,69 54; H 7,04 %-, N 11,80 %.

4. Ultraviolett-Absorptionsspektrum: kein charakteristischer Absorptions-Peak bei Wellenlängen zwischen 220 mn und 370 nm.

5. Infrarot-Absorptionsspektrum: SF-2052-Hydrochlorid

in Kaliumbromidtablette zeigte das in Figur 1 dargestellte Spektrum. Hauptabsorptions-Peaks bei 2900 3500, 1720, 1640, 1510, 1120 und

1050 cm"¹.

6. Molekulargewicht: da SF-2052 unter alkalischen pH-

Bedingungen instabil ist, konnte die freie Base nicht in beständiger Form gewonnen werden. Infolgedessen

war eine direkte Bestimmung des Molekulargewichtes nach der Massenspektrometrie sehr schwierig. Aus dem Kohlenstoff-NMR-Spektrum sowie anderen vorliegenden Daten korinte

abgeleitet werden, daß SF-2052 in Form der freien Base ein Molekulargewicht von etwa 400 bis 450 aufweist.

7. Löslichkeit: leicht löslich in Wasser, löslich in

Methanol und praktisch unlöslich in organischen Lösungsmitteln wie Chloroform, Äthylacetat, Hexan, Benzol, Äthyläther etc.

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8. Beständigkeit: relativ beständig unter sauren bis

neutralen pH-Bedingungen, jedoch instabil unter alkalischen pH-Bedingungen.

5 0. Rf-Werte bei der Dünnr.chicht-Chromatographie an Cellulose:

(a) Rf = 0,46 bei Entwicklung mit n-Propanol-Pyridin-Essisäure-Wasser (Volumenverhältnis 15:10:3:12),

10 (b) Rf =0,10 bei Entwicklung mit n-

Butanol-Essigsäure-Wasser (Volumenverhältnis 2:1:1).

10. Rf-Werte bei der Papier-Chromatographie (aufsteigende Methode Ί:

15 (a) Rf = 0,40 bei Entwicklung mit n-

Propanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (Volumenverhältnis 15:10:3:12),

(b) Rf = 0,09 bei Entwicklung mit n-Butanol-Essigsäure-Wasser (Volumen-

20 verhältnis 2:1 :1).

11. Farbreaktion: positiv bei Verwendung von Ninhydrin,

Greig-Leiback- und Lemieux-Reagenz,

negativ bei Verwendung von Sakaguchi-Reagenz und Silbernitrat.

12.-Kernmagnetische Resonanzspektren: das Wasserstoff-

NMR-Spektrum von SF-2052-HC1 in Deuterowasser (100 MHz, TMS,extern, Standard) ist in Figur 2 der Zeichnungen dargestellt. Hauptsignale wurden beobachtet bei 1,34 ppm (d),

2,00 ppm (m), 3,16 ppm (s), 3,51 ppm (s), 5,33 ppm (d) und 7,99 ppm (s).

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Kohlenstoff-NMR-Spektrum von SF-2052-HCl in Deuterowasser (Dioxan, intern, Standard) ist in Figur 3 dargestellt.

13. Spezifische optische Drehung: (cc)_D = + 87 (c=1,

H O).
2

Unter Berücksichtigung der vorstehend angegebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften von SF-2052-Hydrochlorid kann davon ausgegangen werden, daß SF-2052 in Form der freien Base der folgenden chemischen Strukturformel entspricht:

1
\ ^X OCH.

NH COCH₂NHCH

Erläuterung der beigefügten Zeichnungen:

Figur 1 zeigt eine Kurve des Infrarot-Absorptionsspektrums einer Probe von SF-2052-Hydrochlorid in Kaliumbromidtablette.

Figur 2 zeigt eine Kurve des Wasserstoff-NMR-Absorptionsspektrums einer Probe von SF-2052-Hydro-

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chlorid in Deuterowasser bei 100 MHz.

Figur 3 zeigt eine Kurve des Kohlenstoff-NMR-Ab-

sorptionsspektrums einer Probe von SF-2052-Hydrochlorid in Deuterowasser bei 25 MHz.

5 Die antibakterielle Wirkung von SF-2052 gemäß vorliegender Erfindung (in Form des Sulfates) bei der Inhibierunc des Aachstums verschiedener Bakterien wurde nach der serieller Standard-Verdünnungsmethode unter Verwendung eines Herz-Infusionsagar als Bebrütungs-10 medium bestimmt. Die Bebrütung wurde bei einer Temperatur von 37⁰C in 16 Stunden durchgeführt. Die Mindesthemmkonzentrationen (mcg/ml) von SF-2052-Sulfat sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt.

Tabelle 1

Antibakterielles Spektrum von SF-2052-Sulfat

Test-Mikroorganismen MHK (mcg/ml)

Bacillus subtilis PCI-219 1,56

Staphylococcus aureus 209P 3,12

Sarcina lutea 0,78

Escherichia coli 12,5

Escherichia coli B 6,25

Escherichia coli K-12-R 3,12

Klebsiella pneumonia 3,12

Proteus vulgaris 1,56

Pseudomonas aeruginosa 100

Mycobacterium smegmatis 607 Km-R 100

Mycobacterium smegmatis 607 Sm-R 1,56

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Aus den in der vorstehenden Tabelle enthaltenen Werten geht deutlich hervor, daß SF-2052 gemäß vorliegender Erfindung eine hohe antibakterielle Wirkung sowohl gegen gram-positive als auch gegen gram-negative Bakterien aufweist.

SF-2052 mit den vorstehend beschriebenen chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften stimmt offensichtlich mit keiner aus der Literatur bekannten Substanz überein und muß infolgedessen als eine neue Substanz bezeichnet v/erden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von SF-2052. Dieses Verfahren ist durch folgende Verfahrensschritte gekennzeichnet:

(a) Man züchtet einen SF-2052 erzeugenden Stamm von Actinomycetes, insbesondere einen Stamm von Dactylosporangium matsuzakiense SF-2052 in einem flüssigen wässrigen Kulturmedium, welches assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält, unter aeroben Bedingungen über eine solche Zeitspanne, daß sich die Substanz SF-2052 in dem Kulturmedium ansammeln kann, und

(b) man trennt die Substanz SF-2052 aus der Kultur ab.

Der SF-2052 erzeugende Mikroorganismus, Dactylosporangium matsuzakiense SF-2052, der für die vorliegende Erfindung verwendet wird, wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die bei Inagami-shrine in Matsuzaki-cho, Kamo-gun, Shizuoka-Prefecture, Japan im Februar 1977 eingesammelt wurde. Die Isolierung des Stammes SF-2052 wurde erreicht, indem man eine wässrige Suspension der Bodenprobe auf einem Isolations-Kulturmedium aus 0,2 % löslicher Stärke,

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0,04 % Ammoniumsulfat, 0,02 % Dikaliumphosphat, 0,02 % Magnesiumsulfat, 0,04 % Calciumcarbonat und 1,5 % Agar (pH-Wert nicht eingestellt) bei 28°C 30 Tage bebrütete. Der Stamm SF-2052 wurde bei der öffentlichen ,japanischen Hinterlegungsstelle "Fermentation Research Institute" in Chiba-City, Japan (jetzt verzogen nach Yatabe-cho, Tsukuba-gun, Ibaragi-Prefecture, Japan) unter der Hinterlegungs-Nr. FERM-P 4670 sowie außerdem bei der American Type Culture Collection, Washington,

10 D.C, USA unter der Hinterlegungs-Nr. ATCC 31570 am 26.September 1979 hinterlegt.

Der Stamm SF-2052 weist die im Folgenden angegebenen mikrobiologischen Eigenschaften auf. Die Beobachtungen wurden nach der Methode von E.B. Shirling und D.Gottlieb gemacht, die in dem "International Journal of Systematic Bacteriology" Iji, 313-340 (1966) festgehalten ist.

I. Morphologische Beobachtung:

Die Substratmycelien wachsen wellig mit reichlichen Verzweigungen und haben einen Durchmesser von 0,5 0,6 Mikron. Sowohl auf Agar-Medium als auch auf flüssigen Medien konnte im Regelfall eine Fragmentierung der Substratmycelien nicht beobachtet werden.

Luftmycelien wurden in praktisch allen Fällen nicht beobachtet, woraus geschlossen wird, daß sie tat-

sächlich nicht gebildet werden. Das Substratmycelium des Stammes SF-2052 trägt Sporangien einzeln oder in Büscheln an der Oberfläche von Agarmedium. Das Sporangium bildet sich verhältnismäßig reichlich auf Stärke-Agar-Medium, jedoch nur schwach auf Glycerin-Asparagin-Agar, Tyrosin-Agar und Hafermehl-Agar. Das Sporangium hat eine fingerähnliche Gestalt und eine Größe von

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0,9 - 1,4 χ 4,0 - 6,0 Mikron. Jedes Sporangium enthält üblicherweise eine einzelne Reihe rnit drei Sporen. Fast alle Sporen haben eine zylindrische oder ovale Form und die Oberflächenstruktur der Sporen ist glatt. Jede Spore weist eine Größe von 0,8 bis 1,3 x 1,1 bis 1,6 Mikron auf. Werden die Sporen beispielsweise in einem wässrigen Bodenextrakt suspendiert und 15 bis 30 Minuten abgestellt, so zeigen sie eine freie Beweglichkeit.

II. Kultureigenschaften auf verschiedenen Kulturmedien:

Die Kultureigenschaften des Stammes SF-2052 sind in der folgenden Tabelle 2 zusammengestellt. In der Tabelle beziehen sich die Beschreibungen der Farben in Klammern auf das Standardwerk "Color Harmony Manual" der Container Corporation of America. Die Bebrütung wurde bei 28°C durchgeführt und die Beobachtungen erfolgten jeweils nach einer Bebrütungsdauer von 21 Tagen.

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Tabelle

Kulturmedium

Sucrose-Hitrat-Agar

10

15

Glucose-Asparagin-Agar

Glycerin-Asparagin-Agar

Stärke-Agar

Hafermehl-Agar

Hefeextrakt-Malzextrakt-

Acar

20

30

Tyrosin-Agar

Nähr-Agar

Bennet-Agar 40

Wachstum und Farbe

gewöhnliches Wachstum, bernsteinfarbig bis schwach-orange (3 Ic)

gewöhnliches Wachstum, rötlich-orange (4 pe)

schwaches dünnes Wachstum, schwach Mellon-gelb (3 ea)

gewöhnliches bis gutes Wachstum, rötlichorange (4 pe)

gewöhnliches Wachstum, orange (4 Ic - 5 nc)

gewöhnliches Wachstum, schrumplig, bernsteinfarbig bis hellbraun (3 Ic - 4 ng)

gutes Wachstum, schwachgrauorange bis hellbraun (4 Ic-4 ng)

sehr schwaches Wachstum, schwach orange

gewöhnliches bis gutes Wachstum, rot1icn-orange (4 pe - 5 pe)

Luft- lösliches mycel Pigment

keim

keins

keins keins

keins keins

keins keins keins keins

bräunlichrosa

keins keins keins keins

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,. 29U143

~ At - 31.10.79

Fortsetzung Tabelle 2

Calciummalat-Agar schwaches bis keins keins

gewöhnliches Wachstum, hellorange (3 ga- 4 ga)

III. Physiologische Eigenschaften:

(1) Wachstums-Temperaturbereich: der Stamm SF-2052 wächst in einem Temperaturbereich von 15-40⁰C auf Stärke-Agar-Medium. Die optimale

10 Wachstumstemperatur liegt zwischen 25 und 37°C.

(2) Verflüssigung von Gelatine: bei 21-tägigera Bebrüten bei 20°C erfolgte keine Verflüssigung von Gelatine.

(3) Hydrolyse von Stärke: positiv (bei 21-tägigem 15 Bebrüten bei 28⁰C).

(4) Reduktion von Nitrat: negativ (bei 21-tägigem Bebrüten bei 28°C).

(5) Gerinnung von Magermilch: negativ (bei 21-tägigem Bebrüten bei 28°C).

(6) Peptonisierung von Magermilch: negativ (bei 21-tägigem Bebrüten bei 28°C).

(7) Bildung von Melanoid-Pigment: negativ.

IV. Ausnutzung von Kohlenstoffquellen:

Die Feststellung erfolgte beim Bebrüten bei 28°C an
25 einem Inkubationsmedium folgender Zusammensetzung:

Hefeextrakt (Difco) 5 g

Calciumcarbonat 1 g

Agar (Difco) 15 g

destilliertes Wasser 1000 ml

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Die Ergebnisse der Feststellung sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengestellt.

Tabelle 3

Kohlenstoffquelle Wachstum

5 D-Glucose +++

D-Xylose +++

D-Fructose ++

L-Arabinose +++

D-Mannitol +++

10 I-Inositol +

Rhamnose +++

Saccharose +++

Kaffinose +

kein Zusatz +

15 V. Chemische Zusammensetzung dei? Zellwand:

Die chemische Zusammensetzung der Zellwand und der gesamten Zelle des Stammes SF-2052 wurde nach der Methode von T.Yamaguchi analysiert, die in "J.Bact." 89_, 444-453 (1965) beschrieben ist; weiterhin erfolgte die Untersuchung nach der Methode von B.Becker et al, beschrieben in "Appl. Microbiol." 12,421-423 (1964) sowie nach der Methode von M.P. Lechevalier, beschrieben in "J.Lab. Clin. Med." £4, 934-944 (1968).

Aus den gewonnenen Analysenergebnissen konnte geschlossen werden, daß der Stamm SF-2052 zum Zellwandtyp II gehört, weil die Zellwand Hydroxydiamino-pimelinsäure und Glycin enthält. Das gesamte Zellzuckerschema gehört zum A- oder D-Typ, weil sich gezeigt hat, daß das Hydrolysat der Gesamtzelle Xylose und Galactose zusam-

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men mit einer Spur Arabinose enthält.

Im Hinblick auf die vorstehend erwähnten Eigenschaften des Stammes SF-2052 ist geschlossen worden, daß derselbe zur Gattung Dactylosporangium in der Ordnung Actinomycetales gehört. Von der Gattung Dactylosporangium sind zwei Arten, nämlich Dactylosporangium aurantiacum und Dactylosporangium thailandense bereits bekannt (J.E. Thiemann et al, "Arch.Mikrobiol." 58, 42-52 (1967) und "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" 8th ED., 1974). Ein Vergleich des Stammes SF-2o52 mit diesen bekannten Arten ist in der folgenden Tabelle 4 enthalten.

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Tabelle 4 Eigenschaften

Wachstum auf Glucose-Asparagin-Agar-Medium

Bildung von Sporangium auf Calciummalat-Agar-Medium

Wachstum auf Nähragar-Medium

Stamm SF-2052

gewöhnliches Wachstum, rötlich-orange

keins

sehr schwaches Wachstum,hellorange

keins D.aurantiacum

D.thailandense

Bildung von löslichem Pigment auf Hickey- und Tresner-Agar-Medium

Wachstum auf Kartoffel- kein Wachstum stück

Verflüssigung von negativ Gelatine

Reduktion von Nitrat negativ

Peptonisierung von negativ Magermilch

Ausnutzung von Raffinose keine Ausnutzung gewöhnliches Wachs- gewöhnliches Wachstum, schwach-orange

turn, v:eiß reichlich

sehr gutes Wachstum, weiß

keins

sehr schwaches Wachstum, hellorange

negativ

positiv positiv

rej chiich

Sutes Wachstum, orange

rötlich-braun

sehr schwaches Wachstum,rötlichbraun

positiv

negativ positiv

Ausnutzung

*1

gute Ausnutzung

Bemerkungen; *1 : auf einem Inkubationsmedium, beschrieben von J.E.Thiemann in "Arch.

Mikrobiol." 58, 42-52 (1967)

*2 : auf einem Inkubationsmedium wie vorstehend bei *1 angegeben, welches jedoch zusätzlich eine gewisse Menge Vitamine enthielt

*3 : auf einem Hefeextrakt-Calciumcarbonat-Agar-Medium. Der Stamm SF-2052 wuchs nicht auf den Medien *1 und *2.

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Der Stamm SF-2052 stimmt mit keiner der bekannten Arten der Gattung Dactylosporangium überein, so daß geschlossen wurde, daß es sich um eine neue Art handelt, die als Dactylosporangium matsuzakiense SF-2052 bezeichnet wurde.

Darüberhinaus ist es möglich gewesen, einen weiteren neuen Mikroorganismus aus einer Bodenprobe zu isolieren, die in Choshi-City, Chiba-Prefecture, Japan eingesammelt worden ist. Dieser neue Mikroorganismus erhielt die Bezeichnung SF-2098. Es wurde gefunden, daß der Stamm SF-2098 zur Ordnung Actinomycetales und zur Gattung Micromonospora gehört. Der Stamm SF-2098 wurde bei der öffentlichen japanischen Hinterlegungsstelle "Fermentation Research Institute" unter der Hinterlegungs-Nr.

FERM-P 5073 und bei der American vType Culture Collection unter der Hinterlegungs-Nr. ATCC 31580 am 16.Oktober 1979 hinterlegt. Es konnte festgestellt werden, daß der Stamm Micromospora sp. SF-2098 die Substanz SF-2052 gemäß vorliegender Erfindung erzeugt.

Zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung gehört infolgedessen auch ein Verfahren zur Erzeugung der Substanz SF-2052, welches durch folgende Verfahrensschritte gekennzeichnet ist:

(a) man züchtet einen Stamm von Micromonospora sp.

SF-2098 mit der Hinterlegungs-Nr. FERM-P 5073 bzw. ATCC 31580 in einem wässrigen flüssigen Kulturmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter aeroben Bedingungen über eine solche Zeitspanne, daß sich die Substanz SF-2052 in dem Kulturmedium bilden und ansammeln kann, und

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(b) man trennt die Substanz SF-20.52 aus dem Kulturmedium ab.

Der Stamm SF-2098 weist folgende mikrobiologische Eigenschaften auf:

5 I. Morphologische Beobachtung:

Der Stamm SF-2O98 bildet kein Luftmycel auf verschiedenen Agar-Kulturmedien, die üblicherweise für die Bebrütung von Actinomycetes-Stämmen verwendet werden. Die mikroskopische Untersuchung des Stammes SF-2098, der in einem flüssigen Kulturmedium bebrütet worden war, zeigt, daß das Substratmycelium mit Verzweigungen wächst und daß jeweils eine Spore an verschiedenen Stellen des Substratmycels gebildet wird. Bei der Beobachtung unter dem Elektronenmikroskop zeigt sich, daß die Spore annähernd

15 kugelförmige Gestalt hat; ihre Abmessung ist 1,0 bis 1,3 Mikron im Durchmesser. Die Sporenoberfläche zeigt stumpfe Stacheln.

II. Kultureigenschaften auf verschiedenen Kulturmedien:

Die Bedingungen der Züchtung des Stammes SF-2098, der auf verschiedenen Kulturmedien bei 28°C 15 bis 20 Tage bebrütet wurde, wurde beobachtet und in der folgenden Tabelle 5 zusammengestellt. Die Beschreibung der Farboti in Klammern bezieht sich wieder auf das Standardwerk "Color Harmony Manual" der Container Corporation oi^% America.

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Tabelle 5

Kulturmedium

Saccharose-Nitrat-Agar

Glucose-Asparagin-Agar

Glycerin-Asparagin-

Agar

Stärke-Agar

Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar

Hafermehl-Agar

Tyrosin-Agar

Nähr-Agar lösliches Pigment

keins

keins keins

keins

Wachstum und Farbe

gewöhnliches bis gutes Wachstum, erhöht, orange, (4 la - 4 na)

sehr schwaches Wachstum,farblos

schwaches Wachstum, gelblichbraun (3 ie), später wechselnd in oliv-grau (1 1/2 ge)

gewöhnliches Wachstum, bernsteinfarbig (3 Ic), später wechselnd in dunkel-oliv (1 1/2 pn)

gewöhnliches bis keins gutes Wachstum, helloliv-grau,

(1 1/2 Ii - 1 1/2 ig)

gewöhnliches Wachs- keins turn, bernsteinfarbig (3 Ic), später wechselnd in olivgrau (1 1/2 ig)

schwaches Wachs- keins tum, bernsteinfarbig bis gelblich-braun (3 Ic - 3 ie)

schwaches Wachs- keins turn, schwach

felblich-braun 3 gc)

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Fortsetzung Tabelle 5

Bennet-Agar gewöhnliches Wachstum, keins

feucht, bernsteinfarbig (3 3c)

Calciummalat- schwaches Wachstum, keins Agar helioliv-grau

(11/2 ge)

III. Physiologische Eigenschaften:

(1) Wachstumstemperaturbereich: der Stamm SF-2098 wächst in einem Temperaturbereich von 15-45°C.

(2) Verflüssigung von Gelatine: positiv (bei 21-tägiger Bebrütung bei 20⁰C).

(j) Hydrolyse von Stärke: positiv (bei iA-tägiger bobrüt'.ung boi PU C).

Vj (M R(i(M ni 1 u.snung von Magermilch: Peptonisierung und Gei■ n:r.i:i^r von Magermilch positiv (bei 21-tägiger Bebr.'itung boi :V>°C) .

i'j) Bildung v>n Meianoid-Pigment: negativ

(i->) Reduktion von IJi^ rat: negativ (bei lA-tägiger Bebriituti:, Ix.'i TiJ⁰C).

(7) NaCl-Vertriigl ichkei t (festgestellt nach der Methode ii. " InLorn. J .Syst .Bacteriol. " 2±, 240 (1')71 ):

pjtes WncJisi um bei 0 bit; 1,b %, schwaches Wachs- ','"} turn bei ; bis Λ Ά>, l;ein Wnchstuin bei nielir als

IV. Ausnutzung ν·"! Ι.ιΊι 1 nnr. t.of fquellen :

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	0		Λ θ/ *f ι /°*
Hefeextrakt (Difco)	1		,5 %
Calciumcarbonat	100.
Bacto-Acar (Difco)
destilliertes Wasser

Das Ergebnis der Feststellungen ist in der folgenden Tabelle 6 enthalten.

Tabelle 6

Kohlenstoffquelle Wachstum

kein Zusatz +

D-Glucose +++

D-Fructose ++

D-Xylose +++

Glycerin +

L-Arabinose +

D-Mannitol +

I - Inositol +

Saccharose +++

a-Melibiose +

Raffinose +

Rhamnose +

V. Chemische Zusammensetzung der Zellwand:

Die chemische Zusammensetzung der Zellwand des Stammes r>F-2098 wurde nach der Methode von B.Becker et al, oer.chrieben in "Appl. Microbiol." 1_3,236 (1^{)65), ana- 2b Lysiert;. Aus den Analysenergebnissen konnte geschlossen wcrvlen, daß die Zellwand Ilydroxydiamino-pimelinsüure

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Im Hinblick auf 'lie vorstehend erwähnten Eigenschaften des Stammes SF-2008 und insbesondere bei Berücksichtigung der Tatsachen, daß der Stamm SF-2O9O kein Luftmycel auf Agar-Medien bildet, den mesophilen Actinomycetes, die eine Einzelspore an ihrem Substratmycel aufweisen, zuzurechnen ist, und die Zellwand von SF-2090 Hydroxydiamino-pimelinsäure enthält, wurde der Stamm SF-2098 der Gattung Micromonospora zugerechnet. Folglich wurde für den Stamm SF-2098 die Bezeichnung Micromonospora sp.SF-2098 gewählt.

Bei der fermentativen Herstellung von SF-2052 gemäß vorliegender Erfindung, und zwar entweder mit dem Stamm Dactylosporangium matsuzakiense SF-2052 oder dem Stamm Micromonospora sp. SF-2098, wird der die Substanz SF-2052 erzeugende Stamm in an sich bekannter Weise in einem Kulturmedium gezüchtet, welches Nährstoffquellen enthält, die für gewöhnliche Microorganismen assimilierbar rind. Für den genannten Zweck können alle bekannten Nährstoffe verwendet werden, die auch üblicherweise bei der Züchtung bekannter Actinomycetes-Stämme verwendet werden. Beispiele für geeignete Nährstoffquellen sind Glucose, Glycerin, Saccharose, Stärke, Dextrin, Maltosesirup, Melasse und Sojabohnenöl als Kohlenstoffquellen, Sojabohnenmehl, Weisenkeime, Fleischextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Trockenhefe, Maisweichwasser, Baumwollsamenmehl, Ammoniumsulfat und Natriumnitrat als Stickstof fquellen. Erforderlichenfalls können auch anorganische Salxe wie Calciuracarbonat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, KobaltchLorid, Phosphate u.a. zugesetzt werden.

Darüberhinaus kann auch nützlich sein, solche organischen oder anorganischen Materialien zuzusetzen, die das Wachstum der Stämme SF-2O^r>2 oder SF-2098 unterstützen und die Bildung dor Substanz. SF-2ü'.2 fordern.

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Die Züchtung kann in der flüssigen Phase, insbesondere unter submersen Bedingungen durchgeführt werden, wie dies auch bei der Herstellung bekannter Antibiotika geschieht. Im vorliegenden Fall erfolgt die Züchtung unter aeroben Bedingungen. Der Stamm SF-2052 wird bei einer Temperatur von 25 - 37°C, in der Mehrzahl der Fälle bei einer Temperatur von 28 - 32 C bebrütet. In diesem Fall erreicht die Bildung der Substanz SF-2052 in der Kulturbrühe am Ende einer 2- bis 10-tägigen Bebriitungszeit sowohl bei Schüttelkultur als auch bei der ruhenden Tankkultur ein Maximum. Der Stamm SF-2098 wird bei einer Temperatur von 25 - 40⁰C, im Normalfall etwa bei 30⁰C bebrütet. Das Bebrütungsraedium wird vorzugsweise neutral oder schwach alkalisch eingestellt. Wird der Stamm SF-2098 in flüssiger Phace bebrütet, so erreicht die Ansammlung der Substanz SF-2052 in der Kulturbrühe im allgemeinen nach 3- - 10-tägiger Bebrütung ein Maximum.

Die Prüfung der erfindungsgeraäß gebildeten Substanz SF-2052 erfolgte nach folgender Methode: es wurde ein Prüf-Kulturmedium verwendet, welches 0,5 % Polypepton, 0,3 % Fleischextrakt und 1,5 % Agar (pH 7,0) enthielt; Bacillus subtilis PCI-219 wurde als Te:;t-Mikroorganir>mus verwendet. Bei dieser Prüfmethode wird bei einer Konzentration von 50 mcg/ral bis 10 mcg/ml der Substanz SF-2052 das Verhältnis zwischen dem Logarithmus der Konzentration und dom Durchmesser der Inhibierungszone linear aufgetragen, wobei sich din Inhibierungszone mit 21,2 bis 12,8 mm ergibt, bestimmt nach der üblichen Papierscheibenmethode.

Die Substanz SF-2052 gemäß vorliegender Erfindung ist ein wasserlösliches basisches Antibiotikum, welches bei der Züchtung der Stamm«? ;3F~;'U'>2 oder SF-TOJd

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hauptsächlich in der flüssigen Phase der Kulturbrühe anfällt und aus dieser tinter Ausnutzung der physikochemischen Eigenschaften der Substanz SF-2052 gewonnen werden kann. Die Abtrennung und Reinigung der Substanz SF-2052 kann auf chromatographischein Wege unter Verwendung geeigneter Hilfsmittel erfolgen. Solche Hilfsmittel für die Chromatographie sind synthetische Adsorberharze auf der Basis mikroporöser Copolymere von Styrol und Divinylbenzol (beispielsweise Amberlite XAD-2® oder Diaion HP-2(/©), Gelfiltrationsmittel auf der Basis von mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran (Sephadex G-10^—') oder auf der Basis von Dextransulfatderivaten (Sephadex LH-2O^V^-') oder auf der Basis von

carboxymethylsubstituiertem vernetztem Dextrangel ff?*)

(CM-Sephadex*—') und Kationenaustauscherharze von der Art der schwach sauren Copolymere aus Methacrylsäure

und Divinylbenzol (IRC-50^V£y oder Amberlite CG-50®). Die vorstehend aufgeführten Handelsprodukte werden von den Firmen Rohm & Haas Co., USA, Mitsubishi Kasei Co., Japan, Pharmacia Co., Schweden hergestellt und vertrieben.

Die folgende Arbeitsweise eignet sich zur Abtrennung der Substanz 3F-2052 aus der Kulturbrühe. Die die Substanz SF-2052 enthaltende Kulturbrühe wird durch

Filtrieren oder Zentrifugieren von den festen Bestandteilen befreit. Das so gewonnene Filtrat wird mit dem vorstehend erwähnten Adsorberharz Diaion HP-20^-^ behandelt, um die aktive Substanz zu adsorbieren. Anschließend wird die aktive Substanz durch Eluieren aus dem Harz gewonnen, indem man 50?oiges wässriges Aceton (Wasser-Aceton-Mischung im Volumenverhältnis 1:1; pH-Wert nicht eingestellt) und 50%iges wässriges Aceton, dessen pH-Wert mit Chlorwasserstoffsäure auf

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2,0 eingestellt worden ist, als Laufmittel verwendet. Das gewonnene Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man SF-2052-Hydrochlorid als pulverförmiges Rohprodukt erhält.

Dieses Rohprodukt wird anschließend durch Säulenchromatographie gereinigt, wobei man CM-Sephadex^-^ in der H⁺-Form und in der Na⁺-Form und/oder Aktivkohle in geeignetem Mischungsverhältnis verwendet, so daß das SF-2052-Hydrochlorid in hochgereinigter Form anfällt. Die Substanz SF-2052 in Form der freien Base ist unter alkalischen Bedingungen sehr instabil und kann infolgedessen in dieser Form rein nur schwierig gewonnen werden. Es ist wichtig, daß die Abtrennung und Reinigung der Substanz SF-2052 immer unter neutralen oder sauren Bedingungen erfolgt; das Arbeiten in schwach saurer wässriger Lösung ist zu empfehlen. Im Endstadium der Abtrennung wird die Substanz SF-2052 der Gefriertrocknung unterworfen, wobei das Hydrochlorid oder das Sulfat von SF-2052 in Form eines farblosen amorphen Pulvers

20 anfällt.

Soll die Substanz SF-2052 aus der Kulturbrühe des Stammes SF-2098 gewonnen werden, so ist es ratsam, die Kulturbrühe zunächst durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 2,0 einzustellen. Anschliessend wird die Kulturbrühe unter Verwendung eines Filtrationshilfsmittels wie Diatomeenerde filtriert, um so den Mycelkuchen und andere feste Bestandteile abzutrennen. Weiterhin wird das Brühenfiltrat durch eine Kolonne mit Amberlite IRC-50® (Na⁺-Form) geleitet, um die aktive Substanz zu adsorbieren. Anschließend wird die Harzkolonne mit 0,4 η Chlorwasserstoffsäure eluiert. Das gewonnene Eluat wird mit wässrigem Natriumhydroxid neutralisiert und anschließend mit Aktivkohle entsalzt.

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Die so gewonnene entsalzte Lösung wird weiter durch Säulenchromatographie unter Verwendung von CM-Sephadex®, Aktivkohle und/oder Sephadex LH-20^5) gereinigt, so daß schließlich SF-2052-Hydroc hlorid in hochreiner Form anfällt.

Zur Bestimmung der akuten Toxizität von SF-2052-Sulfat wurde letzteres intravenös in wässriger isotonischer Natriumchloridlösung verschiedenen Gruppen von Mäusen injiziert. Es wurde festgestellt, daß SF-2052-Sulfat einen LDc-Q-Wert von 350 mg/kg bei intravenöser Injektion bei Mäusen zeigt und damit als im wesentlichen nichttoxisch anzusehen ist.

Zum Gegenstand der Erfindung gehört daher schließlich auch ein antibakterielles Mittel, welches als aktiven Bestandteil eine ausreichende Menge wenigstens eines pharmazeutisch akzeptablen Säureanlagerungssalzes der Substanz SF-2052 in Verbindung mit einer pharmazeutisch akzeptablen Flüssigkeit oder einem solchen festen Trägermaterial enthält. Der Gehalt an aktivem Bestandteil in diesem antibakteriellen Mittel kann zwischen 5 und 50 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht, liegen.

Das antibakterielle Mittel gemäß vorliegender Erfindung kann als wässrige Lösung vorliegen, welche den aktiven Bestandteil in Form eines Säureanlagerungssalzes der Substanz SF-2052 in einer Menge von 0,01 bis 0,1 Gew.-% enthält. Diese Lösung eignet sich zum Sterilisieren chirurgischen Materiales und chirurgischer Instrumente sowie von anderen Geräten und Orten, die steril gehalten werden sollen. Das antibakterielle Mittel gemäß der Erfindung kann auch in eine oral verabreichbare Form wie Tabletten, Kapseln, Pulver,

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Lösungen und Suspensionen gebracht werden, indem man eine ausreichende Menge eines pharmazeutisch akzeptablen Säureanlagerungssalzes der Substanz SF-2052 in üblicher Weise mit einem pharmazeutisch akzeptablen festen Trägermaterial wie Stärke, Saccharose, Talcum oder Calciumcarbonat vermischt oder die Substanz in einem pharmazeutisch akzeptablen flüssigen Trägermaterial wie Äthanol und Wasser löst oder suspendiert. Das Verhältnis von aktiver Substanz zu festem oder flüssigem Trägermaterial soll dabei entsprechend der oralen Verabreichungsfοrm ausgewählt werden; es soll üblicherweise zwischen 1:1 und 1:100 (Gewichtsverhältnis) liegen.

Das antibakterielle Mittel gemäß vorliegender Erfindung kann auch in Form von injizierbaren Lösungen oder Suspensionen vorliegen. Letztere gewinnt man, indem man die aktive Substanz in einer ausreichenden Menge von 0,1 bis 10 Gewichtsprozent in einer physiologischen Salzlösung oder einem anderen üblichen pharmazeutisch akzeptablen flüssigen Trägermaterial, z.B. Ringer's Lösung, mit oder ohne Zuhilfenahme geeigneter Dispersionshilfsmittel löst oder suspendiert. Die injizierbare Lösung oder Suspension, die so hergestellt worden ist, kann beispielsweise intravenös, intramuskulär oder intraperitoneal injiziert werden.

Die Dosierung der aktiven Substanz gemäß vorliegender Erfindung hängt, wie dem Fachmann selbstverständlich klar ist, im Einzelfall von der Art der Verabreichungsform, der Verabreichungsweise und der zu behandelnden Krankheit ab. Viele Faktoren, wie Alter, Körpergewicht, Geschlecht, mögliche Diäten, Verabreichungszeit, Verabreichungsart, Ausmaß der Ausscheidung, evtlle. Medikamentenkombinationen sowie Reaktionen des Patienten

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und Schwere des Krankheitsfalles müssen bei der Verabreichung ebenfalls berücksichtigt werden. Im allgemeinen kann jedoch gesagt werden, daß die aktive Verbindung erwachsenen Personen in einer Menge von etwa 5 0,5 bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht täglich verabreicht werden kann. Die jeweils optimale Dosis muß, wie gesagt, vom Fachmann anhand der vorstehend aufgeführten Faktoren festgestellt werden. Auch die Dosierungsweise bekannter antibakterieller Mittel kann als 10 Richtschnur mit herangezogen werden.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung

der Erfindung.

Beispiel 1

(1) Bebrütung des Stammes SF-2052

Es wurde eine Stammkultur von Dactylosporangium matsuzakiense SF-2052 (FERM-P 4670 bzw. ATCC 31570) verwendet und in einem sterilisierten Impfkulturmedium mit 2,0 % Glucose, 0,5 % Pepton, 0,2 % Fleischextrakt, 0,3 % Hefeextrakt, 0,2 % Sojabohnenmehl und 0,1 % Calciumcarbonat (pH-Wert 7,0 vor dem Sterilisieren) bebrütet.

5 bis 6 Schlingen voll der vorstehend erwähnten Stammkultur wurden in 20 ml des vorstehend genannten Impfkulturmediums in einem 100 ml-Erlenmeyer-Kolben eingeimpft. Anschließend wurde 6 Tage bei 28°C bebrütet, wodurch man eine erste Impfkultur erhielt. Die Herstellung dieser ersten Impfkultur wurde in 10 Kolben durchgeführt. Insgesamt 200 ml der ersten Impfkultur wurden in 20 ml-Anteilen in 10 Erlenmeyer-Kolben mit einem Fassungsvermögen von 500 ml eingeimpft, von

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denen jeder 80 ml des eingangs erwähnten Impfkulturmediums enthielt. Die Bebrütung erfolgte in 72 Stunden

bei 28°C.

Auf diese Weise erhielt man eine zweite Impfkultur, die in b ml-Anteilen in 150 Erlenmeyer-Kolben mit einem Fassungsvermögen von jeweils 500 ml eingeimpft wurden; die Kolben enthielten jeweils 80 ml eines Produktionskulturmediums. Das Produktionskulturmedium hatte folgende Zusammensetzung: 4,0 % Glucose, 1,0 % Pepton, 0,4 % Fleischextrakt, 0,6 % Hefeextrakt, 0,4 Sojabohnenmehl und 0,2 % Calciumcarbonat. Die angegebenen Mengen der Nährstoffkomponenten sind jeweils das Zweifache, bezogen auf die Menge im Impfkulturmedium. Die Bebrütung erfolgte in 6 Tagen bei 28°C

15 nach der üblichen Schüttelkulturmethode.

Nach der Bebrütung wurde die Kulturbrühe einer kontinuierlichen Zentrifugation in einer Gefrierzentrifuge (einem von der Firma Tommy Company, Japan, hergestelltem Gerät) unterworfen, wobei man 10 1 Brühenfiltrat in etwa 2-stündiger Zentrifugationsoperation erhielt.

(2) Abtrennung der Substanz SF-2052

Das Brühenfiltrat (10 1), welches wie oben angegeben erhalten worden war, wurde durch eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 750 ml entsprechende Menge eines synthetischen Adsorberharzes, und zwar das

κ)
Handelsprodukt Diaion HP-20 -- enthielt, damit die aktive Substanz adsorbiert werden konnte. Die Harzkolonne wurde zunächst mit 3 1 Wasser gewaschen und dann mit 1,8 1 50%igem wässrigen Aceton (pH-Wert nicht eingestellt) und dann mit 1,8 1 50%igem wäss-

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rigem Aceton (pH-Wert mit HCl auf 2,0 eingestellt) eluiert. Auf diese Weise konnte die Substanz SF-2052 aus der Harzkolonne eluiert werden. Das Eluat wurde in 1,8 1-Fraktionen aufgefangen.

Die aktiven Fraktionen (insgesamt 3,6 1), die die Substanz SF-2052 enthielten, wurden unter vermindertem Druck auf ein kleineres Volumen eingeengt, indem man das Aceton abdestillierte. Das auf diese Weise gewonnene Konzentrat wurde abgestellt und nach dem Absetzen eines Niederschlages filtriert. Das Filtrat wurde durch eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 300 ml entsprechende Menge CM-Sephadex C-25® (H⁺-Form) als Gelfiltrationsmittel enthielt, an welchem aktive Substanz adsorbiert werden kann.

Die Kolonne mit dem Gelfiltrationsmittel wurde mit 1,0 1 0,1 m wässrigem Natriumchlorid, 1,0 1 0,2 m wässrigem Natriumchlorid und schließlich mit 3 1 0,4 m wässrigem Natriumchlorid gewaschen und anschließend mit 0,6 m wässrigem Natriumchlorid eluiert. Das Eluat wurde in 18 ml-Fraktionen aufgefangen; die aktive Substanz fand sich in den Fraktionen 26 bis

Die aktiven Fraktionen wurden durch eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 200 ml entsprechende Menge chromatographischer Aktivkohle enthielt. Die Kolonne mit der adsorbierten aktiven Substanz wurde mit 900 ml Wasser gewaschen und danach mit 1,2 1 5O96igem wässrigen Aceton (pH-Wert nicht eingestellt) sowie 600 ml 50%igem wässrigen Aceton (pH-Wert mit HCl auf 2,0 eingestellt) eluiert. Das Eluat wurde in 1800 ml-Fraktionen aufgefangen. Die aktive Fraktion (1800 ml) mit der Substanz SF-2052 wurde unter vermindertem

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Druck eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde der Gefriertrocknung unterworfen . Auf diese Weise erhielt man 170 mg eines rohen weißen pulvrigen Produktes (Reinheit etwa 20 %), welches SF-2052-Hydrochlorid darstellte.

(3) Reinigung

Das pulverförmige Rohprodukt (170 mg), welches das Hydrochlorid der Substanz SF-2052 darstellte und gemäß vorliegender Verfahrensstufe (2) erhalten worden war, wurde in 5 ml Wasser aufgenommen. Die entstandene wässrige Lösung wurde durch eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 180 ml entsprechende Menge an CM-Sephadex C-25^ (Na⁺-Form) enthielt, welche zuvor mit 0,1 m wässrigem Natriumchlorid imprägniert worden war. Diese Kolonne wurde mit 2 1 0,5 m wässrigem Natriumchlorid eluiert und anschließend mit 1,0 m wässrigem Natriumchlorid entwickelt. Das Eluat wurde in 18 ml-Fraktionen aufgefangen und die aktiven Fraktionen 8-20 mit der Substanz SF-2052 wurden

20 vereinigt.

Die aktiven Fraktionen (insgesamt 220 ml) wurden durch eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 40 ml entsprechende Menge an chromatographischer Aktivkohle enthielt. Die Kohlenstoffkolonne wurde mit 250 ml Wasser gewaschen und anschließend mit 200 ml 50?oigem wässrigen Aceton (pH-Wert nicht eingestellt) und danach mit 200 ml 50%igem wässrigen Aceton (pH-Wert 2,0) eluiert. Das Eluat wurde in 400 ml-Fraktionen aufgefangen. Die aktive Fraktion (400 ml) wurde unter vermindertem Druck eingeengt. Die konzentrierte Lösung wurde der Gefriertrocknung unterworfen, wonach 26 mg SF-2052-Hydrochlorid als farbloses Pulver vor-

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lagen, das rein war.

(4) Bildung von SF-2052-Sulfat

Das farblose Pulver (26 mg), welches reines SF-2052-Hydrochlorid darstellte und gemäß vorstehender Verfahrensstufe (3) erhalten worden war, wurde in 10 ml Wasser aufgenommen. Die gewonnene Lösung wurde durch eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 10 ml entsprechende Menge eines stark basischen Anionenaustauscherharzes, und zwar Amberlite IRA-400 (Sulfat-Form) enthielt. Die die Kolonne verlassende Flüssigkeit wurde eingeengt und der Gefriertrocknung unterworfen. Man erhielt auf diese Weise 30 mg SF-2052-Sulfat als farbloses Pulver. Dieses Produkt zeigte einen Zersetzungspunkt über 220⁰C.

15 Beispiel 2

10 1 des Brühenfiltrates, welches bei dem Züchtungsverfahren gemäß Beispiel 1 (1) erhalten worden war, wurde durch eine Kolonne geleitet, welche eine

einem Volumen von 800 ml entsprechende Menge eines

synthetischen Adsorberharzes, und zwar Diaion HP-20v enthielt. Die Harzkolonne wurde mit 4 1 Wasser gewaschen und dann mit 50%igem wässrigen Aceton (pH = 4,0) gewaschen. Das Eluat wurde in 500 ml-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen Nr. 2 - 6 mit der aktiven Substanz wurden eluiert und vereinigt und unter vermindertem Druck durch Abdestillieren des Acetons eingeengt.

Die konzentrierte Lösung wurde zunächst stehengelassen und später filtriert, nachdem sich ein Niederschlag abgesetzt hatte. Das Filtrat wurde durch eine

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Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 250 ml entsprechende Menge eines Kationenaustauscherharzes, und zwar Amberlite IRC-50vJ (Na⁺-Form) enthielt. Die Harzkolonne wurde anschließend mit 2 1 Wasser gewaschen und mit 0,1 η Wasserstoffsäure eluiert. Das Eluat wurde in 18 ml-Fraktionen aufgefangen. Die aktive Substanz fand sich in den Eluat-Fraktionen 240 - 336. Diese aktiven Fraktionen wurden vereinigt und zur Neutralisation durch eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 150 ml entsprechende Menge eines _ Anionenaustauscherharzes, und zwar Amberlite IR-45^-'' (OH~-Form) enthielt.

Die Kolonne verlassende Lösung (pH 5,4) wurde über eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 80 ml entsprechende Menge chromatographischer Aktivkohle enthielt. Diese Kohlekolonne wurde dann mit 400 ml Wasser gewaschen und mit 300 ml 50%igem wässrigen Aceton (pH-Wert nicht eingestellt) und 300 ml 5O5oigem wässrigen Aceton (pH-Wert mit HCl auf 2,4 eingestellt) eluiert, um die aktive Substanz aus der Kolonne herauszulösen.

Die vereinigte aktive Lösung (insgesamt 600 ml), die auf diese Weise gewonnen worden war, wurde unter vermindertem Druck eingeengt und der Gefriertrocknung unterworfen. Man erhielt auf diese Weise 260 mg SF-2052-Hydrochlorid als schwach gelb gefärbtes pulverförmiges Rohprodukt (Reinheit 16 %).

Beispiel 3

(1) Bebrütung des Stammes SF-2098 Eine Stammkultur von Micromonospora sp. SF-2098

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(Hinterlegungsnummern FERM-P 5073 und ATCC 31580) wurde verwendet und in einem sterilisierten Impfkulturmedium, welches 2,0 % Glucose, 0,5 % Pepton, 0,2 % Fleischextrakt, 0,3 % Hefeextrakt, 0,2 % Soja-5 bohnenmehl und 0,1 % Calciumcarbonat enthielt und

dessen pH-Wert vor dem Sterilisieren nicht eingestellt wurde, bebrütet.

3 bis 4 Schlingen voll der vorstehend erwähnten Stammkultur wurde in 20 ml des ebenfalls erwähnten Impfkulturmediums in einem Erlenmeyer-Kolben mit einem Fassungsvermögen von 100 ml eingeimpft. Die Bebrütung erfolgte in 4 Tagen bei 28°C. Auf diese Weise erhielt man eine Impfkultur. Die Impfkultur wurde in 20 Kolben hergestellt.

Die so gewonnene Impfkultur (insgesamt 400 ml) wurde in 4 ml-Portionen in 100 Erlenmeyer-Kolben mit einem Fassungsvermögen von je 500 ml eingeimpft. Jeder Kolben enthielt 80 ml eines sterilisierten Produktionskulturmediums. Dieses Produktionskulturmedium enthielt 4 % Maltosesirup, 0,3 % Sojabohnenöl, 0,5 % lösliches pflanzliches Protein, 1,0 % Baumwollsamenmehl,0,001 % Ferrosulfat, 0,0001 % Kobaltchlorid und 0,2 % Calciumcarbonat; der pH-Wert lag vor dem Sterilisieren bei 7,0. Die Bebrütung erfolgte in 2 Ta

25 der üblichen Schüttelkulturmethode.

7,0. Die Bebrütung erfolgte in 2 Tagen bei 28° nach

Nach der Bebrütung wurde die Kulturbrühe durch Zugabe von 6 η Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt und filtriert, und zwar unter Verwendung von Diatomeenerde als Filtrierhilfsmittel. Die Menge des gewonnenen Brühenfiltrates betrug etwa 7,0 1.

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(2) Abtrennung der Substanz SF-2052

Das in der vorstehend angegebenen Weise gewonnene Brühenfiltrat (7 l) wurde durch eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 220 ml entsprechende Menge eines Kationenaustauscherharzes, und zwar Amberlite IRC-50® (Na⁺-Form) enthielt.

Die Harzkolonne wurde mit 1 1 Wasser gewaschen und anschließend mit 0,4 η Chlorwasserstoffsäure eluiert. Das Eluat wurde in 250 ml-Fraktionen aufgefangen; die aktive Substanz befand sich in den Fraktionen 2-5 des Eluates. Diese aktiven Fraktionen wurden vereinigt und durch Zugabe von 0,2 η wässrigem Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 4 bis 6 eingestellt. Die danach vorliegende Lösung wurde durch eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 150 ml entsprechende Menge an Aktivkohle enthielt. Die Kohlekolonne wurde mit 500 ml Wasser gewaschen und anschließend zunächst mit 400 ml 50%igem wässrigen Aceton, dessen pH-Wert nicht eingestellt war, und danach mit 400 ml 50%igem wässrigen Aceton, dessen pH-Wert auf 2,2 eingestellt war, eluiert, um die aktive Substanz aus der Kolonne herauszulösen. Die aktiven Fraktionen des Eluates wurden vereinigt (insgesamt 800 ml) und unter vermindertem Druck

25 durch Abdestillieren des Acetons eingeengt.

Die so gewonnene konzentrierte Lösung wurde durch eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 200 ml entsprechende Menge CM-Sephadex C-25® enthielt. Die Kolonne mit der adsorbierten aktiven Substanz wurde dann zunächst mit 1 1 0,3 m wässrigen Natriumchlorid und danach mit 1 1 0,5 m wässrigen Natriumchlorid gewaschen sowie schließlich mit

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0,5 m wässrigen Natriumchlorid eluiert. Das Eluat wurde in 20 ml-Fraktionen aufgefangen; die aktiven Fraktionen 102 - 172, die die Substanz SF-2052 enthielten, wurden vereinigt. Die aktive Lösung wurde durch eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 50 ml entsprechende Menge an chromatographischer Aktivkohle enthielt. Die Kohlekolonne mit der adsorbierten aktiven Substanz wurde mit 200 ml Wasser gewaschen, anschließend zunächst mit 200 ml 50%igem wässrigen Aceton, dessen pH-Wert nicht eingestellt war, und dann mit 200 ml 50%igem wässrigen Aceton, dessen pH-Wert mit HCl auf 2,0 eingestellt worden war, eluiert. Die aktive Substanz ließ sich auf diese Weise in guter Ausbeute eluieren. Die vereinigten aktiven Fraktionen (insgesamt 800 ml) wurden unter vermindertem Druck eingeengt und der Gefriertrocknung unterworfen. Man erhielt auf diese Weise 124 mg SF-2052-Hydrochlorid als weißes pulverförmiges Rohprodukt (Reinheit 20 %).

Dieses pulverförmige Rohprodukt, 120 mg, wurde in 4 ml 50%igem wässrigen Methanol (Wasser-Methanol-Gemisch im Volumenverhältnis 1:1) aufgenommen; die entstandene Lösung wurde durch eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 380 ml entsprechende Menge

25 Sephadex LH-20^-/ enthielt, welches zuvor gut mit 90%igem wässrigen Methanol (Wasser-Methanol-Gemisch im Volumenverhältnis 1:9) gewaschen worden war. Die Kolonne wurde mit 90%igem wässrigen Methanol entwickelt und das Eluat wurde in 12 ml-Fraktionen auf-

30 gefangen. Die aktive Substanz befand sich in den Fraktionen 12 - 16 des Eluates. Die vereinigten aktiven Fraktionen (insgesamt 60 ml) wurden unter

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vermindertem Druck eingeengt und der Gefriertrocknung unterworfen. Man erhielt auf diese Weise 20 mg SF-2052-Hydrochlorid als farbloses pulverförmiges Rohprodukt.

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Claims

Patentansprüche

1.) Das Antibiotikum SF-2052 einschließlich der pharmazeutisch akzeptablen Säureanlagerungssalze desselben, welches eine wasserlösliche basische Verbindung mit antibakterieller Wirkung darstellt, dessen Hydrochlorid in Form eines farblosen und amorphen Pulvers vorliegt, welches unter neutralen und sauren Bedingungen im wesentlichen beständig, unter alkalischen Bedingungen jedoch instabil ist, keinen definierten Schmelzpunkt zeigt, sich dagegen bei oder nahebei 170⁰C allmählich braun verfärbt und sich bei 209 - 210⁰C unter Aufschäumen zersetzt, eine positive Reaktion gegen Ninhydrin, Lemieux-Reagenz und Greig-Leiback-Reagenz und eine negative Reaktion gegen Sakaguchi-Reagenz und Silbernitrat zeigt, leicht löslich in Wasser, löslich in Methanol und unlöslich in Äthylacetat, Chloroform, Benzol und Äthyläther ist und darüberhinaus folgende weitere Kennzeichen aufweist:

(a) Gewichtsanalyse: C 35,69 %; H 7,04 %; 20 N 11,80 %;

(b) das Fehlen eines scharakteristischen Absorptions-Peaks bei 220 nm bis 370 nm im Ultraviolett-Absorptionsspektrum in wässriger Lösung;

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(e) ein Kohlenstoff-NMR-Absorptionsspektrum in 5 Deuterowasser entsprechend dem in Figur 3

der beigefügten Zeichnungen dargestellten;

(f) eine spezifische optische Drehung von (oc)p = +87° (c=1, Wasser) in wässriger Losung;

(g) einen Einzelfleck bei Rf = 0,46 bei der Dünnschichtchromatographie an Cellulose unter Verwendung von n-Propanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (15:10:3:12) als Laufmittel sowie einen weiteren Einzelfleck

15 bei Rf = 0,09 bei der Papierchromatographie

mit n-Butanol-Essigsäure-Wasser (2:1:1) als Laufmittel (aufsteigende Methode).

2.) Das Antibiotikum SF-2052 gemäß Anspruch 1 in Form des Hydrochlorides oder Sulfates.

3.) Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums SF-2052 gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) einen das Antibiotikum SF-2052 erzeugenden 25 Stamm von Actinoraycetes, insbesondere den

Stamm Dactylosporangium raatsuzakiense SF-2052 mit der Hinterlegungs-Nummer FERM-P Λ67Ο oder ATCC 31570 in einem wässrigen flüssigen Kulturmedium, welches

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quellen enthält, unter aeroben Bedingungen so lange züchtet, bis sich eine ausreichen-

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de Menge des Antibiotikums SF-2052 in dem Kulturmedium gebildet und angesammelt hat, und

(b) das Antibiotikum SF-2052 aus der KuI-tür abtrennt.

4.) Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtunr; bzw. Bebrütung bei einer Temperatur von 25 - 37°C über eine Zeitspanne von 2-10 Tagen durchführt.

5.) Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Antibiotikum SF-2052 aus der Kulturbrühe von Dactylosporangium matsuzakiense SF-2052 in Form seines Hydrochlorides isoliert wird.

6.) Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums 15 SF-2052 gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) einen das Antibiotikum SF-2052 erzeugenden Stamm von Micromonospora sp.SF-2098 mit der Hinterlegungs-Nummer FERM-P 5073 oder ATCC 31580 in einem wässrigen

flüssigen Kulturmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter aeroben Bedingungen so lange züchtet, bis sich eine ausreichende Menge des Antibiotikums

SF-2052 in dem Kulturmedium gebildet und angesammelt hat, und

(b) das Antibiotikum SF-2052 aus der Kultur abtrennt.

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7.) Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bzw. Bebrütung bei einer Temperatur von 25 - 40⁰C während einer Zeitspanne von 3-10 Tagen durchführt.

5 8.) Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Antibiotikum SF-2052 aus der Kulturbrühe von Micromonospora sp. SF-2098 in Form seines Hydrochlorides abgetrennt wird.

9.) Antibakterielles Mittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an wenigstens einem pharmazeutisch akzeptablen Säureanlagerungssalz des Antibiotikums SF-2052 in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägermaterial für dasselbe.

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