NL7908047A - Antibioticum, werkwijze voor het bereiden daarvan, en dit antibioticum bevattende gebruikssamenstelling. - Google Patents

Description

Lx 5619 <

Titel : Antibioticum, werkwijze voor het bereiden daarvan, en dit antibioticum bevattende gebruikssamenstelling.

De uitvinding heeft betrekking op een nieuw antibioticum, dat met SF-2052 zal worden aangeduid. Voorts heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor het bereiden van dit antibioticum door het kweken van een stam van actinomycetes, in het bijzonder van 5 de soort Dactylosporangium of van de soort Mikromono 3? o -r a in een kweekaidden. De uitvinding heeft tenslotte betrekking op een voor bacteriebestrijding dienende samenstelling, die de voornoemde stof SF-2052 als het werkzame bestanddeel bevat.

Nuttige antibiotica kunnen worden bereid en afgescheiden 10 uit een kweekvloeistof van verschillende stammen van mikro-organis-men. Bij een poging om nieuwe en nuttige antibiotica te vinden, die werkzaam zijn tegen gram-negatieve en gram-positieve bacteriën, en tegen verschillende bacteriestammen, die bestand zijn tegen de bekende antibiotica, is een onderzoek verricht op de gistingsvloeistof 15 van een nieuw mikro-organisme, dat Dactylosporangium mat-suzakiense SF-2052 wordt genoemd. Daarbij is gebleken, dat een nieuw antibioticum wordt verkregen door dit nieuwe mikro-organisme in een kweekmidden te kweken, dat voedingsmiddelen bevat, die onder aerobe omstandigheden kunnen worden opgenomen. Daarbij kon dit 20 nieuwe antibioticum van de kweekvloeistof worden afgescheiden, aan welk antibioticum de aanduiding SF-2052 is gegeven. De verschillende eigenschappen van deze stof zijn bepaald. Verder is gebleken, dat dit nieuwe antibioticum ook kan worden verkregen door het kweken van een stam van een ander nieuw mikro-organisme, waaraan de naam Mikro-25 monos po ra sp. SF-2098 is gegeven.

De uitvinding verschaft als een nieuw antibioticum de voornoemde stof SF-2052, die als een bacteriebestrijdingsmiddel kan worden gebruikt. De uitvinding verschaft verder werkwijzen voor het bereiden ervan, uitgaande van een stam van actinomycetes. Een en ander 30 zal in de 'onderstaande beschrijving nog nader worden toegelicht.

Volgens de uitvinding wordt als een nieuw antibioticum de voornoemde stof SF-2052 e.n een farmaceutisch aanvaardbaar zuuraddi-tiezout daarvan verschaft, welke stof een in water oplosbare basische verbinding is, die een bacteriebestrijdende werking heeft, terwijl 35 het chloorwaterstofzout daarvan de vorm heeft van een kleurloos amorf 7908047 * - 2 - poeder, dat onder neutrale tot zure omstandigheden althans nagenoeg stabiel is, doch onder basische omstandigheden onstabiel is, verder geen bepaalde smelttemperatuur bezit, doch in de omgeving van 170 °C geleidelijk bruin wordt, terwijl bij 209·«210 °C onder schuimen ont-5 leding optreedt, welke stof voorts een positieve reactie met nin-hydrine, Lemieux-reagens en Greig-Leiback-reagens, doch een negatieve reactie met Sakaguchi-reagens en zilvernitraat vertoont, welk poeder tenslotte goed oplosbaar is in water, oplosbaar is in methanol, en onoplosbaar is in ethylacetaat, chloroform, benzeen en ethyl-10 ether.

De verdere eigenschappen van dit zout zijn: (a) elementsamenstelling: 35,69 #C, 7,04- %H, 11,80 (b) geen kenmerkende absorptiepiek bij 220·.370 nm in het UV-ab-sorptiespectrum in een waterige oplossing; 15 (c) het IR-absorptiespectrum in een KBr-tablet komt overeen met de bijgevoegde fig. 1; (d) het absorptiespectrum voor magnetische resonantie van waterstof, bepaald in D2O, komt in hoofdzaak overeen met de bijgevoegde fig· 2; 20 (e) het absorptiespectrum voor magnetische resonantie van koolstof, bepaald in komt in hoofdzaak overeen met de bijgevoegde fig· 3; 25 o (f) de optische draaiing in waterige oplossing (c* 1) [α] ζ = + 87 J en 25 (g) een enkele vlek wordt verkregen bij Rf = 0,46 bij dunnelaagchro-matografie op cellulose met een mengsel van n-propanol, pyridine, azijnzuur en water (15:10:3*12) als ontwikkeloplossing, en bij Rf = 0,09 bij papierchromatografie met een mengsel van n-butanol, azijnzuur en water (2:1:1) als ontwikkelvloeistof bij toepassing 30 van de opstijgwerkwijze.

De nieuwe stof volgens de uitvinding kan bijvoorbeeld de vorm hebben van een zuuradditiezout van een farmaceutisch aanvaardbaar anorganisch zuur, zoals chloorwaterstofzuur, broomwaterstofzuur, zwavelzuur, salpeterzuur en fosforsuur, of van een farmaceutisch aan-35 vaardbaar organisch zuur, zoals azijnzuur, citroenzuur, benzoëzuur, ascorbinezuur en malexnezuur.

De eigenschappen van het chloorwaterstofzout van SF-2052 zijn: 1· Uiterlijk: Kleurloos amorf poeder; 7908047 3 - 3 - 2. Smeltgedrag: Geen bepaalde smelttemperatuur, langzame ver kleuring naar bruin bij verwarming tot ongeveer 170 °C, gevolgd door ontleding bij 209·.210 °C onder schuimvorming; 3 3« Elementsamenstellingï C 35*69 #, ïï 7,0½ #, N 11,80 UV-absorptie: Geen kenmerkende absorptiepiek kan in bet gebied van 220..370 nm worden waargenomen; 5· IR-absorptie: Na tabletvorming met KBr wordt bet spectrum van fig. 1 verkregen, waarbij de voornaamste 10 absorptiepieken optreden bij 290..350, 172, 16½, 151» 112 en 105 mra”^; 6. Molekuulgewicbt: Daar SF-2052 in basisch midden onstabiel is, kon de vrije base niet in stabiele vorm worden verkregen, zodat een rechtstreekse bepaling 15 van het molekuulgewicht met massaspectrome- trie zeer moeilijk was; uit het magnetisch resonantiespectrum van koolstof en enige andere beschikbare gegevens kon worden afgeleid, dat de vrije base een molekuulgewicht 20 van ongeveer 400..^50 moet hebben; 7. Oplosbaarheid: Gemakkelijk oplosbaar in water, oplosbaar in methanol, en althans nagenoeg onoplosbaar in organische oplosmiddelen zoals chloroform, ethylacetaat, hexaan, benzeen, ethylether 25 e.d.; 8. Stabiliteit: Betrekkelijk stabiel in zuur tot neutraal midden, doch onstabiel in basisch midden; 9· Dunnelaagchromatografie op cellulose: (a) Rf = 0,^6 bij ontwikkeling met n-propa- 30 nol/pyridine/azijnzuur/water (15:10:3:12) (b) Rf = 0,10 bij ontwikkeling met n-butanol/ azijnzuur/water (2:1:1); 10. Papierchromatografie (opstijgend): (a) Rf ‘ = 0,^0 bij ontwikkeling met n-propa- 35 nol/pyridine/azijnzuur/water (15:10:3:12) (b) Rf = 0,09 bij ontwikkeling met n-butanol/ azijnzuur/water (2:1:1); 11. Kleurreacties: Positief voor: ninhydrine, Greig-Leiback- en 79 0 8 0 4 7 Lemieux-reagens, 1 - if -

Negatief voor: Sakaguchi-reagens en silver-nit raat;

12. Magnetische resonantie: Vaterstofspectrum van SF-2052-HC1 in D^O

bij 100 MHz met uitwendige TMS-standaard is 5 in fig. 2 weergegeven; de hoofdsignalen lig gen bij 1,3½ (d), 2,00 (m), 3,16 (s), 3,51 (s), 5j33 (d), en 7»99 Cs)» welke getalwaar--6 den 10 delen voorstellen, terwijl fig. 3 het koolstofspeetrum met dioxan als inwendi-10 ge standaard weergeeft; 13. Optische draaiing: £cc]^ = +87° (cel, H2O).

Op grond van de voornoemde eigenschappen van SF-2052-HC1 kan worden aangenomen, dat de vrije basisch ervan de volgende structuurformule heeft: 15 . NH- CH, m2 \ Γ

COCH.NHCH

De uitvinding zal in het onderstaande nader worden toege-25 licht aan de hand van een tekening; hierin toont: fig· 1 een kromme van de infraroodabsorptie van een monster van het HCl-zout van de nieuwe stof volgens de uitvinding, opgenomen na tabletvorming met KBr; fig. 2 een kromme van het magnetische resonantiespectrum 30 van waterstof van het HCl-zout van deze stof in D^O bij 100 MHz; en fig. 3 een overeenkomstig absorptiespectrum van koolstof bij 25 MHz.

De werking van de nieuwe stof volgens de uitvinding in de sulfaatvorm bij het onderdrukken van de gröèi van verschillende bac-35 teriën werd bepaald met een gangbare verdunningswerkwijze, waarbij hartinfusie-agar-agar als broedmiddel werd gebruikt. Het broeden geschiedde bij een temperatuur van 37 °C gedurende 16 h. De minimale onderdrukkingsconcentratie volgt uit de onderstaande tabel A.

7908047

A

t - 5 -

Tabel A

Minimale onder dr .-

Mikro-organisme concentratie (μκ/ml)

Bacillus subtillis PCI-219 1,56

Staphylococcus aureus 209P 3»12 5 Sarcina lutea 0,78

Escherichia coli 12,5

Escherichia coli B 6,25

Escherichia coli K-12-R 5*12

Klebsiella pneumonia 3f12 10 Proteus vulgaris 1,56

Pseudomonas aeruginosa 100

Mycobacterium saegmatis 607 Km-B 100 ii ii 607 Sm-B 1,56

Uit deze tabel blijkt, dat de nieuve stof volgens de uit-15 vinding een krachtige uitwerking tegen zowel gram-negatieve als graa-positieve bacteriën heeft·

Deze nieuwe stof met de voornoemde eigenschappen valt niet samen met een van de bekende stoffen, zodat deze stof duidelijk nieuw is· 20 De uitvinding verschaft verder een werkwijze voor het be reiden van deze nieuwe stof, welke werkwijze de volgende stappen omvat;

Ca) het kweken van een deze stof voortbrengende stam van actinomy-cetes, in het bijzonder van. Dactylosporangium matsu-25 zakiense SF-2052, in een waterig kweekmidden, dat opneembare koolstof- en stikstofbronnen bevat, waarbij het kweken onder aerobe omstandigheden plaatsvindt gedurende een tijdsduur, die voldoende is om het SF-2052 in het kweekmidden voort te brengen en zich te doen ophopen; en 30 (b) het uit de kweek afscheiden van het SF-2052.

Het mikro-organisme, dat volgens de uitvinding werd gebruikt voor het voortbrengen van SF-2052, is Dactylosporangium matsuzakiense SF-2052, dat was afgescheiden uit een bodemmonster, dat in 1977 ia Japan is gevonden (inagami-schrijn, Matsuza- 35 ki-cho, Kamo-gun, prefectuur Shizuoka). De afscheiding van de SF-2052-stam geschiedde door het bodemmonster in een waterige suspensie te broeden op een afscheidend kweekmidden, dat uit 0,2 % oplosbaar zetmeel, 0,04 % ammoniumsulfaat, 0,02 % kalium—bifosfaat, 0,02 % magnesiumsulfaat, 0,Ok % calciumcarbonaat, en 1,5 % agar-agar 7908047 — 6 — * % (zonder pH-instelling) bestond, welke bewerking gedurende 30 d bij 28 °C werd uitgevoerd. Deze stam is gedeponeerd bij bet Japanse Gistingsonderzoekinstituut onder bet nummer FEEM-P 4670, en tevens bij de American Type Culture Collection te Washington D.C. (US) on-5 der bet nummer ATCC 31570 (1979,09,26).

Deze stam beeft de volgende mikrobiologische eigenschappen. De waarnemingen werden uitgevoerd op de door E.B. Shirling en D. Gottlieb in Int. J. Syst. Bact. _16 (1966) 312*·34θ beschreven wijze; I. Morfologische waarnemingen^ 10 Dragermycelia groeien golfachtig met zeer talrijke vertak kingen, en hebben een middellijn van 0,3..0,6 μιη. Noch in de agar-agar noch in· de vloeistof werd gewoonlijk verbreking van deze myce-lia waargenomen.

Luchtmycelia werden nagenoeg niet waargenomen, zodat kan 13 worden aangenomen, dat deze in feite niet worden gevormd. Het drager-mycelium van de SF-2052-stam draagt sporangia, afzonderlijk of in bosjes, aan het oppervlak van de agar-agar. Sporangia worden betrekkelijk rijkelijk op zetmeel-agar, doch karig op glycerol-asparagine-agar, tyrosine-agar en havermeel-agar gevormd. De sporangia zijn 20 vingervormig, én hebben afmetingen van 0,9..1,4 um bij 4,0..6,0 pm. Elk sporangium bevat meestal een enkele rij van drie sporen. De meeste sporen zijn cilinder- of eivormig, terwijl het oppervlak ervan glad is. Elk spoor heeft een afmeting van 0,8i.1,3 um bij 1,1..1,6 um. Wanneer de sporen bijvoorbeeld in een waterig bodemextract wor-, 25 den gesuspendeerd, en daarin gedurende 15..3Ο min blijven, vertonen zij beweeglijkheid.

II. Eigenschap£en opjrerschillende_kweekmiddens:

De kweekeigenschappen van de SF-2032-stam volgen uit Tabel B. De tussen rechte haken geplaatste kleuraanduidingen komen overeen 30 met het “Color Harmony Manual*' van Container Corp. of America. De broedteraperatuur was 28 °C, terwijl de waarnemingen na 21 d plaatsvonden. .

79 0 8.0-4 r" 4 « - 7 -

Tabel B

Lucht- Oplosbaar

Kweekmidden_ Groei en. kleur mycelium pigment

Sucrose-nitraat-agar gewone groei, barnsteenkl. tot bleek-oranje f3 lc] geen geen

Glucose-asparagine-agar gewone groei, rood-oranje |f4pc] geen geen

Glycerol-asparagine-agar geringe dunne groei, bleek meloengeel geen geen 13 ea] 5 Zetmeel-agar gewone tot goede groei, rood-oranje geen geen (> P°]

Havermeel-agar gewone groei, oranje [4 lc-5 nc] geen geen

Gistextract-moutextract- gewone groei, ge- agar kronkeld, geen geen barnsteen- tot lichtbruin [3 lc-4 ng]

Tyrosine-agar goede groei, enigs- geen bruinzins grijs-oranje tot roze lichtbruin l^l· lc-4 ng]

Voedings-agar zeer geringe groei, geen geen bleek-oranje 10 Bennet-agar gewone tot goede groei, rood-oranje geen geen [k pc-5 pc]

Calciummaleaat-agar geringe tot gewone groei, licht-oranje geen geen [3 ga-4 ga] III. _FysiolOjgische_ eig_enschapgen_: (1) Groeitemperatuur: De SF-2052-stam groeit binnen een gebied

. O

van 15..H-0 C op zetmeel-agar, waarbij o *15 de optimale temperatuur 25· «3? C be draagt ; (2) Vervloeiing van gelatine: Er trad geen vervloeiing op, wan- o neer het broeden bij 20 C gedurende 21 d plaatsvond; 20 (3) Zetmeelhydrolyse: Positief (bij broeden op 28 °C gedurende 21 d); 7908047 - 8 - a (½) Nitraatreductie: Negatief (bij broeden op 28 °C gedurende 21 d) j

(5) Stremming van karnemelk: Negatief (bij broeden op 28 °C

gedurende 21 d);-

5 (6) Peptisering van karnemelk: Negatief (bij broeden op 28 °C

gedurende 21 d); (7) Vorming van melanoidepigment: Negatief.

IV. Jïebruik van kooljrt£fbronnen: Een schatting werd gemaakt bij broeden op 28 °C ineen midden met de 10 volgende samenstelling:

Gistextract (Difco) 5 g

Calciumcarbonaat 1 g

Agar (Difco) 15 g

Gedestilleerd water 1000 ml 15 Pe uitkomsten daarvan zijn in tabel C vermeld.

Tabel C

Koolstofbron Groei D-glucose +++ D-xylose +++ 20 D-fructose ++ L-arabinose +++ D-mannitol +++ X-inositol . +

Rhamnose +++ 25 Sucrose +++

Eaffinose +

Geen toevoeging + V. Samenstelling van dejcelwand;

De samenstelling van de celwand en van de hele cel in de 30 SF-2052-stam werd onderzocht op de wijze zoals beschreven door T. Yamaguchi in J. Bact. 89 (1985) ^^••^53> door B. Becker e.a. in Appl. Microbiol. 12 (196½) **21..423» door M.P. Lechevalier in J.Lab. Clin. Med. 71 (1968) 93^..9½½.

Uit de aldus verkregen uitkomsten blijkt, dat deze stam 35 celwanden van. de soort II heeft, aangezien deze wanden hydroxydiami-ne-pimelinezuur en glycine bevatten. Verder behoort het gehele cel-suikerpatroon tot de soort A of D, daar het hydrolysaat van de gehele cel xylose en galactose samen met een spoor van arabinose bevat.

7908047 - 9 -

Met het oog op de voornoemde eigenschappen van deze stam wordt aangenomen, dat deze behoort tot het geslacht Dactylospo-r a n g i a van de orde Actinomycetales. Van het geslacht Dactylosporangia zijn reeds twee soorten bekend, en wel 5 D. auranti&c njn en D. thailandense, zie J .E. Thiemann e.a., Arch. Mikrobiol. 58 (1967) k2..$2 en "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" 8th ed. (197^)· Een vergelijking van de onderhavige stam met de bekende soorten is in tabel D gemaakt. __, y / Λ t /

X

r / / y t * > / / / / ..

/ / 7210 8 0 4 7 - .10 - Λ

CM

ΙΛ 93 •η « a Ο 4) ο φ φ ο (Μ 'ϋ Ö d -4- Ο φ tO ·0

Ό ·Η · /-» CO

ö Φ Φ 60 ·Η ® Ι> Μ Β Ο ,r"j Ή 4) id VO Ρ Η h Ö U Ο d ΛΑ , . Λ. ·Η •Η b0 Cd Φ d Ή Β ·Η *Η *Η *Η CM Τ’ Xl φ V, Ο 60 Ρ 3 Ρ © Φ Φ * ^ Φ Λ Φ Ο Η Φ Μ « U ·Η ·Η ·Η Ο -μ Ö > Ο ·Π Λ jd +> -Ρ +> COJ > Ο .61 d 'brf'Ö d ΧΪ ·Η Β ·Η Xl ΙΛΙ • 3 φ φ φ φ Ο Φ Ο 10 bO Q Φ Φ Q © 3 > OhO Φ Ο Ο Φ Ο Ο · τ)

60 63 Ο UIO h 63 d ft d ft bO H

O ft

•Η O

& O +> d Φ Λ ·Η £ d • ·§

Λ *H

•Η Ο Φ

•Η ® d O

Φ O < d ε o d _ 60 3 (-1 (3

OH to Φ ·Η · B

Β φ bO φ vs Xl CO

Η Ο -Η Φ .¾ d g d +> +» u xi xi 3 3 d © to

d Μ Φ· Φ Ο d 't-ι «Η *H Β -Ρ I

(Ö OO ΪΟΦΦΦΤ* S +> CM

d Φ H 60 63 I -Η Η Η * Φ B ΙΛ

p Β > +»+»+»+> ·Η > O

do d μ d h Λ S. •'i *ri J r? ® <y

3 +> © Φ +> © Φ O 60 (0 OH &i .O I

• φ ·Η > Φ ·Η Φ Φ -Η Φ O O Φ ft

0 60 3 Ο 63 3 Μ Η Η Ö ft ft 3 · A W

Η Φ • d © ·} Ή fl Q d S ··* O +» d

H ' Ο ·Η B

φ Xl ► 60 _o d

% d d I

b Φ Φ -p ^ t* xi d •rl φ Φ (Ö φ d A d ö o rd h o id o®£> +i r bO Odd

ο ·Η Φ ® > B

1 φ φ φ Ό JO Φ O

CM O vs d H 2 §

ΙΛ d d Jci Β Φ , · Λ P

Ο «> B d d O'h'h'hKX B ·Η

CM d 30 d Φ Φ Φ * Φ d O

I φ o 63 I 60 Η Η H Xl © H

ft d I +> -Ρ-Ρ+» O Xl B

CQOOd d Λ d d Bddd rPdO

30Φ ΦΟΦ Φ bo bo to Φ ω Φ I

ΦΟΦ φ Η © Φ ΦΦΦΦ 60 *> +» 60 d «> 63 H 60 60 d d d 60 3 „2

Η Λ B

Xl O d

I Φ O -P

Φ O Xl X ·

d . I > © CM

•rl ft 60 I * -P #

60 O -rl d Φ d T- CO

d ft φ B d Φ * -rl d d a d d ω η φ bo φ BPBdtOlO-P 60 Μ ft.HbOd©Bd d ft H ft v CO 60 B B d S Η Η Ο < O * ddddl-ΡΕΗΗΦ d.

Φ I d B to 10 * Φ 60 Φ .Ü ft Φ d 60 60 Oo8 ft ω·Η Γ ΛΙ ΙΛ ft CO oBd Hi ft ti ® H ft »#* BO ft I Ή ft i»s B Β H +> d J3 O 0} Φ Xl ΟΦ Xl > -P ft X>

Up -P Φ X d OBd ·· bh dBo do B to p ft φ d dbo d H l> Β H B dxll> © Φ >d > ft η © M © to bCft S ft ft H d H © d •HO bOSO 60ft Ο Φ-ΡΦΟ ·Η ft d ft do oBsd x •Η Η ·Η Ή ·Η Η Η Β ® H d φ d a υ φ a -p d φ !» d d *h φ

OB dH O dd B O d -P U <H Q

dtOOBd Ο Φ 60 d Φ Η B B ft

CD Β > O Cfl >BBC3 > 3 W « O

7908047 - 11 -

De SF-2052-stam valt niet samen met een van de bekende soorten van het geslacht Dactylosporangia , zodat deze als een nieuwe soort kan worden beschouwd, die wordt aangeduid als Dactylosporangium matsuzakiense SF-2052.

5 Het is verder gelukt een nieuw mikro-organisme van een in

Choshi, prefectuur Chiba, Japan, verzameld bodemmonster af te scheiden, welk mikro-organisme de SF-2098-stam is genoemd. Deze stam blijkt tot de orde van de Actinomycetales te behoren, en daarin tot het geslacht Hikromonospora. Deze stam is onder nummer 10 FEBM-P 5073 in Japan gedeponeerd, en onder nummer bij de American Type Culture Collection. Er is gebleken, dat deze SF-2098-stam de voornoemde stof SF-2052 volgens de uitvinding kan voortbrengen.

De uitvinding verschaft een werkwijze voor het bereiden 15 van SF-2052,. die de volgende stappen omvat: (a) Het kweken van een stam van Mi kr om o n o s p o r a sp. SF-2098 (geregistreerd onder FEEM-P 5073 en ATCC ) in een waterig vloeibaar kweekmidden, dat opneembare koolstof- en stikstofbronnen onder aerobe omstandigheden bevat, en wel gedurende een tijd, die 20 voldoende is om het SF-2052 ia het kweekmidden voort te brengen en zich te doen ophopen; en (b) Het afscheiden van het SF-2052 van de kweek.

De SF-2098-stam heeft de volgende mikrobiologische eigenschappen: 25 I· Morfologische waarneming:

De SF-2098-stam vormt geen luchtmycelium op verschillende agar-kweekbodems, die in het algemeen worden gebruikt voor het kweken van actinomycete s-stammen. Mikroskopisch onderzoek heeft aangetoond, dat het dragermycelium met vertakkingen groeit, en dat 30 in verschillende punten daarvan een spoor wordt gevorm. Bij waarneming met een elektronenmikroskoop bleken de sporen ongeveer bolvormig te zijn, terwijl de middellijn ongeveer 1,0..1,3 pm bedroeg. Het oppervlak van de sporen vertoonde stompe uitsteeksels.

II. Kweekgedrag op_verschillende_kweekbodems: 35 De ontwikkeling van SF-2098-kweken, die op verschillende kweekbodems gedurende 15··20 d bij 28 °C waren gebroed, werd waargenomen, waarbij de uitkomsten in tabel E zijn vermeld. De kleuraanduidingen tusen rechte haken berusten op het Color Harmony Manual van Container Corp. of America.

7908047 *

- 12 -Tabel E

Oplosbaar _Kweekbodem Groei en kleur pigment

Sucrose-nitraat-agar normale tot goede groei, geen boog, oranje [4 la-4 na]

Glucose-asparagine-agar zeer zwakke groei, geen kleurloos 5 Glycerol-asparagine- zwakke groei, geel- agar bruin [3 ie] , later ver- geen anderend in olijfgroen [1»5 ge]

Zetmeel-agar gewone groei, oranje bruin [3 lc] , later ver- geen anderend in donker olijfgroen [1,5 pn]

Gistextract-moutextract- gewone tot goede groei, agar licht olijfgroen geen [1,5 11..1,5

Havermeel-agar gewone groei, oranje bruin [3 lc] , later ver- geen anderend in olijfgroen [1.5 ig]

Tyrosine-agar ' zwakke groei, oranje- tot geen geelbruin [3 lc.*3 ie] 10 Voedings-agar zwakke groei, zwak geel- geen bruin [3 gc]

Bennet-agar gewone groei, vochtig, geen oranje-bruin [3 lc]

Calciummalaat-agar zwakke groei, licht olijf- geen groen ['1,5 ge] lil. Fysiologische eigenschappen^ (1) Groeitemperatuurgebied: De SF-2098-stam groeit in een ge- 15 bied van 15··^5 °C; (2) Gelatinevervloeiingï Positief (gebroed bij 20°C geduren de 21 d); (3) Zetmeelhydrolyses Positief (gebroed bij 28 °C gedu rende 14 d); 20 (*0 Werking op karnemelk: Positief tot peptisering en strem ming (gebroed bij 28 °C gedurende 21 d); (5) Vorming van melanoidepigment: Negatief; 7908047 - 13 - (6) Nitraatreductie: Negatief (gebroed bij 28 °C gedu rende 14 d) 5 (?) NaCl-tolerantie (geschat volgens Intern. J. Syst. Bacteriol.

21, (1971) 240)$ 5 goede groei bij .0..1,5 zwakke groei bij 3·«4 en geen groei bij meer dan 5 %* IV. Verbruik van koolstofbronnen^ De schatting werd gemaakt door broeden bij 28 °C ia een midden met 10 de volgende samenstelling:

Gistextract (Difco) 0,5 %

Calciumcarbonaat 0,1 %

Bacto-agar (Difco) 1,5 %

Gedestilleerd water rest 15 De uitkomsten zijn in tabel Έ vermeld.

Tabel F

Koolstofbron Groei

Geen toevoegsel + D-glucose +++ 20 D-fructose ‘ ++ D-xylose +++

Glycerol + L-arabinose + D-mannitol + 25 I-innositol +

Sucrose +++ α-melibiose +

Baffinose +

Shaanose + 30 V. Scheikundige^samenstelling_van_de celwand:_

De samenstelling van de celwand van de SF-2098-stam werd onderzocht zoals beschreven door B. Becker e.a. in Appl. Microbiol.

13 (1965) 236. Uit de aldus verkregen uitkomsten bleek, dat de cel-vand hydroxydiaminopimelinezuur bevatte.

35 Met het oog op de voornoemde eigenschappen van de onder zochte stam, in het bijzonder rekening houdend met het feit, dat geen luchtmycelium op agarvoedingsbodems wordt gevormd, dat verder deze stam een mesofiel actinomyces is, dat een enkele spoor op het dra- 7908047 V- - 14 - --.+ germycelium ervan draagt, en dat de celwand hydroxydiaminopimeline-zuur bevat, kan worden besloten, dat deze stam tot de soort Mikro-monospora behoort. Derhalve wordt deze stam nu aangeduid met Mikromonospora sp. SF-2098. · 5 Bij het door gisting vormen van de stóf SF-2052 volgens de uitvinding, waarbij gebruik wordt gemaakt van ofwel Dactyl o sporangium matsuzakiense SF-2052 of Mikromonospora sp. SF-2098, kan de stam, die SF-2052 voortbrengt, voor het beoogde doel op een bekende wijze worden gekweekt in een kweekmidden, dat voe-10 dingsbronnen bevat, die door gewone mikro-organismen kunnen worden opgenomen. Daartoe kan gebruik worden gemaakt van bekende voedingsstoffen, die in het algemeen voor het kweken van bekende stammen van actinomycetes worden gebruikt. Voorbeelden daarvan zijn glucose, glycerine, sucrose, zetmeel, dextrine, maltosestroop, melasse, 15 en soja-olie als koolstofbron, sojameel, tarwekiemen, vleesextract, pepton, gistextract, gedroogde gist, maïsolie, katoenzaadmaalsel, ammoniumsulfaat en natriumnitraat als een stikstofbron. Desgewenst kunnen anorganische zouten zoals calciumcarbonaat, natriumchloride, kaliumchloride, cobaltchloride, fosfaten en dergelijke worden toege-20 voegd. Voorts kunnen organische of anorganische stoffen, die de groei van de gebruikte SF-2052- of SF-2098-stam en de vorming van het SF-2052-produkt bevorderen, in het kweekmidden worden opgenomen· Wat de te gebruiken kweekwijzen betreft kan worden opgemerkt, dat het kweken in een vloeistof, en in het bijzonder in de 25 ondergedompelde toestand, in het algemeen de voorkeur heeft, zoals dit ook bij de bekende antibiotica het geval is. In het onderhavige geval geschiedt het kweken onder aerobe omstandigheden. De SF-2052-stam kan worden gebroed bij een temperatuur van 25·»37 °C, en meestal bij 28...32 °C. Daarbij bereikt de vorming van de SF-2052-stof 30 in de kweekmassa een maximum aan het einde van een broedperiode van 2·.10 d, zowel bij kweken onder schudden als bij kweken in een bak.

De SF-2098-stam wordt gebroed bij een temperatuur van 25-.^0 °C, en

O

gewoonlijk bij ongeveer 30 C. Het kweekmidden wordt bij voorkeur neutraal of zwak-basisch gehouden. Bij kweken in een vloeistof van 35 deze stans bereikt de vorming van SF-2052 in de kweekmassa gewoonlijk een maximum binnen 3·*10 d.

Voor het ijken van het op deze wijze gevormde SF-2052 kan bijvoorbeeld een ijkmidden worden gebruikt, dat 0,5 % polypepton, 0,3 °/> rundvleesextract, en 1,5 % agar (pH 7*0) bevat, terwijl als 7908047 - 15 - ijkorganisme Baci-llus subtillis PCI-219 kan. worden gebruikt. Bij een concentratie van 50..10 ug/ml van het SF-2052 wordt de betrekking tussen de logaritme van de concentratie en de middellijn van het onderdrukkingsgebied door een rechte voorgesteld, hetgeen 5 overeenkomt met een gebied van 21,2..12,8 mm bij de gebruikelijke bepaling met een papierschijf.

De SF-2052-stof volgens de uitvinding is een in water oplosbaar basisch antibioticum, terwijl deze stof, wanneer deze door het kweken van de S3P-20$2- of SF-2098-stam wordt voortgebracht, in 10 hoofdzaak in de vloeibare fase van de kweekmassa aanwezig is, en daaruit kan worden afgescheiden door gebruik te maken van de fysico-chemische eigenschappen van deze stof. Het afscheiden en zuiveren ervan kan langs chromatografische weg geschieden door gebruik te maken van een absorptiekunststof zoals Amberlite XAD-2 (bestaande uit een 15 mikroporeus copolymeer van styreen en divinylbenzeen, geleverd door Rohm & Haas CoO en Diaion HP-20 (bestaande uit een mikroporeus copo-lymeer van styreen en divinylbenzeen, geleverd door Mitsubishi Kasei Co.) of een gelfiltratiemiddel zoals Sephadex G-10 (bestaande uit dextran met kruisverbindingen uit epichloorhydrine, geleverd door 20 Pharmacia Co.) en Sephadex LH-20 (een gel bestaande uit een derivaat van dextransulfaat, eveneens geleverd door Pharmacia Co.), of een kationuitwisselingshars zoals Amberlite IRC-50 of Amberlite CG-50 (een zwak zure uitwisselingshars, bestaande uit een copolymeer van methacrylzuur en divinylbenzeen, geleverd door Rohm & Haas Co.) en 25 CM-Sephadex (een gelfiltratiemiddel, bestaande uit een met carboxy-methyl gesubstitueerd kruisverbonden dextrangel, geleverd door Pharmacia Co.). Voor het afscheiden van het SF-2052 uit de kweekmassa kan als volgt worden gewerkt. Deze massa wordt ontdaan van de vaste bestanddelen door filtreren of centrifugeren, waarna de 'rest wordt 30 behandeld met Diaion HP-20 voor het adsorberen van de actieve stof, die dan uit de hars wordt uitgewassen door ontwikkeling met een 50 ^’s waterige acetonoplossing (zonder pH-instelling) en met een 50 #*s waterige acetonoplossing (pH = 2,0, ingesteld met behulp van chloorwaterstofzuur) als het wasmiddel, waarna de uitgewassen vloei-35 stof onder verminderde druk wordt geconcentreerd, waarbij een ruw poedervormig produkt wordt verkregen, dat bestaat uit SF-2052-hydro-chloride.

Het ruwe produkt wordt dan gezuiverd door kolomchromato-grafie, waarbij gebruik wordt gemaakt van CM-Sephadex (H+-vorm), 7908047 -16- * CM-Sephadex (Na+-vorm) en/of actieve kool ia een geschikte samenstelling* waarbij een sterk gezuiverd produkt wordt verkregen* dat bestaat uit SF-2052-hydrochloride. Daar de vrije base van SF-2052 onder basische omstandigheden zeer onstabiel is, is het moeilijk het 5 zuivere produkt in de vorm van een vrije base te verkrijgen. Het ia van belang het afscheiden en zuiveren van SF-2052 steeds onder neutrale of zure omstandigheden uit te voeren* waarbij het aanbeveling verdient als laatste stap een zwak zure oplossing van SF-2052 aan een vriesdroogbewerking te onderwerpen* waarbij SF-2052 in de hydro-10 chloride- of sulfaatvorm als een kleurloos amorf poeder wordt verkregen.

Wanneer SF-2052 uit de kweekmassa van de SF-2098-stam moet worden afgescheiden, is het zinvol en doeltreffend deze massa op een pH van 2,0 in te stellen door toevoeging van chloorwaterstofzuur, en 15 daarna deze massa te filteren, bijvoorbeeld met behulp van een filter uit diatomeêënaarde, teneinde de myceliumkoek en andere vaste bestanddelen daaruit te verwijderen, waarna het filtraat door een kolom van Amberlite IRC-50 (Na+-vorm) wordt gevoerd om de actieve stof te adsorberen. Tenslotte wordt de harskolom uitgewassen met 0,4 N 20 chloorwaterstofzuur. De verkregen vloeistof wordt met waterig natri-umhydroxyde geneutraliseerd, en vervolgens met actieve kool ontzout. De verkregen oplossing wordt verder gezuiverd door toepassing van kolomchromatografie met CM-Sephadex, actieve kool en/of Sephadex LH-20, waarbij een sterk gezuiverd produkt wordt verkregen, dat uit 25 SF-2052-hydrochloride bestaat.

Voor het bepalen van de acute giftigheid van SF-2052-sul-faat werd deze stof in een isotone waterige oplossing van natrium-chloride intraveneus in verschillende groepen muizen geïnjiceerd.

Er werd vastgesteld, dat SF-2052-sulfaat een LD^Q-waardè van 350 mg/ 30 kg bij muizen vertoonde, en derhalve als niet-giftig kan worden beschouwd. De uitvinding verschaft' voorts een bacteriebestrijdingsmid-del, dat als actieve stof een werkzame hoeveelheid van tenminste een van de farmaceutisch aanvaardbare zuuradditiezouten van SF-2052 bevat, samen met een farmaceutisch aanvaardbare vloeibare of vaste dra-35 ger. De hoeveelheid van deze actieve stof kan daarbij 5·»50 gew.$ bedragen.

Het bacteriebestrijdingsmiddel volgens de uitvinding kan worden gebruikt als een waterige oplossing, die 0,01..0,1 gew.% van SF-2052-zuuradditiezout bevat, welke oplossing geschikt is voor steri- 7908047 - 17 - lisatie van chirurgisch materiaal en instrumenten, alsmede van andere toestellen en ruimten, die steriel moeten worden gehouden. Dit middel kan voorts worden gebruikt in een voor innemen in de mond geschikte vorm, zoals tabletten, capsules, poeders, oplossingen en 5 suspensies, en wel door een hoeveelheid van een farmaceutisch aanvaardbaar zuuradditiezout van SF-2052 met een gangbare farmaceutisch aanvaardbare vaste drager zoals zetmeel, sucrose, talk of calcium-carbonaat te mengen, of door deze stof op te lossen of te suspenderen in een farmaceutisch aanvaardbare vloeistof zoals ethanol en wa-10 ter. De hoeveelheidsverhouding tussen de actieve stof volgens de uitvinding en het dragermateriaal hangt daarbij af van de aard van het in de mond in te nemen bereide middel, en bedraagt meestal ongeveer 1 ï 1..1 : 100.

Dit bacteriebestrijdingsmiddel kan ook als een injiceer-15 bare oplossing of suspensie worden gebruikt, waarbij dan de actieve stof in een hoeveelheid van 0,1..10 gew.# in een fysiologische zoutoplossing of dergelijke drager, bijvoorbeeld Ringer's oplossing, wordt opgelost of gesuspendeerd, met of zonder toevoeging van een geschikt spreidingsmiddel. Een dergelijke oplossing of suspensie kan 20 voor intraveneuze, intramusculaire of intraperitoneale injectie worden gebruikt.

Het zal duidelijk zijn, dat de gebruikte hoeveelheid van de actieve stof volgens de uitvinding van de aard van de voor toediening gebruikte samenstelling, voorts van de wijze van toediening, 25 en van de te behandelen ziekte afhangt. Daarbij dient uiteraard rekening te worden gehouden met leeftijd, lichaamsgewicht, geslacht, dieet, tijdstip van toediening, toedieningsweg, uitscheidingsgraad, gebruik van andere geneesmiddelen, gevoeligheden en ernst van de ziekte. Gewoonlijk wordt ongeveer 0,5..100 mg/kg van de‘actieve ver-30 binding per dag aam een volwassene gegeven. Optimale hoeveelheden kunnen op de gebruikelijke wijze worden vastgesteld, rekening houdend met vroegere ervaringen.

De uitvinding zal in het onderstaande nader worden toegelicht aan de hand van een aantal niet-beperkende voorbeelden.

35 Voorbeeld I

(1) Broeden van de_SF-2052-stam

Een voorraadkweek van Dactylosporangium matsu-zakiense SF-2052 (geregistreerd als FERM-P A-670 en ATCC No.

31570) werd gebruikt, terwijl voor het broeden een gesteriliseerd 7908047 f.

- 18 - entkweekmiddel werd gebruikt, dat 2,0 % glucose, 0,5 % pepton, 0,2 # vleesextract, 0,3 % gistextract, 0,2 % sojameel en 0,1 % calciumcar-bonaat (pH 7,0 voor het steriliseren) bevatte.

Van deze voorraadkweek werden 5 tot 6 lusvullingen geënt 5 op 20 inl van het voornoemde entkweekmiddel in een Erlenmeyerkolf van 100 ml, waarna bij 28 °C gedurende 6 d werd gebroed, hetgeen een eerste entkweek opleverde. Het vormen van deze eerste entkweek geschiedde in 10 kolven. Totaal 200 ml van de eerste entkweek werd ge-ent in porties van 20 ml in 10 Erlenmeyerkolven van 500 ml, die elk 10 80 ml van het voornoemde entkweekmiddel bevatten, waarna bij 28 °C gedurende 72 h werd gebroed.

Op deze wijze werd een tweede entkweek verkregen, die in porties van 5 ml werd geënt in 150 Erlenmeyerkolven van 500 ml, die elk 80 ml van een bereidingskweekmiddel bevatten. Dit laatste bevat- 15 te 4,0 % glucose, 1,0 % pepton, 0,4 # vleesextract, 0,6 % gist-* extract, 0,4 % sojameel en 0,2 % calciumcarbonaat, d*w.z. elk bestanddeel in een tweemaal grotere hoeveelheid dan in het voornoemde entkweekmiddel. Het kweken geschiedde bij 28 °C gedurende 6 d onder schudden, zoals dit gebruikelijk is.

20 Vervolgens werd de kweekmassa aan een doorlopende centri- fugeerbewerking onderworpen met behulp van een gekoelde centrifuge, waarbij 10 1 filtraat in ongeveer 2 h werd verkregen.

(2) Afscheiden_van_het_SF-2052£

Het voornoemde filtraat (10 1) werd door een kolom met 25 750 ml van het in het voorgaande reeds genoemde Diaion HP-20 gevoerd, teneinde de actieve stof te adsorberen. Deze harskolom werd daarna gewassen met 3 1 water, waarna met 1,8 1 van een 50 #’s waterige acetonoplossing (pH niet ingesteld) werd gespoeld, en vervolgens met 1,8 1 50 %fs waterige acetonoplossing (pH 2,0 ingesteld'met HCl). Op 30 deze wijze werd het S^-2052 uit de harskolom gewassen. De wasvloeistof werd iti hoeveelheden van 1,8 1 verzameld.

De actieve bestanddelen (samen 3*6 1), die het SF-2052 bevatten, werden onder verlaagde druk verdicht door het uitdampen van het aceton. Het concentraat bleef vervolgens staan, en werd daarna 35 gefiltreerd om het gevormde neerslag te verwijderen. Het filtraat werd door een kolom van 300 ml van het eerdergenoemde CM-Sephadex C-25 (H+-vorm) gevoerd voor het adsorberen van de actieve stof.

Deze kolom werd gewassen met opeenvolgende hoeveelheden van 1,0 1 NaCl, en wel van 0,1 N, 0,2 N, 0,4 N resp. 0,6 N. De spoel-

790804T

- 19 - vloeistof werd in porties van 18 ml verzameld, waarbij de actieve stof in de porties 26·*92 werd uitgewassen.

- De actieve bestanddelen werden door een kolom van 200 ml chromatografisch actieve kool gevoerd om de actieve stof te adsor-5 beren, welke kolom werd gewassen met 900 ml water, gevolgd door spoelen met 1,2 1 50 waterige acetonoplossing (pH niet ingesteld) en vervolgens met 600 ml 50 %'a waterige acetonoplossing (pH 2,0 ingesteld met HC1) De spoelvloeistof werd in porties van 1800 ml verzameld, waarna de actieve gedeelten (totaal 1800 ml), die het uitge-10 wassen SF-2052 bevatten, werden samengevoegd, waarna de verkregen oplossing onder verlaagde druk werd verdicht· Deze verdichte oplossing werd drooggevroren, hetgeen 170 mg van een ruw wit poedervormig produkt (zuiverheid ongeveer 20 #) opleverde, welk produkt SF-2052-hydrochloride was.

15 (3) Zuivering

Het voornoemde ruwe produkt (170 mg) werd ia 5 ml water opgelost, waarna de verkregen oplossing door een kolom van 180 ml CM-Sephadex C-25 (Na+-vorm) werd gevoerd, welke kolom met 0,1 N NaCl was gedrenkt. Deze kolom werd daarna gespoeld met 2 1 0,5 N NaCl, ge-20 volgd door ontwikkeling met 1,0 N NaCl. De spoelvloeistof werd in porties van 18 ml verzameld, en de porties 8··20, die het SF-2052 bevatten, werden weer samengevoegd.

De actieve bestanddelen (samen 220 ml) werden door een kolom van 40 ml uit chromatografisch actieve kool gevoerd om de actie-25 ve stof te adsorberen. Deze kolom werd gewassen met 250 ml water, gevolgd door uitspoelen met 200 ml 50 #'s waterige acetonoplossing (pH niet ingesteld), en vervolgens met 200 ml 5° waterige acetonoplossing (pH 2,0), teneinde de actieve stof uit de kolom te spoelen. De spoelvloeistof werd verzameld in porties van 400 ml, waarna 30 de actieve bestanddelen (totaal 400 ml) onder verlaagde druk werden verdicht. De verkregen oplossing werd drooggevroren, waarbij 26 mg SF-2052-HC1 in de vorm van een kleurloos poeder werd verkregen, dat zuiver was.

(4) Vorming van SF-2052-sulfaati_ 35 Het voornoemde kleurloze poeder werd in 10 ml water opge lost, waarna de oplossing door een kolom van 10 ml sterk basische anionuitwisselingshars werd gevoerd, en wel Amberlite IHA-4QQ (sul-faatvorm). De doorgestroomde vloeistof werd verdicht en drooggevro-ren, hetgeen 30 mg van het SF-2052-sulfaat opleverde in de vorm van 7908047 - 20 - * een kleurloos poeder· Dit produkt had een ontledingstemperatuur van meer dan 220 °C. .

Voorbeeld II

Het in de stap (1) van voorbeeld I verkregen filtraat 5 (10 1) werd door een kolom van 800 ml Diaion HP-20 gevoerd om de actieve stof te adsorberen. Deze kolom werd gewassen met k 1 water, en daarna gespoeld met 50 #’s waterige acetonoplossing (pH *f,0), terwijl de spoelvloeistof in porties van 500 ml werd verzameld. De porties 2··6 bevatten de uitgespoelde actieve stof, welke porties 10 met elkaar werden verenigd, en onder verlaagde druk van het &c$ton ontdaan·

De overblijvende vloeistof liet men enige tijd staan, waarna de gevormde neerslag werd afgefiltreerd. Het filtraat werd door een kolom van 250 ml Amberlite 1BG-50 (Na+-vorm) gevoerd, ten-15 einde de actieve stof te adsorberen· Deze kolom werd vervolgens gewassen met 2 1 water, en daarna gespoeld met 0,1 N HC1. De spoelvloeistof werd in porties van 18 ml verzameld, waarbij de actieve stof in de porties 2^0..336 werd uitgespoeld. Deze werden weer met elkaar verenigd, en door een kolom van 150 ml Amberlite IB-^5 (0H~-20 vorm) gevoerd om te worden* geneutraliseerd.

De oplossing (pH 5»**), die deze kolom verliet, werd in een kolom van 80 ml chromatografisch actieve kool gevoerd voor het adsorberen van de actieve stof, welke kolom werd gewassen met kOO ml water, en daarna gespoeld met 3°0 ml 5° $'s waterige acetonoplossing 25 (pH niet ingesteld), en vervolgens met 300 ml 50 %'b waterige acetonoplossing (pH 2,½ ingesteld met HCl), teneinde de actieve stof uit de harskolom te desorberen.

De aldus verkregen actieve oplossing (totaal 600 ml) werd onder verlaagde druk geconcentreerd, en daarna drooggevroren, het-30 geen 260 mg SF-2052-HC1 opleverde in de vorm van een enigszins geel gekleurd ruw poeder (zuiverheid 16 #).

Voorbeeld III

(1) Broeden van de_SF-2098-stam;_

Een voorraadkweek van Mikromonospora sp. SF-2098 35 (geregistreerd als FERM-P 5073 en ATCC No. ) werd gebruikt, alsmede een gesteriliseerd entkweekmiddel, dat 2,0 % glucose, 0,5 % pepton, 0,2 % vleesextract, 0,3 % gistextract, 0,2 % sojameel, en 0,1 ^ calciumcarbonaat (pH, niet ingesteld) bevatte.

7908047 >* - 21 -

Van deze voorraadkweek werden 3 of 4 lusvullingen geent op 20 ml van het voornoemde entmiddel in een Erlenmeyerkolf van 100 ml, gevolgd door broeden bij 28 °C gedurende 4 d, hetgeen een entkweek opleverde. Dit geschiedde in 20 kolven.

5 De verkregen kweek (totaal 4ö0 ml) werd geënt in porties van 4 ml in 100 Erlenmeyerkolven van 500 ml, die elk 80 ml van een gesteriliseerd bereidingskweekmiddel bevatten. Dit middel bevatte b % maltosestroop, 0,3 % soja-olie, 0,5 % oplosbaar plantaardig eiwit, 1,0 % katoenzaadmaalsel, 0,001 # ferrosulfaat, 0,0001 % kobalt-10 chloride en 0,2 % calciumcarbonaat (pH 7,0 voor het steriliseren).

Het broeden geschiedde bij 28 °C gedurende 2 d, zoals gebruikelijk onder schudden.

Na het broeden werd de kweekmassa op een pH 2,0 gebracht door toevoeging van 6 N HC1, en vervolgens met diatomeeënaarde ge-15 filtreerd, hetgeen 7,0 1 filtraat opleverde.

(2) Afscheiden_van_het_SF-2052ï_

Het voornoemde filtraat (71) werd door een kolom van 220 ml Amberlite IBC-50 (Na+-vorm) gevoerd om de actieve stof te adsorberen.

20 Vervolgens werd deze kolom gewassen met 1 1 water, en daar na gespoeld met 0,4 N HC1. De spoelvloeistof werd in porties van 250 ml verzameld, waarbij de actieve stof in de porties 2..5 werd uitge-spoeld. Deze werden met elkaar verenigd, waarna de pH op 4..6 werd ingesteld door het toevoegen van 0,2 N NaOH, waarna de vloeistof 25 door een kolom van 150 ml actieve kool werd gevoerd voor het adsorberen van de actieve stof. Deze kolom werd gewassen met 500 ml water, en daarna gespoeld met 400 ml 50 %'s waterige acetonoplossing (pH niet ingesteld), en daarna met 400 ml 50 %’s waterige acetonoplossing (pH 2,2), teneinde de actieve stof uit de koolkolom te desorberen.

30 De actieve gedeelten van de spoelvloeistof (totaal 800 ml) werden met elkaar verenigd, en onder verlaagde druk van de aceton ontdaan.

De aldus verkregen oplossing werd door een kolom van 200 ml CM-Sephadex 0-25 gevoerd voor het adsorberen van de actieve stof.

Deze kolom werd gewassen met 1 1 0,3 N NaCl, en vervolgens 35 met 1 1 0,5 N NaCl, gevolgd door spoelen met 0,5 N NaClo De spoelvloeistof werd verzameld in porties van 20 ml, waarbij de porties ’ 102..172, die het SF-2052 bevatten, met elkaar werden verenigd. De actieve oplossing werd door een kolom van 50 ml chromatografisch actieve kool gevoerd om de actieve stof te adsorberen. Deze kolom werd 7908047 ff - 22 - gewassen met 200 ml water, en daarna gespoeld met 200 ml 50 -#*s waterige acetonoplossing (pH niet ingesteld), en vervolgens met 200 ml 50 %*b waterige acetonoplossing (pH 2,0 ingesteld met HC1), waardoor de actieve stof met goede opbrengst werd uitgespoeld· De actieve ge-5 deelten (totaal 800 ml) werden onder verlaagde druk geconcentreerd en vervolgens drooggevroren, hetgeen 12*f mg van een ruw wit poeder (zuiverheid 20 #) opleverde, welk poeder SF-2052-HC1 bevatte.

Van dit ruwe poeder werd 120 mg in ml 50 %*s waterige methanoloplossing opgelost, welke oplossing door een kolom van 330 10 ml Sephadex LH-20 werd gevoerd, die goed met 90 f61s methanoloplossing was gewassen. Deze kolom werd ontwikkeld met 90 waterige methanoloplossing, en waarbij de spoelvloeistof in porties van 12 ml werd verzameld. De actieve stof werd in de porties 12..16 uitgespoeld. De samengevoegde actieve gedeelten (totaal 60 ml) werden on-15 der verlaagde druk geconcentreerd en drooggevroren, hetgeen 20 mg van het zuivere SF-2052-HC1 in de vorm van een kleurloos poeder opleverde.

7908047

Claims (7)

1. Nieuwe stof) SF-2052 genoemd, en een farmaceutisch aanvaardbaar zuuradditiezout daarvan, welke stof een in water oplosbare basische verbinding is, die een bacteriebestrijdingswerking vertoont, waarbij SF-2052-HC1 de vorm heeft van een kleurloos en amorf 5 poeder, dat althans nagenoeg stabiel is in neutraal tot zuur midden, doch onstabiel is in basisch midden, welke stof voorts geen bepaalde o smelttemperatuur heeft, doch op of nabij 170 0 naar bruin verkleurt, en onder schuimvorming bij 209·«210 °C ontleedt, welke stof verder positief reageert met ninhydrine, Lemieux-reagens en Greig-Leiback-10 reagens, doch negatief met Sakaguchi-reagens en zilvernitraat, en welke stof tenslotte goed oplosbaar is in water, redelijk oplosbaar is in methanol, en onoplosbaar is in ethylacetaat, chloroform, benzeen en ethylether, gekenmerkt door: (a) een samenstelling van 35*69 % C, 7*04 % H, 11,80 % N; 15 (b) de afwezigheid van een kenmerkende absorptiepiek in het gebied van 220o.370 nm van het UV-absorptiespectrum in een waterige oplossing; (c) een IR-absorptiespectrum in een KBr-tablet, dat met het in fig. 1 afgeheelde spectrum overeenkomt; 20 (d) een absorptiespectrum voor magnetische resonantie van waterstof, bepaald in D^O, dat in hoofdzaak overeenkomt met het in fig. 2 getoonde spectrum; Ce) een absorptiespectrum voor magnetische resonantie van koolstof, bepaald in D^O, dat in hoofdzaak met het in fig. 3 getoonde spec-25 trum overeenkomt; 25 o (f) een optische draaiing in waterige oplossing (c=1)[oe]^'= +87 ; en (g) een enkele vlek bij Rf = 0,46 bij dunnelaagchromatografie op cellulose met een mengsel van n-propanol, pyridine, azijnzuur en wa- 5° ter (15:10:3:12) als ontwikkeloplossing, en bij Rf = 0,09 bij papier chromatografie met een mengsel van n-butanol, azijnzuur en water (2:1:1) als ontwikkelvloeistof door toepassing van de op-s t i j gwerkwi j z e·

2. Stof volgens conclusie 1, in de vorm van SF-2052-hydro-35 chloride of -sulfaat·.

3· Werkwijze voor het vormen van de stof volgens conclusie 1, gekenmerkt door: 7908047 r - 2k - (a) het kweken van een SF-2052 voortbrengende stam van actinomyce-tes, in het bijzonder Dactylosporangium matsuza- k i e n s e SF-2052, geregistreerd als FERM-P 4670 en ATCC 31 570, in een waterig vloeibaar kweekmidden, dat opneembare koolstof-5 en stikstofbronnen bevat, waarbij het kweken onder aerobe omstandigheden plaatsvindt gedurende een tijd, die voldoende is om het SF-2052 in het kweekmidden voort te brengen en zich te doen ophopen; en (b) het uit de kweek afscheiden van het SF-2052· 10 k· Werkwijze volgens conclusie 3* met het kenmerk, dat het kweken plaatsvindt bij een temperatuur van 25o.37 °C gedurende 2..10 d.

5. Werkwijze volgens conclusie 3 of 4, met het kenmerk, dat het SF-2052 in de hydrochloridevorm uit de kweekmassa wordt af- 15 gescheiden.

6. Werkwijze voor het voortbrengen van de stof volgens conclusie 1, gekenmerkt door: (a) het kweken van een stam van Mikromonospora spo SF-2098, geregistreerd als FERM-P 5073 en ATCC , in een waterig 20 vloeibaar kweekmidden,< dat opneembare koolstof- en stikstofbronnen bevat, waarbij het kweken onder aerobe omstandigheden plaatsvindt gedurende een tijd, die voldoende is om het SF-2052 in het kweekmidden voort te brengen en zich te doen ophopen; en (b) het uit de kweek afscheiden van het SF-2052. 25 7· Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat het kweken plaatsvindt bij een temperatuur van 25··kO °C gedurende een tijd van 3·»10 d.

8. Werkwijze volgens conclusie 6 of 7* met het kenmerk, dat het SF-2052 in de hydrochloridevorm uit de kweekmassa wordt af- 30 gescheiden. ·

9. Voor bacteriebestrijding dienende samenstelling, die als actief bestanddeel een doeltreffende hoeveelheid van tenminste een van de farmaceutisch aanvaardbare zuuradditiezouten van SF-2052 bevat, samen met een farmaceutisch aanvaardbare drager voor dit be- 35 standdeel. 7908047