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Verfahren zur Bestimmung von hormonen in Körper-
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flüssigkeiten Bei den Wirbeltieren besteht eine absolute Notwendigkeit,
die einzelnen Organe auf eine koordinierte Leistung abzustinnen. Dies geschieht
im Zusammenwirken des (für die rasche interzelluläre Kommunikation zuständigen)
Nervensystems mit dem endokrinen System. Die Informationsweitergabe des endokrinen
Systems geschieht über die Freiset zung von Hormonen.
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Die Hormone werden in Drüsen (Keim-, Schild-, Thymus-Pankreasdrüse,
Ncbennierenrinde, Hypophysenvorderlappen, Epithelkörper, Lcber) und anderen Strukturen
(Placenta, 7,iId-5, 75 3 LhS PlaTiaei'uiskÖ7Pe-n eilt.
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Auf den ad§quaten physiologischen Reiz hin werden sie von dort abgegeben
und gelangen über die Blut- oder Lymphbahn an den Zielorts Die hormone sind chemische
den Klassen der Steroide, Aminosäuren, Amine, Poptide und Proteine zuzuordnen. Sie
werden überwiegend nicht aus Speichern freigesetzt, sondern neu synthetisiert (vgl.
Ullmann's jEncyclopädie der tecn. Chemie, 4 r2rf2ag, arn 13, 3riIag Kr-ee 59'77).
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Man kann Einteilungen der Hormone gemäß ihren Wirkungen vornehmen:
A. Wirkung auf Wachstum und Differenzierung OWachstumshormon - Releasing - Hormons
Wachstumshormon.
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Somatomedin C, Prolaktin-Release Inhibiting Faktor,
Prolaktin,
TSH-Releasing-Hormon, Thyreotropes hormon, Exophthalmus hervorrufende Substanz,
Thyroxin, langwirkender Thyroid-Stimulator, Brythropoctin, Thymusfaktoren).
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B. Wirkung auf Stoffwechsel, Wasser- und llektrolythaushalt.
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(ACTH-Releasing Faktor, ACM lucocorticoide, Insulin, Somatomedin =
Glucagon, Ca-regulierende llormone, Parat-Hormon, Calcitonin, Vasopressin, Aldosteron,
Angiotensin, Katecholamine.) C. Reproduktion und Steroidbiosynthcse. Gonadotropin-Releasing-Hormon,
Gonadotropine, z.B. LH, ESH, Choriongonadotropin, Chorionsomatomammatropin, Testosteron,
Ustrogene, Progesteron, Melatonin, Oxytocin.
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D. Gewebshormone (Bradykinin, Somatostatin, Prostaglandinc) E. Hormone
der Schilddrüse und Nebenschilddrüse (I.-Thyroxin (T4), L-3,5-3'-Trijodthyronin
(T3), Calcitonin, Parathormon).
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Für viele Hormone scheint ein vom Prinzip her gemeinsamer Wirkungsmechanismus
vorzuliegen. Dieser Mechanismus gilt wahrscheinlich für alle Hormone, die nicht
durch die Tipoproteinmatrix der Zellwand hindurchtreten können, z.B. Peptide, Proteine
und Prostaglandine.
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Die Hormone bilden am Zielort (Target-Organ) mit an der
Zellaußenwand
befindlichen hormonspezifischen Strukturen, den Rezeptorcn, einen Komplex. Die Bildung
des lSormon-Rczeptor-Konplexes aktiviert ein an der Innenseite der Zclllnambran
lokalisiertes Enzym, die Adenylcyclase zu vermehrter Produktion von c-AMP (cyclisches
3, '5'-Adenosinmonophosphat). Das gebildete c-R g löst in der Zelle dicjenige enzymatische
Aktivität aus, die zur Bildung der zellspezifischen Produkte führt.
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Bei Steroidhormonen liegen die Rezeptoren im Zytoplasma des Zielorgans)
z.B. für Progesteron im Endometrium. Auch bei Aimma- und Prostatakarzinomen sind
im Zytoplasma Östradiol-Rezeptoren nachgewiesen. Der cyrtoplasmatische Steroid-Rezeptor-Komplex
wird aktiviert und wandert in den Kern, wo er sich mit einer Akzeptorstelle im Chromatin
verbindet. Schilddrüsenhormone haben Rezeptoren im Kernchromatin des Zielorgans.
Auch zytoplasmatische Rezeptoren wurden beschrieben.
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Die Forschung ist um die Aufklärung der spezifischen Hormon-Rezeptor-Interaktion
bemüht. Der erste Schritt hierzu liegt in der genauen Lekalisierung der Rezeptoren.
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Die Releasing-Hormone des Hypothalamus werden z.B.
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den Membranden von hypophysenvorderlappen-Zellen gebunden.
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Es kommt danach zur Sekretion der Hypopysenvorderlappen-Hormone. Diese
bilden wiederum Hormon-Rezeptor-Komplexe an den Zellmembranen ihrer Zielorte. So
bildet ACTH an den Zellmembranen der nebennierenrinde Rezeptor-Komplexe.
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Für das Wachstumshormon Somatropin sind Muskel und Knochen für Prolactin
die Mamma, für Choriongonadotropin und Chorionsomatomammatropin die Placenta, für
Insulin Leber und Whskulatur, für Calcitonin, Parathyroidhormon und Vasopressin
die
Niere die jeweiligen Rezoptor-Organe. Auch für dic ProstagAandine und für Adrenaline
ist dic Windung an Mcmbranrezeptoren nachgewicsen.
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Im allgemeinen kann damit gerechnet werden, daß die Zielorte und Rezeptoren
von Hormonen entweder bereits bekannt sind oder daß plausible ltpothcsen über sic
bestehen, die in absehbarer Zeit entweder bvestätigt oder korrigiert werden dürften.
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Die Bestimmung der Hormone und ihrer Metaboliten in Körperflüssigkeiten
und im Harn ist eine wichtige analytische Aufgabe. Man gewinnt Aufschluß über Sekretionsleistungen,
Transport, Inaktivierung usw. Die medizinische Diagnostik kann aus Hormonbestimmungen
wichtige Rückschlüsse auf den Allgemeinzustand und auf Stoffwechselstörungen bzw.
-anomalien gewinnen.
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Erinnert sei z.B. an den immunserologischen Schwangerschaftsnachweis
durch Bestimmung des Choriongonadotropins. Weiter spielt der Trijodthyronin (T3)-
und Thyroxin (T4)-Test einc entscheidende Rolle in der Diagnostik der Schilddrüsenerkrankungen.
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Entscheidend hat die Hormonanalytik von der Einführung von Methoden
profitiert, die auf der Best 8 g radioaktiv markierter Hormone basieren. Bedeutung
hat u.a. die lSonnonrezeptormctode (Radioligand-Hormonrezeptor-Methode) erlangt.
Aus tierischen Organen isolierte llormonrezeptoren werden mit dem Gemisch aus dem
zu messenden und dem radioaktiv markierten lSormon inkubiert. Es wird mit Hormon-
konzentrationcn
gearbeitet, die im SSttigungsbereich des Rezeptors liegen. je weniger endogenes
(natives) Bormon sich ursprünglich inder zu untersuchenden llüssigkeit befand, um
so höher muß die Radioaktivität des Hormonrezeptor-Komplexes ausfallen.
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So hat z.B. Koreman eine Bestimmung von Ustrogenen im Schwangerenha
m nach der Radioligand-Hormonrezeptor-Methode entwickelt, bei der eine lösliche
Uterusfraktion die Rezeptoren stellt (vgl. S.G. Korenman, J. Clin. Endocr.
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28, 127 (19683).
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Die Bestimmungsmethoden des Standes der Technik konnten jedoch nicht
völlig befriedigen.
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Es wurde nun gefunden, daß man die Bestimmung von Hormonen in Körperflüssigkeiten,
insbesondere nach der Radioligand-Hormonrezeptor-Methodè, wesentlich verbessern
kann, wenn man ein wäßriges medîum herstellt, das den Hormonrezeptor nach Möglichkeit
in homogener Phase enthält und aus diesem Medium len Hormonrezeptor mit einem geeigneten
(spezifischen) Fällungsmittel, vorzugsweise in für die nachfolgende analytische
Bestimmung, die Zentrifugation und quantitative Bestimmung der einzubringenden Markierung
umfaßt, geeigneten Gefäßen, mit geeigneter Trägeroberfläche, an dieser Trägeroberfläche
immobilisiert, von anhaftender Flüssigkeit befreit, dann die an der Trägeroberfläche
immobilisierte, den Hormonrezeptor enthaltende Phase mit einer definierten Menge
der zum Test vorbereiteten Körperflüssigkrit bzw. Ürin inkubiert, die den zur analytischen
Brfassung markierten Liganden,
insbesondere Radioliganden enthAlt,
und die analytisc1e Bestimmung, insbesondere den Radioliganden-Honnonrezeptor-Tcst,
durchführt.
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Bei der Durchführung des erfindungsgemäßcn Verfahrens wird man sich
vorteilhafterweise an die Hormon-Bestimmungsverfahren des Standes der Technik anschließen
(vgl. Breuer, Hamcl und Krüskemper, "Methoder der Hormonbestimmung", Thieme-Verlag,
(1975) Stuttgart, S. 384 ff.). An erster Stelle steht dic Verwendung radioaktiv
markierter Liganden, aber es können auch andere Markierungen, die sich enzymatisch
oder fluoreszenzspektroskopisch auswerten lassen, angewendet werden, Das erfindungsgemäße
Verfahren soll anhand des Nachweises von Ustrogenen im Schwangerenharn näher dargestellt
werden.
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Das Verfahren setzt, wie bereits ausgefuhrt, bekannte und zugängliche,
für das nachzuweisende Hormon spezifische Rezeptoren voraus.
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Als Quelle für Ustrogenrezeptoren dient z.B. Meerschweinchen-Uterus,
der präpariert, und in tiefgefrorcnem Zustand pulverisiert wird.
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Das Gewebepulver wird unter möglichster Schonung (Kühlung) mit geeignetem
Puffer extrahiert und aus dem Homogenat die rezeptorhaltige Fraktion mit Protaminsulfat
und nacfolgender Zentrifugation an einer festen Phase immobilisert. Als besonders
geeignete Matrix für die Immobilisielang hat sich Polystyrol, insbesondere nach
vorgängiger "chemischer Aufrauhung" bewährt. Mit Vorteil kann z.B. die ImmobiAisierung
an fester Phase
auf Titerplatten aus Polystyrol für serologische
Tcsts, dren Bodenvcrtiefungen z.B. mittels Aceton "aufgeratit" u im Zugc di.cser
Bchandlung abgeflacht worden waren, durchgcführt wurden (Uberführung der ursprünglich
halbkugelförmigkonkaven in eine zylinderförmig-konkave Form der Titerplattcnverticfungen.)
An Stelle von Aceton kann auch cin anderes Keton oder cine sonstige chemische Substanz
mit gleicher Wirkung verwendet werden.
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Gleichzeitig wird der Urin,dessen Ustrogengehalt bestimmt werden soll,
wie folgt behandelt: Zuerst werden durch Zusatz von ß-Glucuronidase und Steroidsulfatase
die konjugierten Steroide hydrolysiert.
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Anschließend wird mit Puffer verdünnt und gleichzeitig der Radioligand
3H-Ustradiol zugesetzt.
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Es erfolgt dann eine Inkubation des an der Matrix durch Fällung immobilisierten
Rezeptors mit dem Radioligand/ östrogenhaltigen Urin wie oben naher beschrieben.
Pro Patient werden zwei Bestimmungsansätze, sowie zwei Leerwerte zur Bestimmung
der unspezifischen Bindung durchgefiErt. Außerdem werden vier sopenannte 100 %-Wertbestimmungen
(= 3H-Östradiol ohne Urin) simultan durchgeführt.
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Der Inkubationsstop wird durch Dekantieren sowie mehrfaches Waschen
mit eiskaltem 1 %-rinderserumalbum in Pufferlösung sowie Wasser erreicht.
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Dann werden die Vertiefungen der Polystyrol-Titerplatte (bzw. anderer
fester Trägermaterialien), in welcher die Tests durchgeführt worden waren, abgeschnitten
und in
Szintillationsfläschchen überfuhrt. Nach Zugabc von 10 ml
Toluolszintillator wird 30 min geschtttclt und dann im "F1tissigkeitszähler" die
Radioaktivität bc-Stimmt.
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Die Auswertung erfolgt anhand einer Eichkurve. Die Details lassen
sich den Beispielen entnehmcn.
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Zusammenfassend lassen sich bei dem crfindungsgemAßen Verfahren die
folgenden allgemein gültigen Verfahrensmerkmale aufstellen: a) Auswahl eines den
liormonrezeptor enthaltenden Organs; b) Gewinnung eines t30rmonrezeptors in löslicher
Form; c) Immobilisierung des hormonrezeptors mit Hilfe einer polymeren Substanz
an einer geeigneten Phase; d) Inkubation des immobilisierten Hormons mit einem Gemisch,
welches das zu bestimmende lSonnon, sowie ein anderes markierter Molekül , entsprechend
der jeweil.igen Markierungsart d.h. mit radioaktiven, enzymatischen oder fluoreszenzspektroskopischen
Verfahren) das seinerseits Affinität zum Hormonrezeptor haben muß und im speziellen
Fall mit dem Hormon identisch sein kann; e) Bcstimmung der an der festen Phase adsorbierten
Verbindung. Besonders überrascht die relativ festc l-laftlmg der immobilisierten
Rezeptorenphase an der Trägeroberfläche.
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Als spezifischc Fällungsmittel für die Re@eptoren sind im Prinzip
solche polymeren Substanzen geeignet, die zur Immobilisierung der Rezeptoren an
der Trägeroberfläche füren, ohne störende Einflüsse auf die Rezeptoren und dic Zugänglichkeit
derselben für die Hormone auszuüben. Man
wird in erst-er linie
auf basische Proteine, also bcsonders Protcinc mit beträchtlichem Gehalt an den
Aminosäuren Arginin, (Hydroxy)-Lysin, Histidin, wie z.B. Protamine, llistone u.ä.
zunickgreifen. Es kommen jedoch auch anderc po1pucre Substanzen biologischen Ursprungs,
soweit sie die genannten Bedingungen erffillen, in Frage.
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Daneben können auch hydrophile, synthetische Polymere, beispielsweise
mit Flockungsmittel-Eigenschaften, insbesondere kationische Flockungsmittel (vgl.
Ullmann's Encyclopädie der technischen Chemie, 4. Auflage, Bd. 11, S. 581 - 586,
Verlag Chemie) Verwendung finden.
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Dic oben aufgezei.gten Verfarensmerkmale lassen sich gegebenenfalls
in zweckmäßig abgewandelter Form auf alle über Rezeptorsysteme wirksamen Hormone
übertragen.
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In erster linie kommen Bestimmungsverfahren für Hormone mit Steroidcharakter,
sowie T3 und T4 in Frage.
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Eine weitere bevorzugte Ausführungsart des erfindungsgemäßen Verfahrens
betrifft die Bestimmung des Dehydro-Testosterons (der biologisch aktiven Form des
Testosterons). Als Rezeptoren sind Nebenhoden (Epididymis) von Meerschweinchen besonders
geeignet.
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Diese können in analoger Weise, wie für Ustrogene ausgeführt, an festen
TrSgern immobilisiert werden. Zweckmäßig gibt man bei der Präparierung der inmobilisierten
Rezeptoren Dith ioerythrit als gSngiges (reduktives) stabilisierendes Agens hinzu.
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Als Radioligand wird 3 Dihydrotestosteron einer
spezifischen
Radioaktivität von 155 Guric/mmol in del Verdünnung von 1,5 . 10-9 mol/1 zugesetzt.
Die weiteren experimentellen Bedingungen entsprechen denen der Ustrogenbestimmung.
Darüber hinaus kann das erfindtlllgsgemäße Verfahren auch zur Bestimmung des Progesterons
mit I4ilfe der an der festen Phase immobilisierten Rezeptoren aus Meerschweinchen-Uteri
verwendet werden.
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Als Radioligand kann 31{-Progesteron einer spezifischen Aktivität
von 98 Curie/mmol in einer Verdünnung von 2,5 . 10-9 mol/1 eingesetzt werden. Die
weiteren experimentellen Bedingungen entsprechen denen der Östrogenbestimmung.
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Die oben angeführten Beispiele lassen sich zur Bcstimmung der entsprecenden
Hormone sowohl im Urin als im Serum verwenden. Die nachfolgend beschriebene Bestimmung
des Thyroxins wird mit Extract aus Serum durchgeführt.
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Fine weitere bevorzugte Ausführungsart des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist die Bestisnung des Thyroxins. Diesc läßt sich mit Rezeptoren oder Proteinen
mit rezeptorähnlichen Eigenschaften, die aus Human-α-globulin-fraktion-4,
meorschweinchenleberhomogenat und Homogenat komplette Kaulquappen in erfindungsgemäßer
Weise an der festen Phase immobilisiert wurden, durchführen. Die Bestimmung des
Thyroxins wird mit durch 125J-markiertem Thyroxin in analoger Weise wie beim Östrogen
durchgeführt. Als besonders überraschend kann die relativ feste Haftung der immobilisierten
Rezeptorenphase an der Trägeroberfläche, die eine Entfernung nicht gebundener radioaktiver
Bezugssubstanz durch Waschen erlaubt, betrachtet werden.
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T)ie folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung des erfindungsgemäßen
Verfahrens, sollen aber in keiner Weise auf die dargestellten Ausführungsarten beschränken.
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Beispiel 1 Östrogenbestimmung mit Ustrogenrezeptoren aus Utenxsgewebe.
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A) Präparation der Uteri: Elcerschweinchen-Uteri in eiskalter Sucrosc-Ldsung
(0,25 mol/l Puffer (P) tlO mmol/l Tris, pH 7,4, 5 mmol/l Na-Azid, 1 mmol/l EDTA)
zweimal waschen, Fettreste entfernen, in kleine Stücke zerschneiden, zwischen gekühltem
Filterpapier auspressen, einfrieren, in flüssigen Stickstoff tauchen, mit Mikrodismembrator
pulverisieren; Gewebspulver in Tiefkühltruhe aufbcwahren.
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B) Vorbehandlung der Titerplatten: Polystyroltiterplatten 25 min im
verschlossenen Gefäß in 85 eO-iges Aceton (15 °s H20, V/V) tauchen, auf 25°C thermostatisieren,
danach mit HlO dest. abspülen, .im Trockenschrank 20 min bei 60°C trocknen, Titerplatten
in Einheiten à 6 Vertiefungen zerschneiden.
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C) Uterus-Homogenat: Cefrorenes Uteruspulver im Becherglas abwiegen
(tiefgckühlten Spatel und Becherglas benutzen), Puffer zugeben - 0,5 g Uteruspulver/10
ml (P) - Gemisch mit gekühlter Spritzc 20 mal aufziehen, Homogenat 5 min bei 20.000
rpm in Kühlzentrifuge (kühlbare Hochgcschwindigkeitszentrifuge Sorvall RC 2B) zentrifugieren,
klaren Überstand mit Spritze entnehmen.
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D) Präzipitation mit Protaminsulfat: (Die folgenden Arbeitsschritte
im Kühlraum durchführen)
Mit Pipettor je 200 µl Protaminsulfatlösung
(0,3 mg ProtaminsulEat/ml (P)) in die Vertiefungen der Plattensegmente pipettieren,
100 µl Homogenat zupipettieren, leicht schütteln, 10 min stchen lassen, 5 min bei
3500 rpm gekühlt zentrifugieren (Hettich "Rotixa"), dckantieren, Plattensegmente
umgedreht auf Filterkarton legen, 30 sec bei 1000 rpm Uberschüssige Flüssigkeit
abschleudern, Platten-Segmente in vorgekuhlten Objektträgerständer stecken, Ständer
2 min in auf -70°C vorgekühltes Dewar-Gefäß legen, Segmente schnell in Exsiccator
legen, 3D min evakuieren; Solid-Phase-Ansätze im Vakuum gekühlt aufbewahren.
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E) Hydrolyse der Schwangerenurine: Je 100 µl Schwangerenurin 1 : 10
mit Acetatpuffer (20 mmol/1 pH 5,4) auf 1 ml im Eppendorfgefäß verdünnen, 10 µl
ß-Glucuronidase/ Steroidsulfatase-Lösung (100.000 FishBan Ejml3 zugeben, mischen
in 2 h bei 56°C inkubieren.
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F) Inkubation: 10 µl des Urinhydrolysats in Eppendorfgefäßen 1 : 100
mit 1 ml 5H-Östradiol-Lösung (92 Ci/mmol, 2,75 . 10-9 mol/1 (P)) verdünnen, je 300
µl in die Vertiefungen der Titerplattensegmente pipettieren, 2 h bei Zimmertemperatur
in feuchter Kammer inkubieren; Ansätze: Doppelansätze/Patient 100 % Wert = 100 %
spezifische Bindung: 4-fach, Inkubation mit 3H-Östradiollösung ohne Urins "Lecrwert"
= unspezifische Bindung: 2-fach, lnkubation mit 1 . 10-6 mol/1 nicht markiertes
Us1radiol in CtpT 3H-Östradiol-Lösung.
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G) Inkubationsstop: Dekantieren, je 0,5 ml eiskalten (P) mit 1 °O
Rindersemnnalbumin mit Pipettor in die Vert-ieftmgen der Plattensegmente pipetieren
u. dekantiercn, nochmals jc 0,5 ml eiskalte BSA-Lösung zugeben, 10 min stchen lassen,
dekantieren, Segmente in kaltes H2O tauchen und dekantieren (2x), Segmente den Vertiefungen
entsprechend zerschneiden, in Szintillationsröhrchen mit 10 ml Toluolszintillator
30 min schütteln, im Liquid-Szintillation-Counter Radioaktivität bestimmen.
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11) Auswertung: blittelwerte der counts der Doppelbestimmungen in
Prozent, bezogen auf den 100 %-Wert der spezifischen Bindung berechnen, (Anteil
der unspezifischen Bindung vorher vom Meß- und 100 t-Wert abziehen), Ustrogenkonzentration
an einer Eichkurve ablesen.
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Beispiel 2 Progesteronbestimmung mit Rezeptoren aus Uterusgewebe.
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progesteronrezeptoren können in den Solid-Phase-Ansätzen aus Meerschweinchen-Uteri-Homogenat
nachgcwiesen werden, die auch zur Ustrogenbestimmung benutzt werden.
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Spezifische Bedingungen: Inkubationsdauer 5 h bei 4°C; 1 t Human-Serum-Albumin
im Inkubationspuffer (zur Erniedrigung der unspezifischen Bindung); 3H-Progesteron
(98 Ci/mmol) in der Verdünnung 2,5 . 10-9 mol/1; weitere experimentelle Bedingungen
entsprechen denen der Ustrogenbestimmung.
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Bcispiel 3 Dihydrotestosteronbestimmung mit Rezeptoren aus
Epididymis Dihydrotestosteron-Rezeptoren wurden mit höchstem Titer im (,cwebehomogenat
der Epidiclymis (Ncbenhoden) von A1cerschweinchen nachgewicsen. (1m Gewebe anderer
Organe: Leber, Prostata, Ifoden, auch ffuman-Prostata, war dieser Nachweis nicht
möglich; vermutlich blockiert das laut Literatur endogen vorhandene Dihydrotestosteron
in diesen Geweben freie Rezeptorstellen und ist in vitro nicht ablösbar.) Spezifische
Testbedingungen: Protaminsulfatfällung mit 0,5 mg Protaminsulfat/ml Puffer Inkubationsdauer
2,5 h bei 4°C; der Inkubationspuffer enthält kein Serum-Albumin jedoch 2 mmol/l
Dithioerythrit (zur reduktiven Stabilisierung der empfindlichen Rezeptoren) ; 3H-Dihydrotestosteron
(155 Ci/mmol) in der Verdiinnung 1,5 . 10-9 mol/1.
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Weitere experimentelle Bedingungen entsprechen denen der Ustrogenbestimmung.
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Beispiel 4 Thyroxinbestimmung mit Rezeptoren aus Human-α-Globulinfraktionen,
Meerschweinchenleberhomogenat und aus Kaulquappenhomogenat.
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Spezifische, d.h. durch nicht radioaktiv markiertes Thyroxin (Th)
kompetitiv hemmbare Bindung von 125J-markiertem Thyroxin (Thx) wurde in der human-α-Globul
in-Fraktion IV (Fa. Miles), im Meerschweincenleber-Homogenat und im Homogenat kompletter
Kaulquappen (Kaulquappenmetamorphose ist der biologische Modellversuch zur Thyroxinwirkung)
nachgewiesen.