DE2943522C2

DE2943522C2 - Verfahren zur Bestimmung von Hormonen in Körperflüssigkeiten

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Publication number: DE2943522C2
Application number: DE19792943522
Authority: DE
Inventors: Gerhardt Dipl.-Chem. Dr.rer.nat. 7142 Marbach Gumboldt
Original assignee: Roehm GmbH Darmstadt
Current assignee: Roehm GmbH Darmstadt
Priority date: 1979-10-27
Filing date: 1979-10-27
Publication date: 1987-02-19
Also published as: DE2943522A1

Description

Bei den Wirbeltieren besteht eine absolute Notwendigkeit, die einzelnen Organe auf eine koordinierte Leistung abzustimmen. Dies geschieht im Zusammenwirken des (für die rasche interzelluläre Kommunikation zuständigen) Nervensystems mit dem endokrinen System. Die Informationsweitergabe des endokrinen Systems geschieht über die Freisetzung von Hormonen.
Die Hormone werden in Drüsen (Keim-, Schild-, Thymus- Pankreasdrüse, Nebennierenrinde, Hypophysenvorderlappen, Epithelkörper, Leber) und anderen Strukturen (Placenta, Zirbeldrüse, ZNS) oder aus Plasmaeiweißkörpern gebildet. Auf den adäquaten physiologischen Reiz hin werden sie von dort abgegeben und gelangen über die Blut- oder Lymphbahn an den Zielort.
Die Hormone sind chemisch den Klassen der Steroide, Aminosäuren, Amine, Peptide und Proteine zuzuordnen. Sie werden überwiegend nicht aus Speichern freigesetzt, sondern neu synthetisiert (vgl. Ullmann's Encyclopädie der techn. Chemie, 4. Auflage, Band 13, Verlag Chemie 1977).
Man kann Einteilungen der Hormone gemäß ihren Wirkungen vornehmen:

A. Wirkung auf Wachstum und Differenzierung
(Wachstumshormon - Releasing - Hormon, Wachstumshormon, Somatomedin C, Prolaktin-Release Inhibiting Faktor, Prolaktin, TSH-Releasing-Hormon, Thyreotropes Hormon, Exophthalmus hervorrufende Substanz, Thyroxin, langwirkender Thyroid-Stimulator, Erythropoctin, Thymusfaktoren).
B. Wirkung auf Stoffwechsel, Wasser- und Elektrolythaushalt.
(ACTH-Releasing Faktor, ACTH, Glucocorticoide, Insulin, Somatomedin = Glucagon, Ca-regulierende Hormone, Parat-Hormon, Calcitonin, Vasopressin, Aldosteron, Angiotensin, Katecholamine).
C. Reproduktion und Steroidbiosynthese.
Gonadotropin-Releasing-Hormon, Gonadotropine, z. B. LH, ESH, Choriongonadotropin, Chorionsomatomammatropin, Testosteron, Östrogene, Progesteron, Melatonin, Oxytocin.
D. Gewebshormone
(Bradykinin, Somatostatin, Prostaglandine)
E. Hormone der Schilddrüse und Nebenschilddrüse
(L-Thyroxin (T₄), L-3,5,3&min;-Tr&ijlig;odthyronin (T₃), Calcitonin, Parathormon).

Für viele Hormone scheint ein vom Prinzip her gemeinsamer Wirkungsmechanismus vorzuliegen. Dieser Mechanismus gilt wahrscheinlich für alle Hormone, die nicht durch die Lipoproteinmatrix der Zellwand hindurchtreten können, z. B. Peptide, Proteine und Prostaglandine.
Die Hormone bilden am Zielort (Target-Organ) mit an der Zellaußenwand befindlichen hormonspezifischen Strukturen, den Rezeptoren, einen Komplex. Die Bildung des Hormon- Rezeptor-Komplexes aktiviert ein an der Innenseite der Zellmembran lokalisiertes Enzym, die Adenylcyclase zu vermehrter Produkton von c-AMP (cyclisches 3&min;,5&min; -Adenosinmonophosphat). Das gebildete c-AMP löst in der Zelle diejenige enzymatische Aktivität aus, die zur Bildung der zellspezifischen Produkte führt.
Bei Steroidhormonen liegen die Rezeptoren im Zytoplasma des Zielorgans, z. B. für Progesteron im Endometrium. Auch bei Mamma- und Prostatakarzinomen sind im Zytoplasma Östradiol-Rezeptoren nachgewiesen. Der cytoplasmatische Steroid-Rezeptor-Komplex wird aktiviert und wandert in den Kern, wo er sich mit einer Akzeptorstelle im Chromatin verbindet. Schilddrüsenhormone haben Rezeptoren im Kernchromatin des Zielorgans. Auch zytoplasmatische Rezeptoren wurden beschrieben.
Die Forschung ist um die Aufklärung der spezifischen Hormon-Rezeptor-Interaktion bemüht. Der erste Schritt hierzu liegt in der genauen Lokalisierung der Rezeptoren. Die Releasing-Hormone des Hypothalamus werden z. B. in den Membranen von Hypophysenvorderlappen-Zellen gebunden. Es kommt danach zur Sekretion der Hypophysenvorderlappen- Hormone. Diese bilden wiederum Hormon-Rezeptor-Komplexe an den Zellmembranen ihrer Zielorte. So bildet ACTH an den Zellmembranen der Nebennierenrinde Rezeptor-Komplexe. Für das Wachstumshormon Somatropin sind Muskel und Knochen, für Prolactin die Mamma, für Choriongonadotropin und Chorionsomatomammatropin die Placenta, für Insulin Leber und Muskulatur, für Calcitonin, Parathyroidhormon und Vasopressin die Niere die jeweiligen Rezeptor-Organe. Auch für die Protaglandine und für Adrenaline ist die Bindung am Membranrezeptoren nachgewiesen.
Im allgemeinen kann damit gerechnet werden, daß die Zielorte und Rezeptoren von Hormonen entweder bereits bekannt sind oder daß plausible Hypothesen über sie bestehen, die in absehbarer Zeit entweder bestätigt oder korrigiert werden dürften.
Die Bestimmung der Hormone und ihrer Metaboliten in Körperflüssigkeiten und im Harn ist eine wichtige analytische Aufgabe (vgl. Breuer, Hamel und Krüsenkemper, "Methode der Hormonbestimmung", Thieme-Verlag, (1975) Stuttgart, S. 384 ff.) Man gewinnt Aufschluß über Sekretionsleistungen, Transport, Inaktivierung usw. Die medizinische Diagnostik kann aus Hormonbestimmungen wichtige Rückschlüsse auf den Allgemeinzustand und auf Stoffwechselstörungen bzw. -anomalien gewinnen.
Erinnert sei z. B. an den immunserologischen Schwangerschaftsnachweis durch Bestimmung des Choriongonadotropins. Weiter spielt der Tr&ijlig;odthyronin (T ₃)- und Thyroxin (T ₄)-Test eine entscheidende Rolle in der Diagnostik der Schilddrüsenerkrankungen.
Entscheidend hat die Hormonanalytik von der Einführung von Methoden profitiert, die auf der Bestimmung radioaktiv markierter Hormone basieren. Bedeutung hat u. a. die Hormonrezeptormethode (Radioligand-Hormonrezeptor-Methode) erlangt. Aus tierischen Organen isolierte Hormonrezeptoren werden mit dem Gemisch aus dem zu messenden und dem radioaktiv markierten Hormon inkubiert. Es wird mit Hormonkonzentrationen gearbeitet, die im Sättigungsbereich des Rezeptors liegen. Je weniger endogenes (natives) Hormon sich ursprünglich in der zu untersuchenden Flüssigkeit befand, um so höher muß die Radioaktivität des Hormonrezeptor-Komplexes ausfallen.
So hat z. B. Koreman eine Bestimmung von Östrogenen im Schwangerenharn nach der Radioligand-Hormonrezeptor-Methode entwickelt, bei der eine lösliche Uterusfraktion die Rezeptoren stellt (vgl. S.G. Korenman, J. Clin. Endocr. 28, 127 (1968)).
Die Literaturstelle "Nature", Vol. 201, Nr. 4920, S. 679-682 hat sich die Bestimmung kleinster Mengen von Hormonen mittels der "competitive protein-binding analysis" zur Aufgabe gemacht. In dieser sehr weit gefaßten Arbeit wird die Anwendbarkeit der Methode bei Bindung mit Proteinen jeder Art betont. Es findet sich aber kein Hinweis auf die Anwendung trägergebundener Hormonrezeptoren bei der analytischen Bestimmung von Hormonen. Die US-PS 37 30 684 ist mit der Bestimmung von Thyroxin aus biologischen Flüssigkeiten befaßt, wobei man das Hormon mit Tetrahydrofuran aus der Flüssigkeit extrahiert, das Protein ausfällt, dann mit markiertem Thyroxin und Thyroxin-spezifischem Globulin in einer Pufferlösung aquilibriert, das ungebundene Thyroxin mittels eines Anionenaustauschers entfernt und das markierte, gebundene Thyroxin bestimmt. Auch hier wird weder Gebrauch gemacht von Hormonrezeptoren aus Target-Organen, noch wird die Solid-Phase-Technik angewendet. Die Veröffentlichung Scand. J. clin. Lab. Invest. Vol. 27, 1971, Seiten 151-159 gilt der Bestimmung von Vitamin B₁₂ mit Hilfe des Intrinsic Factor, der mit dem Vitamin einen pepsinresistenten Komplex bildet. Der Intrinsic Factor war mittels Bromcyan-Aktivierung kovalent an unlösliches Polysaccharid gebunden worden.
Auch diese Literaturstelle gibt kein Verfahren unter Verwendung von Hormonrezeptoren an. Es war somit nicht vorauszusehen, daß die Immobilisierung von Hormonrezeptoren an Trägern in einfachster Weise zu einem sehr effektiven Bestimmungsverfahren für Hormone ausgenutzt werden kann.
Die Bestimmungsmethoden des Standes der Technik konnten jedoch nicht völlig befriedigen, so daß sich die Aufgabe stellte, ein verbessertes Verfahren zur Bestimmung von Hormonen in Körperflüssigkeiten, insbesondere Urin, zu schaffen.
Die Erfindung geht aus von einem St. d. T. gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1. Die gestellte Aufgabe wird gelöst durch die Merkmale des Kennzeichens des Anspruchs 1. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Das erfindungsgemäße Verfahren soll anhand des Nachweises von Östrogenen im Schwangerenharn näher dargestellt werden.
Das Verfahren setzt, wie bereits ausgeführt, bekannte und zugängliche, für das nachzuweisende Hormon spezifische Rezeptoren voraus.
Als Quelle für Östrogenrezeptoren dient z. B. Meerschweinchen- Uterus, der präpariert, und in tiefgefrorenem Zustand pulverisiert wird.
Das Gewebepulver wird unter möglichster Schonung (Kühlung) mit geeignetem Puffer extrahiert und aus dem Homogenat die rezeptorhaltige Fraktion mit Protaminsulfat und nachfolgender Zentrifugation an einer festen Phase immobilisiert. Als besonders geeignete Matrix für die Immobilisierung hat sich Polystyrol, insbesondere nach vorgängiger "chemischer Aufrauhung" bewährt. Mit Vorteil kann z. B. die Immobilisierung an fester Phase auf Titerplatten aus Polystyrol für serologische Tests, deren Bodenvertiefungen z. B. mittels Aceton "aufgerauht" u. im Zuge dieser Behandlung abgeflacht worden waren, durchgeführt werden (Überführung der ursprünglich halbkugelförmig- konkaven in eine zylinderförmig-konkave Form der Titerplattenvertiefungen.) An Stelle von Aceton kann auch ein anderes Keton oder eine sonstige chemische Substanz mit gleicher Wirkung verwendet werden.
Gleichzeitig wird der Urin, dessen Östrogengehalt bestimmt werden soll, wie folgt behandelt: Zuerst werden durch Zusatz von ß-Glucuronidase und Steroidsulfatase die konjugierten Steroide hydrolysiert.
Anschließend wird mit Puffer verdünnt und gleichzeitig der Radioligand ³H-Östradiol zugesetzt.
Es erfolgt dann eine Inkubation des an der Matrix durch Fällung immobilisierten Rezeptors mit dem Radioligand/ östrogenhaltigen Urin wie oben näher beschrieben. Pro Patient werden zwei Bestimmungsansätze, sowie zwei Leerwerte zur Bestimmung der unspezifischen Bindung durchgeführt. Außerdem werden vier sogenannte 100%-Wertbestimmungen (=3H-Östradiol ohne Urin) simultan durchgeführt.
Der Inkubationsstop wird durch Dekantieren sowie mehrfaches Waschen mit eiskaltem 1%-Rinderserumalbum in Pufferlösung sowie Wasser erreicht.
Dann werden die Vertiefungen der Polystyrol-Titerplatte (bzw. anderer fester Trägermaterialien), in welcher die Tests durchgeführt worden waren, abgeschnitten und in Szintillationsfläschchen überführt. Nach Zugabe von 10 ml Toluolszintillator wird 30 min geschüttelt und dann im "Flüssigkeitszähler" die Radioaktivität bestimmt.
Die Auswertung erfolgt anhand einer Eichkurve. Die Details lassen sich den Beispielen entnehmen.
Zusammenfassend lassen sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die folgenden allgemein gültigen Verfahrensmerkmale aufstellen:

a) Auswahl eines den Hormonrezeptor enthaltenden Organs;
b) Gewinnung eines Hormonrezeptors in löslicher Form;
c) Immobilisierung des Hormonrezeptors mit Hilfe einer polymeren Substanz an einer geeigneten Phase;
d) Inkubation des immobilisierten Hormons mit einem Gemisch, welches das zu bestimmende Hormon, sowie ein anderes markiertes Molekül, entsprechend der jeweiligen Markierungsart (d. h. mit radioaktiven, enzymatischen oder fluoreszenzspektroskopischen Verfahren) das seinerseits Affinität zum Hormonrezeptor haben muß und im speziellen Fall mit dem Hormon identisch sein kann;
e) Bestimmung der an der festen Phase adsorbierten Verbindung. Besonders überrascht die relativ feste Haftung der immobilisierten Rezeptorenphase an der Trägeroberfläche.

Als spezifische Fällungsmittel für die Rezeptoren sind im Prinzip solche polymeren Substanzen geeignet, die zur Immobilisierung der Rezeptoren an der Trägeroberfläche führen, ohne störende Einflüsse auf die Rezeptoren und die Zugänglichkeit derselben für die Hormone auszuüben. Man wird in erster Linie auf basische Proteine, also besonders Proteine mit beträchtlichem Gehalt an den Aminosäuren Arginin, (Hydroxy)-Lysin, Histidin, wie z. B. Protamine, Histone u. ä. zurückgreifen. Es kommen jedoch auch andere polymere Substanzen biologischen Ursprungs, soweit sie die genannten Bedingungen erfüllen, in Frage.
Daneben können auch hydrophile, synthetische Polymere, beispielsweise mit Flockungsmittel-Eigenschaften, insbesondere kationische Flockungsmittel (vgl. Ullmann's Encyclopädie der technischen Chemie, 4. Auflage, Bd. 11, S. 581-586, Verlag Chemie) Verwendung finden.
Die oben aufgezeigten Verfahrensmerkmale lassen sich gegebenenfalls in zweckmäßig abgewandelter Form auf alle über Rezeptorsysteme wirksamen Hormone übertragen.
In erster Linie kommen Bestimmungsverfahren für Hormone mit Steroidcharakter, sowie T ₃ und T ₄ in Frage.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsart des erfindungsgemäßen Verfahrens betrifft die Bestimmung des Dehydro- Testosterons (der biologisch aktiven Form des Testosterons). Als Rezeptoren sind Nebenhoden (Epididymis) von Meerschweinchen besonders geeignet.
Diese können in analoger Weise, wie für Östrogene ausgeführt, an festen Trägern immobilisiert werden. Zweckmäßig gibt man bei der Präparierung der immobilisierten Rezeptoren Dithioerythrit als gängiges (reduktives) stabilisierendes Agens hinzu.
Als Radioligand wird ³H-Dihydrotestosteron einer spezifischen Radioaktivität von 155 Curie/mmol in der Verdünnung von 1,5 · 10^-9 mol/l zugesetzt. Die weiteren experimentellen Bedingungen entsprechen denen der Östrogenbestimmung. Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Bestimmung des Progesterons mit Hilfe der an der festen Phase immobilisierten Rezeptoren aus Meerschweinchen-Uteri verwendet werden. Als Radioligand kann ³H-Progesteron einer spezifischen Aktivität von 98 Curie/mmol in einer Verdünnung von 2,5 · 10^-9 mol/l eingesetzt werden. Die weiteren experimentellen Bedingungen entsprechen denen der Östrogenbestimmung.
Die oben angeführten Beispiele lassen sich zur Bestimmung der entsprechenden Hormone sowohl im Urin als im Serum verwenden. Die nachfolgend beschriebene Bestimmung des Thyroxins wird mit Extract aus Serum durchgeführt.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsart des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Bestimmung des Thyroxins. Diese läßt sich mit Rezeptoren oder Proteinen mit rezeptorähnlichen Eigenschaften, die aus Human-α-globulin-fraktion-4, Meerschweinchenleberhomogenat und Homogenat kompletter Kaulquappen in erfindungsgemäßer Weise an der festen Phase immobilisiert wurden, durchführen. Die Bestimmung des Thyroxins wird mit durch ¹²⁵J-markiertem Thyroxin in analoger Weise wie beim Östrogen durchgeführt. Als besonders überraschend kann die relativ feste Haftung der immobilisierten Rezeptorenphase an der Trägeroberfläche, die eine Entfernung nicht gebundener radioaktiver Bezugssubstanz durch Waschen erlaubt, betrachtet werden.
Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Beispiel 1

Östrogenbestimmung mit Östrogenrezeptoren aus Uterusgewebe.

A) Präparation der Uteri:
Meerschweinchen-Uteri in eiskalter Sucrose-Lösung (0,25 mol/l Puffer (P) (10 mmol/l Tris, pH 7,4, 5 mmol/l Na-Azid, 1 mmol/l EDTA) zweimal waschen, Fettreste entfernen, in kleine Stücke zerschneiden, zwischen gekühltem Filterpapier auspressen, einfrieren, in flüssigen Stickstoff tauchen, mit Mikrodismembrator pulverisieren; Gewebspulver in Tiefkühltruhe aufbewahren.
B) Vorbehandlung der Titerplatten:
Polystyroltiterplatten 25 min im verschlossenen Gefäß in 85%-iges Aceton (15% H₂O, v/v) tauchen, auf 25°C thermostatisieren, danach mit H₂O dest. abspülen, im Trockenschrank 20 min bei 60°C trocknen, Titerplatten in Einheiten à 6 Vertiefungen zerschneiden.
C) Uterus-Homogenat:
Gefrorenes Uteruspulver im Becherglas abwiegen ( tiefgekühlen Spatel und Becherglas benutzen), Puffer zugeben - 0,5 g Uteruspulver/10 ml (P) - Gemisch mit gekühlter Spritze 20 mal aufziehen, Homogenat 5 min bei 20 000 rpm in Kühlzentrifuge (kühlbare Hochgeschwindigkeitszentrifuge Sorvall RC 2B) zentrifugieren, klaren Überstand mit Spritze entnehmen.
D) Präzipitation mit Protaminsulfat:
(Die folgenden Arbeitsschritte im Kühlraum durchführen). Mit Pipettor je 200 ul Protaminsulfatlösung (0,3 mg Protaminsulfat/ml (P)) in die Vertiefungen der Plattensegmente pipettieren, 100 µl Homogenat zupipettieren, leicht schütteln, 10 min stehen lassen, 5 min bei 3500 rpm gekühlt zentrifugieren (Hettich "Rotixa"), dekantieren, Plattensegmente umgedreht auf Filterkarton legen, 30 sec bei 1000 rpm überschüssige Flüssigkeit abschleudern, Platten-Segmente in vorgekühlten Objektträgerständer stecken, Ständer 2 min in auf - 70°C vorgekühltes Dewar-Gefäß legen, Segmente schnell in Exsiccator legen, 30 min evakuieren; Solid- Phase-Ansätze im Vakuum gekühlt aufbewahren.
E) Hydrolyse der Schwangerenurine:
Je 100 µl Schwangerenurin 1:10 mit Acetatpuffer (20 mmol/l pH 5,4) auf 1 ml im Eppendorfgefäß verdünnen, 10 µl ß-Glucuronidase/ Steroidsulfatase-Lösung (100 000 Fishman E/ml) zugeben, mischen in 2 h bei 56°C inkubieren.
F) Inkubation:
10 µl des Urinhydrolysats in Eppendorfgefäßen 1 : 100 mit 1 ml ³H-Östradiol-Lösung (92 Ci/mmol, 2,75 · 10^-9 mol/l (P)) verdünnen, je 300 µl in die Vertiefungen der Titerplattensegmente pipettieren, 2 h bei Zimmertemperatur in feuchter Kammer inkubieren;
Ansätze: Doppelansätze/Patient
100% Wert = 100% spezifische Bindung: 4fach, Inkubation mit ³H-Östradiollösung ohne Urin;
"Leerwert" = unspezifische Bindung: 2fach, Inkubation mit 1 · 10^-6 mol/l nicht markiertes Östradiol in obiger ³H-Östradiol-Lösung.
G) Inkubationsstop:
Dekantieren, je 0,5 ml eiskalten (P) mit 1% Rinderserumalbumin mit Pipettor in die Vertiefungen der Plattensegmente pipettieren u. dekantieren, nochmals je 0,5 ml eiskalte BSA-Lösung zugeben, 10 min stehen lassen, dekantieren, Segmente in kaltes H₂O tauchen und dekantieren (2×), Segmente den Vertiefungen entsprechend zerschneiden, in Szintillationsröhrchen mit 10 ml Toluolszintillator 30 min schütteln, im Liquid-Szintillation- Counter Radioaktivität bestimmen.
H) Auswertung:
Mittelwerte der counts der Doppelbestimmungen in Prozent, bezogen auf den 100%-Wert der spezifischen Bindung berechnen, (Anteil der unspezifischen Bindung vorher vom Meß- und 100%-Wert abziehen), Östrogenkonzentration an einer Eichkurve ablesen.

Beispiel 2

Progesteronbestimmung mit Rezeptoren aus Uterusgewebe.

Progesteronrezeptoren können in den Solid- Phase-Ansätzen aus Meerschweinchen-Uteri-Homogenat nachgewiesen werden, die auch zur Östrogenbestimmung benutzt werden. Spezifische Bedingungen:
Inkubationsdauer 5 h bei 4°C;
1% Human-Serum-Albumin im Inkubationspuffer (zur Erniedrigung der unspezifischen Bindung);
³H-Progesteron (98 Ci/mmol) in der Verdünnung 2,5 · 10^-9 mol/l;
weitere experimentelle Bedingungen entsprechen denen der Östrogenbestimmung.

Beispiel 3

Dihydrotestosteronbestimmung mit Rezeptoren aus Epididymis

Dihydrotestosteron-Rezeptoren wurden mit höchstem Titer im Gewebehomogenat der Epididymis (Nebenhoden) von Meerschweinchen nachgewiesen. (Im Gewebe anderer Organe: Leber, Prostata, Hoden, auch Human-Prostata, war dieser Nachweis nicht möglich; vermutlich blockiert das laut Literatur endogen vorhandene Dihydrotestosteron in diesen Geweben freie Rezeptorstellen und ist in vitro nicht ablösbar.)
Spezifische Testbedingungen:
Protaminsulfatfällung mit 0,5 mg Protaminsulfat/ml Puffer Inkubationsdauer 2,5 h bei 4°C;
der Inkubationspuffer enthält kein Serum-Albumin jedoch 2 mmol/l Dithioerythrit (zur reduktiven Stabilisierung der empfindlichen Rezeptoren);
³H-Dihydrotestosteron (155 Ci/mmol) in der Verdünnung 1,5 · 10^-9 mol/l.
Weitere experimentelle Bedingungen entsprechen denen der Östrogenbestimmung.

Beispiel 4

Thyroxinbestimmung mit Rezeptoren aus Human-λ -Globulinfraktionen, Meerschweinchenleberhomogenat und aus Kaulquappenhomogenat.

Spezifische, d. h. durch nicht radioaktiv markiertes Thyroxin (TH) kompetitiv hemmbare Bindung von ¹²⁵J-markiertem Thyroxin (TH^x) wurde in der Human-α-Globulin-Fraktion IV (Fa. Miles), im Meerschweinchenleber-Homogenat und im Homogenat kompletter Kaulquappen (Kaulquappenmetamorphose ist der biologische Modellversuch zur Thyroxinwirkung) nachgewiesen.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung von Hormonen in Körperflüssigkeiten, insbesondere Urin, mit Hilfe der natürlichen Hormonrezeptoren unter Verwendung markierter Hormonliganden, wobei man den Rezeptor in immobilisierter Form mit einer definierten Menge der zum Test vorbereiteten Körperflüssigkeit inkubiert, die den zur analytischen Erfassung markierten Hormonliganden enthält und anschließend die analytische Bestimmung der Hormone vornimmt, dadurch gekennzeichnet, daß man unter den üblichen, schonenden Bedingungen die aus Target-Organen in eine wäßrige, homogene Phase überführten Hormonrezeptoren durch Fällung mit einem spezifischen Fällungsmittel an einer Trägeroberfläche immobilisiert.

2. Verfahren gemäß Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hormonrezeptoren in für die nachfolgende analytische Bestimmung geeigneten Gefäßen mit geeigneter Trägeroberfläche immobilisiert.

3. Verfahren gemäß den Patentansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man aus Polystyrol bestehende Gefäße, insbesondere Röteltiterplatten, verwendet, deren Bodenfläche "chemisch aufgerauht" und in ebenen Zustand gebracht wurde.

4. Verfahren gemäß Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als spezifisches Fällungsmittel zur Fällung der Hormonrezeptoren hydrophile Polymere, vorzugsweise kationische hydrophile Polymere, verwendet.

5. Verfahren gemäß den Patentansprüchen 1 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß man basische Proteine, insbesondere deren Salze, vorzugsweise die Säureadditionssalze des Protamins, verwendet.

6. Verfahren gemäß den Patentansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Östrogenrezeptor und einen radioaktiv markierten Liganden verwendet.

7. Verfahren gemäß den Patentansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Testosteron-Rezeptor und einen radioaktiv markierten Liganden verwendet.

8. Verfahren gemäß den Patentansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Progesteron-Rezeptor und einen radioaktiv markierten Liganden verwendet.

9. Verfahren gemäß den Patentansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Thyroxin-Rezeptor und einen radioaktiv markierten Liganden verwendet.