DE2941449C2

DE2941449C2 - 9H-Pyrido[3,4-b]indolderivate

Info

Publication number: DE2941449C2
Application number: DE2941449A
Authority: DE
Inventors: Yoshiaki Aoyagi; Hiroshi Nagaokakyo Enomoto; Tatsuhiko Suita Kono; Masato Takatsuki Matsuda; Shingo Kyoto Matsumura; Yoshitsugu Kyoto Nomiyama; Haruo Hikone Shiga Tanaka
Original assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Priority date: 1978-10-14
Filing date: 1979-10-12
Publication date: 1985-08-14
Also published as: FR2438657B1; JPS5555187A; GB2031882B; GB2031882A; JPS5936919B2; US4241064A; FR2438657A1; IT1164906B; DE2941449A1; CH644121A5; IT7950505A0

Description

45 50 55 60 65

Die Erfindung betrifft die Verbindungen gemäß Patentanspruch.

Die Tndolderfvate NorisotuboQ.vin (vgl. CA. 72, 43526e (1970)), PJvetü« (CA « 106930t )

l-Hvdroxvmethyl-Ä-carbolin (CA. 67, 50891 (1967)), l-Carbomethoxy-jS-carbcrrfn (CA 88 3449jv (19/8)), i^SSSniureilHnrthylerter (Helv. Chim. Acta, 46, S. 498 IT. (1963)) und Indol[2,3-a]acnd₁z₁n,umcaivp ei rirtr rhem 28 S 3070 ff. (1963)) sind bereits bekannt.

pfcrasmquassioides Benn das in der chinesischen Medizin als Picrasmahoiz bekannt ist (gemäß Japanese PharmaioDoeia Srd seitlangem für die Gewinnung von Picrasmaextrakt und Picrasmatinktur verwendet fa aT) dk M^nbitSr dafs^Uen (Tatsuo Kariyone & Yushiro Kimura, Yakuyo Shkubutsu Da.-J.ten Hirokawa ShoVen) 267 (1963)). Als Bestandteile dieser Kräuterarznei sind Quassiin, N.gak.none usw. oekannt, Ser ίΚ ^wurden noch keiie an4eren interessierenden Verwendungszwecke für diese Matenat entwickelt ErtndungTgeinlB wurde nun handelsübliches Picrasmahoiz oder trockenes pulver.s.ertes P.crasmaholz oder eiS dS trockene, pulverisierte Picrasmakernholz mit einem üblichen polaren organ.schen Losungse Wasser oder Methanol, extrahiert und der Extrakt eingeengt, um den gesamten P.crasmaextrakt zu Γη Sn wurde der Extrakt mittels Sephadex LH (Handelsnamejoderkieselgelchrornatograph.schf ak-SS die FrSnen auf xanthinoxydaseunterdrückende Wirksamkeit untersucht und die *kt.ve Frakt.on gereinigt. Auf diese Weise wurde die erfindungsgemäße Verbindung (I) gefunden.

(D

CHO

Erfindungsgemäß wurde ferner im Verlauf der Reinigung des Stoffes (I) aus diesem Picrasmaholzextrakt das erfindungsgemäße l-Carbomethoxy-4-hydroxy-9H-_Pyrido[3 4-b]indol (II) isoliert.

(H)

COOCH₃

Der StofT(I) kann leicht aus der Substanz (II) gewonnen werden, entweder direkt durch übliche Reduktion od° stufenweise, indem die ^Hydroxylgruppe von (II) durch Acylierung, Tosyl.erung oder Methyherang geschützt und dann die geschützte Verbindung reduziert wird. So kann be.sp.elswe.se _(I durch Reduzieren von (H) mit einer metallorganischen Wasserstoffverbindung, wie Diisobutylalum.mumhydrid (kurz DIBAL), erhal-

? wurde das erfindungsgemäße l-Formyl-3-hydroxy-9H-pyrido[3,4-b]indol (III) hergestellt.

OH

CHO

Hierzu wird l-Carbomethoxy-9H-pyrido[3,4-b]indol mit einer Persäure, wie m-Chlorperbenzoesäure, N-oxydiert, und nach einer üblichen Umlagerung zur Gewinnung der 3-Acetoxyverbindung wird das letztere mit DIBAL zu der Verbindung (III) reduziert. Xanthinoxydaseinhibitoren verbessern die Hyperuricacidämie durch Unterdrückung der Hamsäurebildiing, so daß sie als Therapeutika und Prophylaktika bei Gicht, Nieren- und Harnwegsteinen, Gewebedegeneration des Kreislaufsystems eingesetzt werden.

Die xanlhinoxydaseunterdrückende Wirksamkeit wird ausgedrückt durch die Konzentration (ICj₀) der Probe, die eine 50%ige Unterdrückung der Xanthinoxydasewirksamkeit verursacht. So wurden Testproben unterschiedlicher Konzentrationen in Phosphatpuffer (pH 7,5) 5 Minuten lang vorinkubiert, dann mit 10 uM Xanthin versetzt, die Enzymaktivität nach der Kalkermethode gemessen, das Versuchsergebnis zur Bestimmung derprozentualen Unterdrückung mit der Aktivität einer Vergleichsprobe verglichen und der IC₅₀-Wert durch graphisches Auftragen der Konzentration gegen die prozentuale Inhibition gefunden.

Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, haben alle erfindungsgemäßen 9H-Pyrido[3,4-b]indolderivate eine kohe xanthinoxydasejnhibierende Wirksamkeit, wobei Verbindung (I) mit IC53 ⁼ -r5 XIQ⁴ y/ml bemerkenswei* wirksam ist,

Tabelle 1

Xanthinoxydaseunterdrückende Wirksamkeit

Verbindung

Verbindung (I)

IC₅₀ (

0,00065

OCOCH₃

0,0017

0,072

0,25

COOH

Fortsetzung

Verbindung

IC

₅₀

Verbindung (II)

19

COOCH₃ OCOCH₃

1,5

COOCH₃

1,8

COOCH₃

Verbindung (III)

0,38

CHO

Die erfindungsgemäßen Stoffe wurden ferner auf Antitumorwirksamkeit untersucht. Dabei wurde gefunden, daß sie, wenn sie in Kombination mit Mitomycin C oder einem anderen Antitumormittel eingesetzt werden, die Antitumorwirksamkeit dieses begleitenden Antitumormittels erheblich potenzieren.

So wurden ddY-Mäuse (männlich, Körpergewicht ca. 18 g) 1 Woche lang aufgezogen, und 1 x 10⁶Ehrlish-Asziteszellen pro Tier wurden intraperitoneal transplantiert. Nach 24 Stunden wurde Mitomycin C und/oder erfindungsgemäße Substanz (I) an 7 aufeinanderfolgenden Tagen intraperitoneal verabreicht. Die Mäuse wurden in vier Gruppen vrn je 10 Tieren eingeteilt; eine Gruppe davon erhielt eine Dosis von 0,5 mg/kg/Tag Mitomycin ΐ; eine weitere Gruppe erhielt 50 mg/kg/Tag an erfindungsgerhäßer Substanz. (I); eine dritte Gruppe erhielt 0,5 mg/kg/Tag Mitomycin C plus 50 mg/kg/Tag erfindungsgemäße Substanz (I); und die vierte Gruppe (Vergleichsgruppe) erhielt 0,5% Carboxymethylcellulose.

Die Ergebnisse zeigten, daß alle Tiere der Vergleichsgruppe zwischen dem 18. und dem 24. Tag starben, während alle Tiere, die nur die erfindungsgemäße Substanz (I) allein erhalten hatten, ebenfalls zwischen dem 17. und dem 27. Tag starben. Die Überlebensrate der Gruppe, die Mitomycin C allein erhalten hatte, betrug 60 Tage nach der Transplantation 20%. Dagegen betrug die Überlebensrate der Tiere, die Mitomycin C zusammen mit erfindungsgemäßer Substanz (I) erhalten hatten, 60 Tage nach der Transplantation 90%. Die Kombination von erfindungsgemäßer Substanz CD mit Mitomycin C bedeutet somit einen erheblichen Vorteil. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 der beigefügten Zeichnung dargestellt.

Eine einmalige intraperitoneale Gabe von 1 mg/kg Mitomycin C und 50 mg/kg erfindungsgemäßer Substanz (D am 6. Tag nach der Transplantation führte auch zu einem offensichtlichen Anstieg der Überiebensrate, im Vergleich zu einer Gruppe, die einmalig intraperitoneal 1 mg/kg Mitomycin C erhallen hatte (Fig. 2 der beigefügten Zeichnung). Somit ist klar, daß die Antitumorwirkung durch Anwendung eines erfindungsgemäßen Stoffes in Verbindung mit dem Antitumormittel in beträchtlichem Maße potenziert wird.

In der beigefügten Zeichnung haben die unterschiedlichen Strichmarkicrungen die folgende Bedeutung:

bedeutet die Vcrgleichsgruppc,

O—O bedeute! die Gruppe, die Mitomycin C allein erhalten hat, Γ1—U bedeutet die Gruppe, die die crfindungsgeniiißc Verbindung (I) nach der Erfindung erhalten hat, und ■—■ bedeutet die Gruppe, die Mitomycin C zusammen mit erfindungsgemäßer Verbindung (1) erhalten hai.

Beispiel 1
Isolierung von Substanz (I)

Handelsübliches trockenes, pulverisiertes Piciasmaholz (10 kg) wurde mit 25 ml Methanol bei Raumtemperatur über Nacht extrahiert. Diese Prozedur wurde dreimal wiederholt. Die Extrakte wurden vereinigt und eingeengt, wobei 170 g eines schwarzbraunen pulverformigen Extraktes erhalten wurden.

Die xanthinoxydaseunterdrückende Wirksamkeit dieses Extraktes betrug IC₅₀ = 5 y/ml. 2 g dieses Extraktes wurden auf 200 g Sephadex LH-20® fraktioniert. Das Chromatogramm wurde mit Methanol entwickelt und das Eluat in 14-ml-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen 41 bis 45 wurden vereinigt und eingeengt, wobei 30 mg einer Fraktion mit einer Wirksamkeit von IC₅₀ = 0,1 y/ml erhalten wurden. Diese Fraktion wurde in 30 ml Methanol gelöst uiiu rniüch Huchieisiungsfiüssigchromatographie fraktioniert.

Als Packungsmaterial wurde Bondapak C₁₈" {Umkehrphase) und als Entwicklerlösungsmittel MeOH : H₂O (1:1) verwendet. Mit 2 ml pro Injektion wurde hei einem Verhältnis von 6 ml pro Minute eluiert. Die Wirksamkeil wurde bei 6 bis 10 Minuten ermittelt. Diese Fraktionierung wurde wiederholt, um 5 mg einer Fraktion mit IC₅₁, = 0,02 y/ml zu erhalten.

Diese Fraktion wurde weiterhin aufμ-Bondapak C₁₈ ⁸, einem analytischen Packungsmaterial, fraktioniert und mit einem 1:1-Gemisch aus Methanol und Wasser bei einer Geschwindigkeit von 2 ml pro Minute ontwickelt. 6 Minuten nach der Injektion floß Substanz (I) als einzige Spitze aus. Bei Injektionsdosen von 10 al wurde diese Prozedur wiederholt.

Bei Wiederholung dieses Versuchs mit 170 g Extrakt wurden 17 mg Substanz (I) erhalten. Ausbeute, bezogen auf Extrakt: 0,01%.

Diese Substanz (I) erzeugte eine orange Farbe mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin. Umkristallisation aus Wasser-Meti,dnoi ergab blaßgelbe Nadeln vom Fp. 296-298°C (Zers.).

Hochauflösendes Massenspektrum: M⁺ = 212,0644, was eine Summenformel von C]₂H₈N₂O₂ (212,058573) ergibt. Dieses kristalline Produkt wurde in Äthanol gelöst und das UV-Absorptionsspektrum gemessen. Das UV-Spektrum zeigte Absorptionsmaxima bei 370,283,240 und 210 πΐμ. Auf deralkalischen Seite zeigte das ' Spektrum verstärkte Absorptionsintensitäten bei 370 und 283 πΐμ. Diese Absorptionen wiesen die Existenz eines^-Carbolinkims nach. Ijü InfrarotbsiEich dss Spektrums zsigisR Absorptionen be; 335G, 1660 und 1610 cm*¹ die Existenz von NH-, CHO- unid OH-Gruppen an.

NMR (in DMSO-d₆): δ 11,90 ppm (NH), 10,11 ppm (CHO), 8,21 ppm (3-H), 7,58, 7,65, 7,90 und 8,33 ppm (4 Benzolringprotonen), 7,58-8,0 ppm (OH).

Auf der Grundlage dieser physikalischen Daten ist sichergestellt, daß die Substanz (I) l-Formyi-4-hydroxy-9H-pyrido[3,4-b]indol ist.

Beispiel 2

Isolierung von Substanz (II)

20 g Picrasmaholzextrakt wurde auf 2,0 kg Sephadex LH-20® fraktioniert und mit Methanol eluiert. Das Eluat [

wurde in iOO-ml-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen 11 bis 21 ergaben 1,50 g Nigakinone, während die Fraktionen 22 bis 38 0,12 g Kristalle ergaben. Die Ausbeute der letzteren betrug 0,6%, bezogen auf Extrakt. Umkristallisieren aus Dioxan ergab farblose Prismen vom Fp. 241-242°C.

IR-Spektrum: 3400, 2606-3100, 1670 und 1610 cm"¹.

UV-Spektrum (Äthanol): Absorptionsmaxima bei 365, 350, 304 und 280 mu.

Elementaranalyse ffir C₁₃H₁₀N₂O₃ (MG 242):
Gefunden: C = 64,62% H = 3,77% N = 111,58%
Berechnet: C = 64,46% H = 4,16% N = 11,57%

MG (auf Basis des Massenspektrums): 242

NMR (DMSO-d₆): δ 4,0 ppm, 3H (COOCH₃), H 1,45 ppm, IH (NH), 8,0-8,4 ppm, 2H, 10,0 ppm, IH (OH), 7,2-7,8 ppm. 3H.

Auf der Grundlage dieser Daten ist sichergestellt, daß das obige Produkt l-Carbomethoxy^-hydroxy^H-pyrido[3,4-b]indol ist.

Beispiel 3
Synthese von (I) aus (II)

4,0 g der Verbindung (II) wurden in einem Gemisch aus 20 ml Pyridin und 25 ml Acetanhydrid gelöst und die Lösung bei Raumtemperatur über Nacht stehengelassen. Die erhaltenen Kristalle wurden abfiltriert und aus Methanol umkristallisiert.
Auf diese Weise wurden 2,9 g Monoacetat erhalten. Ausbeute 61,8% (farblose Prismen vom Fp. 220-221°C).

ίο Elementaranalyse für C₁₅H₁₂N₂O₄ (MG 284):

Gefunden: C = 63,23% H = 3,94% N = 9,59%
Berechnet: C = 63,38% H = 4,26% N = 9,86%

MG (auf Basis des Massenspektrums): 284
KMR (DMSO-d₆): ö 2,62 ppm, 3H (COCH₃), 4,07 ppm, 3H (COOCHj), 8,37 ppm, 1H (3-H), 7,20-8,20 ppm, 4H, 11,85 ppm, IH(NH).

UV-Spektrum (Methanol: 360, 300, 264, 243, 212 πΐμ.
jq IR-Spekmnn: 3380, 1760, 1675, 1242, 1222 cm'¹

Auf der Basis dieser Daten war sichergestellt, daß dieses Produkt eine Verbindung der allgemeinen Formel (A) - mit Ri = OAC, R₂ = H und R₃ = COOCH₃ ist.

In 70 ml trockenem Tetrahydrofuran wurden 540 mg dieser Verbindung gelöst, wonach auf einem Trockeneis-Aceton-Bad 7 ml Diisobutylaluminiumhydrid zugefügt wurden.

Nach 2 Stunden wurde das Reaktionsgemisch mit Ammoniak alkalisch gemacht und der Niederschlag abfiltriert. Das Lösungsmittel wurde abdestilliert und der Rückstand aus Methanol-Wasser umkristallisiert. Auf diese Weise wurden 140 mg der Substanz (I) als blaßgelbe Nadeln vom Fp. 296-298°C erhalten. Gemischtes Schmelzen verursachte keine Schmelzpunkterniedrigung. Dieses Produkt war im Hinblick auf IR-, UV-, NMR-, Massenspektrum u. dgl. in voller Übereinstimmung mit dem Produkt nach Beispiel 1.

Beispiel 4

Synthese von Verbindung (A) mit R, = OTS, R₂ = H und R₃ = COOCH₃

In 10 ml Dioxan wurden 24,2 mg der Substanz (II) gelöst, wonach 19,0 mg p-Toluolsulfonylchlorid und 10 mg NaCOj zugesetzt wurden. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 4 Stunden lang gerührt und die erhaltenen Kristalle abfiltriert und aus Methanol umkristallisiert. Auf diese Weise wurden 35 mg farbiöscr Nadeln vorn Fp. 230-231⁰C erhalten. Ausbeute 89,7%.

Beispiel 5

Synthese von Verbindung (III)
a) Herstellung der Ausgangsverbindungen

In 150 ml Chloroform wurden 3,7 g l-Methoxycarbonyl-9H-pyrido[3,4-b]indol gelöst, wonach 13,8 g m-Chlorporbenzoesäure zugesetzt wurden. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 16 Stunden Sang gerührt, wonach it mit 5% NaHCO₃ extrahiert und mit Wasser gewaschen wurde. Die Chloroformschicht enthielt 800 mg des

§ 50 N-Oxids. Ausbeute 20,2%. Umkristallisieren aus Äthylacetat-Methanol ergab Kristalle vom Fp. 192-193⁰C.

N-»O

Das erhaltene N-Oxid (24,2 mg) wurde in 3 ml Acetanhydrid gelöst und auf einem Wasserbad bei 80⁰C zwei Stunden lang umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann in Wasser gegossen, und nach Abdestillieren des Lösungsmittels wurde der Rückstand aus Isopropanol-Wasser umkristallisiert- Auf diese Weise wurden 15 mg gelber Nadeln vom Fp. 151-152°C erhalten. Ausbeute 52,82%.

NMR (DMS0-d₆): 3,99 ppm, 3H (COOCH3), 2,33 ppm, 3H (COCH₃), 8,16 ppm, IH (4-H), 8,22 ppm, IH, 7.2-7,8 ppm, 3H.

MG (auf Basis Massenspeklrum): 284.
«« IR-Spektrum: 3400, 1750, 1690, 1622, 1222 cm '.

UV-Absorptionsspektrum (Methanol): 375, 300, 275, 265, 258, 242 πΐμ.

Die Lösung nahm beim Alkalischmachen eine gelbliche Farbe an. Auf der Grundlage dieser physikalischen Daten ist sichergestellt, daß das Produkt die Verbindung (A) mit R₁ = H, R₂ = OCOCH₃ und R₁ = COOCH₃ ist.

b) In 50 ml trockenem Tetrahydrofuran wurden 135 mg des oben erhaltenen Produktes gelöst, wonach 2 ml Diisobutylaluminiumhydrid zugesetzt wurden Es wurde unter Kühlen mit Trockeneis-Acetcn zwei Stunden lang reduziert. Dann wurde das Reaktionsgemisch in Wasser gegossen, der Niederschlag entfernt, das Losuiigsmittel abdestilligrt und der Rückstand aus Wasser-Methanol umkristallisiert. Auf diese Weise wurden 10 mg der Substanz (III) vom Fp. 290-295⁰C (Zers.) erhalten.

MG (auf Basis Massenspektrum): 212.

IR-Absorptionsspektrum: 3300, 1640, 1620, 1600 cm'¹.

UV-Absorptionsspektrum (MeOH): 420, 292, 282, 262 πΐμ.

NMR-Spektrum (DMSO-d₆): 10,1 ppm, IH (CHO), 7,7 ppm, IH (4-H), 8,2 ppm, IH, 7,2-7,6 ppm, 3H.

Auf der Grundlage dieser physikalischen Werte ist sichergestellt, daß das erhaltene Produkt (III) l-Formyl-3-hydroxy-9H-pyrido[3,4-b]indol ist.

Beispiel 6
Synthese von Verbindung (A) mit R, = OAC, R₂ = H und R₃ = CHO

Unter Rühren wurden 51 mg der Substanz (I) mit 1,0 ml Acetanhydrid und 0,5 ml Pyridin bei Raumtemperatur zwei Stunden lang umgesetzt, und der erhaltene weiße Niederschlag wurde abfiltriert und aus Methanol umkristallisiert. Auf diese Weise wurden 12 mg farbloser Nadeln vom Fp. 250-252⁰C (Zers.) erhalten.

IR-Absorptionsspektrum: 3370 (NH), 1760 (COCH₃), 1680 (CHO) cm"¹.

MG (auf Basis Massenspektrum): 254.

Beispiel 7
Synthese von (A) mit R₁ = OH, R₂ = H und R₃ = CH₂OH

In 30 ml trockenem Tetrahydrofuran wurden 70 ml der Substanz gemäß Beispiel 3 gelöst, d. h. 1-Methoxycarbonyl-4-acetoxy-9H-pyrido[3,4-b]indol (R, = OCOCCH₃, R₂ = H und R₃ = COOCH₃), und unter Eiskühlung mit 4,0 ml Diisobutylaluminiumhydrid versetzt.

Es wurde zwei Stunden lang umgesetzt, wonach nichtumgesetzte Substanz mit einer kleinen Menge Wasser zersetzt wurde. Danach wurde mit Äthylacetat extrahiert. Die organischen Schichten wurden vereinigt und eingeengt und die erhaltenen Kristalle aus Äthylacetat umkristallisiert. Auf diese Weise wurden 16 mg weißer Nadeln vom Fp. 148 -150⁰C (Zers.) erhalten. Das IR-Spektrum zeigte, daß die Absorptionsbande bei 1680 cm"' verschwunden war. Stattdessen war eine starke Absorption bei 1620 cm² zu beobachten.

MG (auf Basis Massenspektrum): 214.

Auf der Grundlage dieser Werte zeigt sich, daß die erhaltene Verbindung das 9H-Pyrido[3,4-b]indol (A) jjit R, = OK, R₂ = H und R₃ = CH₂OH ist.

Beispiel 8
Synthese von (A) mit R₁ = OH, R₂ = H und R₃ = COOH

In 30 ml Methanol wurde 1,0 g der Substanz (III) gelöst und mit 2 ml einer 10%igen Natriumhydroxidlösung versetzt. Das Gemisch wurde auf einem Wasserbad 6 Stunden lang am Rückfluß erhitzt. Danach wurde das Methanol abdestilliert. Der Rückstand wurde mit einer 10%igen wäßrigen HCl-Lösung neutralisiert und die erhaltenen Kristalle abfiltriert und aus Methanol-Tetrahydrofuran umkristallisiert. Auf diese Weise wurden 630 mg farbloser Nadeln vom Fp. 158-159°C (Zers.) erhalten.

MG (auf Basis Massenspektrum): 223.

Elementaranalyse für C₁₂H₈N₂O₃:
Gefunden: C = 63,32% H = 3,28% N = 12,05%
Berechnet: C = 63,16% H = 3,53% N = 12,28%

,§j Das IR-Absorptionsspektrum zeigte, daß die Absorptionsbande der Ausgangsverbindung bei 1680 cm"¹ verschwunden war. Stattdessen war eine Absorption einer Carboxylgruppe bei 1610 cm"¹ zu beobachten. Auf der Grundlage dieser Werte ist sichergestellt, daß das erhaltene Produkt ein 9H-Pyrido[3,4-blindol (A) mit R₁ = OH,

~ R, = H und R₃ = COOH ist.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspruch:
9H-Pyrido[3,4-b]indoIderivate der allgemeinen Formel

R₇ die Hydroxylgruppe und R₃ die Formylgruppe ist, wenn R₁ ein Wasserstoffatom ist;

£ ein Wasserstoffatom und R₃ die Hydroxymethyl-, Carboxyl-, Carbomethoxy- oder Formylgruppe .st,

die Carbomethoxygruppe oder Fonny.gruppe ist, wenn R₁ eine Acetoxy- und R₃ die Carbomethoxygruppe ist, wenn R₁ die Tosyloxygruppe ist.