DE2905657C2 - Konjugat aus einer immunologisch aktiven Substanz und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents
Konjugat aus einer immunologisch aktiven Substanz und Verfahren zu seiner HerstellungInfo
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Description
40
Die Bestimmung physiologisch aktiver Substanzen, z. B. Hormone und Proteine, die in Körperflüssigkeiten,
z. B. Urin und Serum, enthalten sind, ist vom diagnostischen Standpunkt aus sehr wichtig und
entweder durch die auch im deutschen Sprachgebrauch als Radio-Immunoassay (im folgenden abgekürzt RIA)
bezeichnete Bestimmungsmethode oder durch Enzymimmunoassay (im folgenden abgekürzt als EIA)
durchführbar. Sowohl RIA als auch EIA basieren auf dem gleichen Prinzip, nämlich auf der Spezifität von
Antigen-Antikörperreaktionen.
Geeignete, für RIA und EIA üblicherweise verwendete Bestimmungssysteme sind Festphasensysteme, in
denen immunologisch aktive Substanzen zur Anwendung gelangen, die mit Hilfe von wasserunlöslichen
Trägerstoffen insolubilisiert sind. Bei den bisher verwendeten wasserunlöslichen Trägerstoffen handelt
es sich um (1) Kunststoffe, wie Polystyrol und Polyäthylen, (2) natürliche Polymere, wie Sepharose und
Cellulose, (3) Gläser usw. Die Verwendung von Kunststoffen (z. B. Polystyrol und Polyäthylen) als
wasserlösliche Trägerstoffe erweist sich als nachteilig wegen deren unbefriedigender Lagerungsstabilität und
Versuchsgenauigkeit. Immunologisch aktive Substanzen, die an natürliche Polymere, wie Sepharose oder
Cellulose, gebunden sind, sind flockig oder flaumig, und schwierig handzuhaben und erfordern überdurchschnittliches
Geschick, um damit die Bestimmungen erfolgreich durchführen zu können. Andererseits unterscheiden
sich Gläser von den angegebenen wasserunlöslichen Trägerstoffen dadurch, daß immunologisch aktive
Substanzen daran durch kovalente Bindungen gebunden werden können, und daß die an Gläser gebundenen
immunologischen aktiven Substanzen stabil und sehr leicht zu handhaben sind. Die bisher verwendeten
Gläser haben jedoch den Nachteil, daß die Menge an immunologisch aktiver Substanz, die daran gebunden
werden kann, nur gering ist und daß deshalb die Empfindlichkeit und Genauigkeit der Bestimmung nicht
voll befriedigt und der Versuchsbereich ziemlich eng ist
Aufgabe der Erfindung ist es, die aufgezeigten Nachteile zu beseitigen, d.h. Konjugate aus einer
immunologisch aktiven Substanz und Glas mit einer hohen Empfindlichkeit und Genauigkeit innerhalb
breiter Bereiche beim Untersuchen von physiologisch aktiven Substanzen zu schaffen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Konjugat nach dem Patentanspruch 1 gelöst. Ein
Verfahren zur Herstellung eines derartigen Konjugats ergibt sich aus dem Patentanspruch 4.
Ein Mattglas ist nicht mit einem porösen Glas gleichzusetzen. Das erfindungsgemäß eingesetzte Mattglas
ist nicht porös, vielmehr ist nur seine Oberfläche mattiert Es weist vorzugsweise einen Mattierungsgrad
auf, der gewöhnlich zwischen 1,5 und 10 liegt Die Definition des Mattierungsgrades erfolgt in der
nachfolgenden Beschreibung.
In der DE-OS 24 50 523 wird die Überziehung der Oberfläche von Rezeptoren aus einem wasserunlöslichem
Matearial, wie Glaskügelchen, beschrieben. Es werden dabei poröse Glaskügelchen erwähnt, nirgends
jedoch findet man einen Hinweis auf Mattglas.
Die US-PS 39 75 511 betrifft ein Verbundmaterial aus
einem Antikörper, der über ein Silankupplungsmittel mit einem organischen Träger, wie porösem Glas, mit
einer durchschnittlichen Teilchengröße zwischen ungefähr 0,05 und 12 μ verbunden ist Es wird angegeben, daß
das poröse Glas nach bekannten Methoden hergestellt wird, beispielsweise nach der in der US-PS 35 49 524
beschriebenen Methode. Ferner wird angegeben, daß eine an kieselsäurearme· oder an borreiche Glasfaser
durch Auslaugen mit einer Säure unter Bildung eines porösen Glases entfernt wird. Das erhaltene poröse
Glas besteht aus einer steifen Matrix, die ein kontinuierliches System miteinander in Verbindung
stehender Poren aufweist.
Die erfindungsgemäßen Konjugate aus Mattglas führen zu einer höheren Genauigkeit des Untersuchungsei
gebnisses sowohl im Falle von EIA als auch im Falle von RIA, während poröse Glaskonjugate trotz der
größeren Menge von an das Glas gebundenem Protein wesentlich ungenauer bezüglich EIA und RIA sind.
Man nimmt an, daß die Genauigkeitsunterschiede auf folgendes zurückzuführen sind:
Die porösen Glaskonjugate mit miteinander in Verbindung stehenden Mikroporen adsorbieren die
enzy- oder isotopmarkierten Untersuchungsreagentien, beispielsweise Peroxidase, die mit Antihuman IgE
markiert ist, oder Antihuman CEA, das mit 125I markiert
ist. Diese Reagentien können nicht durch Waschen entfernt werden. Diese Adsorption der Reagentien
bedingt eine Zunahme des Adsorptionsvermögens einer Blindprobe (0-Konzentration von immunologisch aktiver
Substanz, wie IgE) und ein Abfallen der Genauigkeit. Im Falle von EIA adsorbieren die porösen Glaskonjugate
auch die Farbstoffe; die in einer Enzymreaktion
farbentwickelt wurden, wodurch die Aktivität behindert
wird. Dies bedingt eine Herabsetzung der Neigung der Tangente der Standarduntersuchungskurve, eine Verschlechterung
der Genauigkeit und eine E;nengung des Untersuchungsbereiches.
Andererseits erfolgt im Falle von Konjugaten aus mattierten Gläsern, die keine miteinander in Verbindung
stehenden Poren aufweisen, nur eine geringe Adsorption der Untersuchungsreagentien, Farbstoffe
und Substanzen in Körperflüssigkeiten. Die Folge ist, daß die Standarduntersuchungskurve einen steilen
Anstieg aufweist, so daß eine verbesserte Genauigkeit, Empfindlichkeit und ein breiterer Untersuchungsbereich
möglich ist
Ferner sind die erfindungsgemäßen Konjugate mit Mattgläsern leicht zu handhaben, gut zu lagern und
außerdem leicht kommerziell herzustellen.
Bei der Durchführung einer Untersuchung durch EIA oder RIA ist eine Trennung der Glaskonjug^te von dem
Reaktionsprodukt (Lösung) erforderlich. Dabei können die erfindungsgemäßen Mattglaskonjugate mit einem
minimalen Durchmesser von 1 mm oder mehr, mit Pinzetten erfaßt und leicht aus der Lösung entnommen
werden.
Demgegenüber muß die Abtrennung von suspendierbaren Verbundmaterialien aus porösen Glasteilchen aus
der Lösung durch Zentrifugieren und anschließende Entfernung der überstehenden Flüssigkeit durch Dekantieren
oder Abpipettieren durchgeführt werden. Dieses Abtrennen ist mühsam, wobei die Gefahr besteht, daß
ein Teil der suspendierbaren Verbundmaterialien aus porösen Glasteilchen zusammen mit der überstehenden
Flüssigkeit abgezogen wird.
Die Erfindung wird durch die Zeichnung näher veranschaulicht, in der darstellen
F i g. 1 eine Standardkurve zur Bestimmung von menschlichem Insulin nach der Sandwich-EIA-Methode
(vgl. das unten angegebene Beispiel 3) und
Fig.2 eine Standardkurve, zur Bestimmung von
menschlichem «-Fetoprotein nach der Sandwich-EIA-Methode
(vgl. das unten angegebene Beispiel 7).
Der Typ der erfindungsgemäß verwendeten immunologisch aktiven Substanz ist nicht sonderlich kritisch.
Geeignete derartige Substanzen sind z. B. Antigene und Antikörper. Beispiele für Antigene sind Hormone, z. B.
Insulin, Gonadotropin, 17-Ketosteroide, Wuchshormone, Thyroxin, Trijodthyronin und Thyroid-stimmulierende
Hormone; Proteine, z. B. IgG, IgA, IgM, IgE, Λ-Fetoprotein, CEA (carcinoembryonales Antigen) und
Protamine; und antigene Komponenten von Pathogenen, z. B. pathogenen Bakterien (z. B. Streptococcen),
Viren (z. B. Hepatitis-Virus und Rubella-Virus), Protozoen
(z. B. Toxoplasma gondii und Malaria-Parasiten) und dergleichen. Geeignete Antikörper sind z. B. Antisera,
die in üblicher bekannter Weise durch Immunisierung von Säugetieren (z. B. Kaninchen und Ziegen) mit Hilfe
der angegebenen Antigene erhalten werden können. Vorzugsweise handelt es sich bei den Antikörpern um
solche, die aus den Antiseren nach üblichen bekannten Reinigungsmethoden, z.B. Fraktionierung unter Verwendung
von gesättigten Ammoniumsulfat, DEAE-CeI-lulose-Säulenchromatographie
und Affinitätschromatographie, erhalten werden.
Der Typ des erfindungsgemäß verwendeten Mattglases ist ebenfalls nicht sonderlich kritisch. So sind z. B.
sowohl physikalisch (mechanisch) wie auch chemisch mattierte Gläser verwendbar. Bevorzugt werden solche
Gläser verwendet, die eine unregelmäßige und in winzigen Dimensionen unebene Oberfläche, die durch
eine physikalische oder chemische Behandlung verursacht ist aufweisen. Geeignete physikalische Methoden
sind z. B. das Abschleifen der Glasoberfläche unter Verwendung eines Schleifmaterials (z. B. Schleifmittel,
Schleifpapier oder mit Schleifmittel beschichtete Textilien), das Aufsprühen eines Schleifmaterials (ζ. Β
Schmirgel oder körniger Korund) mit Hilfe von Druckluft auf die Glasoberfläche (Sandblasen) oder das
Abschleifen der Glasoberfläche mit einem Schleifmaterial in einer geeigneten Vorrichtung z. B. einer
Kugelmühle. Eine geeignete chemische Behandlung ist z. B. das Ätzen mit Fluorwasserstoffsäure, Ammoniumfluorid
oder einem Alkali. Im Hinblick auf die Verarbeitbarkeit und Effizienz der Mattierungsoperation
werden das Sandblasverfahren und die unter Verwendung einer Mattierungslösung, die Fluorwasserstoffsäure
oder Ammoniumfluorid enthält, durchgeführte Methode bevorzugt. Die Gestalt der Glaskörper ist
nicht kritisch und geeignete Formen sind z. B. zylindrische, kugelförmige, röhrenförmige und kubische
Ausgestaltungen Der Durchmesser der Glaskörper beträgt in der Regel 1 bis 20 mm.
Geeignete mattierte Gläser sind z. B. solche mit einem Mattierungsgrad von 1,5 bis 10,0, vorzugsweise
2,0 bis 9,0. Hier und im folgenden wird der Mattierungsgrad definiert als das Verhältnis von
Enzymaktivität eines an mattiertes Glas gebundenen Enzyms zu derjenigen eines an unmattiertes Glas (mit
der gleichen Gestalt und Größe) gebundenen Enzyms. Dabei werden die Enzymaktivitäten nach der folgenden
Methode bestimmt:
(a) Herstellung von Enzym/Glas-Konjugaten
Gleiche Mengen des mattierten Glases und des unmattierten Glases, das die gleiche Gestalt und Größe
wie das mattierte Glas hat, werden in eine 10%ige Lösung von y-Aminopropyl-triäthoxysilan in Aceton
eingetaucht. Nach 1 Stunde langer Inkubation bei 25°C
werden die Gläser abfillriert und mit entionisiertem Wasser gewaschen. Zu den behandelten Gläsern wird
eine 20%ige wäßrige Lösung von Glutaraldehyd zugegeben. Nach 1 Stunde langem Stehen bei 25° C
werden die Gläser mit deionisiertem Wasser gewaschen. Die so behandelten Gläser werden sodann in
0,5 mg/ml einer wäßrigen Lösung von Glucoseoxidase (GOD) eingetaucht (Enzymaktivität von 34,0 E/mg,
Toyo Boseki K.K.). Nach 1 Stunde langer Inkubation bei 250C und anschließender 15stündiger Inkubation bei
40C werden die Gläser abfiltriert und mit deionisiertem
Wasser gewaschen unter Erzielung eines GOD/Mattglas-Konjugats und eines Konjugats aus GOD unr'
unmattiertem Glas, die sodann zur Messung der Absorption bzw. Extinktion herangezogen werden.
(b) Messung der Absorption
Eine bestimmte Anzahl (in der Regel 1 Stück) des GOD/Mattglas-Konjugats wird in jedes von insgesamt
10 Reagenzgläsern eingebracht. Eine Enzymsubstratlösung mit einem Gehalt an /9-D-Ghicose wird zu jedem
.Reagenzglas zugegeben, worauf eine Farbbildungslösung zugesetzt wird, die 3-Methyl-2-benzo-thiazolinonhydrazon-hydrochlorid
(MBTH), N.N-Diäthylanilin (DE/1) und Peroxidase (POD) enthält Nach Inkubation
wird die Absorption bei 590 nm der Überstände in jedem Reagenzglas gemessen. Die angegebene Verfahrensweise
wird wiederholt mit der Ausnahme, daß anstelle des GOD/Mattglas-Konjugats das Konjugat
aus GOD und unmattiertem Glas verwendet wird.
Der Durchschnittswert der Adsorption bei 590 nm der Überstände in jedem Reagenzglas wird als die
Enzymaktivität der !Conjugate aus Enzym und mattiertem Glas bzw. aus Enzym und unmattiertem Glas
angenommen.
Der Mattierungsgrad des mattierten Glases (X) wird nach folgenden Gleichung (1) berechnet:
Enzymaktivität des an das
mattierte Glas gebundenen Enzyms
mattierte Glas gebundenen Enzyms
Enzymaktivität des an das
unmattierte Glas gebundenen Enzyms
unmattierte Glas gebundenen Enzyms
Das angewandte Gewiehisverhältnis von immunologisch
aktiver Substanz zu Mattglas ist nicht sonderlich kritisch, sondern kann in weiten Grenzen je nach
Erfordernis variieren. So werden z. B. 10 bis 1000 Teile,
vorzugsweise 50 bis 300 Teile, einer Lösung der immunologisch aktiven Substanz pro 100 Teile des
mattierten Glases verwendet, wobei die Konzentration der Lösung in der Regel 0,001 bis 40 g/100 ml,
vorzugsweise 0,01 bis 0,1 g/100 ml, beträgt.
Die angewandten Methoden zum Binden der immunologisch aktiven Substanz an das Mattglas sind
nicht sonderlich kritisch. Die immunologisch aktive Substanz kann an die Mattglasoberfläche nach physikalischen
oder chemischen Methoden gebunden werden. Letztgenannte Methoden werden bevorzugt im Hinblick
auf die Tatsache, daß damit eine große Menge an der immunologisch aktiven Substanz an das mattierte
Glas fest und dauerhaft gebunden wird.
Das Binden durch eine physikalische Methode kann hauptsächlich durch physikalische Adsorption (van der
Waa!s-Adsorption) erzielt werden. So kann z.B. das mattierte Glas in eine Lösung der immunologisch
aktiven Substanz eingetaucht und inkubiert oder stehengelassen werden, während einer zur Bildung der
physikalischen Bindung geeigneten Zeitspanne.
Die verwendete Lösung hat eine Konzentration von in der Regel 0,001 bis 40 g/100 ml, vorzugsweise 0,01 bis
0,1 g/100 ml. Die Eintauch- oder Untertauchbehandlung kann z. B. bei einer Temperatur von 0 bis 45° C 1 bis 48
Stunden lang durchgeführt werden.
Eine geeignete chemische Methode ist z. B. eine solche, bei der die immunologisch aktive Substanz an die
Mattglasoberfläche gebunden wird mit Hilfe eines Silanbindemittels und erforderlichenfalls eines Vernetzungsmittels.
Verwendbar ist jedes beliebige Silanbindemittel, das in seinem Molekül sowohl eine funktionell Gruppe, die
mit dem mattierten Glas zu reagieren vermag, als auch eine funktioneile Gruppe, die mit der immunologisch
aktiven Substanz und/oder dem Vernetzungsmittel zu reagieren vermag, aufweist. Beispiele für geeignete, mit
dem Mattglas reaktive funktioneile Gruppen sind z. B. solche, die mit einer Silanolgruppe des mattierten
Glases reagieren; hierzu gehören z. B. Alkoxysilylgruppen (z. B. Methoxy- oder Äthoxy-substituierte Silylgruppen),
Halogensilylgruppen (z.B. Chlor-substituierte
Süylgruppen) und dergleichen. Beispiele für geeignete
funktionelle Gruppen, die mit der immunologisch
aktiven Substanz und/oder dem Vernetzungsmittel zu reagieren vermögen, sind solche, die mit Amino-,
Carboxyl- und/oder Thiolgruppen reaktiv sind; hierzu
gehören z. B. Carboxyl-, Epoxy-, Halogenalkyl- (ζ. Β.
Chloräthyl- und Chlorpropylgruppen), Aldehyd-, Amino-
(primäre und sekundäre Aminogruppen), Thiol-, Isocyanat-, Carboxylat-, Imino- und N'itril- (oder
Cyano-)Gruppen. Spezielle Beispiele für geeignete funktionelle Gruppen, die mit der Aminogruppe
reagieren, sind z. B. Carboxyl-, Epoxy-, Halogenalkyl- und Aldehydgruppen; geeignete funktionelle Gruppen,
die mit der Carboxylgruppe reagieren, sind z. B.
Aminogruppen (primäre und sekundäre Aminogruppen) und Epoxygruppen; geeignete funktionelle Gruppen, die
ίο mit der Thiolgruppe reagieren, sind z. B. Thiol-, Epoxy-,
Halogenalkyl- und Aldehydgruppen.
Typische geeignete Silanbindemittel sind z. B.:
(1) Silanbindemittel, die Amino- und Alkoxysilylgruppen
enthalten:
Aminoalkyl-trialkoxysiiane (z. B. y-Arninopropyltrimethoxysilan,
y-Aminopropyl-triäthoxysilan), N-^-AminoäthylJ-y-aminopropyl-methyl-dimethoxysilan
N-(/3-Aminoäthyl)-}>-aminopropyI-trimethoxysilan
und dergleichen;
(2) Silanbindemittel, die Thiol- und Alkoxysilylgruppen enthalten:
Mercaptoalkyl-trialkoxysilane (z. B. y-Mercaptopropyl-trimethoxysilan)
und dergleichen;
(3) Silanbindemittel, die Epoxy- und Alkoxysilylgruppen enthalten:
y-Glycidoxypropyl-trimethoxysilan, Triäthoxysilylmethyläthylenoxid,
0-(3,4-EpoxycyclohexyI)äthyltrimethoxysilan
und dergleichen;
(4) Silanbindemittel, die Carboxyl- und Alkoxysilylgruppen enthalten:
2-(Trimethoxysilyl)propionsäure und dergleichen; und
(5) Silanbindemittel, die Halogenalkyl- und Alkoxysilylgrupper. enthalten:
(5) Silanbindemittel, die Halogenalkyl- und Alkoxysilylgrupper. enthalten:
y-Chloropropyl-trimethoxysilan und dergleichen.
Beim Binden der immunologisch aktiven Substanz an das mattierte Glas kann das Silanbindemittel mit oder
ohne einem Vernetzungsmittel angewandt werden.
Bei Verwendung eines Vernetzungsmittels wird dieses je nach Typ des Siianbindemitteis und je nach Typ
der zu bindenden immunologisch aktiven Substanz ausgewählt Verwendbar sind prkatisch alle Vernetzungsmittel,
die das Silanbindemittel mit der immunologisch aktiven Substanz zu vernetzen mögen. Geeignete
Vernetzungsmittel sind z. B. Verbindungen, die die
Amino-, Carboxyl- oder Thiolgruppe des Silanbindemittels mit der Amino-, Carboxyl- oder Thiolgruppe der
so immunologisch aktiven Substanz zu vernetzen vermögen, z. B. solche, die zur Erzeugung einer Vernetzungsbindung zwischen Thiolgruppe und Thiolgruppe oder
zwischen Aminogruppe und Thiolgruppe befähigt sind. Geeignete Verbindungea die Aminogruppe und Amiss
nogruppe zu vernetzen vermögen, sind z. B. aliphatische
Dialdehyde (z. B. Glyoxal, Malonaldehyd, Succinaldehyd
und Glutaraldehyd) und Dichlorotriazine (2-Amino-4,6-dichloro-s-triazin)
und dergleichen. Geeignete Vernetzungsmittel zur Herstellung von Bindungen zwischen
Thiolgruppe und Thiolgruppe sind z. B. Dimaleimidverbindung
(z. B. Ν,Ν'-o-Phenylendimaleimid und N,N'-m-Phenylendimaleimid).
Geeignete Vernetzungsmittel zwischen Aminogruppe und Thiolgruppe sind z.B.
MaleinTidocarboxyl-N-hydroxysuccinimidester (z. B.
es m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccininiidester und
4-(Maleimidomethyl)-cyclohexan-l-carboxyl-N-hydro-•
xysuccinimidester).
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate
nach chemischen Methoden bieten sich die beiden folgenden Verfahrensweisen an:
(1) Binden der immunologisch aktiven Substanz an die Mattglasoberfläche durch das Silankupplungsoder-Bindemittel
und
(2) Binden der immunologisch aktiven Substanz an die Mattglasoberfläche durch das Silanbindemittel und
das Vernetzungsmittel.
Nach der ersten Verfahrensweise ist das Konjugat z. B. nach folgender Methode herstellbar: Das Silanbindemittel
wird zuerst an das mattierte Glas gebunden durch Behandlung des Glases mit dem Silanbindemittel
unter Umsetzung des Bindemittels mit den Silanolgruppen der Mattglasoberfläche, worauf das erhaltene
Zwischenprodukt mit der immunologisch aktiven Substanz umgesetzt wird unter Ausbildung einer
Bindung zwischen der immunologisch aktiven Substanz und dem mattierten Glas über das Silanbindemittel.
Wird ein aminohaltiges Silanbindemittel verwendet, so bildet dieses eine Peptidbindung mit der Carboxylgruppe
der immunologisch aktiven Substanz. Die Verwendung eines carboxylhaltigen Silanbindemittels führt zur
Bildung einer Peptidbindung mit der Aminogruppe der immunologisch aktiven Substanz; die Verwendung eines
epoxyhaltigen Silanbindemittels bewirkt eine Additionsreaktion mit der Amino-, Carboxyl- oder Thiolgruppe
der immunologisch aktiven Substanz; die Verwendung eines thiolhaltigen Silanbindemittels führt
zur Bildung einer S-S-Bindung mit der Thiolgruppe der immunologisch aktiven Substanz; die Verwendung eines
lia'iogenalkylhaltigen Silanbindemittels hat eine elektrophile
Substituionsreaktion an der Amino- oder Thiolgruppe der immunologisch aktiven Substanz zur Folge,
und die Verwendung eines aldehydhaltigen Silanbindemittels führt zur Bildung eines Thioacetals oder
Hemithioacetals mit der Thiolgruppe der immunologisch aktiven Substanz.
Vom Standpunkt einer festen und dauerhaften Bindung der immunologisch aktiven Substanz an das
mattierte Glas werden Silanbindemittel bevorzugt, die sowohl eine Aminogruppe als auch eine Alkoxysilylgruppe
oder sowohl eine Carboxylgruppe als auch eine Alkoxysilylgruppe enthalten. Die Reaktion, die in der
Regel abläuft zwischen dem Siianbindemittei und der immunologisch aktiven Substanz, ist eine Peptidbildungsreaktion
und es erweist sich als besonders vorteilhaft dabei ein wasserlösliches Carbo-diimid, das
als Dehydratationskondensationsmittel wirkt, z. B.
N-Äthyl-N'-dernethylaminocarbodiimid, 1 -Äthyl-3-diisopropylaminocarbodiimid
oder l-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid,
zu verwenden.
Nach der zweiten Verfahrensweise kann das Konjugat z. B. nach folgender Methode hergestellt werden:
zuerst wird das Silanbindemittel an das mattierte Glas gebunden, dann wird das Silan-Glas-Reaktionsprodukt
mit dem Vernetzungsmittel umgesetzt, und schließlich wird das erhaltene Zwischenprodukt mit der immunologisch
aktiven Substanz umgesetzt Vom Standpunkt einer festen und dauerhaften Bindung der immunologisch
aktiven Substanz mit dem Mattglas her betrachtet sind bevorzugte Süanbindemittel amino- und alkoxysilylhaltige
Silanbindemittel, insbesondere Aminoalkyltrialkoxysilane,
und bevorzugte Vernetzungsmittel aliphatische Dialdehyde, insbesondere Ghitaraldehyd.
Die Menge des in den chemischen Methoden verwendeten Silanbindemittels ist nicht kritisch und
kann im Rahmen der Erfindung in weiten Grenzen variieren. Das Gewichtsverhältnis einer Lösung des
Silarbindemittels zum Mattglas kann z. B. 30/100 bis 1000/100 betragen, wobei die Lösung eine Konzentration
von in der Regel 0,01 bis 50 Vol.-%, vorzugsweise 0,1 bis 10 Vol.-%, aufweist.
Die Menge des nach der zweiten Verfahrensweise verwendeten Vernetzungsmittels ist ebenfalls nicht
kritisch und kann in weiten Grenzen variieren. Das
ίο Gewichtsverhältnis einer Lösung des Vernetzungsmittels
zum Mattglas kann z.B. 30/100 bis 1000/100 betragen, wobei die Lösung eine Konzentration von in
der Regel 0,0001 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise von 0,1 bis 20 Gew.-%, hat.
Die Verfahren zum Binden der immunologisch aktiven Substanz an das mattierte Glas mit Hilfe des
Silankupplungsmittels und erforderlichenfalls des Vernetzungsmittels
können ähnlich den bekannten, bisher verwendeten Verfahren sein, mit der Ausnahme, daß als
Trägerglas das mattierte Glas verwendet wird.
Ein Beispiel für derartige Verfahren, bei dem die immunologisch aktive Substanz an die Mattglasoberfläche
mit Hilfe des Silanbindemittels nach der ersten Verfahrensweise gebunden wird, ist das folgende: Das
mattierte Glas wird gut eingetaucht in eine Lösung des Silanbindemittels, die eine Lösung mit einer Konzentration
von 0,01 bis 50 V/V-% (vorzugsweise 0,1 bis 10 V/V-%) in einem organischen Lösungsmittel (z. B.
Aceton oder Toluol) darstellt, bei einer Temperatur von 0 bis 8O0C während einer Zeitdauer von 10 Minuten bis
24 Stunden, um das Silanbindemittel mit dem Mattglas reagieren zu lassen. Das auf diese Weise behandelte
Mattglas wird vom Reaktionsgemisch abgetrennt und nacheinander mit Methanol und deionisiertem Wasser
gründlich gewaschen. Zu dem erhaltenen Mattglas werden 10 bis 1000 Teile (vorzugsweise 50 bis 300 Teile)
einer Lösung der immunologisch aktiven Substanz mit einer Konzentration von 0,001 bis 40 g/100 ml (vorzugsweise
0,01 bis 01 g/100 ml) pro 100 Teile Mattglas zugegeben und die Reaktion wird bei etwa 0 bis 40°C 10
Minuten bis 24 Stunden lang (vorzugsweise 1 bis 3 Stunden lang) ablaufen gelassen, so daß das Mattglas
und die immunologisch aktive Substanz aneinander gebunden werden durch das Silanbindemittel. Es erweist
sich als besonders vorteilhaft eine Lösung eines wasserlöslichen Carbodiimide bei einer Konzentration
von 0,1 bis 10 g/100 ml bei der Umsetzung der immunologisch aktiven Substanz mit dem Mattglas, an
das ein amino- oder carboxylhaltiges Silanbindemittel gebunden worden ist zu verwenden.
Ein Beispiel für Verfahren des angegebenen Typs bei dem die immunologisch aktive Substanz an die
Mattgiasoberfiäche mit Hufe des Silanbindemittels und
des Vernetzungsmittels gemäß der zweiten Verfahrens- -weise gebunden wird, ist wie folgt: Das Mattglas wird
gut eingetaucht in eine Lösung des Silanbindemittels, bei der es sich um eine Lösung mit einer Konzentration von
0,01 bis 50 V/V-% (vorzugsweise 0,1 bis 10 V/V-%) in
einem organischen Lösungsmittel (z.B. Aceton oder Toluol) handelt bei einer Temperatur von 0 bis 800C
während einer Zeitdauer von 10 Minuten bis 24 Stunden,
so daß das Silanbindemittel mit dem Mattglas reagieren und daran gebunden werden kann. Dann wird das auf
diese Weise behandelte Mattglas vom Reaktionsgemisch abgetrennt und nacheinander mit Methanol und
deionisiertem Wasser gründlich gewaschen. Das erhaltene Mattglas wird sodann gut eingetaucht in eine
wäßrige Lösung des Vernetzungsmittels mit einer
Konzentration von 0,0001 bis 50 G/G-% (vorzugsweise 0,1 bis 20 G/G-%) bei etwa 0 bis 400C während einer
Zeitspanne von 30 Minuten bis 10 Stunden, wobei das Vernetzungsmittel an das zuvor an das Mattglas
gebundene Silanbindemittel gebunden wird. Das auf diese Weise behandelte Mattglas wird sodann vom
Reaktionsgemisch abgetrennt und gründlich mit deionisiertem Wasser gewaschen. Das erhaltene Mattglas
wird mit 10 bis 1000 Teilen (vorzugsweise mit 50 bis 300 Teilen) einer Lösung der immunologisch aktiven
Substanz mit einer Konzentration von 0,001 bis 40 g/100 ml (vorzugsweise von 0,01 bis 0,1 g/100 ml) pro
100 Teile Mattglas versetzt, und die Reaktion wird bei etwa 0 bis 4O0C 10 Minuten bis 24 Stunden lang
(vorzugsweise 1 bis 3 Stunden lang) ablaufen gelassen, wobei die immunologisch aktive Substanz an das
Mattglas durch das Silanbindemittel und das Vernetzungsmittel gebunden wird.
Die erfindungsgemäßen Konjugate aus immunologisch aktiver Substanz und Glas enthalten in der Regel
0,1 bis 1000 μ& vorzugsweise 50 bis 500 μg (pro g
Mattglas), immunologisch aktive Substanz an das Glas gebunden. Die Menge an Silanbindemittel, die an das
Mattglas nach der chemischen Methode gebunden wird, kann z.B. 10-5 bis 1 μπιοί (vorzugsweise 10~4 bis
10-2μηιο1) pro g Glas betragen. Die Mengen an
Vernetzungsmittel, das an das Konjugat nach der zweiten Verfahrensweise gebunden wird, macht vorzugsweise
die stöchiometrische Menge aus zum Vernetzen der funktioneilen Gruppe des Silanbindemittels,
mit der funktioneilen Gruppe der immunologisch aktiven Substanz, sie kann jedoch variieren, beispielsweise
von 20 bis 100%, bezogen auf die stöchiometrische Menge.
Die wie vorstehend beschrieben hergestellten Konjugate aus immunologisch aktiver Substanz und Mattglas
sind stabil und können langer als 1 Jahr gelagert werden, z. B. in einer mit 0,01 M-Phosphat gepufferten physiologischen
Kochsalzlösung (pH 7,2), die 1% Natriumnitrit und 1 % Rinderserumalbumin enthält, bei 4° C.
Die erfindungsgemäßen Konjugate aus immunologisch aktiver Substanz und Mattglas sind als diagnostische
Reagenzien zur Bestimmung physiologisch aktiver Substanzen in Körperflüssigkeiten, z. B. Urin und
Serum, verwendbar. Beispiele für derartige physiologisch aktive Substanzen, die mit den erfindungsgemäßen
Konjugaten bestimmt werden können, sind Hormone, z.B. Insulin, Gonadotropin, 17-Ketosteroide, Wachstumshormone,
Thyroxin, Trijodthyronin und Thyroidstimmulierende Hormone; Proteine, z. B. IgA, IgG, IgE,
IgM, Λ-Fetoprotein, CEA und Protamine; antigene Elemente oder Fraktionen von pathogenen Bacterien,
Viren und Protozoen, z. B. Streptococcen, Hepatitis-Virus, Rubella-Virus, Toxoplasma gondii und Malariaparasiten;
und Antikörper gegen Bacterien, Viren, Protozoen, Medikamente und so weiter.
Die erfindungsgemäßen Konjugate aus immunologisch aktiver Substanz und Mattglas sind zur Bestimmung
physiologisch aktiver Substanzen in Körperflüssigkeiten nach üblichen bekannten Methoden des RIA
oder EIA unter Verwendung von Feststoffsystemen verwendbar.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. Die folgenden mattierten Gläser gelangten
dabei zum Einsatz:
(1) Mattglas I
(nach physikalischen Methoden mattierte Glaskörper)
(nach physikalischen Methoden mattierte Glaskörper)
300 Glaskörper (6 mm Durchmesser) wurden sandgeblasen durch kräftiges Aufsprühen von körnigem
Koiund (Schleifmaterial), der ein Sieb von 0,25 mm
Maschenweite passierte, auf die Glaskörper während 15 Minuten unter einem Luftdruck von 5 bar (5 kg/cm2).
Der an den Glaskörpern anhaftende Korund wurde sodann abgewaschen, wobei Mattglaskörper mit gleichförmigmattierten
Oberflächen erhalten wurden, deren nach der folgenden Methode bestimmter Mattierungsgrad
4,5 betrug.
Messung des Mattierungsgrads des mattierten Glases
50 Stück der mattierten Glaskörper und 50 Stück der nichtmattierten Glaskörper (welche die gleiche Gestalt
und Größe hatten wie die mattierten Glaskörper) wurden eingetaucht in 25 ml einer 10%-Lösung von
y-Aminopropyl-triäthoxysiian in Acetoa Nach I Stunde
langer Inkubation be; 25° C wurden die erhaltenen Glaskörper äbfiliricfi und ausreichend mit deionisiertem
Wasser gewaschen. Dann wurden (insgesamt) 100
Stück dieser Glaskörper eingetaucht in 25 ml einer wäßrigen Lösung von Glutaraldehyd; nach 1 Stunde
langer Inkubation bei 25° C wurden die auf diese Weise behandelten Glaskörper gründlich mit deionisiertem
Wasser gewaschen. Die erhaltenen Glaskörper wurden sodann eingetaucht in 25 ml einer wäßrigen Lösung, die
12,5 mg Glucoseoxidase (GOD) enthielt (Enzymaktivitlt
34,0 E/ml).
Nach einer Inkubation von zunächst 1 Stunde bei 25° C und anschließend 15 Stunden bei 4° C wurden die
Glaskörper mit deionisiertem Wasser gewaschen unter Erzielung eines GOD/Mattglaskörper-Konjugats und
eines Konjugats aus GOD und nichtmattierten Glaskörpern. In jedes von 10 Teströhrchen wurde ein
Glaskörper aus dem GOD/Mattierglaskörper-Konjugat eingebracht. In jedes von 10 weiteren Teströhrchen
wurde ein Glaskörper aus dem Konjugat aus GOD und nichtmattiertem Glaskörper eingebracht In jedes der
20 Testgläser wurden 2 ml deionisiertes Wasser gegeben, der Gefäßinhalt wurde unter Verwendung
einer Mischvorrichtung verrührt und die überstehende Flüssigkeit wurde unter Verwendung einer Saugvorrichtung
abgesaugt Diese Waschprozedur wurde zweimal wiederholt. Dann wurden 03 ml 0,01 M-Matriumacetatpufferlösung
(pH 5,1), 2,0 ml MBTH-DEA-Lösung (10 mg Natriurnäthylendiamintetraacetat,
1,7 mg3-Methyl-benzo thiazolinon-hydrazon-hydrochlorid,
0,004 ml Ν,Ν-Diäthylanilin in 100 ml 0,lM wäßriger
Essigsäurelösung) und 0,5 ml Peroxidase(POD)-Lösung
(60 E POD in 1 ml 0.1M wäßriger Natriumacetatlösung)
in jedes Testgefäß gegeben. Nach 5 Minuten langer Vorinkubation bei 37° C wurden 0,5 ml einer Lösung von
15 g 0-D-Glucose in 100 ml 0,1 M-Essigsäurelösung
jedem Testgefäß zugesetzt Nach genau 6 Minuten langer Inkubation unter Schütteln bei 37° C wurden in
jedes Testgefäß 1 ml 0,5 N-Salzsäure zugegeben, um die
Reaktion abzustoppen. Die Absorption bzw. Extinktion bei 590 mn der erhaltenen überstehenden Flüssigkeit in
jedem der Gefäße wurde gemessen. Der Mattierungsgrad wurde nach der angegebenen Gleichung (1)
berechnet unter Verwendung des Durchschnittswert der Absorption der 10 überstehenden Flüssigkeiten des
GOD/Mattglas-Konjugats und derjenigen des Konjugats aus GOD und unmattiertem Glas als die
Enzymaktivitäten.
(2) Mattglas II
(nach einer chemischen Methode
mattierte Glasröhrchen)
mattierte Glasröhrchen)
100 g kleine Glasröhrchen (6 mm äußerer Durchmesser, 4 mm innerer Durchmesser und 10 mm Länge)
wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in 200 ml einer Mattierlösung eingetaucht, die 2% Fluorwasserstoffsäure
und 1% Amoniumfluorid enthielt. Die Glasröhrchen wurden sodann aus der Lösung entnommen
und mit Wasser gewaschen, wobei mattierte Glasröhrchen mit gleichmäßig mattierten Oberflächen
erhalten wurden, die einen Mattierungsgrad von 3,2 hatten, bestimmt nach einer ähnlichen Methode wie
oben unter (1) angegeben.
Herstellung eines Konjugats aus einer
immunologisch aktiven Substanz und Mattglas
immunologisch aktiven Substanz und Mattglas
Die angegebenen 100 Mattglasröhrchen (Mattglas II) wurden in 100 ml einer 0,5%igen Lösung von y-Aminopropyl-triäthoxysilan
in Aceton eingetaucht. Nach 10 Stunden langer Inkubation bei Raumtemperatur wurden
die Röhrchen abfiltriert und mit Methanol und anschließend mit Wasser gewaschen. Die erhaltenen
100 Mattglasröhrchen, an die das aminohaltige Silanbindemittel
gebunden worden war, wurden in 40 ml N-Salzlösung eingetaucht Eine Lösung von 50 mg
menschliches IgG in 10 ml physiologischer Kochsalzlösung und eine Lösung, die 0,2% N-Äthyl-N'-dimethylaminopropylcarbodiimid
in 10 ml physiologischer Kochsalzlösung enthielt, wurden zugesetzt. Nach 2
Stunden langer Behandlung unter Eintauchen bei 37° C wurden die Röhrchen nacheinander mit Wasser,
wäßriger 1 M-Propionsäurelösung und Wasser gewaschen, bis kein Protein in den Waschwässern festzustellen
war. Auf diese Weise wurde ein Konjugat erhalten mit einem gebundenen Proteingehalt von 63 μg pro g
Glas, der wie folgt bestimmt wurde:
Messung des gebundenen Proteingehalts
Nach der von S. Moore et aL in Methods in Enzymology 6, 819 (1963), beschriebenen Methode
wurden i0 Stück des Frotein/Gias-Konjugats in eine Lösung von 6 N-Salzsäure eingetaucht und das ganze
System wurde unter vermindertem Druck abgeschmolzen und danach bei 1000C 30 Stunden lang erhitzt Der
Proteingehalt wurde nach der Ninhydrin-Färbemethode bestimmt
Herstellung eines Konjugats aus einer
immunologisch aktiven Substanz und Mattglas
immunologisch aktiven Substanz und Mattglas
200 der angegebenen Mattglaskörper (Mattglas I) wurden in 100 ml einer 0,5%igen Lösung von y-Aminopropyl-triäthoxysflan
in Toluol eingetaucht und 7 Stunden lang zum Sieden erhitzt Die Körper wurden sodann abfiltriert und mit Methanol und anschließend
mit Wasser gewaschen. Zu den 200 Mattglaskörpern, an
die das aminohaltige Silanbindemittel gebunden war, wurden 100 ml wäßrige 2°/oige Glutaraldehydlösung
zugegeben. Nach 2 Stunden langem Stehen bei 4°C wurden die Glaskörper mit deionisiertem Wasser 4- bis
6mal gewaschen, bis sie nicht mehr den Geruch nach Glutaraldehyd aufwiesen. Die auf diese Weise behandelten
200 Mattglaskörper wurden sodann in 40 ml N-Salzlösung eingetaucht. Hierzu wurde eine Lösung
von 50 mg anti-menschliches Insulin (Kaninchen) in
ίο 10 ml physiologischer Kochsalzlösung zugesetzt. Nachdem
die Reaktion 2 Stunden lang bei 300C ablaufen gelassen worden war, wurden die Glaskörper gründlich
mit Wasser gewaschen, bis kein Protein in den Waschwässern mehr nachweisbar war.
Auf diese Weise wurde ein Konjugat erhalten, das einen in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 gemessenen
gebundenen Proteingehalt von 148 μg pro g Glas aufwies.
Bestimmung einer immunologisch aktiven Substanz (menschliches Insulin) mit dem Konjugat aus immunologisch
aktiver Substanz und Mattglas (Sandwich EIA).
Die Insulinbestimmung nach der Sandwich-EIA-Methode wurde durchgeführt unter Verwendung der Konjugate aus anti-menschliches Insulin (Kaninchen) und Mattglas, die gemäß Beispiel 2 erhalten worden waren. In jedes der Teströhrchen (0,9 χ 10 cm) wurden 0,3 ml einer Lösung von 0,01 M-Natriumphosphatpuffer (pH 7,3), die 0,85% Natriumchlorid und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt (im folgenden als »Pufferlösung A« bezeichnet), zugegeben.
Die Insulinbestimmung nach der Sandwich-EIA-Methode wurde durchgeführt unter Verwendung der Konjugate aus anti-menschliches Insulin (Kaninchen) und Mattglas, die gemäß Beispiel 2 erhalten worden waren. In jedes der Teströhrchen (0,9 χ 10 cm) wurden 0,3 ml einer Lösung von 0,01 M-Natriumphosphatpuffer (pH 7,3), die 0,85% Natriumchlorid und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt (im folgenden als »Pufferlösung A« bezeichnet), zugegeben.
In jedes Teströhrchen wurde ein Konjugatkörper aus anti-menschlichem Insulin/Mattglas, hergestellt nach
Beispiel 2, eingebracht. Verschiedene Verdünnungen von menschlichem Insulin wurde hergestellt mit
Pufferlösung A und in die Testgläser (0,1 ml/Glas) gegeben. Nach 1 Stunde langem Schütteln bei
Raumtemperatur wurden 0,1 ml mit Phosphatase markiertes anti-menschliches Insulin zu jedem Testglas
zugesetzt. Nach weiterem Schütteln oder Inkubieren während 1 Stunde wurde etwa 5 ml N-Salzlösung zu
jedem der Gläser zugegeben, und der Glasinhalt wurde gerührt unter Verwendung einer Mischvorrichtung,
worauf die überstehende Flüssigkeit mit Hilfe einer Saugvorrichtung abgesaugt wurde. Diese Waschprozedur
wurde viermal wiederholt Dann wurden 2 ml eines Enzymsubstratreagens (das enthalten war in einem
ALP-Bestimmungspack der Chugai Pharmaceutical Co, Ltd.) in jedes Testglas gegeben. Die Inkubation oder
Reaktion bei 37° C während 30 Minuten unter Schütteln schloß sich an. Dann wurden 2,0 ml einer Farbbildung*
lösung (die enthalten war in dem angegebenen ALP-Bestimmungspack der Chugai Pharmaceutical Co,
Ltd.) jedem Testglas zugesetzt Nach weiterer Inkubation unter Schütteln bei 37° C während 30 Minuten
wurde die Absorption bei 570 nm gemessen zur Bestimmung der Einzymaktivität F i g. 1 gibt die
Standardbestimmungskurve für menschliches Insulin wieder bei Verwendung des Konjugats aus Kaninchenanti-menschliches
Insulin/Mattglaskörper.
Bestimmung der Wirkungsweise des Konjugats 1 aus immunologisch aktiver Substanz und Mattglas.
Ein Konjugat aus Kaninchen-anti-menschliches Insulin/unmattiertem
Glaskörper wurde nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellt, jedoch
unter Verwendung von unmattierten Glaskörpern (6 mm Durchmesser) und mit dem Konjugat aus
Kaninchen-anti-menschliches Insulin/Mattglaskörper gemäß Beispiel 2 verglichen in bezug auf die Menge an
gebundenem Protein. Das .gebundene Protein wurde nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode bestimmt
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt
Gebundenes Protein Glaskörper)
Kaninchen-anti-menschliches 148
Insulin/Mattglaskörper-Konjugat
Kaninchen-anti-menschliches 32
Kaninchen-anti-menschliches 32
Insuün/unmattierte Glaskörper-Konjugat
Die Ergebnisse zeigen, daß eine größere Menge an immunologisch aktiver Substanz an den mattierten
Glaskörper als an den unmattierten Glaskörper gebunden werden kann.
Bestimmung der Wirkungsweise des Konjugats 2 aus der immunologisch aktiven Substanz und mattiertem
Glas.
Ein Konjugat aus Kaninchen-anti-menschliches Insu-Iin/unmattiertem
Glaskörper wurde nach dem in Beispiel 2 beschi iebenen Verfahren hergestellt mit der
Ausnahme, daß unmattierte Glaskörper verwendet wurden. Unter Verwendung dieses Konjugats und des
Konjugats aus Kaninchen-anti-menschliches Insulin/ Mattglaskörper, hergestellt gemäß Beispiel 2, wurden
Bestimmungen des menschlichen Insulins nach der in Beispiel 3 beschriebenen Methode durchgeführt und die
Empfindlichkeit der Bestimmungsmethode, der Versuchsbereich und die Versuchsgenauigkeit wurden
zwischen den beiden Konjugaten verglichen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II
aufgeführt.
| Bestimmung von | Bestimmung von |
| menschlichem | menschlichem |
| Insulin mit Kon- | Insulin mit Ka |
| jugal aus Kanin- | ninchen-anti |
| chen-anti-mensch- | menschliches In |
| liches Insulin/mat | sulin/unmattier |
| tierten Glaskörpern | ten Glaskörpern |
Empfindlichkeit
(μΕ/ml)
(μΕ/ml)
Versuchsbereich
(μΕ/ml) '
Genauigkeit
(bei Bestimmung
von 120 μΕ/ml
menschlichem
Insulin)
(μΕ/ml) '
Genauigkeit
(bei Bestimmung
von 120 μΕ/ml
menschlichem
Insulin)
0,2
0,2-450
0,2-450
118 ±5 μΕ/ml
(Variationskoeffizient
= 4,2%)
(Variationskoeffizient
= 4,2%)
20
20-250
20-250
110 ±20 μΕ/ml (Variationskoeffizient
= 27,3%)
= 27,3%)
körper weitaus besser ist in bezug auf Empfindlichkeit und Versuchsbereich sowie Versuchsgenauigkeit als das
entsprechende, aus unmattierten Glaskörpern hergestellte Konjugat
Herstellung eines Konjugats aus einer immunologisch aktiven Substanz und Mattglas.
(1) Reduktion von anti-menschliches
a-Fetoprotein (anti-menschliches AFP)
a-Fetoprotein (anti-menschliches AFP)
Zu 10 ml einer wäßrigen Lösung von 100 mg anti-menschliches AFP (Kaninchen) (DAKO-Immunoglobulins
Ltd, Dänemark) wurde 1 ml einer 0,1 M-wäßrigen Lösung von 2-Mercaptoäthylamin zugegeben, und
die Inkubation wurde bei 37° C 90 Minuten lang durchgeführt Das auf diese Weise reduzierte antimenschliche
AFP wurde abgetrennt und gereinigt durch eine Sephadex G-25-Säule (1 χ 40 cm), die geupffert
war mit 0,1 M-Natriumacetatpuffer (pH 5,0).
(2) Herstellung eines Konjugats
aus immunologisch aktiver Substanz
(anti-menschliches AFP)/Mattglaskörpern
200 Stücke der Mattglaskörper (Mattglas I) wurden eingetaucht in 100 ml einer O,5°/oigen Lösung von
y-Mercaptopropyl-trimethoxysilan in Toluol, und die
Reaktion wurde 8 Stunden lang unter Rückfluß vonstatten gehengelassen. Die Glaskörper wurden
sodann abfiltriert und mit Methanol und anschließend mit Wasser gewaschen. Zu den 200 Mattglaskörpern, an
die das thiolhaltige Silanbindemittel gebunden war, wurden 100 ml einer gesättigten Ν,Ν'-o-Phenylendimaleimidlösung
in 0,1 M-Natriumacetatpuffer (pH 5,0)
zugegeben. Die Inkubation wurde bei 300C 2 Stunden
lang durchgeführt. Die Glaskörper wurden viermal mit deionisiertem Wasser gewaschen. Die erhaltenen 200
Glaskörper wurden sodann eingetaucht in 90 ml 0,1 M-Natriumacetatpuffer (pH 5,0), und 50 mg des wie
oben unter (1) beschrieben reduzierten anti-menschliches AFP in 10 ml 0,1 M-Natriumacetatpuffer (pH 5,0)
wurden zugesetzt Nach der nachfolgenden Reaktion bei 3O0C während 2 Stunden wurden die erhaltenen
Mattglaskörper gründlich mit Wasser gewaschen, bis in den Waschwässer kein Protein mehr festzustellen war.
Auf diese Weise wurde ein Konjugat aus anti-menschliches AFP/Mattglas erhalten mit einem nach einer
ähnlichen Methode wie in Beispiel 1 beschrieben gemessenen gebundenen Proteingehalt von 103 μg pro
gGlas.
Vergleichsbeispiel 1
Nach dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren, jedoch unter Verwendung von unbehandelten (unmattierten)
Glaskörpern (6 mm Durchmesser) wurde ein Konjugat aus anti-menschliches AFP/unmattierten
Glaskörpern erhalten mit einem nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren gemessenen gebundenen
Proteingehalt von 19 μg pro g Glas.
Die Ergebnisse zeigen, daß das Konjugat aus immunologisch aktiver Substanz und mattiertem Glas-Bestimmung
einer physiologisch aktiven Substanz
(menschliches oc-Fetoprotein — menschliches AFP)
unter Verwendung des Konjugats aus der immunologisch aktiven Substanz und Glas nach dem Sandwich-EIA.
Unter Verwendung des Konjugats aus dem antimenschlichen AFP und Mattglaskörpern und des
Konjugats aus dem anti-menschlichen AFP und unmattierten Glaskörpern wurde die Bestimmung von
menschlichem AFP nach dem Sandwich-EIA durchgeführt
Es wurden 0,3 ml der Pufferlösung A gemäß Beispiel 3
und 1 Körper des Konjuga's aus anti-menschliches AFP/Mattglaskörper gemäß Beispiel 6 oder des
Konjugats aus anti-menschliches AFP/nichtmattierter Glaskörper gemäß Beispiel 1 in jedes der Testgläser
(0,9 χ 10 cm) eingebracht Verschiedene Verdünnungen
von menschlichem AFP wurde hergestellt mit der Pufferlösung A, und 0,1 ml Anteile derselben wurden in
jedes Testglas zugegeben. Die Inkubation wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde lang durchgeführt Nach der
Reaktion wurden etwa 5 ml physiologische Kochsalzlösung zugegeben, das Gemisch wurde unter Verwendung
einer Mischvorrichtung gerührt, und die überstehende Flüssigkeit wurde unter Verwendung einer Saugvorrichtung
abgesaugt, um das Waschen der Glaskörper zu bewirken. Dann wurde 0,1 ml eines mit Peroxidase
markierten anti-menschliches AFP und 0,3 mf der Pufferlösung A in jedes Testglas zugegeben, und die
Inkubation wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde lang durchgeführt Nach beendeter Reaktion wurden etwa
5 ml physiologischer Kochsalzlösung zugesetzt, das Gemisch wurde unter Verwendung eines Mischers
gerührt und die überstehende Flüssigkeit wurde unter Verwendung einer Saugvorrichtung abgesaugt, um das
Waschen der Glaskörper zu bewirken. Ein Enzymsubstratreagens (2,5 ml einer frisch zubereiteten Lösung
von 5-Aminosalicylsäure [0,6 mg/ml] und Harnstoffperoxid
[0,2 mg/ml] in 0,03 M-Natriumphosphatpuffer [pH 6,0]) wurden in jedes Testglas gegeben. Nach 1 Stunde
langer Inkubation bei 37°C wurden 0,1 ml einer 10%igen wäßrigen Lösung von Natriumazid in jedes
Testglas zugesetzt zur Unterbrechung der Reaktion, und die Absorption bei 500 nm wurde gemessen und zu
der Enzymaktivität in Beziehung gesetzt. Die Standardbestimmungskurve für menschliches AFP bei Verwendung
des Konjugats aus anti-menschlichem AFP und Mattglaskörper sowie diejenige bei Verwendung des
Konjugats aus anti-menschlichem A^P und nichtmattiertem
Glaskörper sind in F i g. 2 durch die ausgezogene Linie bzw. die unterbrochene Linie wiedergegeben.
Der Einfluß beider Konjugate wurde miteinander verglichen in bezug auf Empfindlichkeit, Versuchsbereich
und Versuchsgenauigkeit Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III aufgeführt
Bestimmung von
menschlichem
AFP mit Künjugat
aus anti-menschliches AFP/Mattglaskörper
menschlichem
AFP mit Künjugat
aus anti-menschliches AFP/Mattglaskörper
Bestimmung von menschlichem
AFP mil Konjugat aus antimenschliches
AFP/nichl-mattierte Glaskörper
AFP mil Konjugat aus antimenschliches
AFP/nichl-mattierte Glaskörper
Empfindlichkeit 0,5 10
(ng/ml)
Versuchsbereich 0,5-500 10-100
(ng/ml)
Versuchsgenauig- 79 ± 3 ng/ml 76 ± 28 ng/ml
keit (bei Bestim- (Variations- (Variations-
mung von 80 ng/ koeffizient koeffizient
ml menschliches = 3,8) = 36,8%)
AFP)
AFP)
Aus F i g. 2 und Tabelle III ergibt sich eindeutig, daß das Konjugat aus immunologisch aktiver Substanz/
Mattglas weitaus besser ist in bezug auf Empfindlichkeit, Bestimmungsbereich und Genauigkeit als das entsprechende,
unier Verwendung der unmattierten Glaskörper hergestellte Konjugat.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen
Claims (6)
1. Konjugat aus einer immunologisch aktiven Substanz, die physikalisch oder chemisch mit Glas
verbunden ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Glas ein Mattglas ist, das durch Mattieren
der Oberfläche eines Glaskörpers mit einem minimalen Durchmesser von wenigstens 1 mm
erhalten worden ist ι ο
2. Konjugat nach Anspruch 1, daudrch gekennzeichnet, daß das Mattglas einen Mattierungsgrad
von 1,5 bis 10,0 besitzt
3. Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet daß die immunologisch aktive
Substanz und das Mattglas mit Hilfe eines Silankupplungsmittels und erforderlichenfalls eines
Vernetzungsmittels verbunden sind.
4. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats aus einer immunologisch aktiven Substanz und einem
Glas durch Umsetzen einer immunologisch aktiven Substanz mit einem Glas mit einem Silankupplungsmittel
und erforderlichenfalls einem Vernetzungsmittel, dadurch gekennzeichnet daß ein Mattglas,
das durch Mattieren der Oberfläche eines Glaskörpers mit einem minimalen Durchmesser von
wenigstens 1 mm erhalten worden ist, als Glas verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das eingesetzte Mattglas einen
Mattierungsgrad von 1,5 bis 10,0 besitzt.
6. Verwendung eines Konjugats aus einer immunologisch aktiven Substanz und einem Glas
gemäß Anspruch 1 bis 3 in einem diagnostischen Reagens oder zum Untersuchen einer physiologisch
aktiven Substanz.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53016342A JPS608745B2 (ja) | 1978-02-14 | 1978-02-14 | 免疫活性物質−つや消しガラス複合体，その製造法及び該複合体を含有してなる測定試薬 |
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| DE2905657A Expired DE2905657C2 (de) | 1978-02-14 | 1979-02-14 | Konjugat aus einer immunologisch aktiven Substanz und Verfahren zu seiner Herstellung |
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